עבור חולים שעוברים ניתוח השתלה אורטופדי, זיהומים חיידקיים ותגובות חיסוניות הנגרמות על ידי זיהום היו תמיד סיכונים מסכני חיים.חומרים ביולוגיים קונבנציונליים רגישים לזיהום ביולוגי, הגורם לחיידקים לפלוש לאזור הפגוע ולגרום לזיהום לאחר הניתוח.לכן, קיים צורך דחוף בפיתוח ציפויים נגד זיהום ומילוט חיסוני עבור שתלים אורטופדיים.כאן, פיתחנו טכנולוגיה מתקדמת לשינוי פני השטח עבור שתלים אורטופדיים בשם Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), אשר נוצרה בהשראת המשטח החלק של כדים צמחים.ל-LOIS יש דחיית נוזלים לאורך זמן וחזקה למגוון נוזלים וחומרים ביולוגיים (כולל תאים, חלבונים, סידן וחיידקים).בנוסף, אישרנו את העמידות המכאנית נגד שריטות וכוח קיבוע על ידי הדמיית הנזק הבלתי נמנע במהלך ניתוח במבחנה.המודל של שבר דלקתי של מח עצם ארנב שימש למחקר יסודי של קנה המידה האנטי-ביולוגי והיכולת נגד זיהום של LOIS.אנו רואים בעיני רוחנו ש-LOIS, בעל תכונות נוגדות זיהום ביולוגי ועמידות מכנית, מהווה צעד קדימה בניתוחים אורטופדיים ללא זיהומים.
כיום, עקב ההזדקנות הכללית, גדל מאוד מספר החולים הסובלים ממחלות אורטופדיות (כגון שברים מבוגרים, מחלות מפרקים ניווניות ואוסטיאופורוזיס) (1, 2).לכן, מוסדות רפואיים מייחסים חשיבות רבה לניתוחים אורטופדיים, לרבות השתלות אורטופדיות של ברגים, צלחות, מסמרים ומפרקים מלאכותיים (3, 4).עם זאת, השתלים האורטופדיים המסורתיים דווחו כרגישים להידבקות חיידקית ולהיווצרות ביופילם, שעלולים לגרום לזיהום באתר ניתוח (SSI) לאחר ניתוח (5, 6).ברגע שנוצר הביופילם על פני השתל האורטופדי, הסרת הביופילם הופכת לקשה ביותר גם בשימוש במינונים גדולים של אנטיביוטיקה.לכן, זה בדרך כלל מוביל לזיהומים חמורים לאחר הניתוח (7, 8).בשל הבעיות הנ"ל, הטיפול בשתלים נגועים צריך לכלול ניתוח חוזר, לרבות הסרה של כל השתלים והרקמות שמסביב;לכן, המטופל יסבול מכאבים עזים ומסיכונים מסוימים (9, 10).
כדי לפתור חלק מהבעיות הללו, פותחו שתלים אורטופדיים משחררי תרופות כדי למנוע זיהום על ידי חיסול חיידקים המחוברים למשטח (11, 12).עם זאת, האסטרטגיה עדיין מראה מספר מגבלות.דווח כי השתלה ארוכת טווח של שתלים משחררי תרופות גרמה לנזק לרקמות מסביב וגרמה לדלקת שעלולה להוביל לנמק (13, 14).בנוסף, הממסים האורגניים שעשויים להתקיים לאחר תהליך הייצור של שתלים אורטופדיים משחררי תרופות, האסורים בתכלית האיסור על ידי מנהל המזון והתרופות האמריקאי, דורשים שלבי טיהור נוספים כדי לעמוד בסטנדרטים שלו (15).שתלים משחררי תרופות הם מאתגרים לשחרור מבוקר של תרופות, ובשל העמסת התרופות המוגבלת שלהם, יישום ארוך טווח של התרופה אינו אפשרי (16).
אסטרטגיה נפוצה נוספת היא ציפוי השתל בפולימר נוגד גידולים כדי למנוע היצמדות של חומר ביולוגי וחיידקים למשטח (17).לדוגמה, פולימרים דוטריוניים משכו תשומת לב בשל תכונותיהם הלא-דביקות במגע עם חלבוני פלזמה, תאים וחיידקים.עם זאת, יש לו כמה מגבלות הקשורות ליציבות ארוכת טווח ועמידות מכנית, אשר מעכבות את היישום המעשי שלו בשתלים אורטופדיים, במיוחד בגלל גרידה מכנית במהלך פרוצדורות כירורגיות (18, 19).בנוסף, בשל התאימות הביולוגית הגבוהה שלו, היעדר צורך בניתוח הסרה ותכונות ניקוי פני השטח באמצעות קורוזיה, נעשה שימוש בשתלים אורטופדיים מחומרים מתכלים (20, 21).במהלך קורוזיה, הקשרים הכימיים בין מטריצת הפולימר מתפרקים ומתנתקים מהמשטח, והדבקים מנקים את המשטח.עם זאת, עכירות אנטי-ביולוגית על ידי ניקוי פני השטח יעילה בפרק זמן קצר.בנוסף, רוב החומרים הנספגים לרבות פולי(חומצה חלבית-קופולימר חומצה גליקולית) (PLGA), חומצה פולילקטית (PLA) וסגסוגות מבוססות מגנזיום יעברו פירוק ביולוגי ושחיקה לא אחידים בגוף, מה שישפיע לרעה על היציבות המכנית.(עשרים ושתיים).בנוסף, שברי הלוחות המתכלים מספקים מקום לחיידקים להיצמד, מה שמגביר את הסיכוי לזיהום בטווח הארוך.סיכון זה של השפלה מכנית וזיהום מגביל את היישום המעשי של ניתוחים פלסטיים (23).
משטחים סופר-הידרופוביים (SHP) המחקים את המבנה ההיררכי של עלי הלוטוס הפכו לפתרון פוטנציאלי למשטחים נגד עכירות (24, 25).כאשר משטח ה-SHP טובל בנוזל, בועות אוויר יילכדו, ובכך יוצרות כיסי אוויר ומונעות הידבקות חיידקים (26).עם זאת, מחקרים עדכניים הראו שלמשטח SHP יש חסרונות הקשורים לעמידות מכנית ויציבות ארוכת טווח, מה שמפריע ליישום שלו בשתלים רפואיים.יתרה מכך, כיסי האוויר יתמוססו ויאבדו את תכונות האנטי-עיבוי שלהם, ובכך תגרום להידבקות חיידקית רחבה יותר בשל שטח הפנים הגדול של משטח ה-SHP (27, 28).לאחרונה, אייזנברג ועמיתיו הציגו שיטה חדשנית של ציפוי משטחים נגד זיהום ביולוגי על ידי פיתוח משטח חלק בהשראת צמח הכד של Nepenthes (29, 30).המשטח החלק מראה יציבות ארוכת טווח בתנאים הידראוליים, דוחה נוזלים במיוחד לנוזלים ביולוגיים ובעל תכונות של תיקון עצמי.עם זאת, אין שיטה ליישם ציפוי על שתל רפואי בעל צורה מורכבת, וגם לא הוכחה כתומכת בתהליך הריפוי של רקמה פגועה לאחר ההשתלה.
כאן, אנו מציגים משטח שתל אורטופדי משומן (LOIS), משטח שתל אורטופדי בעל מבנה מיקרו/ננו ובשילוב הדוק עם שכבת סיכה דקה כדי למנוע ממנו להיות קשור לניתוחים פלסטיים זיהומים חיידקיים, כגון קיבוע שברים.מכיוון שהמבנה ברמת מיקרו/ננו ברמת הפלואור מקבע בחוזקה את חומר הסיכה על המבנה, ה-LOIS המפותח יכול לדחות באופן מלא את הידבקותם של נוזלים שונים ולשמור על ביצועי אנטי-התכתשות לאורך זמן.ניתן ליישם ציפויי LOIS על חומרים בצורות שונות המיועדים לסינתזת עצמות.התכונות המצוינות נגד זיהומים ביולוגיים של LOIS נגד חיידקי ביופילם [Pseudomonas aeruginosa ו-Staphylococcus aureus עמידים למתיצילין (MRSA)] וחומרים ביולוגיים (תאים, חלבונים וסידן) אושרו במבחנה.שיעור ההידבקות של הידבקות נרחבת למצע הוא פחות מ-1%.בנוסף, גם לאחר מתרחשת לחץ מכני כגון שריטות פני השטח, הריפוי העצמי הנגרם על ידי חומר הסיכה החודר מסייע בשמירה על תכונותיו האנטי-פולסות.תוצאות בדיקת העמידות המכנית מראות שגם לאחר שינוי מבני וכימי, החוזק הכולל לא יקטן משמעותית.בנוסף, בוצע ניסוי במבחנה המדמה את הלחץ המכני בסביבה הכירורגית כדי להוכיח ש-LOIS יכול לעמוד בלחצים מכניים שונים המתרחשים במהלך ניתוח פלסטי.לבסוף, השתמשנו במודל של שבר עצם הירך in vivo המבוסס על ארנב, שהוכיח של-LOIS יש תכונות אנטיבקטריאליות מעולות ותאימות ביולוגית.תוצאות רדיולוגיות והיסטולוגיות אישרו כי התנהגות יציבה של חומר סיכה ותכונות נוגדות זיהום ביולוגי בתוך 4 שבועות לאחר ההשתלה יכולות להשיג ביצועים יעילים נגד זיהום ובריחה חיסונית מבלי לעכב את תהליך ריפוי העצם.
איור 1A מציג דיאגרמה סכמטית של ה-LOIS שפותח, אשר מושתל עם מבנים בקנה מידה מיקרו/ננו במודל שבר עצם הירך של ארנב כדי לאשר את תכונות העיכול האנטי-ביולוגיות המצוינות שלו ואנטי-זיהום.שיטה ביומימטית מתבצעת כדי לדמות את פני השטח של עציץ מים, ולמנוע זיהום ביולוגי על ידי שילוב שכבת סיכה בתוך מבנה המיקרו/ננו של המשטח.המשטח המוזרק עם חומר סיכה יכול למזער את המגע בין חומרים ביולוגיים למשטח.לכן, בשל היווצרותם של קשרים כימיים יציבים על פני השטח, יש לו ביצועים מצוינים של נוגד גידולים ויציבות לטווח ארוך.כתוצאה מכך, התכונות האנטי-ביופולסיביות של משטח הסיכה מאפשרות יישומים מעשיים שונים במחקר ביו-רפואי.עם זאת, מחקר מקיף על האופן שבו משטח מיוחד זה מקיים אינטראקציה בגוף טרם הושלם.על ידי השוואת LOIS עם מצעים עירומים במבחנה באמצעות אלבומין וחיידקי ביופילם, ניתן לאשר את אי ההדבקות של LOIS (איור 1B).בנוסף, על ידי גלגול טיפות המים על המצע החשוף המשופע ועל מצע ה-LOIS (איור S1 וסרט S1), ניתן להדגים את ביצועי הזיהום הביולוגי.כפי שמוצג בתמונת מיקרוסקופ הקרינה, המצע החשוף שהודגרה בתרחיף של חלבון וחיידקים הראה כמות גדולה של חומר ביולוגי נצמד לפני השטח.עם זאת, בשל תכונותיו המצוינות נגד זיהום ביולוגי, LOIS כמעט ולא מציגה קרינה.על מנת לאשר את תכונותיו האנטי-ביופולריות ואנטי-זיהומיות, LOIS הוחל על פני השטח של שתלים אורטופדיים לסינתזה של עצמות (צלחות וברגים) והונחו בדגם שבר של ארנב.לפני ההשתלה, השתל האורטופדי העירום ו-LOIS הודגרו בתרחיף חיידקי למשך 12 שעות.הדגירה המוקדמת מבטיחה שנוצר ביופילם על פני השתל החשוף לשם השוואה.איור 1C מציג תמונה של מקום השבר 4 שבועות לאחר ההשתלה.בצד שמאל, ארנב עם שתל אורטופדי חשוף הראה רמה חמורה של דלקת עקב היווצרות ביופילם על פני השתל.התוצאה ההפוכה נצפתה בארנבות שהושתלו ב-LOIS, כלומר, הרקמות שמסביב של LOIS לא הראו סימני זיהום ולא סימני דלקת.בנוסף, התמונה האופטית משמאל מציינת את מקום הניתוח של הארנב עם השתל החשוף, מה שמצביע על כך שלא נמצאו דבקים מרובים על פני השתל החשוף על פני ה-LOIS.זה מראה של-LOIS יש יציבות ארוכת טווח ובעלת יכולת לשמור על תכונות העיכול האנטי-ביולוגיות ואנטי-הדבקות שלה.
(א) תרשים סכמטי של LOIS והשתלתו במודל שבר עצם הירך של ארנב.(ב) תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של חלבון וביופילם חיידקי על משטח חשוף ומצע LOIS.4 שבועות לאחר ההשתלה, (C) תמונה מצלמת של מקום השבר ו-(D) תמונת רנטגן (מודגשת במלבן אדום).התמונה באדיבות: Kyomin Chae, אוניברסיטת יונסאי.
הארנבות המעוקרות, שנחשפו לרעה, הראו תהליך ריפוי עצם תקין ללא כל סימני דלקת או זיהום.מצד שני, שתלי SHP שהודגרו מראש בתרחיף חיידקים מציגים דלקת הקשורה לזיהום ברקמות שמסביב.ניתן לייחס זאת לחוסר יכולתו לעכב הידבקות חיידקים במשך זמן רב (איור S2).על מנת להוכיח ש-LOIS אינו משפיע על תהליך הריפוי, אלא מעכב זיהומים אפשריים הקשורים להשתלה, הושוו תמונות רנטגן של המטריצה ​​החיובית החשופה ו-LOIS באתר השבר (איור 1D).צילום הרנטגן של השתל החיובי החשוף הראה קווי אוסטאוליזה מתמשכים, המעידים על כך שהעצם לא נרפאה לחלוטין.זה מצביע על כך שתהליך התאוששות העצם עשוי להתעכב מאוד עקב דלקת הקשורה לזיהום.להיפך, זה הראה שהארנבות שהושתלו ב-LOIS החלימו ולא הראו שום מקום שבר ברור.
על מנת לפתח שתלים רפואיים בעלי יציבות ופונקציונליות ארוכת טווח (כולל עמידות בפני זיהום ביולוגי), נעשו מאמצים רבים.עם זאת, נוכחותם של חומרים ביולוגיים שונים והדינמיקה של הידבקות רקמות מגבילה את התפתחות השיטות האמינות הקלינית שלהם.על מנת להתגבר על החסרונות הללו, פיתחנו מבנה שכבות מיקרו/ננו ומשטח שעבר שינוי כימי, אשר מותאם בשל כוח נימי גבוה וזיקה כימית כדי לשמור על חומר הסיכה החלק ביותר במידה הרבה ביותר.איור 2A מציג את תהליך הייצור הכולל של LOIS.ראשית, הכן מצע נירוסטה רפואית (SS) 304.שנית, מבנה המיקרו/ננו נוצר על מצע ה-SS על ידי תחריט כימי באמצעות תמיסת חומצה הידרופלואורית (HF).על מנת לשחזר את העמידות בפני קורוזיה של SS, משתמשים בתמיסת חומצה חנקתית (HNO3) (31) לעיבוד המצע החרוט.הפסיבציה משפרת את עמידות הקורוזיה של מצע ה-SS ומאטה משמעותית את תהליך הקורוזיה שעלול להפחית את הביצועים הכוללים של LOIS.לאחר מכן, על ידי יצירת מונו-שכבה בהרכבה עצמית (SAM) עם 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane (POTS), המשטח עובר שינוי כימי כדי לשפר את האינטראקציה הכימית בין פני השטח לבין זיקת חומר הסיכה החלק.שינוי פני השטח מפחית באופן משמעותי את אנרגיית פני השטח של המשטח המיוצר בקנה מידה מיקרו/ננו, התואם את אנרגיית פני השטח של חומר הסיכה החלק.זה מאפשר להרטיב את חומר הסיכה לחלוטין, ובכך ליצור שכבת סיכה יציבה על פני השטח.המשטח המשתנה מפגין הידרופוביות מוגברת.התוצאות מראות שחומר הסיכה החלקלק מפגין התנהגות יציבה ב-LOIS בשל הזיקה הכימית הגבוהה והכוח הנימי הנגרמים על ידי מבנה המיקרו/ננו (32, 33).השינויים האופטיים על פני השטח של SS לאחר שינוי פני השטח והזרקת חומר סיכה נחקרו.מבנה השכבות המיקרו/ננו הנוצר על פני השטח עלול לגרום לשינויים חזותיים ולהכהות את פני השטח.תופעה זו מיוחסת להשפעה המוגברת של פיזור האור על פני השטח המחוספסים, המגבירה את ההשתקפות המפוזרת הנגרמת על ידי מנגנון לכידת האור (34).בנוסף, לאחר הזרקת חומר הסיכה, ה-LOIS נעשה כהה יותר.שכבת הסיכה גורמת להחזרת פחות אור מהמצע, ובכך להכהות את ה-LOIS.על מנת לייעל את המיקרו-מבנה/ננו-מבנה כדי להראות את זווית ההזזה הקטנה ביותר (SA) להשגת ביצועים נגד זיהום ביולוגי, נעשה שימוש במיקרוסקופ אלקטרוני סורק (SEM) ובזוגות אטומיים לביצוע זמני תחריט HF שונים (0, 3)., 15 ו-60 דקות) מיקרוסקופ כוח (AFM) (איור 2B).תמונות SEM ו-AFM מראות כי לאחר זמן קצר של תחריט (3 דקות של תחריט), המצע החשוף יצר חספוס לא אחיד בקנה מידה ננו.חספוס פני השטח משתנה עם זמן התחריט (איור S3).העקומה המשתנה בזמן מראה שחספוס פני השטח ממשיך לעלות ומגיע לשיא ב-15 דקות של תחריט, ואז נצפית רק ירידה קלה בערך החספוס ב-30 דקות של תחריט.בשלב זה, החספוס ברמת הננו נחרט, בעוד שהחספוס ברמת המיקרו מתפתח במרץ, מה שהופך את שינוי החספוס ליציב יותר.לאחר תחריט במשך יותר מ-30 דקות, נצפית עלייה נוספת בחספוס, אשר מוסברת בפירוט כדלקמן: SS מורכב מפלדה, סגסוגת עם יסודות כולל ברזל, כרום, ניקל, מוליבדן ואלמנטים רבים אחרים.בין היסודות הללו, ברזל, כרום ומוליבדן ממלאים תפקיד חשוב ביצירת חספוס בקנה מידה מיקרוני/ננו על ה-SS על ידי תחריט HF.בשלבים המוקדמים של קורוזיה, ברזל וכרום נפגעים בעיקר מכיוון שלמוליבדן עמידות בפני קורוזיה גבוהה יותר מאשר מוליבדן.עם התקדמות התחריט, תמיסת התחריט מגיעה לרווית יתר מקומית, ויוצרת פלואורידים ותחמוצות הנגרמים מחריטה.פלואוריד ותחמוצת משקעים ובסופו של דבר מוצבים מחדש על פני השטח, ויוצרים חספוס פני השטח בטווח המיקרון/ננו (31).חספוס זה ברמת המיקרו/ננו ממלא תפקיד חשוב בתכונות הריפוי העצמי של LOIS.המשטח בקנה מידה כפול מייצר אפקט סינרגטי, המגדיל מאוד את הכוח הנימים.תופעה זו מאפשרת לחומר הסיכה לחדור פני השטח בצורה יציבה ותורמת לתכונות הריפוי העצמי (35).היווצרות החספוס תלויה בזמן התחריט.מתחת ל-10 דקות של תחריט, פני השטח מכילים רק חספוס בקנה מידה ננו, שאינו מספיק כדי להחזיק מספיק חומר סיכה כדי שתהיה לו עמידות בפני גידול ביולוגי (36).מצד שני, אם זמן הצריבה יעלה על 30 דקות, החספוס בקנה מידה ננו הנוצר מהשקעת ברזל וכרום מחדש ייעלם, ורק החספוס בקנה מידה מיקרו יישאר בגלל מוליבדן.המשטח החרוט יתר על המידה חסר חספוס בקנה מידה ננו ומאבד את ההשפעה הסינרגטית של חספוס דו-שלבי, מה שמשפיע לרעה על מאפייני הריפוי העצמי של LOIS.מדידות SA בוצעו על מצעים עם זמני תחריט שונים כדי להוכיח ביצועים נגד עכירות.סוגים שונים של נוזלים נבחרו בהתבסס על צמיגות ואנרגיית פני השטח, כולל מים מופחתים (DI), דם, אתילן גליקול (EG), אתנול (EtOH) והקסדקאן (HD) (איור S4).דפוס התחריט המשתנה בזמן מראה שלנוזלים שונים עם אנרגיות פנים וצמיגות שונות, ה-SA של LOIS לאחר 15 דקות של תחריט הוא הנמוך ביותר.לכן, LOIS מותאם לחריטה למשך 15 דקות ליצירת חספוס בקנה מידה מיקרוני וננו, המתאים לשמירה יעילה על עמידות חומר הסיכה ותכונות אנטי עכירות מצוינות.
(א) תרשים סכמטי של תהליך הייצור בן ארבעת השלבים של LOIS.התוספת מציגה את ה-SAM שנוצר על המצע.(ב) תמונות SEM ו-AFM, המשמשות למיטוב מבנה המיקרו/ננו של המצע בזמני תחריט שונים.ספקטרוסקופיה של צילומי רנטגן (XPS) של (C) Cr2p ו- (D) F1s לאחר פסיבציה של פני השטח וציפוי SAM.au, יחידה שרירותית.(ה) תמונות מייצגות של טיפות מים על מצעים חשופים, חרוטים, SHP ו-LOIS.(ו) מדידת זווית המגע (CA) ו-SA של נוזלים עם מתחי פנים שונים ב-SHP ו-LOIS.הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD.
לאחר מכן, על מנת לאשר את השינוי בתכונות הכימיות של פני השטח, נעשה שימוש בספקטרוסקופיה של פוטואלקטרון רנטגן (XPS) כדי לחקור את השינוי בהרכב הכימי של פני המצע לאחר כל ציפוי משטח.איור 2C מציג את תוצאות מדידת XPS של המשטח החרוט ב-HF והמשטח שטופל ב-HNO 3.ניתן לייחס את שני השיאים העיקריים ב-587.3 ו-577.7 eV לקשר Cr-O הקיים בשכבת תחמוצת הכרום, שהוא ההבדל העיקרי מהמשטח החרוט ב-HF.זה נובע בעיקר מצריכת ברזל וכרום פלואוריד על פני השטח על ידי HNO3.התחריט מבוסס HNO3 מאפשר לכרום ליצור שכבת תחמוצת פסיבית על פני השטח, מה שהופך את ה-SS החרוט שוב ​​לעמיד בפני קורוזיה.באיור 2D התקבלו ספקטרום XPS כדי לאשר שסילאן מבוסס פלואורו-פחמן נוצר על פני השטח לאחר ציפוי SAM, בעל דחיית נוזלים גבוהה במיוחד אפילו עבור EG, דם ו-EtOH.ציפוי SAM הושלם על ידי תגובה של קבוצות פונקציונליות של סילאן עם קבוצות הידרוקסיל שנוצרו על ידי טיפול בפלזמה.כתוצאה מכך, נצפתה עלייה משמעותית בפסגות CF2 ו-CF3.אנרגיית הקישור בין 286 ל-296 eV מצביעה על כך שהשינוי הכימי הושלם בהצלחה על ידי ציפוי SAM.SHP מציג פסגות גדולות יחסית של CF2 (290.1 ​​eV) ו-CF3 (293.3 eV), הנגרמות על ידי סילאן על בסיס פלואורו-פחמן שנוצר על פני השטח.איור 2E מציג תמונות אופטיות מייצגות של מדידות זווית מגע (CA) עבור קבוצות שונות של מים מופחתים במגע עם חשופים, חרוטים, SHP ו-LOIS.תמונות אלו מראות שהמשטח החרוט הופך להידרופילי בגלל מבנה המיקרו/ננו שנוצר על ידי תחריט כימי, כך שהמים המנוזלים נספגים במבנה.עם זאת, כאשר המצע מצופה ב-SAM, המצע מפגין דחיית מים חזקה, ולכן נוצר SHP משטח ושטח המגע בין המים למשטח קטן.לבסוף, נצפתה ירידה ב-CA ב-LOIS, אותה ניתן לייחס לחדירת חומר סיכה לתוך המיקרו-מבנה, ובכך להגדיל את שטח המגע.על מנת להוכיח שלמשטח יש דוחי נוזלים מצוינים ותכונות לא הדבקות, ה-LOIS הושווה למצע ה-SHP על ידי מדידת CA ו-SA באמצעות נוזלים שונים (איור 2F).סוגים שונים של נוזלים נבחרו בהתבסס על צמיגות ואנרגיית פני השטח, כולל מים מופחתים, דם, EG, EtOH ו-HD (איור S4).תוצאות מדידת CA מראות שכאשר CA נוטה ל-HD, ערך ההפחתה של CA, כאשר CA הוא בעל אנרגיית השטח הנמוכה ביותר.בנוסף, ה-LOIS של CA הכולל נמוך.עם זאת, מדידת ה-SA מראה תופעה שונה לחלוטין.מלבד המים המיוננים, כל הנוזלים נצמדים למצע ה-SHP מבלי להחליק.מצד שני, LOIS מראה SA נמוך מאוד, כאשר כאשר כל הנוזל מוטה בזווית נמוכה מ-10° עד 15°, כל הנוזל יתגלגל.זה מראה היטב כי חוסר ההדבקה של LOIS טובה יותר מזו של משטח SHP.בנוסף, ציפויי LOIS מיושמים גם על סוגים שונים של חומרים, כולל טיטניום (Ti), פוליפנילסולפון (PPSU), פוליאוקסימתילן (POM), פוליאתר אתר קטון (PEEK) ופולימרים נספגים ביולוגיים (PLGA), הם חומרים אורטופדיים הניתנים להשתלה (איור S5)).התמונות הרציפות של הטיפות על החומר שטופל על ידי LOIS מראות שתכונות האנטי-ביופול של LOIS זהות בכל המצעים.בנוסף, תוצאות המדידה של CA ו-SA מראות שניתן ליישם את התכונות הלא-דביקות של LOIS על חומרים אחרים.
על מנת לאשר את תכונות האנטי-עיבוי של LOIS, סוגים שונים של מצעים (כולל חשופים, חרוטים, SHP ו-LOIS) הודגרו עם Pseudomonas aeruginosa ו-MRSA.שני חיידקים אלו נבחרו כחיידקי בית חולים מייצגים, מה שעלול להוביל להיווצרות ביופילם, המוביל ל-SSI (37).איור 3 (A ו-B) מציג את תמונות מיקרוסקופ הקרינה ותוצאות המדידה של יחידת יצירת המושבה (CFU) של המצעים המודגרים בתרחיף החיידקים לטווח קצר (12 שעות) ולטווח ארוך (72 שעות), בהתאמה.תוך פרק זמן קצר, חיידקים יווצרו מקבצים ויגדלו בגודלם, יתכסו בחומרים דמויי ריר וימנעו את סילוקם.עם זאת, במהלך הדגירה של 72 שעות, החיידקים יתבגרו ויהיה קל להתפזר ליצירת מושבות או אשכולות נוספים.לכן, ניתן לשקול שדגירה של 72 שעות היא לטווח ארוך והיא זמן הדגירה המתאים ליצירת ביופילם חזק על פני השטח (38).בפרק זמן קצר, המשטח החרוט ומשטח ה-SHP הפגינו הידבקות חיידקית, שהופחתה בכ-25% עד 50% בהשוואה למצע החשוף.עם זאת, בשל הביצועים והיציבות המצוינים שלה נגד זיהום ביולוגי, LOIS לא הראתה הידבקות ביופילם חיידקי בטווח הקצר והארוך.הדיאגרמה הסכמטית (איור 3C) מתארת ​​את ההסבר של מנגנון העיכול האנטי-ביולוגי של תמיסת התחריט, SHP ו-LOIS.ההנחה היא שלמצע החרוט בעל תכונות הידרופיליות יהיה שטח פנים גדול יותר מהמצע החשוף.לכן, יותר הידבקות חיידקית תתרחש על המצע החרוט.עם זאת, בהשוואה למצע החשוף, למצע החרוט נוצר באופן משמעותי פחות ביופילם על פני השטח.הסיבה לכך היא שמולקולות מים נקשרות בחוזקה למשטח ההידרופילי ופועלות כחומר סיכה למים, ובכך מפריעות להיצמדות של חיידקים בטווח הקצר (39).עם זאת, שכבת מולקולות המים דקה מאוד ומסיסה בתרחפי חיידקים.לכן, השכבה המולקולרית של המים נעלמת לזמן רב, מה שמוביל להידבקות חיידקים וריבוי נרחבים.עבור SHP, בשל תכונותיו הקצרות שאינן הרטבות, הידבקות חיידקים מעוכבת.ניתן לייחס את ההידבקות החיידקית המופחתת לכיסי אוויר הכלואים במבנה השכבתי ולאנרגיית פני השטח הנמוכים יותר, ובכך למזער את המגע בין תרחיף החיידק למשטח.עם זאת, הידבקות חיידקית נרחבת נצפתה ב-SHP מכיוון שהוא איבד את תכונותיו האנטי-התכלותיות במשך זמן רב.הדבר נובע בעיקר מהיעלמותם של כיסי אוויר עקב לחץ הידרוסטטי והתמוססות האוויר במים.הדבר נובע בעיקר מהיעלמותם של כיסי אוויר עקב התמוססות ומבנה השכבות המספק שטח פנים גדול יותר להדבקה (27, 40).בשונה משני המצעים הללו שיש להם השפעה חשובה על יציבות ארוכת טווח, חומר הסיכה המשמן הכלול ב-LOIS מוזרק למבנה המיקרו/ננו ולא ייעלם גם בטווח הארוך.חומרי סיכה מלאים במבני מיקרו/ננו יציבים מאוד ונמשכים מאוד אל פני השטח בשל הזיקה הכימית הגבוהה שלהם, ובכך מונעים הידבקות חיידקים לאורך זמן.איור S6 מראה תמונת מיקרוסקופ קונפוקאלי השתקפות של מצע מושרה בחומרי סיכה טבול במי מלח מאוחסן פוספט (PBS).תמונות רציפות מראות שגם לאחר 120 שעות של רעד קל (120 סל"ד), שכבת חומר הסיכה על ה-LOIS נשארת ללא שינוי, מה שמעיד על יציבות ארוכת טווח בתנאי זרימה.הסיבה לכך היא הזיקה הכימית הגבוהה בין ציפוי SAM על בסיס פלואור לבין חומר הסיכה על בסיס פרפלואורו-פחמן, כך שניתן ליצור שכבת חומר סיכה יציבה.לכן, הביצועים נגד זיהום נשמרים.בנוסף, המצע נבדק כנגד חלבונים מייצגים (אלבומין ופיברינוגן), הנמצאים בפלזמה, תאים הקשורים באופן הדוק לתפקוד החיסון (מקרופאגים ופיברובלסטים), וכאלה הקשורים ליצירת עצם.תכולת הסידן גבוהה מאוד.(איור 3D, 1 ו-2, ואיור S7) (41, 42).בנוסף, תמונות מיקרוסקופ הקרינה של בדיקת ההידבקות לפיברינוגן, אלבומין וסידן הראו מאפייני הידבקות שונים של כל קבוצת מצע (איור S8).במהלך היווצרות העצם, שכבות עצם וסידן שזה עתה נוצרו עשויות להקיף את השתל האורטופדי, מה שלא רק מקשה על ההסרה, אלא גם עלול לגרום לנזק בלתי צפוי למטופל במהלך תהליך ההסרה.לכן, רמות נמוכות של משקעי סידן על לוחות העצם והברגים מועילות לניתוחים אורטופדיים הדורשים הסרת שתלים.בהתבסס על כימות השטח המצורף בהתבסס על עוצמת הקרינה וספירת התאים, אישרנו ש-LOIS מראה תכונות אנטי-ביולוגיות מצוינות עבור כל החומרים הביולוגיים בהשוואה למצעים אחרים.על פי תוצאות ניסויים במבחנה, ניתן ליישם את העיבוי האנטי-ביולוגי LOIS על שתלים אורטופדיים, שיכולים לא רק לעכב זיהומים הנגרמים על ידי חיידקי ביופילם, אלא גם להפחית דלקות הנגרמות על ידי מערכת החיסון הפעילה של הגוף.
(א) תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של כל קבוצה (עירומה, חרוטה, SHP ו-LOIS) שהודגרו ב-Pseudomonas aeruginosa ו-MRSA השעיות למשך 12 ו-72 שעות.(ב) מספר ה-CFU הנצמדים של Pseudomonas aeruginosa ו-MRSA על פני השטח של כל קבוצה.(ג) דיאגרמה סכמטית של מנגנון העיכול האנטי-ביולוגי של תחריט לטווח קצר ולטווח ארוך, SHP ו-LOIS.(ד) (1) מספר הפיברובלסטים הדבוקים לכל מצע ותמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של התאים הדבוקים לחשוף ול-LOIS.(2) בדיקת הידבקות של חלבונים הקשורים למערכת החיסון, אלבומין וסידן המעורבים בתהליך ריפוי העצם (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 ו-**** P <0.0001).ns, לא חשוב.
במקרה של מתחים מרוכזים בלתי נמנעים, עמידות מכנית תמיד הייתה האתגר העיקרי ליישום ציפויים אנטי-פולינג.שיטות ג'ל מסורתיות נגד שפכים מבוססות על פולימרים בעלי מסיסות ושבריריות נמוכה במים.לכן, הם בדרך כלל רגישים ללחץ מכני ביישומים ביו-רפואיים.לכן, ציפויים אנטי-פופולרי עמידים מבחינה מכנית נותרים אתגר עבור יישומים כגון שתלים אורטופדיים (43, 44).איור 4A(1) מדגים את שני סוגי הלחץ העיקריים המופעלים על שתלים אורטופדיים, כולל גירוד (לחץ גזירה) ודחיסה עם התמונה האופטית של השתל הפגוע המיוצר על ידי המלקחיים.לדוגמה, כאשר מהדקים את הבורג עם מברג, או כאשר המנתח מחזיק בחוזקה את לוחית העצם בפינצטה ומפעיל כוח לחיצה, לוחית העצם הפלסטית תיפגע ותישרט הן בסולם המאקרו והן במיקרו/ננו (איור 4A, 2) .על מנת לבדוק האם ה-LOIS המיוצר יכול לעמוד בפני נזקים אלו במהלך ניתוחים פלסטיים, בוצעה ננו-indentation כדי להשוות את הקשיות של המצע החשוף וה-LOIS בסולם המיקרו/ננו כדי לחקור את התכונות המכניות של השפעת מבנה המיקרו/ננו (איור 4ב).הדיאגרמה הסכמטית מציגה את התנהגות העיוות השונה של LOIS עקב נוכחותם של מבנים מיקרו/ננו.עקומת תזוזה של כוח שורטטה על סמך תוצאות הננו-חיתוך (איור 4C).התמונה הכחולה מייצגת את המצע החשוף, שמראה רק דפורמציה קלה, כפי שניתן לראות על ידי עומק השקע המרבי של 0.26 מיקרומטר.מצד שני, העלייה ההדרגתית בכוח הננואינדנטציה ובתזוזה הנצפית ב-LOIS (עקומה אדומה) עשויה להראות סימנים של תכונות מכניות מופחתות, וכתוצאה מכך עומק ננו-חריץ של 1.61μm.הסיבה לכך היא שמבנה המיקרו/ננו הקיים ב-LOIS מספק מרחב התקדמות עמוק יותר לקצה הננו-אינדנטר, ולכן העיוות שלו גדול מזה של המצע החשוף.Konsta-Gdoutos et al.(45) סבור כי בשל נוכחותם של מבנים ננו, ננו-אינדנטציה וחספוס מיקרו/ננו מובילים לעיקומות ננו-ננו לא סדירות.האזור המוצל מתאים לעקומת העיוות הבלתי סדירה המיוחסת לננו-מבנה, בעוד שהאזור הלא-מוצל מיוחס למיקרו-מבנה.דפורמציה זו עלולה לפגוע במבנה המיקרו/ננו של חומר הסיכה המחזיק ולהשפיע לרעה על ביצועי האנטי-עיבוי שלו.על מנת לחקור את השפעת הנזק על LOIS, נזק בלתי נמנע למבני מיקרו/ננו שוכפל בגוף במהלך ניתוח פלסטי.על ידי שימוש בבדיקות הידבקות לדם ולחלבון, ניתן לקבוע את היציבות של תכונות נוגדות הזיהום הביולוגי של LOIS לאחר in vitro (איור 4D).סדרה של תמונות אופטיות מציגה את הנזק שהתרחש ליד החורים של כל מצע.בוצעה בדיקת היצמדות לדם כדי להדגים את ההשפעה של נזק מכני על הציפוי נגד זיהום ביולוגי (איור 4E).בדומה ל-SHP, תכונות האנטי-עיבוי אובדות עקב נזק, ו-LOIS מציגה תכונות אנטי-פouling מצוינות על-ידי דחיית דם.הסיבה לכך היא שבגלל שאנרגיית פני השטח מונעת על ידי פעולת הנימיות המכסה את האזור הפגוע, הזרימה בחומר הסיכה המיקרו-מובנית משחזרת את תכונות האנטי-עיבוי (35).אותה מגמה נצפתה בבדיקת היצמדות חלבון באמצעות אלבומין.באזור הפגוע, ההדבקה של חלבון על פני השטח של SHP נצפה באופן נרחב, ועל ידי מדידת כיסוי השטח שלו, ניתן לכמת אותה כמחצית מרמת ההידבקות של המצע החשוף.מצד שני, LOIS שמרה על תכונותיה האנטי-ביו-פולסי מבלי לגרום להדבקה (איור 4, F ו-G).בנוסף, פני השטח של הבורג נתונים לרוב ללחץ מכני חזק, כמו קידוח, ולכן למדנו את היכולת של ציפוי LOIS להישאר שלם על הבורג במבחנה.איור 4H מציג תמונות אופטיות של ברגים שונים, כולל חשופים, SHP ו-LOIS.המלבן האדום מייצג את אזור המטרה שבו מתרחש מתח מכני חזק במהלך השתלת עצם.בדומה לבדיקת הידבקות החלבון של הצלחת, נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין את הידבקות החלבון ולמדוד את אזור הכיסוי כדי להוכיח את שלמות ציפוי ה-LOIS, אפילו תחת לחץ מכני חזק (איור 4, I ו-J).הברגים המטופלים ב-LOIS מציגים ביצועים מצוינים נגד עכירות, וכמעט שאין חלבון נדבק למשטח.מצד שני, נצפתה הידבקות חלבון בברגים חשופים ובברגי SHP, כאשר כיסוי השטח של ברגי SHP היה שליש מזה של ברגים חשופים.בנוסף, השתל האורטופדי המשמש לקיבוע חייב להיות חזק מבחינה מכנית כדי לעמוד בלחץ המופעל על מקום השבר, כפי שמוצג באיור 4K.לכן, בוצעה בדיקת כיפוף לקביעת השפעת השינוי הכימי על תכונות מכניות.בנוסף, הדבר נעשה כדי לשמור על הלחץ הקבוע מהשתל.הפעל כוח מכני אנכי עד שהשתל מתקפל במלואו ותתקבל עקומת מתח-מתח (איור 4L, 1).שני מאפיינים הכוללים את המודולוס של יאנג וחוזק הכיפוף הושוו בין מצעים חשופים ל-LOIS כאינדיקטורים לחוזק המכני שלהם (איור 4L, 2 ו-3).המודולוס של יאנג מציין את יכולתו של חומר לעמוד בשינויים מכניים.מודול ה-Young של כל מצע הוא 41.48±1.01 ו-40.06±0.96 GPa, בהתאמה;ההבדל הנצפה הוא כ-3.4%.בנוסף, מדווח כי חוזק הכיפוף, הקובע את קשיחות החומר, הוא 102.34±1.51 GPa עבור המצע החשוף ו-96.99±0.86 GPa עבור SHP.המצע החשוף גבוה בכ-5.3%.הירידה הקלה בתכונות המכניות עשויה להיגרם על ידי אפקט החריץ.באפקט החריץ, החספוס המיקרו/ננו עשוי לפעול כסט של חריצים, המוביל לריכוז מתח מקומי ומשפיע על התכונות המכניות של השתל (46).עם זאת, בהתבסס על העובדה שהנוקשות של עצם קליפת המוח האנושית היא בין 7.4 ל-31.6 GPa, ומודול ה-LOIS הנמדד עולה על זה של עצם קליפת המוח האנושית (47), ה-LOIS מספיק כדי לתמוך בשבר ובסך הכל שלו. תכונות מכניות מושפעות באופן מינימלי משינוי פני השטח.
(א) תרשים סכמטי של (1) הלחץ המכני המופעל על השתל האורטופדי במהלך הניתוח, ו-(2) התמונה האופטית של השתל האורטופדי הפגוע.(ב) דיאגרמה סכמטית של מדידת תכונות ננו-מכניות על ידי ננואינדנטציה ו-LOIS על פני השטח החשוף.(ג) עקומת כוח תזוזה של ננו-חריץ של משטח חשוף ו-LOIS.(ד) לאחר ניסויים במבחנה, הדמיית תמונות אופטיות של סוגים שונים של לוחות אורטופדיים (האזור הפגוע מודגש במלבן אדום) כדי לדמות את הלחץ המכני הנגרם במהלך הניתוח.(ה) בדיקת היצמדות לדם ו-(F) בדיקת הידבקות חלבון של קבוצת הצלחות האורטופדיות הפגומות.(ז) מדוד את כיסוי השטח של החלבון הנצמד לצלחת.(ח) תמונות אופטיות של סוגים שונים של ברגים אורטופדיים לאחר הניסוי במבחנה.(I) בדיקת הידבקות חלבון ללימוד שלמות ציפויים שונים.(י) מדוד את כיסוי השטח של החלבון הנצמד לבורג.(יא) תנועת הארנב נועדה ליצור לחץ קבוע על העצם השבורה.(L) (1) תוצאות בדיקת כיפוף ותמונות אופטיות לפני ואחרי כיפוף.ההבדל ב(2) מודול יאנג ו(3) חוזק כיפוף בין שתל חשוף ל-SHP.הנתונים מבוטאים כממוצע ± SD (*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 ו-****P<0.0001).התמונה באדיבות: Kyomin Chae, אוניברסיטת יונסאי.
במצבים קליניים, רוב המגע של חיידקים עם חומרים ביולוגיים ואתרי פצע מגיע מביופילם בוגר ובוגר (48).לפיכך, המרכז האמריקאי לבקרת מחלות ומניעתן מעריך כי 65% מכלל הזיהומים בבני אדם קשורים לביופילם (49).במקרה זה, יש צורך לספק עיצוב ניסיוני in vivo המספק היווצרות ביופילם עקבי על פני השתל.לכן, פיתחנו מודל של שבר עצם הירך של ארנב שבו השתלים אורטופדיים הודגרו מראש בתרחיף חיידקי ולאחר מכן הושתלו בירכי הירך של ארנב כדי לחקור את תכונות האנטי-עיבוי של LOIS in vivo.בשל שלוש העובדות החשובות הבאות, זיהומים חיידקיים נגרמות על ידי תרבית קדם ולא הזרקה ישירה של תרחיפים חיידקיים: (i) המערכת החיסונית של ארנבות חזקה יותר באופן טבעי מזו של בני אדם;לכן, הזרקה של תרחיפים חיידקיים וחיידקים פלנקטוניים אפשרית. אין לזה השפעה על היווצרות ביופילמים.(II) חיידקים פלנקטוניים רגישים יותר לאנטיביוטיקה, ובדרך כלל משתמשים באנטיביוטיקה לאחר ניתוח;לבסוף, (iii) תרחיף החיידקים הפלנקטוני עשוי להיות מדולל על ידי נוזלי הגוף של החיה (50).על ידי תרבית מראש של השתל בתרחיף חיידקי לפני ההשתלה, נוכל לחקור ביסודיות את ההשפעות המזיקות של זיהום חיידקי ותגובת גוף זר (FBR) על תהליך ריפוי העצם.הארנבות הוקרבו 4 שבועות לאחר ההשתלה, מכיוון שהאוסאואינטגרציה החיונית לתהליך ריפוי העצם תושלם תוך 4 שבועות.לאחר מכן, השתלים הוסרו מהארנבים למחקרים במורד הזרם.איור 5A מציג את מנגנון ההתפשטות של חיידקים.השתל האורטופדי הנגוע מוחדר לגוף.כתוצאה מהדגירה מוקדמת בתרחיף חיידקים, שש מתוך ששת הארנבות שהושתלו בשתלים עירומים נדבקו, בעוד שאף אחת מהארנבות שהושתלו בשתלים שטופלו ב-LOIS לא נדבקה.זיהומים חיידקיים מתקדמים בשלושה שלבים, כולל גדילה, התבגרות ופיזור (51).ראשית, החיידקים המחוברים מתרבים וגדלים על פני השטח, ולאחר מכן החיידקים יוצרים ביופילם כאשר הם מפרישים פולימר חוץ-תאי (EPS), עמילואיד ו-DNA חוץ-תאי.ביופילם לא רק מפריע לחדירת אנטיביוטיקה, אלא גם מקדם הצטברות של אנזימים מפרקי אנטיביוטיקה (כגון β-lactamase) (52).לבסוף, הביופילם מפיץ את החיידקים הבוגרים אל הרקמות שמסביב.לכן, זיהום מתרחש.בנוסף, כאשר גוף זר חודר לגוף, זיהום שעלול לגרום לתגובה חיסונית חזקה עלול לגרום לדלקת חמורה, כאב וירידה בחסינות.איור 5B מספק סקירה כללית של ה-FBR שנגרם על ידי החדרת שתל אורטופדי, במקום התגובה החיסונית הנגרמת על ידי זיהום חיידקי.המערכת החיסונית מזהה את השתל המוחדר כגוף זר, ולאחר מכן גורמת לתאים ולרקמות להגיב כדי לעטוף את הגוף הזר (53).בימים הראשונים של FBR נוצרה מטריצת אספקה ​​על פני השטח של שתלים אורטופדיים, שהביאה לספיחת פיברינוגן.הפיברינוגן הנספג יוצר אז רשת פיברין צפופה מאוד, אשר מקדמת את ההתקשרות של לויקוציטים (54).לאחר יצירת רשת הפיברין, תתרחש דלקת חריפה עקב חדירת נויטרופילים.בשלב זה משתחררים מגוון ציטוקינים כמו tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) ו-IL-β, ומונוציטים מתחילים לחדור לאתר ההשתלה ולהתמיין לתאי ענק.פאג' (41, 55, 56).הפחתת FBR תמיד הייתה אתגר מכיוון שעודף FBR עלול לגרום לדלקת חריפה וכרונית, שעלולה להוביל לסיבוכים קטלניים.על מנת להעריך את ההשפעה של זיהומים חיידקיים ברקמות המקיפות את השתל החשוף ו-LOIS, נעשה שימוש בצביעה של המטוקסילין ואאוזין (H&E) ו-Masson trichrome (MT).עבור ארנבות שהושתלו עם מצעים חשופים, זיהומים חיידקיים חמורים התקדמו, ושקופיות רקמות H&E הראו בבירור מורסות ונמק שנגרמו על ידי דלקת.מצד שני, משטח ה-LOIS האנטי-ביולוגי החזק במיוחד מעכב הידבקות חיידקים, כך שהוא אינו מראה סימני זיהום ומפחית דלקת (איור 5C).התוצאות של צביעת MT הראו את אותה מגמה.עם זאת, צביעת MT הראתה גם בצקת בארנבות שהושתלו ב-LOIS, מה שמצביע על כך שהחלמה עומדת להתרחש (איור 5D).על מנת לחקור את מידת התגובה החיסונית, בוצעה צביעה אימונוהיסטוכימית (IHC) באמצעות ציטוקינים TNF-α ו-IL-6 הקשורים לתגובה חיסונית.שתל שלילי עירום שלא נחשף לחיידקים הושווה ל-LOIS שנחשף לחיידקים אך לא נגוע כדי לחקור את תהליך הריפוי בהיעדר זיהום חיידקי.איור 5E מציג תמונה אופטית של שקופית IHC המבטאת TNF-α.האזור החום מייצג את התגובה החיסונית, מה שמצביע על כך שהתגובה החיסונית ב-LOIS מופחתת מעט.בנוסף, הביטוי של IL-6 ב-LOIS היה נמוך משמעותית מהביטוי השלילי של עירום סטרילי (איור 5F).הביטוי של ציטוקין היה כמומת על ידי מדידת אזור צביעת הנוגדנים התואם לציטוקין (איור 5G).בהשוואה לארנבות שנחשפו לשתלים השליליים, רמות הביטוי של הארנבות שהושתלו עם LOIS היו נמוכות יותר, מה שהראה הבדל משמעותי.הירידה בביטוי הציטוקינים מצביעה על כך שתכונות אנטי-התעיתויות ארוכות הטווח והיציבות של LOIS קשורות לא רק לעיכוב של זיהומים חיידקיים, אלא גם לירידה ב-FBR, המושרה על ידי מקרופאגים הנצמדים למצע (53, 57, 58).לכן, התגובה החיסונית המופחתת עקב תכונות ההתחמקות החיסונית של LOIS עשויה לפתור את תופעות הלוואי לאחר ההשתלה, כגון תגובה חיסונית מוגזמת לאחר ניתוח פלסטי.
(א) תרשים סכמטי של מנגנון היווצרות ביופילם והתפשטות על פני השטח של שתל אורטופדי נגוע.eDNA, DNA חוץ תאי.(ב) תרשים סכמטי של תגובה חיסונית לאחר החדרת שתל אורטופדי.(ג) צביעת H&E ו-(D) צביעת MT של הרקמות שמסביב של שתלים אורטופדיים עם חיובי חשוף ו-LOIS.IHC של ציטוקינים הקשורים למערכת החיסון (E) TNF-α ו-(F) IL-6 הם תמונות מוכתמות של ארנבות עירומות-שליליות ו-LOIS מושתלות.(ז) כימות של ביטוי ציטוקינים על ידי מדידת כיסוי שטח (** P <0.01).
התאימות הביולוגית של LOIS והשפעתה על תהליך ריפוי העצם נבדקו in vivo באמצעות הדמיה אבחנתית [רנטגן ומיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת (CT)] ו-Osteoclast IHC.איור 6A מציג את תהליך ריפוי העצם הכולל שלושה שלבים שונים: דלקת, תיקון ועיצוב מחדש.כאשר מתרחש שבר, תאים דלקתיים ופיברובלסטים יחדרו לתוך העצם השבורה ויתחילו לצמוח לתוך רקמת כלי הדם.במהלך שלב התיקון, צמיחת רקמת כלי הדם מתפשטת ליד מקום השבר.רקמת כלי הדם מספקת חומרים מזינים ליצירת עצם חדשה, הנקראת קאלוס.השלב הסופי של תהליך ריפוי העצם הוא שלב העיצוב מחדש, בו מצטמצם גודל הקאלוס לגודל עצם תקינה בעזרת עלייה ברמת האוסטאוקלסטים הפעילים (59).שחזור תלת מימדי (3D) של אתר השבר בוצע באמצעות סריקות מיקרו-CT כדי לראות את ההבדלים ברמת היווצרות הקאלוס בכל קבוצה.התבונן בחתך הרוחב של עצם הירך כדי לראות את עובי הקאלוס המקיף את העצם השבורה (איור 6, B ו-C).צילומי רנטגן שימשו גם לבדיקת אתרי השברים של כל הקבוצות מדי שבוע כדי לצפות בתהליכי התחדשות העצם השונים בכל קבוצה (איור S9).יבלת ועצמות בוגרות מוצגות בכחול/ירוק ובשנהב, בהתאמה.רוב הרקמות הרכות מסוננות עם סף מוגדר מראש.חיובי עירום ו-SHP אישרו היווצרות של כמות קטנה של יבלת סביב אתר השבר.מצד שני, הנגטיב החשוף של LOIS ואתר השבר מוקפים בילית עבה.צילומי מיקרו-CT הראו כי היווצרות יבלת נבלמת על ידי זיהום חיידקי ודלקת הקשורה לזיהום.הסיבה לכך היא שמערכת החיסון נותנת עדיפות לריפוי של פציעות ספיגה הנגרמות על ידי דלקת הקשורה לזיהום, במקום התאוששות עצם (60).צביעת IHC ו-Tartrate Acid Phosphatase (TRAP) בוצעו כדי לצפות בפעילות אוסטאוקלסט וספיגת עצם (איור 6D) (61).רק כמה אוסטאוקלסטים פעילים שנצבעו בסגול נמצאו ב-positives עירום וב-SHP.מצד שני, אוסטאוקלסטים פעילים רבים נצפו ליד העצמות החיוביות והבוגרות העירומות של LOIS.תופעה זו מצביעה על כך שבנוכחות אוסטאוקלסטים, הקאלוס מסביב לאתר השבר עובר תהליך שיפוץ אלים (62).נפח העצם ואזור ביטוי האוסטאוקלסט של הקאלוס נמדדו כדי להשוות את רמת היווצרות הקאלוס סביב אתר השבר בכל הקבוצות, כדי לכמת את בדיקת המיקרו-CT ותוצאות IHC (איור 6E, 1 ו-2).כצפוי, השליליים העירומים והיווצרות הקאלוס ב-LOIS היו גבוהים משמעותית מאשר בקבוצות האחרות, מה שמעיד על כך שהתרחש שיפוץ עצם חיובי (63).איור S10 מציג את התמונה האופטית של אתר הניתוח, תוצאת צביעת ה-MT של הרקמה שנאספה ליד הבורג, ותוצאת צביעה TRAP המדגישה את ממשק הבורג-עצם.במצע החשוף נצפתה היווצרות יבלת חזקה ופיברוזיס, בעוד שהשתל שטופל ב-LOIS הראה משטח לא דבוק יחסית.באופן דומה, בהשוואה לתשלילים עירומים, נצפתה פיברוזיס נמוכה יותר בארנבות שהושתלו ב-LOIS, כפי שמצוין על ידי החצים הלבנים.בנוסף, ניתן לייחס את הבצקת המוצקה (חץ כחול) לתכונות ההתחמקות החיסונית של LOIS, ובכך להפחית את הדלקת הקשה.משטח הנון-סטיק סביב השתל ופיברוזיס מופחת מצביעים על כך שתהליך ההסרה קל יותר, מה שגורם בדרך כלל לשברים אחרים או דלקות.תהליך ריפוי העצם לאחר הסרת הבורג הוערך על ידי פעילות האוסטאוקלסט בממשק הבורג-עצם.גם העצם החשופה וגם ממשק שתל ה-LOIS ספגו רמות דומות של אוסטאוקלסטים להמשך ריפוי העצם, מה שמצביע על כך שלציפוי ה-LOIS אין השפעה שלילית על ריפוי העצם או התגובה החיסונית.על מנת לאשר ששינוי פני השטח שבוצע ב-LOIS אינו מפריע לתהליך ריפוי העצם, נעשה שימוש בבדיקת רנטגן כדי להשוות את ריפוי העצם של הארנבים עם יונים שליליים חשופים ו-6 שבועות של השתלת LOIS (איור 6F).התוצאות הראו שבהשוואה לקבוצה החיובית בעירום הלא נגוע, LOIS הראתה את אותה מידה של ריפוי עצם, ולא היו סימנים ברורים לשבר (קו אוסטאוליזה מתמשך) בשתי הקבוצות.
(א) תרשים סכמטי של תהליך ריפוי עצם לאחר שבר.(ב) ההבדל במידת היווצרות הקאלוס של כל קבוצת פני השטח ו-(ג) תמונת החתך של אתר השבר.(ד) צביעת TRAP כדי לדמיין פעילות אוסטאוקלסט וספיגת עצם.בהתבסס על פעילות TRAP, היווצרות של callus חיצוני של עצם קליפת המוח נותחה כמותית על ידי (E) (1) מיקרו-CT ו-(2) פעילות אוסטאוקלסט.(ו) 6 שבועות לאחר ההשתלה, תמונות רנטגן של העצם השבורה של הנגטיב החשוף (מודגש על ידי המלבן המקווקו האדום) ו-LOIS (מודגש על ידי המלבן המקווקו הכחול).ניתוח סטטיסטי בוצע על ידי ניתוח חד כיווני של שונות (ANOVA).* P <0.05.** P <0.01.
בקיצור, LOIS מספקת סוג חדש של אסטרטגיית זיהום אנטיבקטריאלית וציפוי מילוט חיסוני עבור שתלים אורטופדיים.שתלים אורטופדיים קונבנציונליים עם פונקציונליזציה של SHP מציגים תכונות אנטי-ביופולנס לטווח קצר, אך אינם יכולים לשמור על תכונותיהם לאורך זמן.הסופרהידרופוביות של המצע לוכדת בועות אוויר בין החיידקים למצע, ובכך יוצרים כיסי אוויר, ובכך מונעים זיהום חיידקי.עם זאת, בשל פיזור האוויר, כיסי אוויר אלו מוסרים בקלות.מצד שני, LOIS הוכיחה היטב את יכולתה למנוע זיהומים הקשורים לביופילם.לכן, בשל תכונות האנטי-דחייה של שכבת חומר הסיכה המוזרקת למשטח המיקרו/ננו השכבתי, ניתן למנוע דלקת הקשורה לזיהום.שיטות אפיון שונות כולל מדידות SEM, AFM, XPS ו-CA משמשות כדי לייעל את תנאי הייצור של LOIS.בנוסף, ניתן ליישם את LOIS גם על חומרים ביולוגיים שונים הנפוצים בציוד קיבוע אורטופדי, כגון PLGA, Ti, PE, POM ו-PPSU.לאחר מכן, LOIS נבדק במבחנה כדי להוכיח את תכונותיו נגד חיידקים וחומרים ביולוגיים הקשורים לתגובה חיסונית.התוצאות מראות שיש לו השפעות אנטיבקטריאליות ואנטי-ביוסיות מצוינות בהשוואה לשתל החשוף.בנוסף, LOIS מראה חוזק מכני גם לאחר הפעלת לחץ מכני, דבר בלתי נמנע בניתוחים פלסטיים.בשל תכונות הריפוי העצמי של חומר הסיכה על פני השטח של מבנה המיקרו/ננו, LOIS שמרה בהצלחה על תכונות העיכול האנטי-ביולוגיות שלו.על מנת לחקור את התאימות הביולוגית והתכונות האנטי-בקטריאליות של LOIS in vivo, LOIS הושתל בעצם הירך של ארנבת למשך 4 שבועות.לא נצפה זיהום חיידקי בארנבות שהושתלו ב-LOIS.בנוסף, השימוש ב-IHC הראה רמה מופחתת של תגובה חיסונית מקומית, מה שמעיד על כך ש-LOIS אינו מעכב את תהליך ריפוי העצם.LOIS מציגה תכונות אנטיבקטריאליות וחיסוניות מצוינות, והוכחה כמונעת ביעילות היווצרות ביופילם לפני ובמהלך ניתוח אורטופדי, במיוחד עבור סינתזת עצמות.על ידי שימוש במודל של שבר דלקתי של מח עצם עצם הירך, נחקרה לעומק ההשפעה של זיהומים הקשורים לביופילם על תהליך ריפוי העצם המושרה על ידי שתלים מודגרים.כמחקר עתידי, יש צורך במודל חדש in vivo כדי לחקור זיהומים אפשריים לאחר ההשתלה כדי להבין ולמנוע זיהומים הקשורים לביופילם במהלך כל תהליך הריפוי.בנוסף, אוסטאואינדוקציה היא עדיין אתגר לא פתור באינטגרציה עם LOIS.יש צורך במחקר נוסף כדי לשלב הידבקות סלקטיבית של תאים אוסטאו-אינדוקטיביים או רפואה רגנרטיבית עם LOIS כדי להתגבר על האתגר.בסך הכל, LOIS מייצגת ציפוי שתלים אורטופדי מבטיח עם חוסן מכני ותכונות מצוינות נגד זיהומים ביולוגיים, שיכולים להפחית את ה-SSI ואת תופעות הלוואי החיסוניות.
שטפו את המצע 15 מ"מ x 15 מ"מ x 1 מ"מ 304 SS (Dong Kang M-Tech Co., קוריאה) באציטון, EtOH ומים DI למשך 15 דקות כדי להסיר מזהמים.על מנת ליצור מבנה ברמת מיקרו/ננו על פני השטח, המצע המנוקה טובל בתמיסת HF של 48% עד 51% (DUKSAN Corp., דרום קוריאה) ב-50°C.זמן התחריט משתנה בין 0 ל-60 דקות.לאחר מכן, המצע החרוט נוקה במים מופחתים והונח בתמיסת 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) ב-50 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי ליצור שכבת פסיבציה של תחמוצת כרום על פני השטח.לאחר הפסיבציה שוטפים את המצע במים דהיוניים ומייבשים לקבלת מצע בעל מבנה שכבות.לאחר מכן, המצע נחשף לפלסמת חמצן (100 W, 3 דקות), וטבול מיד בתמיסה של 8.88 mM POTS (Sigma-Aldrich, גרמניה) בטולואן בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.לאחר מכן, המצע המצופה ב-POTS נוקה ב-EtOH, וחולל ב-150 מעלות צלזיוס למשך שעתיים כדי לקבל POTS SAM צפוף.לאחר ציפוי SAM נוצרה שכבת סיכה על המצע על ידי מריחת חומר סיכה פרפלואורופוליאתר (Krytox 101; DuPont, ארה"ב) בנפח העמסה של 20 מיקרומטר/ס"מ 2. לפני השימוש יש לסנן את חומר הסיכה דרך מסנן 0.2 מיקרון.הסר עודפי חומר סיכה על ידי הטיה בזווית של 45 מעלות למשך 15 דקות.אותו הליך ייצור שימש עבור שתלים אורטופדיים עשויים 304 SS (לוח נעילה ובורג נעילה קורטיקלי; Dong Kang M-Tech Co., קוריאה).כל השתלים האורטופדיים נועדו להתאים לגיאומטריה של עצם הירך של הארנב.
מורפולוגיה של פני השטח של המצע והשתלים האורטופדיים נבדקה על ידי SEM פליטת שדה (Inspect F50, FEI, ארה"ב) ו-AFM (XE-100, Park Systems, דרום קוריאה).חספוס פני השטח (Ra, Rq) נמדד על ידי הכפלת השטח של 20 מיקרומטר ב-20 מיקרומטר (n=4).מערכת XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, יפן) מצוידת במקור Al Kα רנטגן בגודל נקודה של 100μm2 שימשה לניתוח ההרכב הכימי של פני השטח.מערכת מדידת CA מצוידת במצלמת לכידת תמונה דינמית (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​דרום קוריאה) שימשה למדידת CA ו-SA נוזליים.עבור כל מדידה, 6 עד 10 μl של טיפות (מים deionized, דם סוס, EG, 30% אתנול, ו-HD) מונחות על פני השטח כדי למדוד CA.כאשר זווית הנטייה של המצע גדלה במהירות של 2°/s (n = 4), ה-SA נמדד כאשר הטיפה נופלת.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] ו-MRSA (ATCC 25923) נרכשו מ-ATCC (מנאסס, וירג'יניה, ארה"ב), ותרבות המניות נשמרה ב-80 מעלות צלזיוס.לפני השימוש, התרבית הקפואה הודגרה במרק סויה שהופשר טריפסין (קומד, קוריאה) ב-37 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות ולאחר מכן הועברה פעמיים כדי להפעיל אותה.לאחר הדגירה, התרבית עברה צנטריפוגה ב-10,000 סל"ד למשך 10 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ונשטפה פעמיים בתמיסת PBS (pH 7.3).התרבית הצנטריפוגה עוברת תת-תרבות על לוחות אגר דם (BAP).MRSA ו-Pseudomonas aeruginosa הוכנו בן לילה ותופחו במרק Luria-Bertani.הריכוז של Pseudomonas aeruginosa ו-MRSA בחיסון נקבע כמותית על ידי CFU של התרחיף בדילול סדרתי על אגר.לאחר מכן, התאם את ריכוז החיידקים ל-0.5 תקן McFarland, שהוא שווה ערך ל-108 CFU/ml.לאחר מכן יש לדלל את תרחיף החיידקים הפועל 100 פעמים ל-106 CFU/ml.כדי לבדוק את תכונות ההידבקות האנטיבקטריאליות, המצע עוקר ב-121 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני השימוש.לאחר מכן המצע הועבר ל-25 מ"ל של תרחיף חיידקים והודגרה ב-37 מעלות צלזיוס עם ניעור נמרץ (200 סל"ד) למשך 12 ו-72 שעות.לאחר הדגירה, כל מצע הוסר מהאינקובטור ונשטף 3 פעמים עם PBS כדי להסיר כל חיידק צף על פני השטח.על מנת לצפות בביופילם על המצע, הביופילם תוקן במתנול והוכתם ב-1 מ"ל של כתום קרימידין למשך 2 דקות.לאחר מכן נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי (BX51TR, אולימפוס, יפן) כדי לצלם תמונות של הביופילם המוכתם.על מנת לכמת את הביופילם על גבי המצע, התאים המחוברים הופרדו מהמצע בשיטת ה-Bead Vortex, שנחשבה לשיטה המתאימה ביותר להסרת חיידקים מחוברים (n=4).באמצעות מלקחיים סטריליים, הסר את המצע ממדיום הגידול והקש על צלחת הבאר כדי להסיר עודפי נוזלים.תאים מחוברים באופן רופף הוסרו על ידי שטיפה פעמיים עם PBS סטרילי.כל מצע הועבר לאחר מכן למבחנה סטרילית המכילה 9 מ"ל של 0.1% חלבון ept saltine (PSW) ו-2 גרם של 20 עד 25 חרוזי זכוכית סטריליים (קוטר 0.4 עד 0.5 מ"מ).לאחר מכן הוא עבר מערבולת במשך 3 דקות כדי לנתק את התאים מהדגימה.לאחר מערבולת, התרחיף דולל באופן סדרתי פי 10 עם 0.1% PSW, ולאחר מכן 0.1 מ"ל מכל דילול חוסן על BAP.לאחר 24 שעות של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, ה-CFU נספר באופן ידני.
עבור התאים, נעשה שימוש בפיברובלסטים של עכברים NIH/3T3 (CRL-1658; אמריקאי ATCC) ומקרופאגים עכברים RAW 264.7 (TIB-71; ATCC אמריקאי).השתמש במדיום נשר שונה של Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, קוריאה) כדי לגדל פיברובלסטים של עכברים ולהוסיף עם 10% סרום עגל (S103-01, Welgene) ו-1% פניצילין-סטרפטומיצין (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene) השתמשו ב-DMEM לתרבית מקרופאגים של עכברים, בתוספת נסיוב בקר עוברי של 10% (S001-01, Welgene) ו-1% PS. מניחים את המצע בצלחת תרבית תאים עם שש בארים, וחיסנו את התאים ב-105 תאים/ס"מ. התאים הודגרו במשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 עבור צביעת תאים, התאים היו קבועים עם 4% paraformaldehyde למשך 20 דקות והונחו ב-0.5% Triton X Incubate לטבול את המצע ב-50nM tetramethylrhodamine ב-37°C למשך 30 דקות לאחר תהליך הדגירה, השתמשו במצע עם 4',6-diamino-2-phenylindole (H-1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD מדיום קיבוע (n = 4 לכל תא). , fluorescein, fluorescein isothiocyanate-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, גרמניה) ופלזמה אנושית הפיברינוגן המצומד Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, ארה"ב) הומס ב-PBS (10 mM, pH 7.4).הריכוזים של אלבומין ופיברינוגן היו 1 ו-150 מיקרוגרם/מ"ל, בהתאמה.לאחר המצע לפני הטבילה בתמיסת החלבון, שטפו אותם עם PBS כדי לייבש מחדש את פני השטח.לאחר מכן לטבול את כל המצעים בצלחת שש באר המכילה את תמיסת החלבון ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 ו-90 דקות.לאחר הדגירה, המצע הוסר מתמיסת החלבון, נשטף בעדינות עם PBS 3 פעמים, וקבוע עם 4% פרפורמלדהיד (n = 4 לכל חלבון).עבור סידן, נתרן כלורי (0.21 M) ואשלגן פוספט (3.77 מ"מ) ) הומס במים מפושטים.ה-pH של התמיסה הותאם ל-2.0 על ידי הוספת תמיסת הידרוכלוריד (1M).לאחר מכן הומס סידן כלורי (5.62 מ"מ) בתמיסה.על ידי הוספת 1M tris(hydroxymethyl)-amino Methane מתאים את ה-pH של התמיסה ל-7.4.לטבול את כל המצעים בצלחת שש בארים מלאה בתמיסת סידן פוספט 1.5× והסר מהתמיסה לאחר 30 דקות.לצביעה, 2 גרם Alizarin Red S (CI 58005) מערבבים עם 100 מ"ל מים מפושטים.לאחר מכן, השתמשו ב-10% אמוניום הידרוקסיד כדי להתאים את ה-pH ל-4. צבעו את המצע בתמיסת Alizarin Red למשך 5 דקות, ולאחר מכן נערו מעליו את הצבע העודף והספיגו.לאחר תהליך הניעור, הסר את המצע.החומר מיובש, לאחר מכן טובל באציטון למשך 5 דקות, לאחר מכן טובל בתמיסת אצטון-קסילן (1:1) למשך 5 דקות, ולבסוף נשטף עם קסילן (n = 4).נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי (Axio Imager) עם עדשות אובייקטיביות ×10 ו ×20..A2m, Zeiss, Germany) מצלמת את כל המצעים.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) שימש כדי לכמת את נתוני ההידבקות של חומרים ביולוגיים בכל קבוצה של ארבעה אזורי הדמיה שונים.המר את כל התמונות לתמונות בינאריות עם ספים קבועים להשוואת מצע.
נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקאלי של Zeiss LSM 700 לניטור היציבות של שכבת חומר הסיכה ב-PBS במצב השתקפות.דגימת הזכוכית המצופה SAM על בסיס פלואור עם שכבת סיכה מוזרקת הוטבעה בתמיסת PBS, ונבדקה באמצעות שייקר מסלולי (SHO-1D; Daihan Scientific, דרום קוריאה) בתנאי ניעור מתונים (120 סל"ד).לאחר מכן קח את הדגימה ועקוב אחר אובדן חומר סיכה על ידי מדידת אובדן האור המוחזר.כדי לרכוש תמונות פלואורסצנטיות במצב השתקפות, הדגימה נחשפת ללייזר 633 ננומטר ולאחר מכן נאספה, מכיוון שהאור יוחזר מהדגימה.הדגימות נמדדו במרווחי זמן של 0, 30, 60 ו-120 שעות.
על מנת לקבוע את השפעת תהליך שינוי פני השטח על התכונות הננו-מכניות של שתלים אורטופדיים, נעשה שימוש ב-Nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, ארה"ב) המצויד בקצה יהלום ברקוביץ' בצורת פירמידה תלת-צדדית למדידת ננו-אינדנדיון.עומס השיא הוא 10 mN והשטח הוא 100μmx 100μm.עבור כל המדידות, זמן הטעינה והפריקה הוא 10 שניות, וזמן ההחזקה תחת עומס הזחה שיא הוא 2 שניות.קח מדידות מחמישה מיקומים שונים ולקחת את הממוצע.על מנת להעריך את ביצועי החוזק המכני תחת עומס, בוצעה בדיקת כיפוף תלת נקודות רוחבית באמצעות מכונת בדיקה אוניברסלית (Instron 5966, Instron, ארה"ב).המצע נדחס בקצב קבוע של 10 N/s עם עומס מוגבר.תוכנת Bluehill Universal (n=3) שימשה לחישוב מודול הכיפוף ומתח הלחיצה המקסימלי.
על מנת לדמות את תהליך הניתוח והנזק המכני הנגרם במהלך הניתוח, בוצע תהליך הניתוח במבחנה.עצם הירך נאספו מהארנבות הלבנות הניו זילנדיות שהוצאו להורג.עצם הירך נוקה וקבוע ב-4% פרפורמלדהיד למשך שבוע.כפי שתואר בשיטת הניסוי בבעלי חיים, עצם הירך הקבועה נותחה בניתוח.לאחר הניתוח, השתל האורטופדי הושקע בדם (דם סוס, KISAN, קוריאה) למשך 10 שניות כדי לאשר אם התרחשו הידבקויות בדם לאחר הפעלת הפגיעה המכנית (n=3).
בסך הכל 24 ארנבות לבנים ניו זילנד זכרים (משקל 3.0 עד 3.5 ק"ג, גיל ממוצע 6 חודשים) חולקו באופן אקראי לארבע קבוצות: עירום שלילי, עירום חיובי, SHP ו-LOIS.כל ההליכים הכוללים בעלי חיים בוצעו בהתאם לסטנדרטים האתיים של הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (אושרה על ידי IACUC, KOREA-2017-0159).השתל האורטופדי מורכב מלוח נעילה עם חמישה חורים (אורך 41 מ"מ, רוחב 7 מ"מ ועובי 2 מ"מ) וברגים נעילה קורטיקליים (אורך 12 מ"מ, קוטר 2.7 מ"מ) לקיבוע שבר.מלבד הצלחות והברגים המשמשים בקבוצה החשופה-שלילית, כל הצלחות והברגים הודגרו בתרחיף MRSA (106 CFU/ml) למשך 12 שעות.הקבוצה העירומה-שלילית (n=6) טופלה בשתלים משטח עירום ללא חשיפה לתרחיף חיידקים, כביקורת שלילית לזיהום.הקבוצה החיובית החשופה (n=6) טופלה בשתל משטח חשוף שנחשף לחיידקים כביקורת חיובית לזיהום.קבוצת SHP (n=6) טופלה בשתלי SHP שנחשפו לחיידקים.לבסוף, קבוצת LOIS טופלה באמצעות שתלי LOIS חשופים לחיידקים (n=6).כל בעלי החיים מוחזקים בכלוב, ומספקים הרבה מזון ומים.לפני הניתוח, הארנבות צמו במשך 12 שעות.החיות הורדמו על ידי הזרקה תוך שרירית של xyazine (5 מ"ג/ק"ג) והזרקה לווריד של פקליטקסל (3 מ"ג/ק"ג) לצורך אינדוקציה.לאחר מכן, יש להעביר 2% איזופלורן ו-50% עד 70% חמצן רפואי (קצב זרימה 2 ליטר לדקה) דרך מערכת הנשימה כדי לשמור על הרדמה.הוא מושתל באמצעות גישה ישירה לעצם הירך הצדדית.לאחר הסרת שיער וחיטוי פובידון-יוד לעור, נעשה חתך באורך של כ-6 ס"מ בצד החיצוני של עצם הירך האמצעית השמאלית.על ידי פתיחת הרווח בין השרירים המכסים את עצם הירך, עצם הירך חשופה במלואה.הנח את הצלחת מול ציר הירך וקבע אותה באמצעות ארבעה ברגים.לאחר הקיבוע, השתמש בלהב מסור (עובי 1 מ"מ) כדי ליצור באופן מלאכותי שבר באזור שבין החור השני לחור הרביעי.בתום הניתוח הפצע נשטף במי מלח ונסגר בתפרים.לכל ארנב הוזרק תת עורית אנרופלוקסצין (5 מ"ג/ק"ג) מדולל שליש בתמיסת מלח.צילומי רנטגן לאחר ניתוח של עצם הירך נלקחו בכל החיות (0, 7, 14, 21, 28 ו-42 ימים) כדי לאשר את האוסטאוטומיה של העצם.לאחר הרדמה עמוקה, כל החיות הומתו על ידי KCl תוך ורידי (2 mmol/kg) ב-28 ו-42 ימים.לאחר הביצוע, עצם הירך נסרק במיקרו-CT כדי לצפות ולהשוות את תהליך ריפוי העצם ויצירת עצם חדשה בין ארבע הקבוצות.
לאחר הביצוע נאספו הרקמות הרכות שהיו במגע ישיר עם השתלים האורטופדיים.הרקמה נקבעה בפורמלין נייטרלי 10% מאוחסן למשך הלילה ולאחר מכן התייבשה ב-EtOH.הרקמה המיובשת הוטבעה בפרפין וחתוכה בעובי של 40 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום (400CS; EXAKT, גרמניה).על מנת לדמיין את הזיהום, בוצעו צביעת H&E וצביעת MT.על מנת לבדוק את תגובת המארח, הרקמה החתוכה הודגרה עם נוגדן ראשוני אנטי-TNF-α ארנב (AB6671, Abcam, ארה"ב) ואנטי-IL-6 של ארנב (AB6672; Abcam, ארה"ב), ולאחר מכן טופלה עם חזרת.אוקסידאז.החל את מערכת הצביעה אבידין-ביוטין קומפלקס (ABC) על המקטעים לפי הוראות היצרן.על מנת להופיע כמוצר תגובה חום, נעשה שימוש ב-3,3-diaminobenzidine בכל החלקים.סורק שקופיות דיגיטלי (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, הונגריה) שימש כדי להמחיש את כל הפרוסות, ולפחות ארבעה מצעים בכל קבוצה נותחו על ידי תוכנת ImageJ.
צילומי רנטגן צולמו בכל החיות לאחר הניתוח ומדי שבוע למעקב אחר ריפוי שברים (n=6 לקבוצה).לאחר הביצוע, נעשה שימוש במיקרו-CT ברזולוציה גבוהה כדי לחשב את היווצרות הקאלוס סביב עצם הירך לאחר הריפוי.עצם הירך שהתקבל נוקה, קבוע ב-4% פרפורמלדהיד למשך 3 ימים, והתייבש ב-75% אתנול.העצמות המיובשות נסרקו לאחר מכן באמצעות מיקרו-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, בלגיה) כדי ליצור תמונות ווקסל תלת-ממדיות (2240×2240 פיקסלים) של דגימת העצם.השתמש במסנן Al 1.0 מ"מ כדי להפחית רעשי אות ולהחיל רזולוציה גבוהה על כל הסריקות (E = 133 kVp, I = 60 μA, זמן אינטגרציה = 500 ms).תוכנת Nrecon (גרסה 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, בלגיה) שימשה ליצירת נפח תלת-ממדי של הדגימה הסרוקה מההקרנה הצידית הדו-ממדית הנרכשת.לצורך ניתוח, התמונה המשוחזרת בתלת-ממד מחולקת לקוביות של 10 מ"מ × 10 מ"מ × 10 מ"מ בהתאם לאתר השבר.חשב את הקאלוס מחוץ לעצם הקורטיקלית.תוכנת DataViewer (גרסה 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, בלגיה) שימשה כדי לנתב מחדש את נפח העצם הסרוקה, ותוכנת CT-Analyzer (גרסה 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, בלגיה) שימשה לניתוח.מקדמי הספיגה היחסיים של קרני רנטגן בעצמות בוגרות וביבלת נבדלים על ידי צפיפותם, ולאחר מכן מכמתים את נפח הקאלוס (n=4).על מנת לאשר שהתאימות הביולוגית של LOIS אינה מעכבת את תהליך ריפוי העצם, בוצעו ניתוחי רנטגן ומיקרו-CT נוספים בשתי ארנבות: הקבוצות העירומות-שליליות ו-LOIS.שתי הקבוצות הוצאו להורג בשבוע השישי.
עצם הירך מחיות שהוקרבו נאספו וקבועות ב-4% פרפורמלדהיד למשך 3 ימים.לאחר מכן השתל האורטופדי מוסר בזהירות מעצם הירך.עצם הירך נמחקה במשך 21 ימים באמצעות 0.5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).לאחר מכן, עצם הירך המסוידת הוטבעה ב-EtOH כדי להפוך אותה למיובשת.עצם הירך המיובש הוסרה בקסילן והוטמעה בפרפין.לאחר מכן הדגימה נחתכה עם מיקרוטום סיבובי אוטומטי (Leica RM2255, Leica Biosystems, גרמניה) בעובי של 3 מיקרומטר.עבור צביעת TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, גרמניה), דגימות החתכים עברו דה-פראפין, הוזרמו מחדש והודגרו במגיב TRAP ב-37 מעלות צלזיוס למשך שעה.התמונות נרכשו באמצעות סורק שקופיות (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, הונגריה) וכומתו על ידי מדידת כיסוי השטח של האזור המוכתם.בכל ניסוי, לפחות ארבעה מצעים בכל קבוצה נותחו על ידי תוכנת ImageJ.
ניתוח מובהקות סטטיסטית בוצע באמצעות GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., ארה"ב).מבחן t לא מזווג וניתוח שונות של שונות (ANOVA) שימשו לבדיקת ההבדלים בין קבוצות ההערכה.רמת המובהקות מצוינת באיור באופן הבא: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 ו-****P<0.0001;NS, אין הבדל משמעותי.
לחומרים משלימים למאמר זה, ראה http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
זהו מאמר בגישה פתוחה המופץ על פי תנאי הרישיון Creative Commons Attribution-Non-Commercial, המאפשר שימוש, הפצה ושכפול בכל מדיום, כל עוד השימוש אינו למטרת רווח מסחרי והנחת היסוד היא שהמקור העבודה נכונה.התייחסות.
הערה: אנו מבקשים מכם לספק כתובת מייל בלבד כדי שהאדם עליו אתם ממליצים לעמוד ידע שאתם רוצים שהוא יראה את המייל ושהמייל אינו ספאם.לא נלכד כתובות דוא"ל.
שאלה זו משמשת כדי לבדוק אם אתה מבקר אנושי וכדי למנוע הגשת דואר זבל אוטומטית.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
ציפויי הבריחה האנטי-בקטריאליים והחיסוניים של שתלים אורטופדיים יכולים להפחית זיהומים ותגובות חיסוניות הנגרמות על ידי זיהומים.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
ציפויי הבריחה האנטי-בקטריאליים והחיסוניים של שתלים אורטופדיים יכולים להפחית זיהומים ותגובות חיסוניות הנגרמות על ידי זיהומים.
©2021 האגודה האמריקאית לקידום המדע.כל הזכויות שמורות.AAAS הוא שותף של HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ו-COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.