För patienter som genomgår ortopedisk implantatkirurgi har bakteriella infektioner och infektionsinducerade immunsvar alltid varit livshotande risker.Konventionella biologiska material är mottagliga för biologisk kontaminering, vilket gör att bakterier invaderar det skadade området och orsakar postoperativ infektion.Därför finns det ett akut behov av att utveckla beläggningar mot infektion och immunflykt för ortopediska implantat.Här har vi utvecklat en avancerad ytmodifieringsteknik för ortopediska implantat som kallas Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), som är inspirerad av den släta ytan hos kannor för växter.LOIS har långvarig och stark vätskeavstötning mot en mängd olika vätskor och biologiska ämnen (inklusive celler, proteiner, kalcium och bakterier).Dessutom bekräftade vi den mekaniska hållbarheten mot repor och fixeringskraft genom att simulera den oundvikliga skadan under in vitro-operationen.Modellen för inflammatorisk lårbensfraktur från kaninbenmärg användes för att noggrant studera den antibiologiska skalningen och anti-infektionsförmågan hos LOIS.Vi föreställer oss att LOIS, som har anti-biofouling-egenskaper och mekanisk hållbarhet, är ett steg framåt inom infektionsfri ortopedisk kirurgi.
Idag har antalet patienter som lider av ortopediska sjukdomar (såsom äldre frakturer, degenerativa ledsjukdomar och osteoporos) ökat kraftigt på grund av det övergripande åldrandet (1, 2).Därför lägger medicinska institutioner stor vikt vid ortopedisk kirurgi, inklusive ortopediska implantat av skruvar, plattor, spikar och konstgjorda leder (3, 4).Traditionella ortopediska implantat har dock rapporterats vara känsliga för bakteriell vidhäftning och biofilmbildning, vilket kan orsaka infektion på operationsstället (SSI) efter operation (5, 6).När biofilmen väl har bildats på ytan av det ortopediska implantatet blir det extremt svårt att ta bort biofilmen även vid användning av stora doser antibiotika.Därför leder det vanligtvis till allvarliga postoperativa infektioner (7, 8).På grund av ovanstående problem bör behandlingen av infekterade implantat innefatta reoperation, inklusive avlägsnande av alla implantat och omgivande vävnader;därför kommer patienten att drabbas av svår smärta och vissa risker (9, 10).
För att lösa några av dessa problem har läkemedelsavgivande ortopediska implantat utvecklats för att förhindra infektion genom att eliminera bakterier fästa på ytan (11, 12).Strategin visar dock fortfarande på flera begränsningar.Det har rapporterats att långvarig implantation av läkemedelsavgivande implantat har orsakat skador på omgivande vävnader och orsakat inflammation, vilket kan leda till nekros (13, 14).Dessutom kräver de organiska lösningsmedel som kan finnas efter tillverkningsprocessen av läkemedelsavgivande ortopediska implantat, vilka är strängt förbjudna av US Food and Drug Administration, ytterligare reningssteg för att uppfylla dess standarder (15).Läkemedelsavgivande implantat är utmanande för kontrollerad frisättning av läkemedel, och på grund av deras begränsade läkemedelsbelastning är långtidsapplicering av läkemedlet inte genomförbart (16).
En annan vanlig strategi är att belägga implantatet med en antifouling-polymer för att förhindra att biologiskt material och bakterier fastnar på ytan (17).Till exempel har zwitterjoniska polymerer väckt uppmärksamhet på grund av deras icke-vidhäftande egenskaper när de kommer i kontakt med plasmaproteiner, celler och bakterier.Det har dock vissa begränsningar relaterade till långtidsstabilitet och mekanisk hållbarhet, vilket hindrar dess praktiska tillämpning i ortopediska implantat, särskilt på grund av mekanisk skrapning under kirurgiska ingrepp (18, 19).På grund av dess höga biokompatibilitet, bristande behov av borttagningskirurgi och ytrengörande egenskaper genom korrosion, har ortopediska implantat gjorda av biologiskt nedbrytbara material använts (20, 21).Under korrosion bryts de kemiska bindningarna mellan polymermatrisen ner och lossnar från ytan, och vidhäftningen rengör ytan.Antibiologisk nedsmutsning genom ytrengöring är dock effektiv på kort tid.Dessutom kommer de flesta absorberbara material inklusive poly(mjölksyra-glykolsyrasampolymer) (PLGA), polymjölksyra (PLA) och magnesiumbaserade legeringar att genomgå ojämn biologisk nedbrytning och erosion i kroppen, vilket kommer att negativt påverka mekanisk stabilitet.(tjugotvå).Dessutom ger de biologiskt nedbrytbara plattfragmenten en plats för bakterier att fästa, vilket ökar risken för infektion på sikt.Denna risk för mekanisk nedbrytning och infektion begränsar den praktiska tillämpningen av plastikkirurgi (23).
Superhydrofoba (SHP) ytor som efterliknar den hierarkiska strukturen hos lotusblad har blivit en potentiell lösning för antifouling-ytor (24, 25).När SHP-ytan är nedsänkt i vätska kommer luftbubblor att fångas och därigenom bilda luftfickor och förhindra bakteriell vidhäftning (26).Nyligen genomförda studier har dock visat att SHP-ytan har nackdelar relaterade till mekanisk hållbarhet och långtidsstabilitet, vilket hindrar dess applicering i medicinska implantat.Dessutom kommer luftfickorna att lösas upp och förlora sina antifouling-egenskaper, vilket resulterar i bredare bakteriell vidhäftning på grund av den stora ytan på SHP-ytan (27, 28).Nyligen introducerade Aizenberg och kollegor en innovativ metod för ytbeläggning mot biopåväxt genom att utveckla en slät yta inspirerad av Nepenthes pitcher plant (29, 30).Den släta ytan visar långvarig stabilitet under hydrauliska förhållanden, är extremt vätskeavvisande mot biologiska vätskor och har självreparerande egenskaper.Det finns dock varken en metod att applicera en beläggning på ett komplexformat medicinskt implantat, och det är inte heller bevisat att det stöder läkningsprocessen av skadad vävnad efter implantation.
Här introducerar vi en smord ortopedisk implantatyta (LOIS), en mikro/nanostrukturerad ortopedisk implantatyta och tätt kombinerad med ett tunt smörjmedelsskikt för att förhindra att det associeras med plastikkirurgi Bakteriella infektioner, såsom frakturfixering.Eftersom den fluorfunktionaliserade mikro/nano-nivåstrukturen fixerar smörjmedlet på strukturen, kan den utvecklade LOIS helt stöta bort vidhäftningen av olika vätskor och bibehålla antifouling-prestanda under lång tid.LOIS-beläggningar kan appliceras på material av olika former avsedda för bensyntes.De utmärkta anti-biopåväxtegenskaperna hos LOIS mot biofilmbakterier [Pseudomonas aeruginosa och meticillinresistent Staphylococcus aureus (MRSA)] och biologiska substanser (celler, proteiner och kalcium) har bekräftats in vitro.Vidhäftningshastigheten för omfattande vidhäftning till substratet är mindre än 1%.Dessutom, även efter mekanisk påfrestning såsom ytrepor, hjälper den självläkande som orsakas av det penetrerande smörjmedlet att bibehålla dess antifouling-egenskaper.De mekaniska hållbarhetstestresultaten visar att även efter strukturell och kemisk modifiering kommer den totala hållfastheten inte att minska nämnvärt.Dessutom genomfördes ett in vitro-experiment som simulerar den mekaniska påfrestningen i operationsmiljön för att bevisa att LOIS tål olika mekaniska påfrestningar som uppstår vid plastikkirurgi.Slutligen använde vi en kaninbaserad in vivo lårbensfrakturmodell, som bevisade att LOIS har överlägsna antibakteriella egenskaper och biokompatibilitet.Radiologiska och histologiska resultat bekräftade att stabilt smörjmedelsbeteende och anti-biopåväxtegenskaper inom 4 veckor efter implantation kan uppnå effektiv anti-infektion och immunflykt utan att fördröja benläkningsprocessen.
Figur 1A visar ett schematiskt diagram av den utvecklade LOIS, som är implanterad med strukturer i mikro/nanoskala i lårbensfrakturmodellen hos kanin för att bekräfta dess utmärkta anti-biologiska nedsmutsning och anti-infektionsegenskaper.En biomimetisk metod utförs för att simulera ytan på en vattenkrukväxt, och för att förhindra biofouling genom att införliva ett smörjmedelsskikt i ytans mikro/nanostruktur.Ytan som injiceras med smörjmedel kan minimera kontakten mellan biologiska ämnen och ytan.Därför, på grund av bildningen av stabila kemiska bindningar på ytan, har den utmärkt antifouling-prestanda och långtidsstabilitet.Som ett resultat av detta tillåter smörjytans anti-biopåväxtegenskaper olika praktiska tillämpningar inom biomedicinsk forskning.En omfattande forskning om hur denna speciella yta samverkar i kroppen har dock ännu inte avslutats.Genom att jämföra LOIS med nakna substrat in vitro med hjälp av albumin och biofilmbakterier kan LOIS icke-vidhäftningsförmåga bekräftas (Figur 1B).Dessutom, genom att rulla av vattendropparna på det lutande kala substratet och LOIS-substratet (Figur S1 och Movie S1), kan den biologiska kontamineringens prestanda demonstreras.Som visas i fluorescensmikroskopbilden visade det exponerade substratet inkuberat i en suspension av protein och bakterier att en stor mängd biologiskt material vidhäftade ytan.Men på grund av dess utmärkta anti-biofouling-egenskaper uppvisar LOIS knappast någon fluorescens.För att bekräfta dess anti-biofouling och anti-infektion egenskaper, applicerades LOIS på ytan av ortopediska implantat för bensyntes (plattor och skruvar) och placerades i en kaninfrakturmodell.Före implantationen inkuberades det nakna ortopediska implantatet och LOIS i en bakteriesuspension under 12 timmar.Förinkubationen säkerställer att en biofilm bildas på ytan av det exponerade implantatet för jämförelse.Figur 1C visar ett foto av frakturstället 4 veckor efter implantation.Till vänster visade en kanin med ett bart ortopediskt implantat en allvarlig nivå av inflammation på grund av bildandet av en biofilm på implantatets yta.Det motsatta resultatet observerades hos kaniner implanterade med LOIS, det vill säga de omgivande vävnaderna av LOIS visade varken tecken på infektion eller tecken på inflammation.Dessutom indikerar den optiska bilden till vänster operationsstället för kaninen med det exponerade implantatet, vilket indikerar att inga flera bindemedel som fanns på ytan av det exponerade implantatet hittades på ytan av LOIS.Detta visar att LOIS har långtidsstabilitet och har förmågan att bibehålla sina antibiologiska nedsmutsnings- och antividhäftningsegenskaper.
(A) Schematiskt diagram av LOIS och dess implantation i en lårbensfrakturmodell av kanin.(B) Fluorescensmikroskopibild av protein och bakteriell biofilm på bar yta och LOIS-substrat.4 veckor efter implantation, (C) en fotografisk bild av frakturstället och (D) en röntgenbild (markerad med en röd rektangel).Bild med tillstånd: Kyomin Chae, Yonsei University.
De steriliserade, exponerade negativt implanterade kaninerna visade en normal benläkningsprocess utan några tecken på inflammation eller infektion.Å andra sidan uppvisar SHP-implantat som förinkuberats i en bakteriesuspension infektionsrelaterad inflammation i de omgivande vävnaderna.Detta kan tillskrivas dess oförmåga att hämma bakteriell vidhäftning under lång tid (Figur S2).För att bevisa att LOIS inte påverkar läkningsprocessen, utan hämmar möjliga infektioner relaterade till implantation, jämfördes röntgenbilder av den exponerade positiva matrisen och LOIS på frakturstället (Figur 1D).Röntgenbilden av det blotta positiva implantatet visade ihållande osteolyslinjer, vilket tydde på att benet inte var helt läkt.Detta tyder på att benåtervinningsprocessen kan försenas kraftigt på grund av infektionsrelaterad inflammation.Tvärtom visade det att kaninerna som implanterats med LOIS hade läkt och inte visade något uppenbart frakturställe.
För att utveckla medicinska implantat med långsiktig stabilitet och funktionalitet (inklusive resistens mot biofouling) har många ansträngningar gjorts.Närvaron av olika biologiska ämnen och dynamiken i vävnadsvidhäftning begränsar dock utvecklingen av deras kliniskt tillförlitliga metoder.För att komma till rätta med dessa brister har vi utvecklat en mikro/nanoskiktad struktur och kemiskt modifierad yta, som är optimerad på grund av hög kapillärkraft och kemisk affinitet för att hålla det jämnaste smörjmedlet i största utsträckning.Figur 2A visar den övergripande tillverkningsprocessen för LOIS.Förbered först ett substrat av rostfritt stål (SS) 304 av medicinsk kvalitet.För det andra bildas mikro/nano-strukturen på SS-substratet genom kemisk etsning med fluorvätesyra (HF) lösning.För att återställa korrosionsbeständigheten hos SS, används en salpetersyra (HNO3)-lösning (31) för att bearbeta det etsade substratet.Passivering förbättrar korrosionsbeständigheten hos SS-substratet och saktar avsevärt ner korrosionsprocessen, vilket kan minska den totala prestandan hos LOIS.Sedan, genom att bilda ett självmonterat monolager (SAM) med 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyltrietoxisilan (POTS), modifieras ytan kemiskt för att förbättra den kemiska interaktionen mellan ytan och den släta smörjmedelsaffiniteten.Ytmodifieringen minskar ytenergin avsevärt på den tillverkade mikro/nanoskala strukturerade ytan, vilket matchar ytenergin hos det släta smörjmedlet.Detta gör att smörjmedlet kan vätas helt och därigenom bilda ett stabilt smörjmedelsskikt på ytan.Den modifierade ytan uppvisar förbättrad hydrofobicitet.Resultaten visar att det hala smörjmedlet uppvisar stabilt beteende på LOIS på grund av den höga kemiska affiniteten och kapillärkraften som orsakas av mikro/nano-strukturen (32, 33).De optiska förändringarna på ytan av SS efter ytmodifiering och smörjmedelsinjektion studerades.Den mikro/nanoskiktade strukturen som bildas på ytan kan orsaka visuella förändringar och göra ytan mörkare.Detta fenomen tillskrivs den förbättrade ljusspridningseffekten på den grova ytan, vilket ökar den diffusa reflektionen som orsakas av ljusfångningsmekanismen (34).Dessutom, efter att smörjmedlet har injicerats, blir LOIS mörkare.Smörjskiktet gör att mindre ljus reflekteras från substratet, vilket gör att LOIS blir mörkare.För att optimera mikrostrukturen/nanostrukturen för att visa den minsta glidvinkeln (SA) för att uppnå anti-biofouling-prestanda, användes svepelektronmikroskopi (SEM) och atompar för att utföra olika HF-etsningstider (0, 3).15 och 60 minuter) Force Microscope (AFM) (Figur 2B).SEM- och AFM-bilder visar att efter en kort tids etsning (3 minuters etsning) har det kala substratet bildat ojämn nanoskala grovhet.Ytråheten ändras med etsningstiden (Figur S3).Den tidsvarierande kurvan visar att ytjämnheten fortsätter att öka och når en topp vid 15 minuters etsning, och då observeras endast en liten minskning av råhetsvärdet vid 30 minuters etsning.Vid denna tidpunkt etsas grovheten på nanonivå bort, medan råheten på mikronivån utvecklas kraftigt, vilket gör råhetsförändringen mer stabil.Efter etsning i mer än 30 minuter observeras en ytterligare ökning av grovheten, vilket förklaras i detalj enligt följande: SS är sammansatt av stål, legerat med element inklusive järn, krom, nickel, molybden och många andra element.Bland dessa grundämnen spelar järn, krom och molybden en viktig roll för att bilda mikron/nanoskala grovhet på SS genom HF-etsning.I de tidiga stadierna av korrosion är järn och krom främst korroderade eftersom molybden har högre korrosionsbeständighet än molybden.Allt eftersom etsningen fortskrider når etslösningen lokal övermättnad och bildar fluorider och oxider orsakade av etsning.Fluorid och oxid fälls ut och återavsätts så småningom på ytan, vilket bildar en ytjämnhet i mikron/nano-området (31).Denna grovhet på mikro/nanonivå spelar en viktig roll för LOIS:s självläkande egenskaper.Den dubbla skalytan ger en synergistisk effekt, vilket kraftigt ökar kapillärkraften.Detta fenomen gör att smörjmedlet kan penetrera ytan stabilt och bidrar till självläkande egenskaper (35).Uppkomsten av grovhet beror på etsningstiden.Under 10 minuters etsning innehåller ytan endast nanoskala grovhet, vilket inte räcker för att hålla tillräckligt med smörjmedel för att ha biofouling-resistens (36).Å andra sidan, om etsningstiden överstiger 30 minuter, kommer den nanoskaliga grovheten som bildas av återavsättningen av järn och krom att försvinna, och endast mikroskalig råhet kommer att finnas kvar på grund av molybden.Den överetsade ytan saknar grovhet i nanoskala och förlorar den synergistiska effekten av tvåstegsråhet, vilket negativt påverkar de självläkande egenskaperna hos LOIS.SA-mätningar utfördes på substrat med olika etstider för att bevisa antifouling-prestanda.Olika typer av vätskor valdes ut utifrån viskositet och ytenergi, inklusive avjoniserat (DI) vatten, blod, etylenglykol (EG), etanol (EtOH) och hexadekan (HD) (Figur S4).Det tidsvarierande etsmönstret visar att för olika vätskor med olika ytenergier och viskositeter är SA för LOIS efter 15 minuters etsning den lägsta.Därför är LOIS optimerad för att etsa i 15 minuter för att bilda mikron och nanoskala grovhet, vilket är lämpligt för att effektivt bibehålla hållbarheten hos smörjmedlet och utmärkta antifouling-egenskaper.
(A) Schematiskt diagram över LOIS-tillverkningsprocessen i fyra steg.Insättningen visar SAM bildad på substratet.(B) SEM- och AFM-bilder, används för att optimera substratets mikro/nanostruktur under olika etsningstider.Röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) spektra av (C) Cr2p och (D) F1s efter ytpassivering och SAM-beläggning.au, godtycklig enhet.(E) Representativa bilder av vattendroppar på nakna, etsade, SHP- och LOIS-substrat.(F) Kontaktvinkeln (CA) och SA-mätning av vätskor med olika ytspänningar på SHP och LOIS.Data uttrycks som medelvärde ± SD.
Sedan, för att bekräfta förändringen i ytans kemiska egenskaper, användes röntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) för att studera förändringen i den kemiska sammansättningen av substratytan efter varje ytbeläggning.Figur 2C visar XPS-mätresultaten för den HF-etsade ytan och den HNO3-behandlade ytan.De två huvudtopparna vid 587,3 och 577,7 eV kan tillskrivas den Cr-O-bindning som finns i kromoxidskiktet, vilket är huvudskillnaden från den HF-etsade ytan.Detta beror främst på förbrukningen av järn och kromfluorid på ytan av HNO3.Den HNO3-baserade etsningen gör att krom bildar ett passiverande oxidskikt på ytan, vilket gör det etsade SS återigen motståndskraftigt mot korrosion.I figur 2D erhölls XPS-spektra för att bekräfta att fluorkolbaserad silan bildades på ytan efter SAM-beläggningen, som har extremt hög vätskeavstötning även för EG, blod och EtOH.SAM-beläggningen fullbordas genom att silanfunktionella grupper reageras med hydroxylgrupper som bildas genom plasmabehandling.Som ett resultat observerades en signifikant ökning av CF2- och CF3-topparna.Bindningsenergin mellan 286 och 296 eV indikerar att den kemiska modifieringen har slutförts framgångsrikt av SAM-beläggningen.SHP visar relativt stora CF2 (290,1 eV) och CF3 (293,3 eV) toppar, som orsakas av den fluorkolbaserade silanen som bildas på ytan.Figur 2E visar representativa optiska bilder av kontaktvinkelmätningar (CA) för olika grupper av avjoniserat vatten i kontakt med blott, etsat, SHP och LOIS.Dessa bilder visar att den etsade ytan blir hydrofil på grund av mikro/nanostrukturen som bildas genom kemisk etsning så att avjoniserat vatten absorberas i strukturen.Men när substratet är belagt med SAM, uppvisar substratet stark vattenavstötning, så ett yt-SHP bildas och kontaktytan mellan vatten och ytan är liten.Slutligen observerades en minskning av CA i LOIS, vilket kan hänföras till penetration av smörjmedel i mikrostrukturen, vilket ökar kontaktytan.För att bevisa att ytan har utmärkt vätskeavstötande och icke-vidhäftande egenskaper jämfördes LOIS med SHP-substratet genom att mäta CA och SA med olika vätskor (Figur 2F).Olika typer av vätskor valdes ut utifrån viskositet och ytenergi, inklusive avjoniserat vatten, blod, EG, EtOH och HD (Figur S4).CA-mätresultat visar att när CA tenderar till HD, är reduktionsvärdet för CA, där CA har lägst ytenergi.Dessutom är LOIS för den totala CA låg.SA-mätningen visar dock på ett helt annat fenomen.Förutom det joniserade vattnet fäster alla vätskor på SHP-substratet utan att glida av.Å andra sidan visar LOIS en mycket låg SA, där när all vätska lutar i en vinkel lägre än 10° till 15° kommer all vätska att rulla av.Detta visar starkt att icke-vidhäftningsförmågan hos LOIS är bättre än hos SHP-ytan.Dessutom appliceras LOIS-beläggningar också på olika typer av material, inklusive titan (Ti), polyfenylsulfon (PPSU), polyoximetylen (POM), polyeter-eterketon (PEEK) och bioabsorberbara polymerer (PLGA), De är implanterbara ortopediska material (Figur S5)).De sekventiella bilderna av dropparna på materialet som behandlats av LOIS visar att LOIS anti-biopåväxtegenskaper är desamma på alla substrat.Dessutom visar mätresultaten från CA och SA att de icke-vidhäftande egenskaperna hos LOIS kan appliceras på andra material.
För att bekräfta antifouling-egenskaperna hos LOIS inkuberades olika typer av substrat (inklusive blottade, etsade, SHP och LOIS) med Pseudomonas aeruginosa och MRSA.Dessa två bakterier valdes ut som representativa sjukhusbakterier, vilket kan leda till bildandet av biofilmer, vilket leder till SSI (37).Figur 3 (A och B) visar fluorescensmikroskopbilderna och mätresultaten för den kolonibildande enheten (CFU) av substraten som inkuberats i bakteriesuspensionen under kortvarig (12 timmar) respektive långvarig (72 timmar).På kort tid kommer bakterier att bilda kluster och växa i storlek, täcka sig med slemliknande ämnen och förhindra att de tas bort.Men under 72-timmars inkubationen kommer bakterierna att mogna och bli lätta att sprida för att bilda fler kolonier eller kluster.Därför kan det anses att 72 timmars inkubation är långvarig och är den lämpliga inkubationstiden för att bilda en stark biofilm på ytan (38).Under en kort tidsperiod uppvisade den etsade ytan och ytan av SHP bakteriell vidhäftning, som minskade med cirka 25 % till 50 % jämfört med det kala substratet.Men på grund av dess utmärkta anti-biofouling-prestanda och stabilitet, visade LOIS inte bakteriell biofilmvidhäftning på kort och lång sikt.Det schematiska diagrammet (Figur 3C) beskriver förklaringen av den antibiologiska nedsmutsningsmekanismen för etslösningen, SHP och LOIS.Antagandet är att det etsade substratet med hydrofila egenskaper kommer att ha en större ytarea än det kala substratet.Därför kommer mer bakteriell vidhäftning att uppstå på det etsade substratet.Jämfört med det kala substratet har det etsade substratet dock betydligt mindre biofilm bildad på ytan.Detta beror på att vattenmolekyler binder fast till den hydrofila ytan och fungerar som ett smörjmedel för vatten, vilket på kort sikt stör vidhäftningen av bakterier (39).Lagret av vattenmolekyler är dock mycket tunt och lösligt i bakteriesuspensioner.Därför försvinner det vattenmolekylära lagret under lång tid, vilket leder till omfattande bakteriell vidhäftning och spridning.För SHP, på grund av dess kortsiktiga icke-vätande egenskaper, hämmas bakteriell vidhäftning.Den minskade bakteriella vidhäftningen kan tillskrivas luftfickor som är fångade i den skiktade strukturen och lägre ytenergi, vilket minimerar kontakten mellan bakteriesuspensionen och ytan.Däremot observerades omfattande bakteriell vidhäftning i SHP eftersom det förlorade sina antifouling-egenskaper under lång tid.Detta beror främst på att luftfickor försvinner på grund av hydrostatiskt tryck och upplösning av luft i vatten.Detta beror främst på att luftfickor försvinner på grund av upplösning och den skiktade strukturen som ger en större yta för vidhäftning (27, 40).Till skillnad från dessa två substrat som har en viktig effekt på långtidsstabiliteten, injiceras det smörjande smörjmedlet som finns i LOIS i mikro/nanostrukturen och kommer inte att försvinna ens på lång sikt.Smörjmedel fyllda med mikro/nanostrukturer är mycket stabila och attraheras starkt av ytan på grund av sin höga kemiska affinitet och förhindrar därigenom bakteriell vidhäftning under lång tid.Figur S6 visar en reflektionskonfokalmikroskopbild av ett smörjmedelsinfunderat substrat nedsänkt i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).Kontinuerliga bilder visar att även efter 120 timmars lätt skakning (120 rpm) förblir smörjmedelsskiktet på LOIS oförändrat, vilket indikerar långtidsstabilitet under flödesförhållanden.Detta beror på den höga kemiska affiniteten mellan den fluorbaserade SAM-beläggningen och det perfluorkolbaserade smörjmedlet, så att ett stabilt smörjmedelsskikt kan bildas.Därför bibehålls antifouling-prestandan.Dessutom testades substratet mot representativa proteiner (albumin och fibrinogen), som finns i plasma, celler nära besläktade med immunfunktionen (makrofager och fibroblaster), och de som är relaterade till benbildning.Halten av kalcium är mycket hög.(Figur 3D, 1 och 2, och Figur S7) (41, 42).Dessutom visade fluorescensmikroskopbilderna av vidhäftningstestet för fibrinogen, albumin och kalcium olika vidhäftningsegenskaper för varje substratgrupp (Figur S8).Under benbildning kan nybildade ben- och kalciumlager omge det ortopediska implantatet, vilket inte bara försvårar avlägsnandet utan också kan orsaka oväntad skada på patienten under borttagningsprocessen.Därför är låga nivåer av kalciumavlagringar på benplattor och skruvar fördelaktiga för ortopedisk kirurgi som kräver avlägsnande av implantat.Baserat på kvantifieringen av det bifogade området baserat på fluorescensintensiteten och cellantalet, bekräftade vi att LOIS visar utmärkta anti-biopåväxtegenskaper för alla biologiska ämnen jämfört med andra substrat.Enligt resultaten av in vitro-experiment kan den anti-biologiska påväxten LOIS appliceras på ortopediska implantat, som inte bara kan hämma infektioner orsakade av biofilmbakterier, utan också minska inflammation orsakad av kroppens aktiva immunsystem.
(A) Fluorescensmikroskopbilder av varje grupp (naken, etsad, SHP och LOIS) inkuberade i Pseudomonas aeruginosa och MRSA-suspensioner i 12 och 72 timmar.(B) Antalet vidhäftande CFU av Pseudomonas aeruginosa och MRSA på ytan av varje grupp.(C) Schematiskt diagram av den anti-biologiska nedsmutsningsmekanismen för kortsiktig och långvarig etsning, SHP och LOIS.(D) (1) Antalet fibroblaster vidhäftade till varje substrat och fluorescensmikroskopbilder av cellerna vidhäftade till det nakna och LOIS.(2) Vidhäftningstest av immunrelaterade proteiner, albumin och kalcium involverade i benläkningsprocessen (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 och **** P <0,0001).ns, inte viktigt.
Vid oundvikliga koncentrerade spänningar har mekanisk hållbarhet alltid varit den största utmaningen för applicering av bottenfärger.Traditionella anti-avloppsgelmetoder är baserade på polymerer med låg vattenlöslighet och bräcklighet.Därför är de vanligtvis mottagliga för mekanisk stress i biomedicinska tillämpningar.Därför förblir mekaniskt hållbara antifouling-beläggningar en utmaning för applikationer som ortopediska implantat (43, 44).Figur 4A(1) visar de två huvudtyperna av stress som appliceras på ortopediska implantat, inklusive repning (skjuvspänning) och kompression med den optiska bilden av det skadade implantatet som produceras av pincett.Till exempel, när skruven dras åt med en skruvmejsel, eller när kirurgen håller fast benplattan med en pincett och applicerar tryckkraft, kommer plastbenplattan att skadas och repas på både makro- och mikro/nano-skalan (Figur 4A, 2) .För att testa om den tillverkade LOIS kan motstå dessa skador under plastikkirurgi, utfördes nanoindentation för att jämföra hårdheten hos det nakna substratet och LOIS på mikro/nano-skalan för att studera de mekaniska egenskaperna hos mikro/nanostrukturen Impact (Figur 4B).Det schematiska diagrammet visar olika deformationsbeteende hos LOIS på grund av närvaron av mikro/nano-strukturer.En kraft-förskjutningskurva ritades baserat på resultaten av nanoindentation (Figur 4C).Den blå bilden representerar det nakna substratet, som endast visar en liten deformation, som ses av det maximala intryckningsdjupet på 0,26 μm.Å andra sidan kan den gradvisa ökningen av nanoindentationskraften och förskjutningen som observeras i LOIS (röd kurva) visa tecken på minskade mekaniska egenskaper, vilket resulterar i ett nanoindentationsdjup på 1,61μm.Detta beror på att mikro/nano-strukturen som finns i LOIS ger ett djupare framstegsutrymme för spetsen av nanoindentern, så dess deformation är större än den för det nakna substratet.Konsta-Gdoutos et al.(45) anser att på grund av närvaron av nanostrukturer leder nanointryckning och mikro/nano-jämnhet till oregelbundna nanoindenteringskurvor.Det skuggade området motsvarar den oregelbundna deformationskurvan som tillskrivs nanostrukturen, medan det icke-skuggade området tillskrivs mikrostrukturen.Denna deformation kan skada mikrostrukturen/nanostrukturen hos det kvarhållande smörjmedlet och negativt påverka dess antifouling-prestanda.För att studera effekten av skada på LOIS, replikerades oundvikliga skador på mikro/nano-strukturer i kroppen under plastikkirurgi.Genom att använda blod- och proteinvidhäftningstester kan stabiliteten hos LOIS anti-biofouling-egenskaper efter in vitro bestämmas (Figur 4D).En serie optiska bilder visar skadan som inträffade nära hålen på varje substrat.Ett blodvidhäftningstest utfördes för att demonstrera effekten av mekanisk skada på beläggningen mot biologisk beväxning (Figur 4E).Liksom SHP går antifouling-egenskaperna förlorade på grund av skador och LOIS uppvisar utmärkta antifouling-egenskaper genom att stöta bort blod.Detta beror på att, eftersom ytenergin drivs av kapillärverkan som täcker det skadade området, återställer flödet i det mikrostrukturerade smörjmedelssmörjmedlet de antifouling-egenskaperna (35).Samma trend observerades i proteinadhesionstestet med användning av albumin.I det skadade området observeras vidhäftningen av protein på ytan av SHP i stor utsträckning, och genom att mäta dess yttäckning kan den kvantifieras som hälften av vidhäftningsnivån för det kala substratet.Å andra sidan bibehöll LOIS sina anti-biopåväxtegenskaper utan att orsaka vidhäftning (Figur 4, F och G).Dessutom utsätts skruvens yta ofta för stark mekanisk påfrestning, såsom borrning, så vi studerade LOIS-beläggningens förmåga att förbli intakt på skruven in vitro.Figur 4H visar optiska bilder av olika skruvar, inklusive blanka, SHP och LOIS.Den röda rektangeln representerar målområdet där stark mekanisk stress uppstår under benimplantation.På samma sätt som plattans proteinvidhäftningstest används ett fluorescensmikroskop för att avbilda proteinvidhäftningen och mäta täckningsområdet för att bevisa integriteten hos LOIS-beläggningen, även under stark mekanisk påfrestning (Figur 4, I och J).De LOIS-behandlade skruvarna uppvisar utmärkt antifouling-prestanda och nästan inget protein fäster på ytan.Å andra sidan observerades proteinvidhäftning i blotta skruvar och SHP-skruvar, där areatäckningen för SHP-skruvar var en tredjedel av den för bara skruvar.Dessutom måste det ortopediska implantatet som används för fixering vara mekaniskt starkt för att motstå den påkänning som appliceras på frakturstället, som visas i figur 4K.Därför utfördes ett böjningstest för att bestämma effekten av kemisk modifiering på mekaniska egenskaper.Dessutom görs detta för att bibehålla den fixerade spänningen från implantatet.Applicera vertikal mekanisk kraft tills implantatet är helt vikt och en spännings-töjningskurva erhålls (Figur 4L, 1).Två egenskaper inklusive Youngs modul och böjhållfasthet jämfördes mellan kala och LOIS-substrat som indikatorer på deras mekaniska hållfasthet (Figur 4L, 2 och 3).Youngs modul indikerar förmågan hos ett material att motstå mekaniska förändringar.Youngs modul för varje substrat är 41,48±1,01 respektive 40,06±0,96 GPa;den observerade skillnaden är cirka 3,4 %.Dessutom rapporteras att böjhållfastheten, som bestämmer materialets seghet, är 102,34±1,51 GPa för det kala underlaget och 96,99±0,86 GPa för SHP.Det kala underlaget är cirka 5,3 % högre.Den lätta minskningen av mekaniska egenskaper kan orsakas av notch-effekten.I notch-effekten kan mikro/nano-råheten fungera som en uppsättning skåror, vilket leder till lokal spänningskoncentration och påverkar implantatets mekaniska egenskaper (46).Baserat på det faktum att styvheten hos mänskligt kortikalt ben rapporteras vara mellan 7,4 och 31,6 GPa, och den uppmätta LOIS-modulen överstiger den för mänskligt kortikalt ben (47), är LOIS tillräckligt för att stödja frakturen och dess totala. mekaniska egenskaper påverkas minimalt av ytmodifiering.
(A) Schematiskt diagram av (1) den mekaniska belastningen som appliceras på det ortopediska implantatet under operationen, och (2) den optiska bilden av det skadade ortopediska implantatet.(B) Schematiskt diagram av mätning av nano-mekaniska egenskaper genom nanoindentation och LOIS på den kala ytan.(C) Nanoindentationskraft-förskjutningskurva för bar yta och LOIS.(D) Efter in vitro-experiment, simulera de optiska bilderna av olika typer av ortopediska plattor (det skadade området är markerat med en röd rektangel) för att simulera den mekaniska stressen som orsakas under operationen.(E) Blodvidhäftningstest och (F) proteinadhesionstest av den skadade ortopediska plattgruppen.(G) Mät areatäckningen av proteinet som fäster vid plattan.(H) Optiska bilder av olika typer av ortopediska skruvar efter in vitro-experimentet.(I) Proteinvidhäftningstest för att studera integriteten hos olika beläggningar.(J) Mät areatäckningen av proteinet som fäster vid skruven.(K) Kaninens rörelse är avsedd att generera en fixerad stress på det frakturerade benet.(L) (1) Böjtestresultat och optiska bilder före och efter böjning.Skillnaden i (2) Youngs modul och (3) böjstyrka mellan blott implantat och SHP.Data uttrycks som medelvärde ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 och ****P<0,0001).Bild med tillstånd: Kyomin Chae, Yonsei University.
I kliniska situationer kommer de flesta bakteriella kontakterna med biologiska material och sårställen från mogna, mogna biofilmer (48).Därför uppskattar US Centers for Disease Control and Prevention att 65 % av alla mänskliga infektioner är relaterade till biofilmer (49).I det här fallet är det nödvändigt att tillhandahålla en experimentell design in vivo som ger konsekvent biofilmbildning på implantatets yta.Därför utvecklade vi en lårbensfrakturmodell för kanin där ortopediska implantat förinkuberades i en bakteriesuspension och sedan implanterades i lårbenen från kanin för att studera antifouling-egenskaperna hos LOIS in vivo.På grund av följande tre viktiga fakta induceras bakterieinfektioner av förkultur snarare än direkt injektion av bakteriesuspensioner: (i) Immunsystemet hos kaniner är naturligt starkare än hos människor;därför är injektion av bakteriesuspensioner och planktonbakterier möjlig Det har ingen effekt på bildandet av biofilmer.(Ii) Planktonbakterier är mer mottagliga för antibiotika, och antibiotika används vanligtvis efter operation;slutligen, (iii) den planktoniska bakteriesuspensionen kan spädas ut av djurets kroppsvätskor (50).Genom att förodla implantatet i en bakteriesuspension före implantation kan vi grundligt studera de skadliga effekterna av bakterieinfektion och främmande kroppsreaktion (FBR) på benläkningsprocessen.Kaninerna avlivades 4 veckor efter implantation, eftersom den osseointegration som är nödvändig för benläkningsprocessen kommer att vara fullbordad inom 4 veckor.Sedan togs implantaten bort från kaninerna för studier nedströms.Figur 5A visar spridningsmekanismen för bakterier.Det infekterade ortopediska implantatet förs in i kroppen.Som ett resultat av förinkubation i bakteriesuspension infekterades sex av de sex kaninerna implanterade med nakna implantat, medan ingen av kaninerna implanterade med LOIS-behandlade implantat var infekterade.Bakterieinfektioner fortskrider i tre steg, inklusive tillväxt, mognad och spridning (51).Först reproducerar de fästa bakterierna och växer på ytan, och sedan bildar bakterierna en biofilm när de utsöndrar extracellulär polymer (EPS), amyloid och extracellulärt DNA.Biofilm stör inte bara penetrationen av antibiotika, utan främjar också ackumuleringen av antibiotikanedbrytande enzymer (som β-laktamas) (52).Slutligen sprider biofilmen de mogna bakterierna till de omgivande vävnaderna.Därför uppstår infektion.Dessutom, när en främmande kropp kommer in i kroppen, kan en infektion som kan orsaka ett starkt immunsvar orsaka allvarlig inflammation, smärta och minskad immunitet.Figur 5B ger en översikt över FBR orsakad av införandet av ett ortopediskt implantat, snarare än immunsvaret orsakat av en bakterieinfektion.Immunsystemet känner igen det insatta implantatet som en främmande kropp och får sedan cellerna och vävnaderna att reagera för att kapsla in den främmande kroppen (53).I början av FBR bildades en försörjningsmatris på ytan av ortopediska implantat, vilket resulterade i adsorption av fibrinogen.Det adsorberade fibrinogenet bildar sedan ett mycket tätt fibrinnätverk, vilket främjar vidhäftningen av leukocyter (54).När väl fibrinnätverket har bildats kommer akut inflammation att uppstå på grund av infiltrationen av neutrofiler.I detta steg frisätts en mängd olika cytokiner såsom tumörnekrosfaktor-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) och IL-β, och monocyter börjar infiltrera implantationsstället och differentieras till jätteceller.fag (41, 55, 56).Att minska FBR har alltid varit en utmaning eftersom överdriven FBR kan orsaka akut och kronisk inflammation, vilket kan leda till dödliga komplikationer.För att bedöma effekten av bakterieinfektioner i vävnaderna som omger det nakna implantatet och LOIS, användes hematoxylin och eosin (H&E) och Masson trichrome (MT) färgning.För kaniner implanterade med bara substrat utvecklades allvarliga bakterieinfektioner och H&E-vävnadsglas visade tydligt bölder och nekros orsakad av inflammation.Å andra sidan hämmar den extremt starka anti-biofouling-ytan LOIS bakteriell vidhäftning, så den visar inga tecken på infektion och minskar inflammation (Figur 5C).Resultaten av MT-färgning visade samma trend.Men MT-färgning visade också ödem hos kaniner implanterade med LOIS, vilket indikerar att återhämtning är på väg att inträffa (Figur 5D).För att studera graden av immunsvar utfördes immunhistokemisk (IHC) färgning med användning av cytokiner TNF-a och IL-6 relaterade till immunsvar.Ett naket negativt implantat som inte exponerades för bakterier jämfördes med ett LOIS som exponerats för bakterier men inte infekterats för att studera läkningsprocessen i frånvaro av bakteriell infektion.Figur 5E visar en optisk bild av ett IHC-objektglas som uttrycker TNF-a.Det bruna området representerar immunsvaret, vilket indikerar att immunsvaret i LOIS är något reducerat.Dessutom var uttrycket av IL-6 i LOIS signifikant mindre än det negativa uttrycket av steril naken (Figur 5F).Uttrycket av cytokin kvantifierades genom att mäta området för antikroppsfärgning som motsvarar cytokinet (Figur 5G).Jämfört med kaninerna som exponerats för de negativa implantaten var expressionsnivåerna för kaninerna implanterade med LOIS lägre, vilket visade en meningsfull skillnad.Minskningen av cytokinuttryck indikerar att de långsiktiga, stabila antifouling-egenskaperna hos LOIS inte bara är relaterade till hämningen av bakteriella infektioner, utan också till minskningen av FBR, som induceras av makrofager som fäster vid substratet (53, 57, 58).Därför kan det minskade immunsvaret på grund av LOIS:s immunförsvarsegenskaper lösa biverkningarna efter implantation, såsom överdrivet immunsvar efter plastikkirurgi.
(A) Ett schematiskt diagram över mekanismen för biofilmbildning och spridning på ytan av ett infekterat ortopediskt implantat.eDNA, extracellulärt DNA.(B) Schematiskt diagram över immunsvar efter ortopedisk implantatinsättning.(C) H&E-färgning och (D) MT-färgning av omgivande vävnader av ortopediska implantat med blott positiv och LOIS.IHC av immunrelaterade cytokiner (E) TNF-α och (F) IL-6 är färgade bilder av nakna-negativa och LOIS-implanterade kaniner.(G) Kvantifiering av cytokinuttryck genom yttäckningsmätning (**P <0,01).
Biokompatibiliteten hos LOIS och dess effekt på benläkningsprocessen undersöktes in vivo med hjälp av diagnostisk bildbehandling [röntgen och mikrodatortomografi (CT)] och osteoklast IHC.Figur 6A visar benläkningsprocessen som involverar tre olika stadier: inflammation, reparation och ombyggnad.När en fraktur uppstår kommer inflammatoriska celler och fibroblaster att tränga in i det frakturerade benet och börja växa in i kärlvävnaden.Under reparationsfasen sprider sig inväxten av vaskulär vävnad nära frakturstället.Vaskulär vävnad tillhandahåller näringsämnen för bildandet av nytt ben, vilket kallas kallus.Det sista skedet av benläkningsprocessen är remodelleringsstadiet, där kallusstorleken reduceras till storleken på normalt ben med hjälp av en ökning av nivån av aktiverade osteoklaster (59).Tredimensionell (3D) rekonstruktion av frakturstället utfördes med hjälp av mikro-CT-skanningar för att observera skillnaderna i nivån av kallusbildning i varje grupp.Observera lårbenets tvärsnitt för att observera tjockleken på kallus som omger det frakturerade benet (Figur 6, B och C).Röntgenstrålar användes också för att undersöka frakturställena för alla grupper varje vecka för att observera de olika benregenereringsprocesserna i varje grupp (Figur S9).Callus och mogna ben visas i blått/grönt respektive elfenben.De flesta mjukdelar filtreras bort med en förinställd tröskel.Naken positiv och SHP bekräftade bildandet av en liten mängd kallus runt frakturstället.Å andra sidan är det exponerade negativa av LOIS och frakturstället omgivna av tjock kallus.Mikro-CT-bilder visade att bildningen av förhårdnader hindrades av bakteriell infektion och infektionsrelaterad inflammation.Detta beror på att immunsystemet prioriterar läkning av septiska skador orsakade av infektionsrelaterad inflammation, snarare än benåtervinning (60).IHC- och tartratresistent surfosfatas (TRAP)-färgning utfördes för att observera osteoklastaktivitet och benresorption (Figur 6D) (61).Endast ett fåtal aktiverade osteoklaster färgade lila hittades i nakna positiva och SHP.Å andra sidan observerades många aktiverade osteoklaster nära de nakna positiva och mogna benen av LOIS.Detta fenomen indikerar att i närvaro av osteoklaster genomgår kallus runt frakturstället en våldsam ombyggnadsprocess (62).Benvolymen och osteoklastexpressionsområdet för kallus mättes för att jämföra nivån av kallusbildning runt frakturstället i alla grupper, för att kvantifiera mikro-CT-skanningen och IHC-resultaten (Figur 6E, 1 och 2).Som väntat var de nakna negativa och kallusbildning i LOIS signifikant högre än i de andra grupperna, vilket tyder på att positiv benombyggnad inträffade (63).Figur S10 visar den optiska bilden av operationsstället, MT-färgningsresultatet av vävnaden som samlats in nära skruven och TRAP-färgningsresultatet som framhäver gränssnittet mellan skruv och ben.I det kala substratet observerades stark kallus- och fibrosbildning, medan det LOIS-behandlade implantatet visade en relativt ovidhäftad yta.På liknande sätt, jämfört med nakna negativ, observerades lägre fibros hos kaniner implanterade med LOIS, vilket indikeras av de vita pilarna.Dessutom kan det fasta ödemet (blå pil) tillskrivas LOIS:s immunförsvarsegenskaper, vilket minskar svår inflammation.Den non-stick ytan runt implantatet och minskad fibros tyder på att borttagningsprocessen är lättare, vilket vanligtvis resulterar i andra frakturer eller inflammation.Benläkningsprocessen efter skruvborttagning utvärderades av osteoklastaktiviteten vid gränsytan mellan skruv och ben.Både det nakna benet och LOIS-implantatets gränssnitt absorberade liknande nivåer av osteoklaster för att ytterligare benläkning, vilket indikerar att LOIS-beläggningen inte har någon negativ effekt på benläkning eller immunsvar.För att bekräfta att ytmodifieringen utförd på LOIS inte stör benläkningsprocessen, användes röntgenundersökning för att jämföra benläkningen hos kaninerna med exponerade negativa joner och 6 veckors LOIS-implantation (Figur 6F).Resultaten visade att jämfört med den oinfekterade nakenpositiva gruppen visade LOIS samma grad av benläkning, och det fanns inga uppenbara tecken på fraktur (kontinuerlig osteolyslinje) i båda grupperna.
(A) Schematiskt diagram över benläkningsprocessen efter fraktur.(B) Skillnaden i graden av kallusbildning för varje ytgrupp och (C) tvärsnittsbilden av frakturstället.(D) TRAP-färgning för att visualisera osteoklastaktivitet och benresorption.Baserat på TRAP-aktivitet analyserades bildningen av extern kallus av kortikalt ben kvantitativt med (E) (1) mikro-CT och (2) osteoklastaktivitet.(F) 6 veckor efter implantation, röntgenbilder av det brutna benet av det exponerade negativet (markerat med den röda streckade rektangeln) och LOIS (markerad av den blå streckade rektangeln).Statistisk analys utfördes genom envägsvariansanalys (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Kort sagt, LOIS tillhandahåller en ny typ av antibakteriell infektionsstrategi och immunescape-beläggning för ortopediska implantat.Konventionella ortopediska implantat med SHP-funktionalisering uppvisar kortsiktiga anti-biopåväxtegenskaper, men kan inte behålla sina egenskaper under lång tid.Substratets superhydrofobicitet fångar luftbubblor mellan bakterierna och substratet och bildar därigenom luftfickor och förhindrar därigenom bakterieinfektion.Men på grund av luftens spridning kan dessa luftfickor lätt avlägsnas.Å andra sidan har LOIS väl bevisat sin förmåga att förhindra biofilmrelaterade infektioner.Därför kan infektionsrelaterad inflammation förhindras på grund av de antiavstötande egenskaperna hos smörjmedelsskiktet som injiceras i den skiktade mikro/nanostrukturytan.Olika karakteriseringsmetoder inklusive SEM, AFM, XPS och CA-mätningar används för att optimera LOIS tillverkningsförhållanden.Dessutom kan LOIS även appliceras på olika biologiska material som vanligtvis används i ortopedisk fixeringsutrustning, såsom PLGA, Ti, PE, POM och PPSU.Sedan testades LOIS in vitro för att bevisa dess anti-biofouling egenskaper mot bakterier och biologiska substanser relaterade till immunsvar.Resultaten visar att den har utmärkta antibakteriella och anti-biopåväxteffekter jämfört med det bara implantatet.Dessutom uppvisar LOIS mekanisk styrka även efter att ha använt mekanisk påfrestning, vilket är oundvikligt vid plastikkirurgi.På grund av de självläkande egenskaperna hos smörjmedlet på ytan av mikro/nano-strukturen, bibehöll LOIS framgångsrikt sina anti-biologiska nedsmutsningsegenskaper.För att studera biokompatibiliteten och antibakteriella egenskaperna hos LOIS in vivo, implanterades LOIS i lårbenet från kanin under 4 veckor.Ingen bakterieinfektion observerades hos kaniner implanterade med LOIS.Dessutom visade användningen av IHC en reducerad nivå av lokalt immunsvar, vilket indikerar att LOIS inte hämmar benläkningsprocessen.LOIS uppvisar utmärkta antibakteriella och immunförsvarsegenskaper och har visat sig effektivt förhindra biofilmbildning före och under ortopedisk kirurgi, speciellt för bensyntes.Genom att använda en modell för inflammatorisk lårbensfraktur från kaninbenmärg studerades effekten av biofilmrelaterade infektioner på benläkningsprocessen inducerad av förinkuberade implantat djupt.Som en framtida studie behövs en ny in vivo-modell för att studera möjliga infektioner efter implantation för att fullt ut förstå och förhindra biofilmrelaterade infektioner under hela läkningsprocessen.Dessutom är osteoinduktion fortfarande en olöst utmaning i integrationen med LOIS.Ytterligare forskning behövs för att kombinera selektiv vidhäftning av osteoinduktiva celler eller regenerativ medicin med LOIS för att övervinna utmaningen.Sammantaget representerar LOIS en lovande ortopedisk implantatbeläggning med mekanisk robusthet och utmärkta anti-biopåväxtegenskaper, vilket kan minska SSI och immunbiverkningar.
Tvätta 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS-substratet (Dong Kang M-Tech Co., Korea) i aceton, EtOH och DI-vatten i 15 minuter för att avlägsna föroreningar.För att bilda en struktur på mikro/nanonivå på ytan, nedsänks det rengjorda substratet i en 48% till 51% HF-lösning (DUKSAN Corp., Sydkorea) vid 50°C.Etsningstiden varierar från 0 till 60 minuter.Sedan rengjordes det etsade substratet med avjoniserat vatten och placerades i en 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.)-lösning vid 50°C under 30 minuter för att bilda ett passiveringsskikt av kromoxid på ytan.Efter passivering tvättas substratet med avjoniserat vatten och torkas för att erhålla ett substrat med skiktad struktur.Därefter exponerades substratet för syreplasma (100 W, 3 minuter) och nedsänktes omedelbart i en lösning av 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Tyskland) i toluen vid rumstemperatur under 12 timmar.Sedan rengjordes substratet belagt med POTS med EtOH och glödgades vid 150°C under 2 timmar för att erhålla en tät POTS SAM.Efter SAM-beläggning bildades ett smörjmedelsskikt på substratet genom att applicera ett perfluorpolyetersmörjmedel (Krytox 101; DuPont, USA) med en belastningsvolym på 20 μm/cm 2. Innan användning, filtrera smörjmedlet genom ett 0,2 mikron filter.Ta bort överflödigt smörjmedel genom att luta i 45° vinkel i 15 minuter.Samma tillverkningsprocedur användes för ortopediska implantat gjorda av 304 SS (låsplatta och kortikal låsskruv; Dong Kang M-Tech Co., Korea).Alla ortopediska implantat är designade för att passa geometrin på kaninens lårben.
Ytmorfologin för substratet och ortopediska implantat inspekterades av fältemission SEM (Inspektera F50, FEI, USA) och AFM (XE-100, Park Systems, Sydkorea).Ytgrovheten (Ra, Rq) mäts genom att multiplicera arean 20 μm med 20 μm (n=4).Ett XPS-system (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japan) utrustat med en Al Ka-röntgenkälla med en fläckstorlek på 100μm2 användes för att analysera den kemiska ytsammansättningen.Ett CA-mätningssystem utrustat med en dynamisk bildfångstkamera (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Sydkorea) användes för att mäta flytande CA och SA.För varje mätning placeras 6 till 10 μl droppar (avjoniserat vatten, hästblod, EG, 30 % etanol och HD) på ytan för att mäta CA.När substratets lutningsvinkel ökar med en hastighet av 2°/s (n = 4), mäts SA när droppen faller.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] och MRSA (ATCC 25923) köptes från ATCC (Manassas, Virginia, USA), och stamkulturen hölls vid -80°C.Före användning inkuberades den frysta kulturen i trypsin-tinad sojabönsbuljong (Komed, Korea) vid 37°C under 18 timmar och överfördes sedan två gånger för att aktivera den.Efter inkubation centrifugerades kulturen vid 10 000 rpm under 10 minuter vid 4°C och tvättades två gånger med en PBS (pH 7,3)-lösning.Den centrifugerade kulturen subodlas sedan på blodagarplattor (BAP).MRSA och Pseudomonas aeruginosa bereddes över natten och odlades i Luria-Bertani-buljong.Koncentrationen av Pseudomonas aeruginosa och MRSA i inokulumet bestämdes kvantitativt av suspensionens CFU i serieutspädningar på agar.Justera sedan bakteriekoncentrationen till 0,5 McFarland-standard, vilket motsvarar 108 CFU/ml.Späd sedan den fungerande bakteriesuspensionen 100 gånger till 106 CFU/ml.För att testa de antibakteriella vidhäftningsegenskaperna steriliserades substratet vid 121°C i 15 minuter före användning.Substratet överfördes sedan till 25 ml bakteriesuspension och inkuberades vid 37°C under kraftig skakning (200 rpm) under 12 och 72 timmar.Efter inkubering avlägsnades varje substrat från inkubatorn och tvättades 3 gånger med PBS för att avlägsna eventuella flytande bakterier på ytan.För att observera biofilmen på substratet fixerades biofilmen med metanol och färgades med 1 ml crimidin orange under 2 minuter.Sedan användes ett fluorescensmikroskop (BX51TR, Olympus, Japan) för att ta bilder av den färgade biofilmen.För att kvantifiera biofilmen på substratet separerades de fästa cellerna från substratet med pärlvirvelmetoden, vilket ansågs vara den mest lämpliga metoden för att avlägsna vidhäftade bakterier (n = 4).Använd en steril pincett, ta bort substratet från tillväxtmediet och knacka på brunnsplattan för att avlägsna överflödig vätska.Löst fästa celler avlägsnades genom tvättning två gånger med steril PBS.Varje substrat överfördes sedan till ett sterilt provrör innehållande 9 ml 0,1 % protein ept saltlösning (PSW) och 2 g av 20 till 25 sterila glaspärlor (0,4 till 0,5 mm i diameter).Det vortexade sedan i 3 minuter för att lossa cellerna från provet.Efter virvling späddes suspensionen ut i serie 10-faldigt med 0,1 % PSW och sedan inokulerades 0,1 ml av varje utspädning på BAP.Efter 24 timmars inkubation vid 37°C räknades CFU manuellt.
För cellerna användes musfibroblaster NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) och musmakrofager RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC).Använd Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) för att odla musfibroblaster och komplettera med 10 % kalvserum (S103-01, Welgene) och 1 % penicillin-streptomycin (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene) Använd DMEM för att odla musmakrofager, kompletterat med 10% fetalt nötkreatursserum (S001-01, Welgene) och 1% PS. Placera substratet i en cellodlingsplatta med sex brunnar, och inokulera cellerna med 105 celler/cm2. Cellerna inkuberades över natten vid 37°C och 5% CO2. För cellfärgning fixerades cellerna med 4% paraformaldehyd i 20 minuter och placerades i 0,5% Triton X Incubate under 5 minuter i -100 nM tetrametylrhodamin vid 37°C i 30 minuter Efter inkubationsprocessen, använd substratet med 4',6-diamino-2-fenylindol (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD-fixeringsmedium (n = 4 per cell). fluorescein, fluorescein isotiocyanat-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Tyskland) och human plasma. Alexa Fluor 488-konjugerade fibrinogen (F13191, Invitrogen, USA) löstes i PBS (10 mM, pH 7,4).Koncentrationerna av albumin och fibrinogen var 1 respektive 150 μg/ml.Efter substratet Innan nedsänkning i proteinlösningen, skölj dem med PBS för att återhydrera ytan.Sänk sedan ner alla substrat i en platta med sex brunnar som innehåller proteinlösningen och inkubera vid 37°C i 30 och 90 minuter.Efter inkubation avlägsnades substratet sedan från proteinlösningen, tvättades försiktigt med PBS 3 gånger och fixerades med 4% paraformaldehyd (n = 4 för varje protein).För kalcium, natriumklorid (0,21 M) och kaliumfosfat (3,77 mM) löstes i avjoniserat vatten.Lösningens pH justerades till 2,0 genom tillsats av hydrokloridlösning (IM).Därefter löstes kalciumklorid (5,62 mM) i lösningen.Genom att tillsätta 1 M tris(hydroximetyl)-amino justerar Metan lösningens pH till 7,4.Sänk ned alla substrat i en platta med sex brunnar fylld med 1,5 x kalciumfosfatlösning och avlägsna från lösningen efter 30 minuter.För färgning, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Blanda med 100 ml avjoniserat vatten.Använd sedan 10 % ammoniumhydroxid för att justera pH-värdet till 4. Färga substratet med Alizarin Red-lösning i 5 minuter och skaka sedan av överflödigt färgämne och blotta.Efter skakningsprocessen, ta bort substratet.Materialet dehydratiseras, nedsänks sedan i aceton i 5 minuter, nedsänks sedan i en aceton-xylen-lösning (1:1) under 5 minuter och tvättas slutligen med xylen (n = 4).Fluorescensmikroskop (Axio Imager) med objektivlinser ×10 och ×20 används..A2m, Zeiss, Tyskland) avbildar alla substrat.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) användes för att kvantifiera adhesionsdata för biologiska ämnen på varje grupp av fyra olika bildområden.Konvertera alla bilder till binära bilder med fasta trösklar för substratjämförelse.
Ett Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop användes för att övervaka stabiliteten hos smörjmedelsskiktet i PBS i reflektionsläge.Det fluorbaserade SAM-belagda glasprovet med ett injicerat smörjskikt nedsänktes i en PBS-lösning och testades med en orbital shaker (SHO-1D; Daihan Scientific, Sydkorea) under milda skakförhållanden (120 rpm).Ta sedan provet och övervaka förlusten av smörjmedel genom att mäta förlusten av reflekterat ljus.För att få fluorescensbilder i reflektionsläge, exponeras provet för en 633 nm laser och samlas sedan in, eftersom ljuset kommer att reflekteras tillbaka från provet.Proverna mättes med tidsintervall på 0, 30, 60 och 120 timmar.
För att bestämma inverkan av ytmodifieringsprocessen på de nanomekaniska egenskaperna hos ortopediska implantat användes en nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) utrustad med en tresidig pyramidformad Berkovich diamantspets för att mäta nanoindenedion.Toppbelastningen är 10 mN och arean är 100μmx 100μm.För alla mätningar är lastnings- och lossningstiden 10 s, och hålltiden under maximal intryckningsbelastning är 2 s.Ta mätningar från fem olika platser och ta medelvärdet.För att utvärdera den mekaniska hållfastheten under belastning utfördes ett tvärgående trepunktsböjningstest med en universell testmaskin (Instron 5966, Instron, USA).Substratet komprimeras med en konstant hastighet av 10 N/s med ökad belastning.Bluehill Universal programvara (n = 3) användes för att beräkna böjmodulen och maximal tryckspänning.
För att simulera operationsprocessen och den relaterade mekaniska skadan som orsakats under operationen utfördes operationsprocessen in vitro.Lårbenen samlades in från de avrättade vita kaninerna från Nya Zeeland.Lårbenet rengjordes och fixerades i 4% paraformaldehyd under 1 vecka.Som beskrivits i djurförsöksmetoden opererades det fixerade lårbenet kirurgiskt.Efter operationen nedsänktes det ortopediska implantatet i blod (hästblod, KISAN, Korea) i 10 s för att bekräfta om blodsammanväxningar inträffade efter att den mekaniska skadan applicerats (n = 3).
Totalt 24 vita nyzeeländska hankaniner (vikt 3,0 till 3,5 kg, medelålder 6 månader) delades slumpmässigt in i fyra grupper: nakennegativa, nakenpositiva, SHP och LOIS.Alla procedurer som involverade djur utfördes i enlighet med de etiska standarderna från Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-godkänd, KOREA-2017-0159).Det ortopediska implantatet består av en låsplatta med fem hål (längd 41 mm, bredd 7 mm och tjocklek 2 mm) och kortikala låsskruvar (längd 12 mm, diameter 2,7 mm) för frakturfixering.Förutom de plattor och skruvar som användes i den bara-negativa gruppen, inkuberades alla plattor och skruvar i MRSA-suspension (106 CFU/ml) under 12 timmar.Den nakna-negativa gruppen (n=6) behandlades med nakna ytimplantat utan exponering för bakteriesuspension, som en negativ kontroll för infektion.Den kala positiva gruppen (n = 6) behandlades med ett implantat med blott yta exponerat för bakterier som en positiv kontroll för infektion.SHP-gruppen (n = 6) behandlades med bakteriellt exponerade SHP-implantat.Slutligen behandlades LOIS-gruppen med bakterieexponerade LOIS-implantat (n = 6).Alla djur hålls i en bur och mycket mat och vatten tillhandahålls.Före operationen fastade kaninerna i 12 timmar.Djuren bedövades genom intramuskulär injektion av xylazin (5 mg/kg) och intravenös injektion av paklitaxel (3 mg/kg) för induktion.Tillför därefter 2 % isofluran och 50 % till 70 % medicinskt syre (flödeshastighet 2 l/min) genom andningssystemet för att upprätthålla anestesin.Det implanteras genom ett direkt närmande till det laterala lårbenet.Efter hårborttagning och povidon-jod-desinfektion av huden gjordes ett ca 6 cm långt snitt på utsidan av vänstra mellersta lårbenet.Genom att öppna gapet mellan musklerna som täcker lårbenet exponeras lårbenet helt.Placera plattan framför lårbensskaftet och fixera den med fyra skruvar.Efter fixering, använd ett sågblad (1 mm tjockt) för att på konstgjord väg skapa en fraktur i området mellan det andra hålet och det fjärde hålet.I slutet av operationen tvättades såret med koksaltlösning och stängdes med suturer.Varje kanin injicerades subkutant med enrofloxacin (5 mg/kg) utspädd en tredjedel i saltlösning.Postoperativa röntgenbilder av lårbenet togs på alla djur (0, 7, 14, 21, 28 och 42 dagar) för att bekräfta benets osteotomi.Efter djup anestesi dödades alla djur med intravenös KCl (2 mmol/kg) på 28 och 42 dagar.Efter utförande skannades lårbenet med mikro-CT för att observera och jämföra benläkningsprocessen och ny benbildning mellan de fyra grupperna.
Efter utförandet samlades de mjukdelar som var i direkt kontakt med de ortopediska implantaten upp.Vävnaden fixerades i 10 % neutralt buffrat formalin över natten och dehydrerades sedan i EtOH.Den uttorkade vävnaden bäddades in i paraffin och sektionerades i en tjocklek av 40 μm med hjälp av en mikrotom (400CS; EXAKT, Tyskland).För att visualisera infektionen utfördes H&E-färgning och MT-färgning.För att kontrollera värdsvaret inkuberades den sektionerade vävnaden med primär antikropp mot kanin-anti-TNF-a (AB6671, Abcam, USA) och kanin-anti-IL-6 (AB6672; Abcam, USA) och behandlades sedan med pepparrot.Oxidas.Applicera färgningssystemet avidin-biotinkomplex (ABC) på sektionerna enligt tillverkarens instruktioner.För att framstå som en brun reaktionsprodukt användes 3,3-diaminobensidin i alla delar.En digital diascanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungern) användes för att visualisera alla skivor, och minst fyra substrat i varje grupp analyserades med ImageJ-programvara.
Röntgenbilder togs på alla djur efter operation och varje vecka för att övervaka frakturläkning (n=6 per grupp).Efter utförande användes högupplöst mikro-CT för att beräkna bildningen av kallus runt lårbenet efter läkning.Det erhållna lårbenet rengjordes, fixerades i 4 % paraformaldehyd under 3 dagar och dehydrerades i 75 % etanol.De uttorkade benen skannades sedan med hjälp av mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgien) för att generera 3D-voxelbilder (2240×2240 pixlar) av benprovet.Använd 1,0 mm Al-filter för att minska signalbruset och tillämpa hög upplösning på alla skanningar (E = 133 kVp, I = 60 μA, integrationstid = 500 ms).Nrecon programvara (version 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgien) användes för att generera en 3D-volym av det skannade provet från den förvärvade 2D-laterala projektionen.För analys är den 3D-rekonstruerade bilden uppdelad i 10 mm × 10 mm × 10 mm kuber enligt frakturplatsen.Beräkna kallus utanför det kortikala benet.Programvaran DataViewer (version 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgien) användes för att digitalt omdirigera den skannade benvolymen, och CT-Analyzer (version 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgien) användes för analys.De relativa röntgenabsorptionskoefficienterna i moget ben och förhårdnader särskiljs genom sin densitet, och sedan kvantifieras volymen av kallus (n = 4).För att bekräfta att biokompatibiliteten hos LOIS inte fördröjer benläkningsprocessen, utfördes ytterligare röntgen- och mikro-CT-analyser på två kaniner: den nakna-negativa och LOIS-gruppen.Båda grupperna avrättades under den sjätte veckan.
Lårbenen från avlivade djur samlades upp och fixerades i 4% paraformaldehyd under 3 dagar.Det ortopediska implantatet avlägsnas sedan försiktigt från lårbenet.Lårbenet avkalkades under 21 dagar med användning av 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Sedan nedsänktes det avkalkade lårbenet i EtOH för att göra det uttorkat.Det dehydratiserade lårbenet avlägsnades i xylen och bäddades in i paraffin.Därefter skivades provet med en automatisk roterande mikrotom (Leica RM2255, Leica Biosystems, Tyskland) med en tjocklek på 3 μm.För TRAP-färgning (F6760, Sigma-Aldrich, Tyskland) avparaffinerades de sektionerade proverna, rehydrerades och inkuberades i TRAP-reagens vid 37°C under 1 timme.Bilder togs med hjälp av en diabildskanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungern) och kvantifierades genom att mäta områdets täckning av det färgade området.I varje experiment analyserades minst fyra substrat i varje grupp med ImageJ-mjukvara.
Statistisk signifikansanalys utfördes med användning av GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Oparat t-test och envägsvariansanalys (ANOVA) användes för att testa skillnaderna mellan utvärderingsgrupperna.Signifikansnivån anges i figuren enligt följande: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 och ****P<0,0001;NS, ingen signifikant skillnad.
För kompletterande material till den här artikeln, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Detta är en artikel med öppen tillgång som distribueras under villkoren för Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillåter användning, distribution och reproduktion i vilket medium som helst, så länge som användningen inte är för kommersiell vinning och förutsättningen är att originalet arbetet är korrekt.Referens.
Obs: Vi ber dig endast att ange en e-postadress så att personen du rekommenderar till sidan vet att du vill att den ska se mejlet och att mejlet inte är spam.Vi kommer inte att fånga några e-postadresser.
Den här frågan används för att testa om du är en mänsklig besökare och för att förhindra automatiska skräppostmeddelanden.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
De antibakteriella och immuna flyktbeläggningarna på ortopediska implantat kan minska infektioner och immunsvar orsakade av infektioner.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
De antibakteriella och immuna flyktbeläggningarna på ortopediska implantat kan minska infektioner och immunsvar orsakade av infektioner.
©2021 American Association for the Advancement of Science.Alla rättigheter förbehållna.AAAS är partner till HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef och COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.