За пациентите, подложени на операция за ортопедични импланти, бактериалните инфекции и предизвиканите от инфекции имунни отговори винаги са били животозастрашаващи рискове.Конвенционалните биологични материали са податливи на биологично замърсяване, което кара бактериите да нахлуят в увредената област и да причинят следоперативна инфекция.Следователно има спешна необходимост от разработване на антиинфекциозни и имунни покрития за ортопедични импланти.Тук разработихме усъвършенствана технология за модификация на повърхността за ортопедични импланти, наречена Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), която е вдъхновена от гладката повърхност на каните за растения.LOIS има дълготрайно и силно отблъскване на течности към различни течности и биологични вещества (включително клетки, протеини, калций и бактерии).В допълнение, ние потвърдихме механичната издръжливост срещу надраскване и силата на фиксиране чрез симулиране на неизбежната повреда по време на ин витро операцията.Моделът на възпалителна бедрена фрактура на заешки костен мозък беше използван за задълбочено изследване на антибиологичното мащабиране и антиинфекциозната способност на LOIS.Ние предвиждаме, че LOIS, който има анти-биообрастващи свойства и механична издръжливост, е стъпка напред в ортопедичната хирургия без инфекции.
Днес, поради цялостното застаряване, броят на пациентите, страдащи от ортопедични заболявания (като фрактури в напреднала възраст, дегенеративни ставни заболявания и остеопороза) значително се е увеличил (1, 2).Поради това медицинските институции отдават голямо значение на ортопедичната хирургия, включително ортопедични импланти от винтове, пластини, пирони и изкуствени стави (3, 4).Съобщава се обаче, че традиционните ортопедични импланти са податливи на бактериална адхезия и образуване на биофилм, което може да причини инфекция на хирургичното място (SSI) след операция (5, 6).След като биофилмът се образува върху повърхността на ортопедичния имплант, отстраняването на биофилма става изключително трудно дори при използването на големи дози антибиотици.Поради това обикновено води до тежки следоперативни инфекции (7, 8).Поради горните проблеми, лечението на инфектирани импланти трябва да включва повторна операция, включително отстраняване на всички импланти и околните тъкани;следователно пациентът ще страда от силна болка и някои рискове (9, 10).
За да се решат някои от тези проблеми, са разработени отделящи лекарства ортопедични импланти за предотвратяване на инфекция чрез елиминиране на бактерии, прикрепени към повърхността (11, 12).Стратегията обаче все още показва няколко ограничения.Съобщава се, че дългосрочното имплантиране на импланти, излъчващи лекарство, е причинило увреждане на околните тъкани и е причинило възпаление, което може да доведе до некроза (13, 14).В допълнение, органичните разтворители, които могат да съществуват след производствения процес на отделящи лекарства ортопедични импланти, които са строго забранени от Администрацията по храните и лекарствата на САЩ, изискват допълнителни стъпки на пречистване, за да отговарят на нейните стандарти (15).Елуиращите лекарства импланти са предизвикателство за контролирано освобождаване на лекарства и поради ограниченото им натоварване с лекарства, дългосрочното приложение на лекарството не е осъществимо (16).
Друга често срещана стратегия е имплантът да се покрие с полимер против замърсяване, за да се предотврати прилепването на биологични вещества и бактерии към повърхността (17).Например, цвитерионните полимери са привлекли вниманието поради техните неадхезивни свойства, когато са в контакт с плазмени протеини, клетки и бактерии.Той обаче има някои ограничения, свързани с дългосрочната стабилност и механичната издръжливост, които възпрепятстват практическото му приложение в ортопедични импланти, особено поради механично изстъргване по време на хирургични процедури (18, 19).В допълнение, поради високата си биосъвместимост, липсата на необходимост от операция за отстраняване и свойствата за почистване на повърхността чрез корозия, са използвани ортопедични импланти, изработени от биоразградими материали (20, 21).По време на корозия химическите връзки между полимерната матрица се разрушават и отделят от повърхността, а прилепналите елементи почистват повърхността.Въпреки това, антибиологичното замърсяване чрез повърхностно почистване е ефективно за кратък период от време.В допълнение, повечето абсорбируеми материали, включително съполимер на поли(млечна киселина-гликолова киселина) (PLGA), полимлечна киселина (PLA) и сплави на основата на магнезий, ще претърпят неравномерно биоразграждане и ерозия в тялото, което ще повлияе отрицателно на механичната стабилност.(двадесет и две).В допълнение, биоразградимите фрагменти от плочи осигуряват място за прикрепване на бактерии, което увеличава шанса за инфекция в дългосрочен план.Този риск от механично разграждане и инфекция ограничава практическото приложение на пластичната хирургия (23).
Суперхидрофобните (SHP) повърхности, които имитират йерархичната структура на лотосовите листа, са се превърнали в потенциално решение за повърхности против замърсяване (24, 25).Когато повърхността на SHP е потопена в течност, въздушните мехурчета ще бъдат уловени, като по този начин ще се образуват въздушни джобове и ще се предотврати бактериалната адхезия (26).Въпреки това, последните проучвания показват, че SHP повърхността има недостатъци, свързани с механичната издръжливост и дългосрочна стабилност, което възпрепятства приложението й в медицински импланти.Освен това въздушните джобове ще се разтворят и ще загубят свойствата си против замърсяване, което ще доведе до по-широка бактериална адхезия поради голямата повърхност на повърхността на SHP (27, 28).Наскоро Aizenberg и колеги представиха иновативен метод за нанасяне на повърхностно покритие против биообрастяне, като разработиха гладка повърхност, вдъхновена от растението Nepenthes pitcher (29, 30).Гладката повърхност показва дълготрайна стабилност при хидравлични условия, изключително течноотблъскваща биологични течности и има свойства за самовъзстановяване.Въпреки това, няма нито метод за нанасяне на покритие върху медицински имплант със сложна форма, нито е доказано, че подпомага процеса на зарастване на увредена тъкан след имплантиране.
Тук представяме смазана повърхност на ортопедични импланти (LOIS), микро/наноструктурирана повърхност на ортопедични импланти и плътно комбинирана с тънък смазващ слой, за да се предотврати свързването й с пластична хирургия Бактериални инфекции, като фиксиране на фрактури.Тъй като функционализираната с флуор структура на микро/нано ниво здраво фиксира лубриканта върху структурата, разработеният LOIS може напълно да отблъсне адхезията на различни течности и да поддържа ефективността против замърсяване за дълго време.Покритията LOIS могат да се нанасят върху материали с различни форми, предназначени за костен синтез.Отличните антибиообрастващи свойства на LOIS срещу бактерии от биофилм [Pseudomonas aeruginosa и метицилин-резистентен Staphylococcus aureus (MRSA)] и биологични вещества (клетки, протеини и калций) са потвърдени in vitro.Степента на адхезия на екстензивна адхезия към основата е по-малка от 1%.В допълнение, дори след механичен стрес, като например надраскване на повърхността, самовъзстановяването, причинено от проникващата смазка, помага да се запазят неговите свойства против замърсяване.Резултатите от изпитването за механична издръжливост показват, че дори след структурна и химическа модификация, общата якост няма да бъде значително намалена.Освен това беше проведен in vitro експеримент, който симулира механичния стрес в хирургическата среда, за да се докаже, че LOIS може да издържи на различни механични натоварвания, възникващи по време на пластичната хирургия.И накрая, използвахме in vivo модел на фрактура на бедрената кост на базата на заек, който доказа, че LOIS има превъзходни антибактериални свойства и биосъвместимост.Рентгенологичните и хистологичните резултати потвърдиха, че стабилното поведение на лубриканта и свойствата срещу биообрастяне в рамките на 4 седмици след имплантирането могат да постигнат ефективна антиинфекция и ефективност на имунната защита, без да забавят процеса на зарастване на костта.
Фигура 1А показва схематична диаграма на разработения LOIS, който е имплантиран с микро/наномащабни структури в модел на фрактура на бедрената кост на заек, за да потвърди неговите отлични антибиологични свойства срещу замърсяване и инфекции.Извършва се биомиметичен метод за симулиране на повърхността на саксийно растение и за предотвратяване на биозамразяване чрез включване на смазващ слой в микро/нано структурата на повърхността.Повърхността, инжектирана със смазка, може да сведе до минимум контакта между биологичните вещества и повърхността.Поради това, поради образуването на стабилни химични връзки на повърхността, той има отлични противообрастващи характеристики и дългосрочна стабилност.В резултат на това свойствата на смазващата повърхност срещу биообрастяне позволяват различни практически приложения в биомедицинските изследвания.Все още обаче не са завършени задълбочени изследвания за това как тази специална повърхност взаимодейства в тялото.Чрез сравняване на LOIS с голи субстрати in vitro с използване на албумин и бактерии от биофилм, неадхезивността на LOIS може да бъде потвърдена (Фигура 1B).В допълнение, чрез търкаляне на водните капки върху наклонения гол субстрат и LOIS субстрата (Фигура S1 и филм S1), може да се демонстрира ефективността на биологичното замърсяване.Както е показано на изображението на флуоресцентния микроскоп, откритият субстрат, инкубиран в суспензия от протеин и бактерии, показва голямо количество биологичен материал, прилепнал към повърхността.Въпреки това, поради отличните си свойства срещу биообрастяне, LOIS почти не показва никаква флуоресценция.За да се потвърдят неговите анти-биообрастващи и анти-инфекциозни свойства, LOIS беше нанесен върху повърхността на ортопедични импланти за костен синтез (плочи и винтове) и поставен в модел на фрактура на заек.Преди имплантирането, голият ортопедичен имплант и LOIS се инкубират в бактериална суспензия в продължение на 12 часа.Предварителната инкубация гарантира образуването на биофилм върху повърхността на открития имплант за сравнение.Фигура 1C показва снимка на мястото на фрактурата 4 седмици след имплантирането.Вляво заек с гол ортопедичен имплант показа тежко ниво на възпаление поради образуването на биофилм върху повърхността на импланта.Обратният резултат се наблюдава при зайци, имплантирани с LOIS, т.е. околните тъкани на LOIS не показват нито признаци на инфекция, нито признаци на възпаление.В допълнение, оптичното изображение вляво показва хирургичното място на заека с открития имплант, което показва, че на повърхността на LOIS не са открити множество лепила, присъстващи на повърхността на открития имплант.Това показва, че LOIS има дългосрочна стабилност и има способността да поддържа своите антибиологични свойства срещу замърсяване и антиадхезия.
(A) Схематична диаграма на LOIS и нейното имплантиране в модел на фрактура на бедрената кост на заек.(B) Флуоресцентно микроскопско изображение на протеинов и бактериален биофилм върху гола повърхност и LOIS субстрат.4 седмици след имплантирането, (C) фотографско изображение на мястото на фрактурата и (D) рентгеново изображение (маркирано с червен правоъгълник).С любезното съдействие на изображението: Kyomin Chae, Университет Йонсей.
Стерилизираните, експонирани отрицателно имплантирани зайци показват нормален процес на заздравяване на костите без никакви признаци на възпаление или инфекция.От друга страна, SHP имплантите, предварително инкубирани в бактериална суспензия, показват свързано с инфекция възпаление на околните тъкани.Това може да се дължи на неговата неспособност да инхибира бактериалната адхезия за дълго време (Фигура S2).За да се докаже, че LOIS не влияе на лечебния процес, но инхибира възможни инфекции, свързани с имплантирането, бяха сравнени рентгенови изображения на откритата положителна матрица и LOIS на мястото на фрактурата (Фигура 1D).Рентгеновото изображение на оголения положителен имплант показва персистиращи линии на остеолиза, което показва, че костта не е напълно зараснала.Това предполага, че процесът на възстановяване на костите може да бъде значително забавен поради възпаление, свързано с инфекция.Напротив, това показа, че зайците, имплантирани с LOIS, са зараснали и не показват очевидно място на фрактура.
Бяха положени много усилия, за да се разработят медицински импланти с дългосрочна стабилност и функционалност (включително устойчивост на биозамърсяване).Въпреки това, наличието на различни биологични вещества и динамиката на тъканната адхезия ограничава развитието на техните клинично надеждни методи.За да преодолеем тези недостатъци, ние разработихме микро/нано слоеста структура и химически модифицирана повърхност, която е оптимизирана поради високата капилярна сила и химичния афинитет, за да запази най-гладкото смазващо средство в най-голяма степен.Фигура 2A показва цялостния производствен процес на LOIS.Първо, подгответе субстрат от медицинска неръждаема стомана (SS) 304.Второ, микро/нано структурата се формира върху SS субстрата чрез химическо ецване с помощта на разтвор на флуороводородна киселина (HF).За да се възстанови корозионната устойчивост на SS, разтвор на азотна киселина (HNO3) (31) се използва за обработка на ецвания субстрат.Пасивирането повишава устойчивостта на корозия на SS субстрата и значително забавя процеса на корозия, което може да намали цялостната производителност на LOIS.След това, чрез образуване на самосглобяващ се монослой (SAM) с 1H, 1H, 2H, 2H-перфлуорооктилтриетоксисилан (POTS), повърхността е химически модифицирана, за да се подобри химическото взаимодействие между повърхността и гладката смазка Affinity.Повърхностната модификация значително намалява повърхностната енергия на произведената микро/наномащабна структурирана повърхност, която съответства на повърхностната енергия на гладката смазка.Това позволява смазката да бъде напълно намокрена, като по този начин образува стабилен слой смазка на повърхността.Модифицираната повърхност показва повишена хидрофобност.Резултатите показват, че хлъзгавият лубрикант проявява стабилно поведение върху LOIS поради високия химичен афинитет и капилярна сила, причинени от микро/нано структурата (32, 33).Изследвани са оптичните промени на повърхността на SS след повърхностна модификация и инжектиране на лубрикант.Микро/нанослоестата структура, образувана на повърхността, може да причини визуални промени и да потъмни повърхността.Това явление се дължи на засиления ефект на разсейване на светлината върху грапавата повърхност, което увеличава дифузното отражение, причинено от механизма за улавяне на светлината (34).Освен това, след инжектиране на лубриканта, LOIS става по-тъмен.Смазващият слой кара по-малко светлина да се отразява от субстрата, като по този начин потъмнява LOIS.За да се оптимизира микроструктурата/наноструктурата, за да се покаже най-малкият ъгъл на плъзгане (SA) за постигане на ефективност срещу биообрастяне, бяха използвани сканираща електронна микроскопия (SEM) и атомни двойки за извършване на различни времена на HF ецване (0, 3)., 15 и 60 минути) Силов микроскоп (AFM) (Фигура 2B).SEM и AFM изображенията показват, че след кратко време на ецване (3 минути ецване), голият субстрат е образувал неравномерна грапавост в наномащаб.Грапавостта на повърхността се променя с времето за ецване (Фигура S3).Променящата се във времето крива показва, че грапавостта на повърхността продължава да нараства и достига пик при 15 минути ецване, а след това се наблюдава само леко намаляване на стойността на грапавостта при 30 минути ецване.В този момент грапавостта на нано ниво се гравира, докато грапавостта на микро ниво се развива енергично, правейки промяната на грапавостта по-стабилна.След ецване за повече от 30 минути се наблюдава допълнително увеличаване на грапавостта, което е обяснено подробно, както следва: SS се състои от стомана, легирана с елементи, включително желязо, хром, никел, молибден и много други елементи.Сред тези елементи желязото, хромът и молибденът играят важна роля при образуването на микронна/наномащабна грапавост върху SS чрез HF ецване.В ранните етапи на корозия желязото и хромът са корозирали главно, тъй като молибденът има по-висока устойчивост на корозия от молибдена.С напредването на ецването ецващият разтвор достига локално пренасищане, образувайки флуориди и оксиди, причинени от ецването.Флуоридът и оксидът се утаяват и в крайна сметка се отлагат отново на повърхността, образувайки повърхностна грапавост в микрон/нано диапазон (31).Тази грапавост на микро/нано ниво играе важна роля в самолечебните свойства на LOIS.Повърхността с двоен мащаб създава синергичен ефект, значително увеличавайки капилярната сила.Това явление позволява на лубриканта да проникне стабилно в повърхността и допринася за свойствата на самолечение (35).Образуването на грапавост зависи от времето за ецване.Под 10 минути ецване, повърхността съдържа само грапавост в наномащаб, която не е достатъчна, за да побере достатъчно смазка, за да има устойчивост на биообрастяне (36).От друга страна, ако времето за ецване надвиши 30 минути, наномащабната грапавост, образувана от повторното отлагане на желязо и хром, ще изчезне и само микромащабната грапавост ще остане поради молибдена.Прекомерно ецваната повърхност няма наномащабна грапавост и губи синергичния ефект на двустепенната грапавост, което се отразява негативно върху характеристиките на самовъзстановяване на LOIS.Измерванията на SA бяха извършени върху субстрати с различни времена на ецване, за да се докаже ефективността срещу замърсяване.Бяха избрани различни видове течности въз основа на вискозитета и повърхностната енергия, включително дейонизирана (DI) вода, кръв, етилен гликол (EG), етанол (EtOH) и хексадекан (HD) (Фигура S4).Променливият във времето модел на ецване показва, че за различни течности с различна повърхностна енергия и вискозитет, SA на LOIS след 15 минути ецване е най-ниската.Поради това LOIS е оптимизиран да ецва за 15 минути, за да образува микронна и наномащабна грапавост, която е подходяща за ефективно поддържане на издръжливостта на смазката и отличните свойства против замърсяване.
(A) Схематична диаграма на четириетапния производствен процес на LOIS.Вмъкването показва SAM, образуван върху субстрата.(B) SEM и AFM изображения, използвани за оптимизиране на микро/нано структурата на субстрата при различни времена на ецване.Рентгенова фотоелектронна спектроскопия (XPS) спектри на (C) Cr2p и (D) F1s след повърхностна пасивация и SAM покритие.au, произволна единица.(E) Представителни изображения на водни капчици върху голи, гравирани, SHP и LOIS субстрати.(F) Измерване на контактния ъгъл (CA) и SA на течности с различни повърхностни напрежения на SHP и LOIS.Данните са изразени като средно ± SD.
След това, за да се потвърди промяната в химичните свойства на повърхността, беше използвана рентгенова фотоелектронна спектроскопия (XPS) за изследване на промяната в химичния състав на повърхността на субстрата след всяко повърхностно покритие.Фигура 2C показва резултатите от XPS измерванията на HF гравираната повърхност и третираната с HNO 3 повърхност.Двата основни пика при 587,3 и 577,7 eV могат да бъдат приписани на Cr-O връзката, съществуваща в слоя хромен оксид, което е основната разлика от повърхността, гравирана с HF.Това се дължи главно на консумацията на желязо и хромов флуорид на повърхността от HNO3.Офортът на базата на HNO3 позволява на хрома да образува пасивиращ оксиден слой върху повърхността, което прави гравирания SS отново устойчив на корозия.На Фигура 2D са получени XPS спектри, за да се потвърди, че силан на основата на флуоровъглерод е образуван на повърхността след SAM покритието, което има изключително високо отблъскване на течности дори за EG, кръв и EtOH.SAM покритието се завършва чрез взаимодействие на силанови функционални групи с хидроксилни групи, образувани чрез плазмено третиране.В резултат на това се наблюдава значително увеличение на CF2 и CF3 пиковете.Енергията на свързване между 286 и 296 eV показва, че химическата модификация е успешно завършена от SAM покритието.SHP показва относително големи CF2 (290,1 ​​eV) и CF3 (293,3 eV) пикове, които са причинени от базирания на флуоровъглерод силан, образуван на повърхността.Фигура 2E показва представителни оптични изображения на измерванията на контактния ъгъл (CA) за различни групи дейонизирана вода в контакт с гола, гравирана, SHP и LOIS.Тези изображения показват, че гравираната повърхност става хидрофилна поради микро/нано структурата, образувана чрез химическо ецване, така че дейонизираната вода се абсорбира в структурата.Въпреки това, когато субстратът е покрит със SAM, субстратът проявява силно водоотблъскване, така че се образува повърхностен SHP и контактната площ между водата и повърхността е малка.И накрая, намаление на CA се наблюдава при LOIS, което може да се дължи на проникването на смазка в микроструктурата, като по този начин се увеличава контактната площ.За да се докаже, че повърхността има отлично отблъскване на течности и незалепващи свойства, LOIS беше сравнен с SHP субстрата чрез измерване на CA и SA с помощта на различни течности (Фигура 2F).Бяха избрани различни видове течности въз основа на вискозитет и повърхностна енергия, включително дейонизирана вода, кръв, EG, EtOH и HD (Фигура S4).Резултатите от измерването на CA показват, че когато CA клони към HD, стойността на редукция на CA, където CA има най-ниската повърхностна енергия.В допълнение, LOIS на общия CA е нисък.Измерването на SA обаче показва съвсем различно явление.С изключение на йонизираната вода, всички течности се придържат към SHP субстрата, без да се изплъзват.От друга страна, LOIS показва много ниска SA, където, когато цялата течност е наклонена под ъгъл, по-малък от 10° до 15°, цялата течност ще се изтърколи.Това ясно показва, че незалепването на LOIS е по-добро от това на SHP повърхността.В допълнение, LOIS покритията се прилагат и към различни видове материали, включително титан (Ti), полифенилсулфон (PPSU), полиоксиметилен (POM), полиетер етер кетон (PEEK) и биоабсорбируеми полимери (PLGA). Те са имплантируеми ортопедични материали (Фигура S5)).Последователните изображения на капчиците върху материала, третиран с LOIS, показват, че анти-биообрастващите свойства на LOIS са еднакви за всички субстрати.В допълнение, резултатите от измерванията на CA и SA показват, че незалепващите свойства на LOIS могат да се приложат към други материали.
За да се потвърдят противообрастващите свойства на LOIS, различни видове субстрати (включително голи, ецвани, SHP и LOIS) бяха инкубирани с Pseudomonas aeruginosa и MRSA.Тези две бактерии бяха избрани като представителни болнични бактерии, които могат да доведат до образуването на биофилми, водещи до SSI (37).Фигура 3 (A и B) показва изображенията от флуоресцентен микроскоп и резултатите от измерването на образуващата колония единица (CFU) на субстратите, инкубирани в бактериалната суспензия съответно за кратко (12 часа) и дългосрочно (72 часа).За кратък период от време бактериите ще образуват клъстери и ще нараснат по размер, покривайки се с подобни на слуз вещества и предотвратявайки тяхното отстраняване.По време на 72-часовата инкубация обаче бактериите ще узреят и ще станат лесни за разпръскване, за да образуват повече колонии или клъстери.Следователно може да се счита, че 72-часовата инкубация е дългосрочна и е подходящото време за инкубация за образуване на силен биофилм на повърхността (38).За кратък период от време гравираната повърхност и повърхността на SHP показаха бактериална адхезия, която беше намалена с около 25% до 50% в сравнение с голия субстрат.Въпреки това, поради отличната си ефективност и стабилност срещу биообрастяне, LOIS не показа адхезия на бактериален биофилм в краткосрочен и дългосрочен план.Схематичната диаграма (Фигура 3C) описва обяснението на механизма за антибиологично замърсяване на ецващия разтвор, SHP и LOIS.Предположението е, че ецваният субстрат с хидрофилни свойства ще има по-голяма повърхност от чистия субстрат.Поради това ще се появи повече бактериална адхезия върху гравирания субстрат.Въпреки това, в сравнение с голия субстрат, гравираният субстрат има значително по-малко образуван биофилм на повърхността.Това е така, защото водните молекули се свързват здраво с хидрофилната повърхност и действат като лубрикант за водата, като по този начин пречат на адхезията на бактериите в краткосрочен план (39).Слоят от водни молекули обаче е много тънък и разтворим в бактериални суспензии.Поради това водният молекулярен слой изчезва за дълго време, което води до обширна бактериална адхезия и пролиферация.За SHP, поради неговите краткотрайни свойства на немокрене, бактериалната адхезия се инхибира.Намалената бактериална адхезия може да се дължи на въздушни джобове, уловени в слоестата структура и по-ниска повърхностна енергия, като по този начин се минимизира контактът между бактериалната суспензия и повърхността.Въпреки това се наблюдава обширна бактериална адхезия в SHP, тъй като той губи свойствата си против обрастване за дълго време.Това се дължи главно на изчезването на въздушните джобове поради хидростатичното налягане и разтварянето на въздуха във водата.Това се дължи главно на изчезването на въздушни джобове поради разтваряне и слоестата структура, която осигурява по-голяма повърхност за адхезия (27, 40).За разлика от тези два субстрата, които имат важен ефект върху дългосрочната стабилност, смазочният лубрикант, съдържащ се в LOIS, се инжектира в микро/нано структурата и няма да изчезне дори в дългосрочен план.Лубрикантите, пълни с микро/нано структури, са много стабилни и са силно привлечени от повърхността поради високия си химичен афинитет, като по този начин предотвратяват бактериалната адхезия за дълго време.Фигура S6 показва рефлекторно конфокално микроскопско изображение на влят с лубрикант субстрат, потопен във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS).Непрекъснатите изображения показват, че дори след 120 часа леко разклащане (120 rpm), смазочният слой върху LOIS остава непроменен, което показва дългосрочна стабилност при условия на поток.Това се дължи на високия химичен афинитет между SAM покритието на основата на флуор и лубриканта на основата на перфлуоровъглерод, така че може да се образува стабилен лубрикантен слой.Поради това ефективността против замърсяване се запазва.В допълнение, субстратът е тестван срещу представителни протеини (албумин и фибриноген), които са в плазмата, клетки, тясно свързани с имунната функция (макрофаги и фибробласти), и тези, свързани с образуването на кост.Съдържанието на калций е много високо.(Фигура 3D, 1 и 2 и Фигура S7) (41, 42).В допълнение, изображенията на флуоресцентния микроскоп на теста за адхезия за фибриноген, албумин и калций показват различни характеристики на адхезия на всяка група субстрати (Фигура S8).По време на образуването на кост, новообразуваните костни и калциеви слоеве могат да заобикалят ортопедичния имплант, което не само затруднява отстраняването, но може също така да причини неочаквано увреждане на пациента по време на процеса на отстраняване.Следователно ниските нива на калциеви отлагания върху костните пластини и винтове са полезни за ортопедична хирургия, която изисква отстраняване на импланта.Въз основа на количественото определяне на прикрепената област въз основа на интензитета на флуоресценция и броя на клетките, ние потвърдихме, че LOIS показва отлични свойства срещу биообрастяне за всички биологични вещества в сравнение с други субстрати.Според резултатите от in vitro експерименти, антибиологичното замърсяване LOIS може да се приложи към ортопедични импланти, които могат не само да инхибират инфекции, причинени от бактерии от биофилм, но също така да намалят възпалението, причинено от активната имунна система на тялото.
(A) Флуоресцентни микроскопски изображения на всяка група (голи, гравирани, SHP и LOIS), инкубирани в суспензии на Pseudomonas aeruginosa и MRSA за 12 и 72 часа.(B) Броят на прилепналите CFU на Pseudomonas aeruginosa и MRSA на повърхността на всяка група.(C) Схематична диаграма на механизма за антибиологично замърсяване при краткотрайно и дългосрочно ецване, SHP и LOIS.(D) (1) Броят на фибробластите, прилепнали към всеки субстрат и изображения от флуоресцентен микроскоп на клетките, прилепнали към голото и LOIS.(2) Тест за адхезия на имуносвързани протеини, албумин и калций, участващи в процеса на заздравяване на костите (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 и **** P <0,0001).ns, не е важно.
В случай на неизбежни концентрирани напрежения, механичната издръжливост винаги е била основното предизвикателство за прилагането на антиобрастващи покрития.Традиционните методи с гел против отпадъчни води се основават на полимери с ниска водоразтворимост и крехкост.Поради това те обикновено са податливи на механичен стрес в биомедицинските приложения.Следователно, механично издръжливите противообрастващи покрития остават предизвикателство за приложения като ортопедични импланти (43, 44).Фигура 4A(1) демонстрира двата основни вида напрежение, приложено към ортопедични импланти, включително надраскване (напрежение на срязване) и компресия с оптичното изображение на повредения имплант, произведено от форцепса.Например, когато винтът се затегне с отвертка или когато хирургът държи плътно костната пластина с пинсети и прилага сила на натиск, пластмасовата костна пластина ще бъде повредена и надраскана както на макро, така и на микро/нано скали (Фигура 4A, 2) .За да се тества дали произведеният LOIS може да издържи на тези щети по време на пластична хирургия, беше извършено наноиндентиране, за да се сравни твърдостта на голия субстрат и LOIS в микро/нано скала, за да се изследват механичните свойства на микро/нано структурата Въздействие (Фигура 4B).Схематичната диаграма показва различното поведение на деформация на LOIS поради наличието на микро/нано структури.Беше начертана крива сила-изместване въз основа на резултатите от наноиндентацията (Фигура 4C).Синьото изображение представлява голия субстрат, който показва само лека деформация, както се вижда от максималната дълбочина на вдлъбнатината от 0,26-μm.От друга страна, постепенното увеличаване на силата на наноиндентация и изместването, наблюдавано в LOIS (червена крива), може да покаже признаци на намалени механични свойства, което води до дълбочина на наноиндентация от 1,61 μm.Това е така, защото микро/нано структурата, присъстваща в LOIS, осигурява по-дълбоко пространство за напредък за върха на наноиндентора, така че неговата деформация е по-голяма от тази на голия субстрат.Конста-Гдутос и др.(45) вярва, че поради наличието на наноструктури, наноиндентацията и микро/нано грапавостта водят до неправилни криви на наноиндентация.Защрихованата област съответства на кривата на неправилна деформация, приписвана на наноструктурата, докато незащрихованата зона се приписва на микроструктурата.Тази деформация може да увреди микроструктурата/наноструктурата на задържащия лубрикант и да повлияе отрицателно на неговата ефективност срещу замърсяване.За да се проучи въздействието на увреждането върху LOIS, неизбежното увреждане на микро/нано структурите е възпроизведено в тялото по време на пластична хирургия.Чрез използване на кръвни и протеинови адхезионни тестове може да се определи стабилността на антибиообрастващите свойства на LOIS след in vitro (Фигура 4D).Серия от оптични изображения показва щетите, настъпили близо до дупките на всеки субстрат.Извършен е тест за адхезия на кръвта, за да се демонстрира ефектът от механичното увреждане върху анти-биообрастващото покритие (Фигура 4E).Подобно на SHP, свойствата против обрастване се губят поради повреда, а LOIS показва отлични свойства против обрастване, като отблъсква кръвта.Това е така, защото тъй като повърхностната енергия се задвижва от капилярното действие, покриващо повредената зона, потокът в микроструктурираната смазка възстановява свойствата против замърсяване (35).Същата тенденция се наблюдава при теста за протеинова адхезия с използване на албумин.В увредената зона адхезията на протеин върху повърхността на SHP се наблюдава широко и чрез измерване на нейното покритие на площта може да се определи количествено като половината от нивото на адхезия на голия субстрат.От друга страна, LOIS поддържа своите анти-биообрастващи свойства, без да причинява адхезия (Фигура 4, F и G).В допълнение, повърхността на винта често е подложена на силен механичен стрес, като например пробиване, така че ние проучихме способността на покритието LOIS да остане непокътнато върху винта in vitro.Фигура 4H показва оптични изображения на различни винтове, включително голи, SHP и LOIS.Червеният правоъгълник представлява целевата област, където възниква силен механичен стрес по време на имплантиране на кост.Подобно на теста за протеинова адхезия на плаката, флуоресцентен микроскоп се използва за изобразяване на протеиновата адхезия и измерване на зоната на покритие, за да се докаже целостта на LOIS покритието, дори при силно механично натоварване (Фигура 4, I и J).Обработените с LOIS винтове показват отлична производителност против замърсяване и почти никакъв протеин не полепва по повърхността.От друга страна, протеинова адхезия се наблюдава при голи винтове и SHP винтове, където покритието на площта на SHP винтовете е една трета от това на голите винтове.В допълнение, ортопедичният имплант, използван за фиксиране, трябва да бъде механично здрав, за да издържи напрежението, приложено върху мястото на фрактурата, както е показано на фигура 4K.Поради това беше извършен тест за огъване, за да се определи ефектът от химическата модификация върху механичните свойства.В допълнение, това се прави, за да се поддържа фиксираното напрежение от импланта.Приложете вертикална механична сила, докато имплантът бъде напълно сгънат и се получи крива напрежение-деформация (Фигура 4L, 1).Две свойства, включително модул на Йънг и якост на огъване, бяха сравнени между голи и LOIS субстрати като индикатори за тяхната механична якост (Фигура 4L, 2 и 3).Модулът на Юнг показва способността на материала да издържа на механични промени.Модулът на Юнг за всеки субстрат е съответно 41,48±1,01 и 40,06±0,96 GPa;наблюдаваната разлика е около 3,4%.Освен това се съобщава, че якостта на огъване, която определя издръжливостта на материала, е 102,34±1,51 GPa за голия субстрат и 96,99±0,86 GPa за SHP.Голият субстрат е приблизително 5,3% по-висок.Лекото намаляване на механичните свойства може да се дължи на ефекта на прорезите.При ефекта на прореза микро/нано грапавостта може да действа като набор от прорези, което води до концентрация на локално напрежение и засяга механичните свойства на импланта (46).Въпреки това, въз основа на факта, че се съобщава, че твърдостта на човешката кортикална кост е между 7,4 и 31,6 GPa, а измереният LOIS модул надвишава този на човешката кортикална кост (47), LOIS е достатъчен, за да поддържа фрактурата и цялостната й механичните свойства се влияят минимално от повърхностна модификация.
(A) Схематична диаграма на (1) механичното напрежение, приложено върху ортопедичния имплант по време на операцията, и (2) оптичното изображение на повредения ортопедичен имплант.(B) Схематична диаграма на измерване на наномеханичните свойства чрез наноиндентация и LOIS върху голата повърхност.(C) Крива сила-изместване на наноиндентация на гола повърхност и LOIS.(D) След in vitro експерименти, симулирайте оптичните изображения на различни видове ортопедични пластини (увредената зона е подчертана с червен правоъгълник), за да симулирате механичния стрес, причинен по време на операцията.(E) Тест за кръвна адхезия и (F) тест за протеинова адхезия на повредената група ортопедични пластини.(G) Измерете повърхностното покритие на протеина, прилепнал към плаката.(H) Оптични изображения на различни видове ортопедични винтове след in vitro експеримента.(I) Тест за адхезия на протеин за изследване на целостта на различни покрития.(J) Измерете площта на покритие на протеина, прилепнал към винта.(K) Движението на заека има за цел да генерира фиксирано напрежение върху счупената кост.(L) (1) Резултати от теста за огъване и оптични изображения преди и след огъване.Разликата в (2) модула на Йънг и (3) якостта на огъване между гол имплант и SHP.Данните са изразени като средно ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 и ****P<0,0001).С любезното съдействие на изображението: Kyomin Chae, Университет Йонсей.
В клинични ситуации повечето бактериални контакти с биологични материали и места на рани идват от зрели, зрели биофилми (48).Следователно Центровете за контрол и превенция на заболяванията на САЩ изчисляват, че 65% от всички човешки инфекции са свързани с биофилми (49).В този случай е необходимо да се осигури in vivo експериментален дизайн, който осигурява последователно образуване на биофилм върху повърхността на импланта.Поради това разработихме модел на фрактура на бедрената кост на заек, при който ортопедичните импланти бяха предварително инкубирани в бактериална суспензия и след това имплантирани в бедрени кости на заек, за да се изследват свойствата против замърсяване на LOIS in vivo.Поради следните три важни факта, бактериалните инфекции се предизвикват от предварително култивиране, а не от директно инжектиране на бактериални суспензии: (i) Имунната система на зайците е естествено по-силна от тази на хората;следователно е възможно инжектиране на бактериални суспензии и планктонни бактерии. Няма ефект върху образуването на биофилми.(Ii) Планктонните бактерии са по-податливи на антибиотици и антибиотиците обикновено се използват след операция;накрая, (iii) суспензията от планктонни бактерии може да бъде разредена от телесните течности на животното (50).Чрез предварително култивиране на импланта в бактериална суспензия преди имплантиране, ние можем задълбочено да проучим вредните ефекти от бактериалната инфекция и реакцията на чуждо тяло (FBR) върху процеса на заздравяване на костта.Зайците бяха умъртвени 4 седмици след имплантирането, тъй като остеоинтеграцията, която е от съществено значение за процеса на заздравяване на костите, ще бъде завършена в рамките на 4 седмици.След това имплантите бяха отстранени от зайците за изследвания надолу по веригата.Фигура 5А показва механизма на пролиферация на бактериите.Заразеният ортопедичен имплант се въвежда в тялото.В резултат на предварителна инкубация в бактериална суспензия, шест от шестте заека, имплантирани с голи импланти, са били заразени, докато нито един от зайците, имплантирани с третирани с LOIS импланти, не е бил заразен.Бактериалните инфекции протичат в три стъпки, включително растеж, узряване и дисперсия (51).Първо, прикрепените бактерии се възпроизвеждат и растат на повърхността, а след това бактериите образуват биофилм, когато отделят извънклетъчен полимер (EPS), амилоид и извънклетъчна ДНК.Биофилмът не само пречи на проникването на антибиотиците, но също така насърчава натрупването на ензими, разграждащи антибиотиците (като β-лактамаза) (52).Накрая, биофилмът разпространява зрелите бактерии в околните тъкани.Поради това възниква инфекция.Освен това, когато чуждо тяло навлезе в тялото, инфекция, която може да предизвика силен имунен отговор, може да причини силно възпаление, болка и намален имунитет.Фигура 5B предоставя общ преглед на FBR, причинен от поставянето на ортопедичен имплант, а не на имунния отговор, причинен от бактериална инфекция.Имунната система разпознава поставения имплант като чуждо тяло и след това кара клетките и тъканите да реагират, за да капсулират чуждото тяло (53).В ранните дни на FBR на повърхността на ортопедичните импланти се формира захранваща матрица, което води до адсорбция на фибриноген.След това адсорбираният фибриноген образува силно плътна фибринова мрежа, която подпомага прикрепването на левкоцитите (54).След като се образува фибриновата мрежа, ще настъпи остро възпаление поради инфилтрацията на неутрофили.В този етап се освобождават различни цитокини, като фактор на туморна некроза-α (TNF-α), интерлевкин-4 (IL-4) и IL-β, и моноцитите започват да инфилтрират мястото на имплантиране и да се диференцират в гигантски клетки.Фаг (41, 55, 56).Намаляването на FBR винаги е било предизвикателство, тъй като прекомерният FBR може да причини остро и хронично възпаление, което може да доведе до фатални усложнения.За да се оцени въздействието на бактериалните инфекции в тъканите около голия имплант и LOIS, бяха използвани оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E) и трихром по Masson (MT).При зайци, имплантирани с голи субстрати, тежките бактериални инфекции прогресират и H&E тъканните слайдове ясно показват абсцеси и некрози, причинени от възпаление.От друга страна, изключително силната анти-биообрастваща повърхност LOIS инхибира бактериалната адхезия, така че не показва признаци на инфекция и намалява възпалението (Фигура 5C).Резултатите от МТ оцветяването показват същата тенденция.Въпреки това, оцветяването с МТ също показва оток при зайци, имплантирани с LOIS, което показва, че възстановяването е на път да настъпи (Фигура 5D).За да се изследва степента на имунния отговор, беше извършено имунохистохимично (IHC) оцветяване с помощта на цитокини TNF-α и IL-6, свързани с имунния отговор.Голият отрицателен имплант, който не е бил изложен на бактерии, е сравнен с LOIS, който е бил изложен на бактерии, но не е заразен, за да се изследва лечебният процес при липса на бактериална инфекция.Фигура 5E показва оптично изображение на IHC слайд, който експресира TNF-α.Кафявата област представлява имунния отговор, което показва, че имунният отговор при LOIS е леко намален.В допълнение, експресията на IL-6 в LOIS е значително по-малка от отрицателната експресия на стерилни голи (Фигура 5F).Експресията на цитокин се определя количествено чрез измерване на площта на оцветяване на антитялото, съответстваща на цитокина (Фигура 5G).В сравнение със зайците, изложени на негативните импланти, нивата на експресия на зайците, имплантирани с LOIS, са по-ниски, което показва значителна разлика.Намаляването на експресията на цитокини показва, че дългосрочните, стабилни свойства против замърсяване на LOIS са свързани не само с инхибирането на бактериални инфекции, но също и с намаляването на FBR, което се индуцира от макрофагите, прилепнали към субстрата (53, 57, 58).Следователно намаленият имунен отговор, дължащ се на свойствата на LOIS за избягване на имунитета, може да разреши страничните ефекти след имплантирането, като прекомерен имунен отговор след пластична хирургия.
(A) Схематична диаграма на механизма на образуване и разпространение на биофилм върху повърхността на заразен ортопедичен имплант.еДНК, извънклетъчна ДНК.(B) Схематична диаграма на имунния отговор след поставяне на ортопедичен имплант.(C) H&E оцветяване и (D) MT оцветяване на околните тъкани на ортопедични импланти с гол положителен и LOIS.IHC на имунно-свързаните цитокини (E) TNF-α и (F) IL-6 са оцветени изображения на голи отрицателни и LOIS-имплантирани зайци.(G) Количествено определяне на експресията на цитокини чрез измерване на покритието на площ (** P <0.01).
Биосъвместимостта на LOIS и неговият ефект върху процеса на заздравяване на костите бяха изследвани in vivo с помощта на диагностично изображение [рентгенова и микрокомпютърна томография (CT)] и IHC на остеокласти.Фигура 6А показва процеса на заздравяване на костта, включващ три различни етапа: възпаление, възстановяване и ремоделиране.Когато настъпи фрактура, възпалителните клетки и фибробластите ще проникнат в счупената кост и ще започнат да растат в съдовата тъкан.По време на фазата на възстановяване, врастването на съдовата тъкан се разпространява близо до мястото на фрактурата.Съдовата тъкан осигурява хранителни вещества за образуването на нова кост, която се нарича калус.Последният етап от процеса на заздравяване на костта е етапът на ремоделиране, при който размерът на калуса се намалява до размера на нормалната кост с помощта на повишаване на нивото на активираните остеокласти (59).Триизмерна (3D) реконструкция на мястото на фрактурата беше извършена с помощта на микро-CT сканиране, за да се наблюдават разликите в нивото на образуване на калус във всяка група.Наблюдавайте напречното сечение на бедрената кост, за да наблюдавате дебелината на калуса, заобикалящ счупената кост (Фигура 6, B и C).Рентгеновите лъчи също бяха използвани за изследване на местата на фрактури на всички групи всяка седмица, за да се наблюдават различните процеси на костна регенерация във всяка група (Фигура S9).Калусът и зрелите кости са показани съответно в синьо/зелено и слонова кост.Повечето меки тъкани се филтрират с предварително зададен праг.Голо положително и SHP потвърдиха образуването на малко количество калус около мястото на фрактурата.От друга страна, откритият негатив на LOIS и мястото на фрактурата са заобиколени от дебел калус.Микро-CT изображения показват, че образуването на калус е възпрепятствано от бактериална инфекция и свързано с инфекцията възпаление.Това е така, защото имунната система дава приоритет на лечението на септични наранявания, причинени от възпаление, свързано с инфекция, вместо възстановяване на костите (60).Извършено е оцветяване с IHC и устойчива на тартарат кисела фосфатаза (TRAP), за да се наблюдава активността на остеокластите и костната резорбция (Фигура 6D) (61).Само няколко активирани остеокласти, оцветени в лилаво, бяха открити в голи позитиви и SHP.От друга страна, много активирани остеокласти се наблюдават близо до голите положителни и зрели кости на LOIS.Това явление показва, че в присъствието на остеокласти, калусът около мястото на фрактурата претърпява силен процес на ремоделиране (62).Костният обем и зоната на експресия на остеокластите на калуса бяха измерени, за да се сравни нивото на образуване на калус около мястото на фрактурата във всички групи, така че да се определят количествено микро-CT сканирането и резултатите от IHC (Фигура 6E, 1 и 2).Както се очакваше, голите негативи и образуването на калус в LOIS бяха значително по-високи, отколкото в другите групи, което показва, че е настъпило положително костно ремоделиране (63).Фигура S10 показва оптичното изображение на мястото на операцията, резултата от оцветяването с МТ на тъканта, събрана близо до винта, и резултата от оцветяването с TRAP, подчертаващ интерфейса винт-кост.В голия субстрат се наблюдава силен калус и образуване на фиброза, докато третираният с LOIS имплант показва относително незалепена повърхност.По подобен начин, в сравнение с голите негативи, се наблюдава по-слаба фиброза при зайци, имплантирани с LOIS, както е показано с белите стрелки.В допълнение, твърдият оток (синя стрелка) може да се припише на свойствата на LOIS за избягване на имунитета, като по този начин намалява тежкото възпаление.Незалепващата повърхност около импланта и намалената фиброза предполагат, че процесът на отстраняване е по-лесен, което обикновено води до други фрактури или възпаление.Процесът на заздравяване на костта след отстраняване на винта беше оценен чрез активността на остеокластите в интерфейса винт-кост.Както оголената кост, така и интерфейсът на импланта LOIS абсорбираха подобни нива на остеокласти за по-нататъшно заздравяване на костите, което показва, че покритието LOIS няма отрицателен ефект върху заздравяването на костите или имунния отговор.За да се потвърди, че повърхностната модификация, извършена върху LOIS, не пречи на процеса на заздравяване на костите, беше използвано рентгеново изследване за сравняване на заздравяването на костите на зайците с открити отрицателни йони и 6 седмици имплантиране на LOIS (Фигура 6F).Резултатите показват, че в сравнение с неинфектираната гола положителна група, LOIS показва същата степен на заздравяване на костта и няма очевидни признаци на фрактура (непрекъсната линия на остеолиза) и в двете групи.
(A) Схематична диаграма на процеса на заздравяване на костта след фрактура.(B) Разликата в степента на образуване на калус на всяка повърхностна група и (C) изображението на напречното сечение на мястото на фрактурата.(D) TRAP оцветяване за визуализиране на активността на остеокластите и костната резорбция.Въз основа на активността на TRAP, образуването на външен калус на кортикална кост беше количествено анализирано чрез (E) (1) микро-CT и (2) остеокластна активност.(F) 6 седмици след имплантирането, рентгенови изображения на счупената кост на експонирания негатив (маркиран от червения пунктиран правоъгълник) и LOIS (маркиран от синия пунктиран правоъгълник).Статистическият анализ беше извършен чрез еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Накратко, LOIS осигурява нов тип стратегия за антибактериална инфекция и покритие за имунно спасение за ортопедични импланти.Конвенционалните ортопедични импланти с SHP функционализация показват краткотрайни свойства срещу биообрастяне, но не могат да запазят свойствата си за дълго време.Свръххидрофобността на субстрата улавя въздушни мехурчета между бактериите и субстрата, като по този начин образува въздушни джобове, като по този начин предотвратява бактериална инфекция.Въпреки това, поради дифузията на въздуха, тези въздушни джобове се отстраняват лесно.От друга страна, LOIS е доказал способността си да предотвратява инфекции, свързани с биофилма.Следователно, благодарение на свойствата против отхвърляне на смазващия слой, инжектиран в повърхността на слоеста микро/нано структура, възпалението, свързано с инфекция, може да бъде предотвратено.Различни методи за характеризиране, включително SEM, AFM, XPS и CA измервания, се използват за оптимизиране на производствените условия на LOIS.В допълнение, LOIS може да се приложи и към различни биологични материали, които обикновено се използват в ортопедично оборудване за фиксиране, като PLGA, Ti, PE, POM и PPSU.След това LOIS беше тестван in vitro, за да се докажат неговите анти-биообрастващи свойства срещу бактерии и биологични вещества, свързани с имунния отговор.Резултатите показват, че има отлични антибактериални и антибиообрастващи ефекти в сравнение с чистия имплант.В допълнение, LOIS показва механична здравина дори след прилагане на механично напрежение, което е неизбежно в пластичната хирургия.Благодарение на самовъзстановяващите се свойства на лубриканта върху повърхността на микро/нано структурата, LOIS успешно поддържа своите антибиологични свойства срещу замърсяване.За да се изследват биосъвместимостта и антибактериалните свойства на LOIS in vivo, LOIS се имплантира в бедрената кост на заек за 4 седмици.Не е наблюдавана бактериална инфекция при зайци, имплантирани с LOIS.В допълнение, използването на IHC демонстрира намалено ниво на локален имунен отговор, което показва, че LOIS не инхибира процеса на заздравяване на костите.LOIS проявява отлични антибактериални и имунни свойства и е доказано, че ефективно предотвратява образуването на биофилм преди и по време на ортопедична хирургия, особено за костен синтез.Чрез използване на модел на възпалителна бедрена фрактура на костен мозък на заек, ефектът от инфекциите, свързани с биофилм, върху процеса на заздравяване на костите, предизвикан от предварително инкубирани импланти, беше задълбочено проучен.Като бъдещо проучване е необходим нов in vivo модел за изследване на възможни инфекции след имплантиране, за да се разберат напълно и да се предотвратят инфекции, свързани с биофилма, по време на целия процес на оздравяване.В допълнение, остеоиндукцията все още е неразрешено предизвикателство при интегрирането с LOIS.Необходими са допълнителни изследвания за комбиниране на селективна адхезия на остеоиндуктивни клетки или регенеративна медицина с LOIS, за да се преодолее предизвикателството.Като цяло, LOIS представлява обещаващо покритие за ортопедични импланти с механична устойчивост и отлични свойства срещу биообрастяне, което може да намали SSI и имунните странични ефекти.
Измийте 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS субстрат (Dong Kang M-Tech Co., Корея) в ацетон, EtOH и DI вода за 15 минути, за да отстраните замърсителите.За да се образува структура на микро/нано ниво на повърхността, почистеният субстрат се потапя в 48% до 51% разтвор на HF (DUKSAN Corp., Южна Корея) при 50°C.Времето за ецване варира от 0 до 60 минути.След това гравираният субстрат се почиства с дейонизирана вода и се поставя в 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) разтвор при 50°C за 30 минути, за да се образува пасивиращ слой от хромен оксид върху повърхността.След пасивиране субстратът се измива с дейонизирана вода и се изсушава до получаване на субстрат със слоеста структура.След това субстратът се излага на кислородна плазма (100 W, 3 минути) и веднага се потапя в разтвор от 8.88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Германия) в толуен при стайна температура за 12 часа.След това субстратът, покрит с POTS, се почиства с EtOH и се отгрява при 150 ° C в продължение на 2 часа, за да се получи плътен POTS SAM.След SAM покритие, върху субстрата се образува смазващ слой чрез нанасяне на перфлуорополиетерна смазка (Krytox 101; DuPont, САЩ) с обем на натоварване от 20 μm/cm 2. Преди употреба филтрирайте смазката през 0,2 микронен филтър.Отстранете излишния лубрикант чрез накланяне под ъгъл от 45° за 15 минути.Същата производствена процедура беше използвана за ортопедични импланти, изработени от 304 SS (заключваща плоча и кортикален заключващ винт; Dong Kang M-Tech Co., Корея).Всички ортопедични импланти са проектирани да отговарят на геометрията на бедрената кост на заека.
Повърхностната морфология на субстрата и ортопедичните импланти беше проверена чрез полеви емисии SEM (Inspect F50, FEI, САЩ) и AFM (XE-100, Park Systems, Южна Корея).Грапавостта на повърхността (Ra, Rq) се измерва чрез умножаване на площта от 20 μm по 20 μm (n=4).XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Япония) система, оборудвана с източник на рентгенови лъчи Al Kα с размер на петна от 100 μm2, беше използвана за анализиране на химическия състав на повърхността.Система за измерване на CA, оборудвана с камера за динамично заснемане на изображения (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Южна Корея), беше използвана за измерване на течни CA и SA.За всяко измерване 6 до 10 μl капчици (дейонизирана вода, конска кръв, EG, 30% етанол и HD) се поставят върху повърхността за измерване на CA.Когато ъгълът на наклона на субстрата се увеличава със скорост от 2 ° / s (n = 4), SA се измерва, когато капката падне.
Pseudomonas aeruginosa [Американска колекция от типови култури (ATCC) 27853] и MRSA (ATCC 25923) бяха закупени от ATCC (Манасас, Вирджиния, САЩ) и основната култура беше поддържана при -80°C.Преди употреба, замразената култура се инкубира в размразен с трипсин соев бульон (Komed, Корея) при 37°C в продължение на 18 часа и след това се прехвърля два пъти, за да се активира.След инкубиране, културата се центрофугира при 10 000 rpm за 10 минути при 4°C и се промива два пъти с PBS (рН 7.3) разтвор.След това центрофугираната култура се субкултивира върху плаки с кръвен агар (BAP).MRSA и Pseudomonas aeruginosa се приготвят за една нощ и се култивират в бульон Luria-Bertani.Концентрацията на Pseudomonas aeruginosa и MRSA в инокулума се определя количествено чрез CFU на суспензията в серийни разреждания върху агар.След това регулирайте бактериалната концентрация до 0,5 стандарт на McFarland, което е еквивалентно на 108 CFU/ml.След това разредете работната бактериална суспензия 100 пъти до 106 CFU/ml.За да се тестват антибактериалните адхезионни свойства, субстратът се стерилизира при 121°C за 15 минути преди употреба.След това субстратът се прехвърля в 25 ml бактериална суспензия и се инкубира при 37°С с енергично разклащане (200 rpm) за 12 и 72 часа.След инкубацията, всеки субстрат се отстранява от инкубатора и се промива 3 пъти с PBS, за да се отстранят всякакви плаващи бактерии на повърхността.За да се наблюдава биофилмът върху субстрата, биофилмът се фиксира с метанол и се оцветява с 1 ml кримидин оранжево за 2 минути.След това беше използван флуоресцентен микроскоп (BX51TR, Olympus, Япония), за да се направят снимки на оцветения биофилм.За да се определи количествено биофилмът върху субстрата, прикрепените клетки бяха отделени от субстрата чрез метода на завихряне на мъниста, който се счита за най-подходящия метод за отстраняване на прикрепени бактерии (n = 4).С помощта на стерилни щипци отстранете субстрата от растежната среда и потупайте плочата с ямки, за да отстраните излишната течност.Леко прикрепените клетки се отстраняват чрез промиване два пъти със стерилен PBS.След това всеки субстрат се прехвърля в стерилна епруветка, съдържаща 9 ml 0,1% протеин ept физиологичен разтвор (PSW) и 2 g от 20 до 25 стерилни стъклени перли (0,4 до 0,5 mm в диаметър).След това се разбърква в продължение на 3 минути, за да се отделят клетките от пробата.След разбъркване, суспензията се разрежда серийно 10-кратно с 0.1% PSW и след това 0.1 ml от всяко разреждане се инокулира върху BAP.След 24 часа инкубиране при 37°С, CFU се преброява ръчно.
За клетките бяха използвани миши фибробласти NIH/3T3 (CRL-1658; американски ATCC) и миши макрофаги RAW 264.7 (TIB-71; американски ATCC).Използвайте модифицираната Eagle среда на Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Корея) за култивиране на миши фибробласти и добавете 10% телешки серум (S103-01, Welgene) и 1% пеницилин-стрептомицин (PS; LS202-02, Welgene (Welgene) ). Използвайте DMEM за култивиране на миши макрофаги, допълнен с 10% фетален говежди серум (S001-01, Welgene) и 1% PS. Поставете субстрата в плоча с шест ямки и инокулирайте клетките при 105 клетки/cm2. Клетките се инкубират за една нощ при 37°C и 5% CO2, за оцветяване на клетките, клетките се фиксират с 4% параформалдехид за 20 минути и се поставят в 0,5% Triton X Incubate за 5 минути в -100°С при 37°C за 30 минути.. След процеса на инкубация използвайте фиксираща среда 4',6-диамино-2-фенилиндол (H -1200, Vector Laboratories, UK) (n = 4 на клетка). , флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцианат-албумин (A9771, Sigma-Aldrich, Германия) и човешка плазма Конюгираният с Alexa Fluor 488 фибриноген (F13191, Invitrogen, САЩ) се разтваря в PBS (10 mM, рН 7,4).Концентрациите на албумин и фибриноген са съответно 1 и 150 μg/ml.След субстрата Преди да ги потопите в протеиновия разтвор, изплакнете ги с PBS, за да рехидратирате повърхността.След това потопете всички субстрати в плака с шест гнезда, съдържаща протеиновия разтвор, и инкубирайте при 37°C за 30 и 90 минути.След инкубиране, субстратът се отстранява от протеиновия разтвор, промива се внимателно с PBS 3 пъти и се фиксира с 4% параформалдехид (n = 4 за всеки протеин).За калций, натриев хлорид (0.21 М) и калиев фосфат (3.77 тМ) се разтварят в дейонизирана вода.рН на разтвора се коригира до 2.0 чрез добавяне на разтвор на хидрохлорид (1М).След това калциев хлорид (5.62 тМ) се разтваря в разтвора.Чрез добавяне на 1M трис(хидроксиметил)-амино метанът коригира pH на разтвора до 7,4.Потопете всички субстрати в плака с шест ямки, пълна с 1,5 × разтвор на калциев фосфат и извадете от разтвора след 30 минути.За оцветяване 2 g Alizarin Red S (CI 58005) се смесват със 100 ml дейонизирана вода.След това използвайте 10% амониев хидроксид, за да коригирате рН до 4. Боядисайте субстрата с разтвор на Alizarin Red за 5 минути, след което изтръскайте излишното багрило и попийте.След процеса на разклащане отстранете субстрата.Материалът се дехидратира, след това се потапя в ацетон за 5 минути, след това се потапя в разтвор на ацетон-ксилен (1:1) за 5 минути и накрая се промива с ксилен (n = 4).Използва се флуоресцентен микроскоп (Axio Imager) с лещи на обектив ×10 и ×20..A2m, Zeiss, Германия) изображения на всички субстрати.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) беше използван за количествено определяне на данните за адхезия на биологични вещества във всяка група от четири различни области на изображения.Преобразувайте всички изображения в двоични изображения с фиксирани прагове за сравнение на субстрата.
Използван е конфокален микроскоп Zeiss LSM 700 за наблюдение на стабилността на смазващия слой в PBS в режим на отражение.Базираната на флуор SAM покрита стъклена проба с инжектиран смазващ слой беше потопена в разтвор на PBS и тествана с помощта на орбитален шейкър (SHO-1D; Daihan Scientific, Южна Корея) при условия на леко разклащане (120 rpm).След това вземете пробата и наблюдавайте загубата на лубрикант чрез измерване на загубата на отразена светлина.За да се получат флуоресцентни изображения в режим на отражение, пробата се излага на 633 nm лазер и след това се събира, тъй като светлината ще се отрази обратно от пробата.Пробите се измерват на интервали от време от 0, 30, 60 и 120 часа.
За да се определи влиянието на процеса на повърхностна модификация върху наномеханичните свойства на ортопедичните импланти, за измерване на наноиндендион беше използван наноиндентер (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, САЩ), оборудван с тристранен пирамидален диамантен връх Berkovich.Пиковото натоварване е 10 mN, а площта е 100μmx 100μm.За всички измервания времето за зареждане и разтоварване е 10 s, а времето за задържане при пиково натоварване на вдлъбнатината е 2 s.Направете измервания от пет различни места и вземете средната стойност.За да се оцени представянето на механичната якост при натоварване, беше извършен триточков тест за огъване с помощта на универсална машина за изпитване (Instron 5966, Instron, САЩ).Субстратът се компресира с постоянна скорост от 10 N/s с повишено натоварване.Софтуерната програма Bluehill Universal (n = 3) беше използвана за изчисляване на модула на огъване и максималното напрежение на натиск.
За да се симулира оперативният процес и свързаните с него механични повреди, причинени по време на операцията, оперативният процес беше извършен in vitro.Бедрените кости са събрани от екзекутираните новозеландски бели зайци.Бедрената кост се почиства и фиксира в 4% параформалдехид за 1 седмица.Както е описано в метода за експеримент с животни, фиксираната бедрена кост е оперирана хирургически.След операцията ортопедичният имплант беше потопен в кръв (конска кръв, KISAN, Корея) за 10 s, за да се потвърди дали след прилагането на механичното нараняване са настъпили кръвни сраствания (n = 3).
Общо 24 мъжки новозеландски бели зайци (тегло от 3,0 до 3,5 kg, средна възраст 6 месеца) бяха разделени на случаен принцип в четири групи: голи негативни, голи положителни, SHP и LOIS.Всички процедури, включващи животни, бяха извършени в съответствие с етичните стандарти на Институционалния комитет за грижа и използване на животните (одобрен от IACUC, KOREA-2017-0159).Ортопедичният имплант се състои от заключваща пластина с пет отвора (дължина 41 mm, ширина 7 mm и дебелина 2 mm) и кортикални заключващи винтове (дължина 12 mm, диаметър 2,7 mm) за фиксиране на фрактурата.С изключение на онези плаки и винтове, използвани в групата с голи отрицателни резултати, всички плаки и винтове бяха инкубирани в суспензия на MRSA (106 CFU/ml) в продължение на 12 часа.Голата отрицателна група (n=6) беше третирана с импланти с гола повърхност без излагане на бактериална суспензия, като отрицателна контрола за инфекция.Голата положителна група (n = 6) беше третирана с имплант с гола повърхност, изложен на бактерии като положителна контрола за инфекция.Групата SHP (n = 6) беше лекувана с бактериално изложени SHP импланти.И накрая, групата LOIS беше лекувана с експонирани на бактерии LOIS импланти (n = 6).Всички животни се отглеждат в клетка, осигурени са много храна и вода.Преди операцията зайците са били гладни в продължение на 12 часа.Животните бяха анестезирани чрез интрамускулно инжектиране на ксилазин (5 mg/kg) и интравенозно инжектиране на паклитаксел (3 mg/kg) за индукция.След това подайте 2% изофлуран и 50% до 70% медицински кислород (скорост на потока 2 L/min) през дихателната система, за да поддържате анестезията.Имплантира се чрез директен достъп до страничната бедрена кост.След обезкосмяване и повидон-йодна дезинфекция на кожата е направен разрез с дължина около 6 см от външната страна на лявата средна бедрена кост.Чрез отваряне на празнината между мускулите, покриващи бедрената кост, бедрената кост е напълно разкрита.Поставете пластината пред бедрената кост и я фиксирайте с четири винта.След фиксиране, използвайте трион (1 mm дебелина), за да създадете изкуствено фрактура в областта между втория отвор и четвъртия отвор.В края на операцията раната се промива с физиологичен разтвор и се затваря с конци.Всеки заек се инжектира подкожно с енрофлоксацин (5 mg/kg), разреден една трета във физиологичен разтвор.Следоперативни рентгенови лъчи на бедрената кост бяха направени на всички животни (0, 7, 14, 21, 28 и 42 дни), за да се потвърди остеотомията на костта.След дълбока анестезия, всички животни бяха убити чрез интравенозен KCl (2 mmol/kg) на 28 и 42 дни.След екзекуцията бедрената кост беше сканирана с микро-CT, за да се наблюдава и сравни процеса на заздравяване на костите и образуването на нова кост между четирите групи.
След екзекуцията бяха събрани меките тъкани, които бяха в пряк контакт с ортопедичните импланти.Тъканта се фиксира в 10% неутрален буфериран формалин за една нощ и след това се дехидратира в EtOH.Дехидратираната тъкан се вгражда в парафин и се разделя с дебелина 40 μm с помощта на микротом (400CS; EXAKT, Германия).За да се визуализира инфекцията, бяха извършени H&E оцветяване и MT оцветяване.За да се провери отговорът на гостоприемника, разрезната тъкан се инкубира със заешко анти-TNF-α първично антитяло (AB6671, Abcam, САЩ) и заешко анти-IL-6 (AB6672; Abcam, САЩ) и след това се третира с хрян.Оксидаза.Нанесете системата за оцветяване на авидин-биотин комплекс (ABC) върху срезовете съгласно инструкциите на производителя.За да изглежда като кафяв реакционен продукт, 3,3-диаминобензидин е използван във всички части.Цифров слайд скенер (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Унгария) беше използван за визуализиране на всички срезове и най-малко четири субстрата във всяка група бяха анализирани от софтуера ImageJ.
Направени са рентгенови изображения на всички животни след операцията и всяка седмица, за да се наблюдава зарастването на фрактури (n=6 на група).След екзекуцията беше използвана микро-КТ с висока разделителна способност за изчисляване на образуването на калус около бедрената кост след зарастването.Получената бедрена кост се почиства, фиксира в 4% параформалдехид в продължение на 3 дни и се дехидратира в 75% етанол.След това дехидратираните кости бяха сканирани с помощта на микро-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Канди, Белгия), за да се генерират 3D вокселни изображения (2240 ​​× 2240 пиксела) на костната проба.Използвайте 1,0 mm Al филтър, за да намалите шума на сигнала и да приложите висока разделителна способност към всички сканирания (E = 133 kVp, I = 60 μA, време за интегриране = 500 ms).Софтуерът Nrecon (версия 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Белгия) беше използван за генериране на 3D обем на сканираната проба от получената 2D странична проекция.За анализ, 3D реконструираното изображение се разделя на кубчета 10 mm × 10 mm × 10 mm според мястото на счупване.Изчислете калуса извън кортикалната кост.Софтуерът DataViewer (версия 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Белгия) беше използван за цифрово пренасочване на сканирания обем на костта и софтуерът CT-Analyzer (версия 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Белгия) беше използван за анализ.Относителните коефициенти на рентгенова абсорбция в зряла кост и калус се отличават с тяхната плътност и след това обемът на калуса се определя количествено (n = 4).За да се потвърди, че биосъвместимостта на LOIS не забавя процеса на заздравяване на костите, бяха извършени допълнителни рентгенови лъчи и микро-CT анализ при два заека: голите отрицателни и LOIS групите.И двете групи бяха екзекутирани на 6-та седмица.
Бедрените кости от умъртвени животни се събират и фиксират в 4% параформалдехид в продължение на 3 дни.След това ортопедичният имплант се отстранява внимателно от бедрената кост.Бедрената кост се декалцира в продължение на 21 дни с помощта на 0.5 М EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).След това декалцифицираната бедрена кост се потапя в EtOH, за да се дехидратира.Дехидратираната бедрена кост се отстранява в ксилен и се поставя в парафин.След това пробата се нарязва с автоматичен ротационен микротом (Leica RM2255, Leica Biosystems, Германия) с дебелина 3 μm.За TRAP оцветяване (F6760, Sigma-Aldrich, Германия), нарязаните проби се депарафинизират, рехидратират и инкубират в TRAP реагент при 37°C за 1 час.Изображенията бяха получени с помощта на скенер за слайдове (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Унгария) и количествено определени чрез измерване на покритието на оцветената зона.Във всеки експеримент най-малко четири субстрата във всяка група бяха анализирани от софтуера ImageJ.
Анализът на статистическата значимост беше извършен с помощта на GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., САЩ).Несдвоен t-тест и еднопосочен анализ на дисперсията (ANOVA) бяха използвани за тестване на разликите между групите за оценка.Нивото на значимост е показано на фигурата, както следва: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 и ****P<0,0001;NS, няма съществена разлика.
За допълнителни материали към тази статия, моля, вижте http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Това е статия със свободен достъп, разпространявана съгласно условията на Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, който позволява използването, разпространението и възпроизвеждането във всякакъв носител, стига използването да не е с търговска цел и предпоставката е, че оригиналът работата е правилна.справка.
Забележка: Молим ви само да предоставите имейл адрес, така че лицето, което препоръчвате на страницата, да знае, че искате да види имейла и че имейлът не е спам.Няма да улавяме имейл адреси.
Този въпрос се използва, за да се тества дали сте човек и да се предотврати автоматично изпращане на спам.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Антибактериалните и защитните покрития на ортопедичните импланти могат да намалят инфекциите и имунните реакции, причинени от инфекции.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Антибактериалните и защитните покрития на ортопедичните импланти могат да намалят инфекциите и имунните реакции, причинени от инфекции.
©2021 Американска асоциация за напредък на науката.всички права запазени.AAAS е партньор на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.