Para pacientes submetidos a cirurgia de implante ortopédico, as infecções bacterianas e as respostas imunológicas induzidas por infecções sempre foram riscos fatais.Os materiais biológicos convencionais são suscetíveis à contaminação biológica, o que faz com que bactérias invadam a área lesada e causem infecção pós-operatória.Portanto, existe uma necessidade urgente de desenvolver revestimentos anti-infecção e de escape imunológico para implantes ortopédicos.Aqui, desenvolvemos uma tecnologia avançada de modificação de superfície para implantes ortopédicos chamada Lubricated Orthopaedic Implant Surface (LOIS), que é inspirada na superfície lisa dos jarros de plantas.LOIS tem repelência líquida forte e duradoura a uma variedade de líquidos e substâncias biológicas (incluindo células, proteínas, cálcio e bactérias).Além disso, confirmamos a durabilidade mecânica contra arranhões e força de fixação simulando os danos inevitáveis ​​durante a cirurgia in vitro.O modelo de fratura femoral inflamatória da medula óssea de coelho foi usado para estudar minuciosamente a capacidade antibiológica e anti-infecciosa do LOIS.Prevemos que o LOIS, que possui propriedades antibioincrustantes e durabilidade mecânica, seja um passo à frente na cirurgia ortopédica livre de infecções.
Hoje, devido ao envelhecimento geral, o número de pacientes que sofrem de doenças ortopédicas (como fraturas em idosos, doenças articulares degenerativas e osteoporose) aumentou muito (1, 2).Portanto, as instituições médicas atribuem grande importância à cirurgia ortopédica, incluindo implantes ortopédicos de parafusos, placas, pregos e articulações artificiais (3, 4).No entanto, foi relatado que os implantes ortopédicos tradicionais são suscetíveis à adesão bacteriana e à formação de biofilme, o que pode causar infecção do sítio cirúrgico (ISC) após a cirurgia (5, 6).Uma vez formado o biofilme na superfície do implante ortopédico, a remoção do biofilme torna-se extremamente difícil mesmo com o uso de grandes doses de antibióticos.Portanto, geralmente leva a infecções pós-operatórias graves (7, 8).Devido aos problemas acima, o tratamento de implantes infectados deve incluir a reoperação, incluindo a remoção de todos os implantes e tecidos adjacentes;portanto, o paciente sofrerá fortes dores e alguns riscos (9, 10).
Para resolver alguns destes problemas, foram desenvolvidos implantes ortopédicos com eluição de medicamentos para prevenir infecções, eliminando bactérias aderidas à superfície (11, 12).No entanto, a estratégia ainda apresenta diversas limitações.Foi relatado que a implantação a longo prazo de implantes farmacológicos causou danos aos tecidos circundantes e causou inflamação, o que pode levar à necrose (13, 14).Além disso, os solventes orgânicos que podem existir após o processo de fabricação de implantes ortopédicos com eluição de medicamentos, que são estritamente proibidos pela Food and Drug Administration dos EUA, exigem etapas adicionais de purificação para atender aos seus padrões (15).Os implantes farmacológicos são um desafio para a liberação controlada de medicamentos e, devido à sua carga limitada de medicamentos, a aplicação do medicamento a longo prazo não é viável (16).
Outra estratégia comum é revestir o implante com um polímero anti-incrustante para evitar que matéria biológica e bactérias adiram à superfície (17).Por exemplo, os polímeros zwitteriônicos têm atraído a atenção devido às suas propriedades não adesivas quando em contato com proteínas plasmáticas, células e bactérias.Porém, apresenta algumas limitações relacionadas à estabilidade a longo prazo e durabilidade mecânica, que dificultam sua aplicação prática em implantes ortopédicos, principalmente devido à raspagem mecânica durante procedimentos cirúrgicos (18, 19).Além disso, devido à sua alta biocompatibilidade, ausência de necessidade de cirurgia de remoção e propriedades de limpeza de superfície por meio da corrosão, têm sido utilizados implantes ortopédicos feitos de materiais biodegradáveis ​​(20, 21).Durante a corrosão, as ligações químicas entre a matriz polimérica são quebradas e destacadas da superfície, e os aderentes limpam a superfície.No entanto, a incrustação antibiológica através da limpeza da superfície é eficaz num curto período de tempo.Além disso, a maioria dos materiais absorvíveis, incluindo poli(copolímero de ácido láctico-ácido glicólico) (PLGA), ácido polilático (PLA) e ligas à base de magnésio, sofrerão biodegradação e erosão desiguais no corpo, o que afetará negativamente a estabilidade mecânica.(vinte e dois).Além disso, os fragmentos da placa biodegradável fornecem um local para a fixação de bactérias, o que aumenta a chance de infecção a longo prazo.Este risco de degradação mecânica e infecção limita a aplicação prática da cirurgia plástica (23).
Superfícies superhidrofóbicas (SHP) que imitam a estrutura hierárquica das folhas de lótus tornaram-se uma solução potencial para superfícies antiincrustantes (24, 25).Quando a superfície do SHP é imersa em líquido, as bolhas de ar ficam presas, formando assim bolsas de ar e evitando a adesão bacteriana (26).Porém, estudos recentes demonstraram que a superfície SHP apresenta desvantagens relacionadas à durabilidade mecânica e estabilidade a longo prazo, o que dificulta sua aplicação em implantes médicos.Além disso, as bolsas de ar irão dissolver-se e perder as suas propriedades anti-incrustantes, resultando assim numa adesão bacteriana mais ampla devido à grande área superficial da superfície SHP (27, 28).Recentemente, Aizenberg e colegas introduziram um método inovador de revestimento de superfície anti-bioincrustante, desenvolvendo uma superfície lisa inspirada na planta Nepenthes (29, 30).A superfície lisa apresenta estabilidade de longo prazo sob condições hidráulicas, é extremamente repelente a líquidos biológicos e possui propriedades auto-reparadoras.No entanto, não existe um método para aplicar um revestimento a um implante médico de formato complexo, nem está comprovado que apoie o processo de cicatrização de tecido danificado após a implantação.
Aqui, apresentamos uma superfície de implante ortopédico lubrificada (LOIS), uma superfície de implante ortopédico micro/nanoestruturada e firmemente combinada com uma fina camada de lubrificante para evitar que seja associada à cirurgia plástica. Infecções bacterianas, como fixação de fraturas.Como a estrutura de nível micro/nano funcionalizada com flúor fixa firmemente o lubrificante na estrutura, o LOIS desenvolvido pode repelir totalmente a adesão de vários líquidos e manter o desempenho antiincrustante por um longo tempo.Os revestimentos LOIS podem ser aplicados em materiais de vários formatos destinados à síntese óssea.As excelentes propriedades anti-bioincrustantes do LOIS contra bactérias de biofilme [Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA)] e substâncias biológicas (células, proteínas e cálcio) foram confirmadas in vitro.A taxa de adesão extensiva ao substrato é inferior a 1%.Além disso, mesmo após a ocorrência de estresse mecânico, como arranhões na superfície, a autocura causada pelo lubrificante penetrante ajuda a manter suas propriedades antiincrustantes.Os resultados dos testes de durabilidade mecânica mostram que mesmo após modificações estruturais e químicas, a resistência total não será significativamente reduzida.Além disso, foi realizado um experimento in vitro que simula o estresse mecânico no ambiente cirúrgico para comprovar que o LOIS pode suportar diversos estresses mecânicos que ocorrem durante a cirurgia plástica.Finalmente, utilizamos um modelo de fratura femoral in vivo baseado em coelho, que provou que o LOIS possui propriedades antibacterianas e biocompatibilidade superiores.Os resultados radiológicos e histológicos confirmaram que o comportamento lubrificante estável e as propriedades anti-incrustantes dentro de 4 semanas após a implantação podem alcançar um desempenho eficaz de anti-infecção e escape imunológico sem atrasar o processo de cicatrização óssea.
A Figura 1A mostra um diagrama esquemático do LOIS desenvolvido, que é implantado com estruturas em escala micro/nano no modelo de fratura femoral de coelho para confirmar suas excelentes propriedades anti-biológicas de incrustação e anti-infecção.Um método biomimético é realizado para simular a superfície de um vaso de planta com água e para evitar a bioincrustação, incorporando uma camada lubrificante dentro da estrutura micro/nano da superfície.A superfície injetada com lubrificante pode minimizar o contato entre substâncias biológicas e a superfície.Portanto, devido à formação de ligações químicas estáveis ​​na superfície, possui excelente desempenho antiincrustante e estabilidade a longo prazo.Como resultado, as propriedades antibioincrustantes da superfície lubrificante permitem diversas aplicações práticas em pesquisa biomédica.No entanto, uma extensa pesquisa sobre como esta superfície especial interage no corpo ainda não foi concluída.Ao comparar o LOIS com substratos nus in vitro usando albumina e bactérias de biofilme, a não adesividade do LOIS pode ser confirmada (Figura 1B).Além disso, rolando as gotas de água no substrato nu inclinado e no substrato LOIS (Figura S1 e Filme S1), o desempenho da contaminação biológica pode ser demonstrado.Conforme mostrado na imagem do microscópio de fluorescência, o substrato exposto incubado em uma suspensão de proteínas e bactérias apresentou grande quantidade de material biológico aderido à superfície.No entanto, devido às suas excelentes propriedades anti-bioincrustantes, LOIS dificilmente apresenta qualquer fluorescência.Para confirmar suas propriedades antibioincrustantes e antiinfecciosas, o LOIS foi aplicado na superfície de implantes ortopédicos para síntese óssea (placas e parafusos) e colocado em modelo de fratura de coelho.Antes da implantação, o implante ortopédico nu e o LOIS foram incubados em suspensão bacteriana por 12 horas.A pré-incubação garante que um biofilme seja formado na superfície do implante exposto para comparação.A Figura 1C mostra uma foto do local da fratura 4 semanas após a implantação.À esquerda, um coelho com implante ortopédico descoberto apresentou grave nível de inflamação devido à formação de um biofilme na superfície do implante.O resultado oposto foi observado em coelhos implantados com LOIS, ou seja, os tecidos circundantes da LOIS não apresentaram sinais de infecção nem sinais de inflamação.Além disso, a imagem óptica à esquerda indica o sítio cirúrgico do coelho com o implante exposto, indicando que nenhum adesivo múltiplo presente na superfície do implante exposto foi encontrado na superfície do LOIS.Isto mostra que LOIS tem estabilidade a longo prazo e tem a capacidade de manter suas propriedades anti-incrustantes e anti-adesão.
(A) Diagrama esquemático do LOIS e sua implantação em modelo de fratura femoral de coelho.(B) Imagem de microscopia de fluorescência de proteínas e biofilme bacteriano em superfície nua e substrato LOIS.4 semanas após a implantação, (C) uma imagem fotográfica do local da fratura e (D) uma imagem de raio-X (destacada por um retângulo vermelho).Imagem cortesia: Kyomin Chae, Universidade Yonsei.
Os coelhos esterilizados, expostos e implantados negativamente, apresentaram um processo normal de cicatrização óssea, sem quaisquer sinais de inflamação ou infecção.Por outro lado, os implantes SHP pré-incubados numa suspensão bacteriana apresentam inflamação relacionada com a infecção nos tecidos circundantes.Isto pode ser atribuído à sua incapacidade de inibir a adesão bacteriana por um longo período (Figura S2).Para comprovar que o LOIS não afeta o processo de cicatrização, mas inibe possíveis infecções relacionadas à implantação, foram comparadas imagens radiográficas da matriz positiva exposta e do LOIS no local da fratura (Figura 1D).A imagem radiográfica do implante positivo nu mostrou linhas de osteólise persistentes, indicando que o osso não estava completamente cicatrizado.Isto sugere que o processo de recuperação óssea pode ser bastante retardado devido à inflamação relacionada à infecção.Pelo contrário, mostrou que os coelhos implantados com LOIS tinham cicatrizado e não apresentavam qualquer local de fractura evidente.
Para desenvolver implantes médicos com estabilidade e funcionalidade a longo prazo (incluindo resistência à bioincrustação), muitos esforços foram feitos.No entanto, a presença de diversas substâncias biológicas e a dinâmica da adesão tecidual limitam o desenvolvimento de seus métodos clinicamente confiáveis.Para superar essas deficiências, desenvolvemos uma estrutura em camadas micro/nano e uma superfície quimicamente modificada, que é otimizada devido à alta força capilar e afinidade química para manter o lubrificante mais suave ao máximo.A Figura 2A mostra o processo geral de fabricação do LOIS.Primeiro, prepare um substrato de aço inoxidável (SS) 304 de qualidade médica.Em segundo lugar, a estrutura micro/nano é formada no substrato SS por ataque químico utilizando solução de ácido fluorídrico (HF).Para restaurar a resistência à corrosão do SS, uma solução de ácido nítrico (HNO3) (31) é usada para processar o substrato gravado.A passivação aumenta a resistência à corrosão do substrato SS e retarda significativamente o processo de corrosão que pode reduzir o desempenho geral do LOIS.Em seguida, formando uma monocamada automontada (SAM) com 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltrietoxissilano (POTS), a superfície é quimicamente modificada para melhorar a interação química entre a superfície e o lubrificante liso Affinity.A modificação da superfície reduz significativamente a energia superficial da superfície estruturada em escala micro/nano fabricada, que corresponde à energia superficial do lubrificante liso.Isto permite que o lubrificante seja completamente umedecido, formando assim uma camada lubrificante estável na superfície.A superfície modificada exibe hidrofobicidade melhorada.Os resultados mostram que o lubrificante escorregadio apresenta comportamento estável no LOIS devido à alta afinidade química e força capilar causada pela estrutura micro/nano (32, 33).As alterações ópticas na superfície do SS após modificação da superfície e injeção de lubrificante foram estudadas.A estrutura em camadas micro/nano formadas na superfície pode causar alterações visuais e escurecer a superfície.Este fenômeno é atribuído ao maior efeito de dispersão da luz na superfície rugosa, o que aumenta a reflexão difusa causada pelo mecanismo de captura de luz (34).Além disso, após a injeção do lubrificante, o LOIS fica mais escuro.A camada lubrificante faz com que menos luz seja refletida no substrato, escurecendo assim a LOIS.A fim de otimizar a microestrutura/nanoestrutura para mostrar o menor ângulo de deslizamento (SA) para alcançar o desempenho anti-bioincrustação, microscopia eletrônica de varredura (MEV) e pares atômicos foram utilizados para realizar diferentes tempos de ataque de HF (0, 3)., 15 e 60 minutos) Microscópio de Força (AFM) (Figura 2B).Imagens SEM e AFM mostram que após um curto período de ataque (3 minutos de ataque), o substrato nu formou rugosidade irregular em nanoescala.A rugosidade da superfície muda com o tempo de condicionamento (Figura S3).A curva variável no tempo mostra que a rugosidade da superfície continua a aumentar e atinge um pico aos 15 minutos de ataque, e então apenas uma ligeira diminuição no valor da rugosidade é observada aos 30 minutos de ataque.Neste ponto, a rugosidade de nível nano é eliminada, enquanto a rugosidade de nível micro se desenvolve vigorosamente, tornando a mudança de rugosidade mais estável.Após o ataque por mais de 30 minutos, observa-se um novo aumento na rugosidade, que é explicado detalhadamente a seguir: O SS é composto de aço, ligado a elementos como ferro, cromo, níquel, molibdênio e muitos outros elementos.Entre esses elementos, o ferro, o cromo e o molibdênio desempenham um papel importante na formação de rugosidade em escala micro/nano no SS por ataque com HF.Nos estágios iniciais da corrosão, o ferro e o cromo são corroídos principalmente porque o molibdênio tem maior resistência à corrosão do que o molibdênio.À medida que o ataque avança, a solução de ataque atinge a supersaturação local, formando fluoretos e óxidos causados ​​pelo ataque.O flúor e o óxido precipitam e eventualmente redepositam-se na superfície, formando uma rugosidade superficial na faixa mícron/nano (31).Essa rugosidade de nível micro/nano desempenha um papel importante nas propriedades de autocura do LOIS.A superfície de escala dupla produz um efeito sinérgico, aumentando consideravelmente a força capilar.Este fenômeno permite que o lubrificante penetre na superfície de forma estável e contribui para propriedades de autocura (35).A formação de rugosidade depende do tempo de ataque.Com menos de 10 minutos de ataque, a superfície contém apenas rugosidade em nanoescala, o que não é suficiente para reter lubrificante suficiente para ter resistência à bioincrustação (36).Por outro lado, se o tempo de ataque ultrapassar 30 minutos, a rugosidade em nanoescala formada pela redeposição de ferro e cromo desaparecerá, permanecendo apenas a rugosidade em microescala devido ao molibdênio.A superfície excessivamente gravada carece de rugosidade em escala nanométrica e perde o efeito sinérgico da rugosidade de dois estágios, o que afeta negativamente as características de autocura do LOIS.As medições de SA foram realizadas em substratos com diferentes tempos de ataque para comprovar o desempenho antiincrustante.Vários tipos de líquidos foram selecionados com base na viscosidade e energia superficial, incluindo água deionizada (DI), sangue, etilenoglicol (EG), etanol (EtOH) e hexadecano (HD) (Figura S4).O padrão de gravação variável no tempo mostra que para vários líquidos com diferentes energias superficiais e viscosidades, o SA de LOIS após 15 minutos de gravação é o mais baixo.Portanto, LOIS é otimizado para gravar por 15 minutos para formar rugosidade em escala micrométrica e nanométrica, o que é adequado para manter efetivamente a durabilidade do lubrificante e excelentes propriedades antiincrustantes.
(A) Diagrama esquemático do processo de fabricação em quatro etapas do LOIS.A inserção mostra o SAM formado no substrato.(B) Imagens SEM e AFM, utilizadas para otimizar a estrutura micro/nano do substrato sob diferentes tempos de ataque.Espectros de espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) de (C) Cr2p e (D) F1s após passivação de superfície e revestimento SAM.au, unidade arbitrária.(E) Imagens representativas de gotículas de água em substratos nus, gravados, SHP e LOIS.(F) O ângulo de contato (CA) e medição SA de líquidos com diferentes tensões superficiais em SHP e LOIS.Os dados são expressos como média ± DP.
Então, para confirmar a mudança nas propriedades químicas da superfície, a espectroscopia de fotoelétrons de raios X (XPS) foi utilizada para estudar a mudança na composição química da superfície do substrato após cada revestimento superficial.A Figura 2C mostra os resultados da medição XPS da superfície gravada com HF e da superfície tratada com HNO3.Os dois picos principais em 587,3 e 577,7 eV podem ser atribuídos à ligação Cr-O existente na camada de óxido de cromo, que é a principal diferença da superfície gravada com HF.Isto se deve principalmente ao consumo de fluoreto de ferro e cromo na superfície pelo HNO3.A gravação à base de HNO3 permite que o cromo forme uma camada de óxido passivante na superfície, o que torna o SS gravado novamente resistente à corrosão.Na Figura 2D, os espectros XPS foram obtidos para confirmar que o silano à base de fluorocarbono foi formado na superfície após o revestimento SAM, que possui repelência a líquidos extremamente alta, mesmo para EG, sangue e EtOH.O revestimento SAM é completado pela reação de grupos funcionais silano com grupos hidroxila formados por tratamento com plasma.Como resultado, foi observado um aumento significativo nos picos de CF2 e CF3.A energia de ligação entre 286 e 296 eV indica que a modificação química foi completada com sucesso pelo revestimento SAM.SHP mostra picos relativamente grandes de CF2 (290,1 ​​eV) e CF3 (293,3 eV), que são causados ​​​​pelo silano à base de fluorocarbono formado na superfície.A Figura 2E mostra imagens ópticas representativas de medições de ângulo de contato (CA) para diferentes grupos de água deionizada em contato com água pura, gravada, SHP e LOIS.Essas imagens mostram que a superfície gravada torna-se hidrofílica devido à micro/nanoestrutura formada pelo ataque químico, de modo que a água deionizada é absorvida pela estrutura.No entanto, quando o substrato é revestido com SAM, o substrato apresenta forte repelência à água, de modo que uma superfície SHP é formada e a área de contato entre a água e a superfície é pequena.Por fim, foi observada uma diminuição no CA no LOIS, o que pode ser atribuído à penetração do lubrificante na microestrutura, aumentando assim a área de contato.Para provar que a superfície possui excelente repelência a líquidos e propriedades não adesivas, o LOIS foi comparado com o substrato SHP medindo CA e SA utilizando vários líquidos (Figura 2F).Vários tipos de líquidos foram selecionados com base na viscosidade e energia superficial, incluindo água deionizada, sangue, EG, EtOH e HD (Figura S4).Os resultados da medição de CA mostram que quando CA tende a HD, o valor de redução de CA, onde CA tem a menor energia superficial.Além disso, o LOIS da AC global é baixo.No entanto, a medição SA mostra um fenómeno completamente diferente.Exceto a água ionizada, todos os líquidos aderem ao substrato da PCH sem escorregar.Por outro lado, LOIS mostra um SA muito baixo, onde quando todo o líquido é inclinado em um ângulo inferior a 10° a 15°, todo o líquido irá rolar.Isto mostra fortemente que a não aderência do LOIS é melhor que a da superfície SHP.Além disso, os revestimentos LOIS também são aplicados em vários tipos de materiais, incluindo titânio (Ti), polifenilsulfona (PPSU), polioximetileno (POM), poliéter éter cetona (PEEK) e polímeros bioabsorvíveis (PLGA), são materiais ortopédicos implantáveis ​​(Figura S5)).As imagens sequenciais das gotículas no material tratado pelo LOIS mostram que as propriedades antibioincrustantes do LOIS são as mesmas em todos os substratos.Além disso, os resultados das medições de CA e SA mostram que as propriedades não adesivas do LOIS podem ser aplicadas a outros materiais.
A fim de confirmar as propriedades anti-incrustantes do LOIS, vários tipos de substratos (incluindo nus, gravados, SHP e LOIS) foram incubados com Pseudomonas aeruginosa e MRSA.Estas duas bactérias foram selecionadas como bactérias hospitalares representativas, o que pode levar à formação de biofilmes, levando à ISC (37).A Figura 3 (A e B) mostra as imagens do microscópio de fluorescência e os resultados da medição da unidade formadora de colônias (UFC) dos substratos incubados na suspensão bacteriana por curto prazo (12 horas) e longo prazo (72 horas), respectivamente.Num curto período de tempo, as bactérias formarão aglomerados e aumentarão de tamanho, cobrindo-se com substâncias semelhantes ao muco e impedindo a sua remoção.No entanto, durante a incubação de 72 horas, as bactérias amadurecem e tornam-se fáceis de dispersar para formar mais colónias ou aglomerados.Portanto, pode-se considerar que a incubação de 72 horas é de longo prazo e é o tempo de incubação apropriado para formar um biofilme forte na superfície (38).Num curto período de tempo, a superfície atacada e a superfície do SHP exibiram adesão bacteriana, que foi reduzida em cerca de 25% a 50% em comparação com o substrato nu.No entanto, devido ao seu excelente desempenho e estabilidade anti-bioincrustação, o LOIS não apresentou adesão de biofilme bacteriano a curto e longo prazo.O diagrama esquemático (Figura 3C) descreve a explicação do mecanismo de incrustação antibiológica da solução de ataque, SHP e LOIS.A suposição é que o substrato gravado com propriedades hidrofílicas terá uma área superficial maior do que o substrato descoberto.Portanto, ocorrerá mais adesão bacteriana no substrato gravado.No entanto, em comparação com o substrato nu, o substrato gravado possui significativamente menos biofilme formado na superfície.Isto ocorre porque as moléculas de água se ligam firmemente à superfície hidrofílica e atuam como lubrificante para a água, interferindo assim na adesão de bactérias a curto prazo (39).No entanto, a camada de moléculas de água é muito fina e solúvel em suspensões bacterianas.Portanto, a camada molecular da água desaparece por muito tempo, levando à extensa adesão e proliferação bacteriana.Para SHP, devido às suas propriedades não umectantes de curto prazo, a adesão bacteriana é inibida.A adesão bacteriana reduzida pode ser atribuída a bolsas de ar presas na estrutura em camadas e à menor energia superficial, minimizando assim o contato entre a suspensão bacteriana e a superfície.No entanto, extensa adesão bacteriana foi observada no SHP porque perdeu suas propriedades antiincrustantes por muito tempo.Isto se deve principalmente ao desaparecimento de bolsas de ar devido à pressão hidrostática e à dissolução do ar na água.Isto se deve principalmente ao desaparecimento das bolsas de ar devido à dissolução e à estrutura em camadas que proporciona uma maior área superficial para adesão (27, 40).Ao contrário destes dois substratos que têm um efeito importante na estabilidade a longo prazo, o lubrificante contido no LOIS é injetado na estrutura micro/nano e não desaparecerá mesmo a longo prazo.Os lubrificantes preenchidos com micro/nano estruturas são muito estáveis ​​e são fortemente atraídos para a superfície devido à sua alta afinidade química, evitando assim a adesão bacteriana por um longo tempo.A Figura S6 mostra uma imagem de microscópio confocal de reflexão de um substrato infundido com lubrificante imerso em solução salina tamponada com fosfato (PBS).Imagens contínuas mostram que mesmo após 120 horas de leve agitação (120 rpm), a camada lubrificante no LOIS permanece inalterada, indicando estabilidade a longo prazo sob condições de fluxo.Isto se deve à alta afinidade química entre o revestimento SAM à base de flúor e o lubrificante à base de perfluorocarbono, de modo que uma camada lubrificante estável pode ser formada.Portanto, o desempenho antiincrustante é mantido.Além disso, o substrato foi testado contra proteínas representativas (albumina e fibrinogênio), que estão no plasma, células intimamente relacionadas à função imunológica (macrófagos e fibroblastos) e aquelas relacionadas à formação óssea.O teor de cálcio é muito alto.(Figura 3D, 1 e 2, e Figura S7) (41, 42).Além disso, as imagens do microscópio de fluorescência do teste de adesão para fibrinogênio, albumina e cálcio mostraram diferentes características de adesão de cada grupo de substrato (Figura S8).Durante a formação óssea, camadas recém-formadas de osso e cálcio podem envolver o implante ortopédico, o que não só dificulta a remoção, mas também pode causar danos inesperados ao paciente durante o processo de remoção.Portanto, baixos níveis de depósitos de cálcio nas placas ósseas e nos parafusos são benéficos para cirurgias ortopédicas que requerem a remoção do implante.Com base na quantificação da área anexada com base na intensidade de fluorescência e na contagem de células, confirmamos que o LOIS apresenta excelentes propriedades anti-bioincrustantes para todas as substâncias biológicas em comparação com outros substratos.De acordo com os resultados de experimentos in vitro, o antibiológico LOIS pode ser aplicado em implantes ortopédicos, que podem não apenas inibir infecções causadas por bactérias do biofilme, mas também reduzir a inflamação causada pelo sistema imunológico ativo do corpo.
(A) Imagens de microscópio de fluorescência de cada grupo (nu, gravado, SHP e LOIS) incubados em suspensões de Pseudomonas aeruginosa e MRSA por 12 e 72 horas.(B) O número de UFC aderentes de Pseudomonas aeruginosa e MRSA na superfície de cada grupo.(C) Diagrama esquemático do mecanismo de incrustação antibiológica de ataque químico de curto e longo prazo, SHP e LOIS.(D) (1) O número de fibroblastos aderidos a cada substrato e imagens de microscópio de fluorescência das células aderidas ao nu e ao LOIS.(2) Teste de adesão de proteínas relacionadas ao sistema imunológico, albumina e cálcio envolvidos no processo de cicatrização óssea (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 e **** P <0,0001).ns, não é importante.
No caso de tensões concentradas inevitáveis, a durabilidade mecânica sempre foi o principal desafio para a aplicação de revestimentos antiincrustantes.Os métodos tradicionais de gel anti-esgoto são baseados em polímeros com baixa solubilidade e fragilidade em água.Portanto, eles são geralmente suscetíveis ao estresse mecânico em aplicações biomédicas.Portanto, os revestimentos anti-incrustantes mecanicamente duráveis ​​continuam a ser um desafio para aplicações como implantes ortopédicos (43, 44).A Figura 4A(1) demonstra os dois principais tipos de tensão aplicada aos implantes ortopédicos, incluindo arranhões (tensão de cisalhamento) e compressão com a imagem óptica do implante danificado produzida pela pinça.Por exemplo, quando o parafuso é apertado com uma chave de fenda, ou quando o cirurgião segura a placa óssea firmemente com uma pinça e aplica força compressiva, a placa óssea plástica será danificada e arranhada nas escalas macro e micro/nano (Figura 4A, 2).Para testar se o LOIS fabricado pode suportar esses danos durante a cirurgia plástica, foi realizada nanoindentação para comparar a dureza do substrato descoberto e o LOIS na escala micro/nano para estudar as propriedades mecânicas da estrutura micro/nano Impacto (Figura 4B).O diagrama esquemático mostra os diferentes comportamentos de deformação do LOIS devido à presença de micro/nano estruturas.Uma curva de deslocamento de força foi desenhada com base nos resultados da nanoindentação (Figura 4C).A imagem azul representa o substrato nu, que apresenta apenas uma ligeira deformação, conforme visto pela profundidade máxima de indentação de 0,26 μm.Por outro lado, o aumento gradual da força de nanoindentação e do deslocamento observado na LOIS (curva vermelha) pode mostrar sinais de propriedades mecânicas reduzidas, resultando em uma profundidade de nanoindentação de 1,61μm.Isso ocorre porque a estrutura micro/nano presente no LOIS proporciona um espaço de avanço mais profundo para a ponta do nanoindentador, de modo que sua deformação é maior que a do substrato nu.Konsta-Gdoutos et al.(45) acredita que devido à presença de nanoestruturas, a nanoindentação e a micro/nano rugosidade levam a curvas de nanoindentação irregulares.A área sombreada corresponde à curva de deformação irregular atribuída à nanoestrutura, enquanto a área não sombreada é atribuída à microestrutura.Esta deformação pode danificar a microestrutura/nanoestrutura do lubrificante de retenção e afetar negativamente o seu desempenho anti-incrustante.A fim de estudar o impacto dos danos na LOIS, danos inevitáveis ​​às micro/nano estruturas foram replicados no corpo durante a cirurgia plástica.Usando testes de adesão de sangue e proteínas, a estabilidade das propriedades anti-bioincrustantes do LOIS após in vitro pode ser determinada (Figura 4D).Uma série de imagens ópticas mostra os danos ocorridos próximos aos furos de cada substrato.Um teste de adesão sanguínea foi realizado para demonstrar o efeito do dano mecânico no revestimento anti-bioincrustante (Figura 4E).Assim como o SHP, as propriedades antiincrustantes são perdidas devido a danos, e o LOIS exibe excelentes propriedades antiincrustantes ao repelir o sangue.Isso ocorre porque, como a energia superficial é impulsionada pela ação capilar que cobre a área danificada, o fluxo no lubrificante lubrificante microestruturado restaura as propriedades antiincrustantes (35).A mesma tendência foi observada no teste de adesão proteica utilizando albumina.Na área danificada, a adesão da proteína na superfície do SHP é amplamente observada e, medindo sua cobertura de área, pode ser quantificada como metade do nível de adesão do substrato nu.Por outro lado, LOIS manteve suas propriedades antibioincrustantes sem causar adesão (Figura 4, F e G).Além disso, a superfície do parafuso é frequentemente submetida a fortes esforços mecânicos, como a perfuração, por isso estudamos a capacidade do revestimento LOIS de permanecer intacto no parafuso in vitro.A Figura 4H mostra imagens ópticas de diferentes parafusos, incluindo bare, SHP e LOIS.O retângulo vermelho representa a área alvo onde ocorre forte estresse mecânico durante a implantação óssea.Semelhante ao teste de adesão proteica da placa, um microscópio de fluorescência é usado para visualizar a adesão proteica e medir a área de cobertura para provar a integridade do revestimento LOIS, mesmo sob forte estresse mecânico (Figura 4, I e J).Os parafusos tratados com LOIS apresentam excelente desempenho antiincrustante e quase nenhuma proteína adere à superfície.Por outro lado, a adesão proteica foi observada em parafusos não revestidos e parafusos SHP, onde a área de cobertura dos parafusos SHP foi um terço daquela dos parafusos não revestidos.Além disso, o implante ortopédico utilizado para fixação deve ser mecanicamente resistente para suportar o estresse aplicado no local da fratura, conforme mostra a Figura 4K.Portanto, um teste de flexão foi realizado para determinar o efeito da modificação química nas propriedades mecânicas.Além disso, isso é feito para manter a tensão fixa do implante.Aplique força mecânica vertical até que o implante esteja totalmente dobrado e uma curva tensão-deformação seja obtida (Figura 4L, 1).Duas propriedades, incluindo módulo de Young e resistência à flexão, foram comparadas entre substratos nus e LOIS como indicadores de sua resistência mecânica (Figura 4L, 2 e 3).O módulo de Young indica a capacidade de um material resistir a mudanças mecânicas.O módulo de Young de cada substrato é 41,48±1,01 e 40,06±0,96 GPa, respectivamente;a diferença observada é de cerca de 3,4%.Além disso, é relatado que a resistência à flexão, que determina a tenacidade do material, é de 102,34±1,51 GPa para o substrato nu e 96,99±0,86 GPa para SHP.O substrato nu é aproximadamente 5,3% maior.A ligeira diminuição nas propriedades mecânicas pode ser causada pelo efeito entalhe.No efeito entalhe, a rugosidade micro/nano pode atuar como um conjunto de entalhes, levando à concentração local de tensões e afetando as propriedades mecânicas do implante (46).No entanto, com base no facto de que a rigidez do osso cortical humano é relatada entre 7,4 e 31,6 GPa, e o módulo LOIS medido excede o do osso cortical humano (47), o LOIS é suficiente para suportar a fractura e o seu impacto global. as propriedades mecânicas são minimamente afetadas pela modificação da superfície.
(A) Diagrama esquemático de (1) o estresse mecânico aplicado ao implante ortopédico durante a operação e (2) a imagem óptica do implante ortopédico danificado.(B) Diagrama esquemático da medição de propriedades nanomecânicas por nanoindentação e LOIS na superfície nua.(C) Curva de força-deslocamento de nanoindentação de superfície nua e LOIS.(D) Após experimentos in vitro, simule as imagens ópticas de diferentes tipos de placas ortopédicas (a área danificada é destacada com um retângulo vermelho) para simular o estresse mecânico causado durante a operação.(E) Teste de adesão sanguínea e (F) teste de adesão proteica do grupo de placas ortopédicas danificadas.(G) Medir a cobertura da área da proteína aderida à placa.(H) Imagens ópticas de diferentes tipos de parafusos ortopédicos após experimento in vitro.(I) Teste de adesão de proteínas para estudar a integridade de diferentes revestimentos.(J) Meça a cobertura da área da proteína aderindo ao parafuso.(K) O movimento do coelho destina-se a gerar uma tensão fixa no osso fraturado.(L) (1) Resultados de testes de dobra e imagens ópticas antes e depois da dobra.A diferença em (2) módulo de Young e (3) resistência à flexão entre implante descoberto e SHP.Os dados são expressos como média ± DP (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 e ****P<0,0001).Imagem cortesia: Kyomin Chae, Universidade Yonsei.
Em situações clínicas, a maior parte do contato bacteriano com materiais biológicos e locais de feridas vem de biofilmes maduros e maduros (48).Portanto, os Centros de Controle e Prevenção de Doenças dos EUA estimam que 65% de todas as infecções humanas estão relacionadas a biofilmes (49).Neste caso, é necessário fornecer um desenho experimental in vivo que proporcione formação consistente de biofilme na superfície do implante.Portanto, desenvolvemos um modelo de fratura femoral de coelho no qual os implantes ortopédicos foram pré-incubados em uma suspensão bacteriana e depois implantados em fêmures de coelhos para estudar as propriedades anti-incrustantes do LOIS in vivo.Devido aos três factos importantes seguintes, as infecções bacterianas são induzidas por pré-cultura em vez de injecção directa de suspensões bacterianas: (i) O sistema imunitário dos coelhos é naturalmente mais forte que o dos humanos;portanto, é possível a injeção de suspensões bacterianas e bactérias planctônicas. Não tem efeito na formação de biofilmes.(Ii) As bactérias planctônicas são mais suscetíveis aos antibióticos, e os antibióticos são geralmente usados ​​após a cirurgia;finalmente, (iii) a suspensão de bactérias planctônicas pode ser diluída pelos fluidos corporais do animal (50).Ao pré-cultivar o implante em uma suspensão bacteriana antes da implantação, podemos estudar minuciosamente os efeitos nocivos da infecção bacteriana e da reação de corpo estranho (FBR) no processo de cicatrização óssea.Os coelhos foram sacrificados 4 semanas após a implantação, pois a osseointegração essencial para o processo de cicatrização óssea estará concluída em 4 semanas.Em seguida, os implantes foram removidos dos coelhos para estudos posteriores.A Figura 5A mostra o mecanismo de proliferação de bactérias.O implante ortopédico infectado é introduzido no corpo.Como resultado da pré-incubação em suspensão bacteriana, seis dos seis coelhos implantados com implantes nus foram infectados, enquanto nenhum dos coelhos implantados com implantes tratados com LOIS foi infectado.As infecções bacterianas ocorrem em três etapas, incluindo crescimento, maturação e dispersão (51).Primeiro, as bactérias aderidas se reproduzem e crescem na superfície e, em seguida, as bactérias formam um biofilme quando excretam polímero extracelular (EPS), amiloide e DNA extracelular.O biofilme não só interfere na penetração dos antibióticos, mas também promove o acúmulo de enzimas que degradam os antibióticos (como a β-lactamase) (52).Finalmente, o biofilme espalha as bactérias maduras nos tecidos circundantes.Portanto, ocorre infecção.Além disso, quando um corpo estranho entra no corpo, uma infecção que pode causar uma forte resposta imunológica pode causar inflamação intensa, dor e diminuição da imunidade.A Figura 5B fornece uma visão geral da FBR causada pela inserção de um implante ortopédico, em vez da resposta imune causada por uma infecção bacteriana.O sistema imunológico reconhece o implante inserido como um corpo estranho e, em seguida, faz com que as células e os tecidos reajam para encapsular o corpo estranho (53).Nos primórdios da FBR, uma matriz de fornecimento foi formada na superfície dos implantes ortopédicos, o que resultou na adsorção de fibrinogênio.O fibrinogênio adsorvido forma então uma rede de fibrina altamente densa, que promove a fixação de leucócitos (54).Uma vez formada a rede de fibrina, ocorrerá inflamação aguda devido à infiltração de neutrófilos.Nesta etapa, uma variedade de citocinas, como fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interleucina-4 (IL-4) e IL-β, são liberadas e os monócitos começam a se infiltrar no local de implantação e a se diferenciar em células gigantes.Fago (41, 55, 56).A redução da FBR sempre foi um desafio porque a FBR excessiva pode causar inflamação aguda e crônica, o que pode levar a complicações fatais.Para avaliar o impacto das infecções bacterianas nos tecidos ao redor do implante nu e do LOIS, foram utilizadas coloração com hematoxilina e eosina (H&E) e tricrômico de Masson (MT).Para coelhos implantados com substratos nus, as infecções bacterianas graves progrediram e as lâminas de tecido H&E mostraram claramente abcessos e necrose causados ​​por inflamação.Por outro lado, a superfície anti-biofouling extremamente forte LOIS inibe a adesão bacteriana, por isso não mostra sinais de infecção e reduz a inflamação (Figura 5C).Os resultados da coloração MT mostraram a mesma tendência.No entanto, a coloração MT também mostrou edema em coelhos implantados com LOIS, indicando que a recuperação está prestes a ocorrer (Figura 5D).Para estudar o grau de resposta imune, foi realizada coloração imuno-histoquímica (IHQ) utilizando citocinas TNF-α e IL-6 relacionadas à resposta imune.Um implante negativo nu que não foi exposto a bactérias foi comparado com um LOIS que foi exposto a bactérias, mas não infectado, para estudar o processo de cicatrização na ausência de infecção bacteriana.A Figura 5E mostra uma imagem óptica de uma lâmina IHC que expressa TNF-α.A área marrom representa a resposta imune, indicando que a resposta imune na LOIS é ligeiramente reduzida.Além disso, a expressão de IL-6 em LOIS foi significativamente menor que a expressão negativa de nu estéril (Figura 5F).A expressão da citocina foi quantificada medindo a área de coloração do anticorpo correspondente à citocina (Figura 5G).Em comparação com os coelhos expostos aos implantes negativos, os níveis de expressão dos coelhos implantados com LOIS foram mais baixos, mostrando uma diferença significativa.A diminuição na expressão de citocinas indica que as propriedades anti-incrustantes estáveis ​​e de longo prazo do LOIS não estão apenas relacionadas à inibição de infecções bacterianas, mas também à diminuição da FBR, que é induzida por macrófagos aderindo ao substrato (53, 57, 58).Portanto, a resposta imune reduzida devido às propriedades de evasão imunológica do LOIS pode resolver os efeitos colaterais após a implantação, como a resposta imune excessiva após cirurgia plástica.
(A) Um diagrama esquemático do mecanismo de formação e propagação de biofilme na superfície de um implante ortopédico infectado.eDNA, DNA extracelular.(B) Diagrama esquemático da resposta imune após inserção de implante ortopédico.(C) coloração H&E e (D) coloração MT dos tecidos circundantes de implantes ortopédicos com positivo nu e LOIS.IHC de citocinas relacionadas ao sistema imunológico (E) TNF-α e (F) IL-6 são imagens coradas de coelhos nus negativos e implantados com LOIS.(G) Quantificação da expressão de citocinas por medição de cobertura de área (** P <0,01).
A biocompatibilidade do LOIS e seu efeito no processo de cicatrização óssea foram examinados in vivo usando imagens de diagnóstico [raio-X e tomografia microcomputadorizada (TC)] e IHC de osteoclastos.A Figura 6A mostra o processo de cicatrização óssea envolvendo três fases diferentes: inflamação, reparação e remodelação.Quando ocorre uma fratura, células inflamatórias e fibroblastos penetram no osso fraturado e começam a crescer no tecido vascular.Durante a fase de reparo, o crescimento do tecido vascular se espalha próximo ao local da fratura.O tecido vascular fornece nutrientes para a formação de novo osso, denominado calo.A fase final do processo de cicatrização óssea é a fase de remodelação, na qual o tamanho do calo é reduzido ao tamanho do osso normal com a ajuda do aumento do nível de osteoclastos ativados (59).A reconstrução tridimensional (3D) do local da fratura foi realizada por meio de microtomografia computadorizada para observar as diferenças no nível de formação de calo em cada grupo.Observe o corte transversal do fêmur para observar a espessura do calo que circunda o osso fraturado (Figura 6, B e C).Radiografias também foram utilizadas para examinar os locais de fratura de todos os grupos todas as semanas para observar os diferentes processos de regeneração óssea em cada grupo (Figura S9).Calos e ossos maduros são mostrados em azul/verde e marfim, respectivamente.A maioria dos tecidos moles é filtrada com um limite predefinido.Nude positivo e SHP confirmaram a formação de uma pequena quantidade de calo ao redor do local da fratura.Por outro lado, o negativo exposto da LOIS e o local da fratura são circundados por calo espesso.Imagens de micro-CT mostraram que a formação de calo foi prejudicada por infecção bacteriana e inflamação relacionada à infecção.Isto ocorre porque o sistema imunológico prioriza a cura de lesões sépticas causadas por inflamação relacionada à infecção, em vez da recuperação óssea (60).A coloração IHC e fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) foi realizada para observar a atividade dos osteoclastos e a reabsorção óssea (Figura 6D) (61).Apenas alguns osteoclastos ativados corados em roxo foram encontrados em positivos nus e SHP.Por outro lado, muitos osteoclastos ativados foram observados próximos aos ossos nus positivos e maduros de LOIS.Esse fenômeno indica que na presença de osteoclastos o calo ao redor do local da fratura está passando por um violento processo de remodelação (62).O volume ósseo e a área de expressão de osteoclastos do calo foram medidos para comparar o nível de formação de calo ao redor do local da fratura em todos os grupos, de modo a quantificar os resultados da micro-TC e IHQ (Figura 6E, 1 e 2).Como esperado, os negativos nus e a formação de calos no LOIS foram significativamente maiores do que nos outros grupos, indicando que ocorreu remodelação óssea positiva (63).A Figura S10 mostra a imagem óptica do sítio cirúrgico, o resultado da coloração MT do tecido coletado próximo ao parafuso e o resultado da coloração TRAP destacando a interface parafuso-osso.No substrato descoberto, foi observada forte formação de calos e fibrose, enquanto o implante tratado com LOIS mostrou uma superfície relativamente não aderida.Da mesma forma, em comparação com os negativos nus, foi observada menor fibrose em coelhos implantados com LOIS, conforme indicado pelas setas brancas.Além disso, o edema firme (seta azul) pode ser atribuído às propriedades de evasão imunológica da LOIS, reduzindo assim a inflamação grave.A superfície antiaderente ao redor do implante e a redução da fibrose sugerem que o processo de remoção é mais fácil, o que geralmente resulta em outras fraturas ou inflamações.O processo de consolidação óssea após a remoção do parafuso foi avaliado pela atividade dos osteoclastos na interface parafuso-osso.Tanto o osso descoberto quanto a interface do implante LOIS absorveram níveis semelhantes de osteoclastos para promover a cicatrização óssea, indicando que o revestimento LOIS não tem efeito negativo na cicatrização óssea ou na resposta imunológica.Para confirmar que a modificação superficial realizada no LOIS não interfere no processo de cicatrização óssea, o exame radiográfico foi utilizado para comparar a cicatrização óssea dos coelhos com íons negativos expostos e 6 semanas de implantação do LOIS (Figura 6F).Os resultados mostraram que, em comparação com o grupo positivo nu não infectado, o LOIS apresentou o mesmo grau de consolidação óssea e não houve sinais óbvios de fratura (linha de osteólise contínua) em ambos os grupos.
(A) Diagrama esquemático do processo de consolidação óssea após fratura.(B) A diferença no grau de formação de calo de cada grupo de superfície e (C) a imagem transversal do local da fratura.(D) coloração TRAP para visualizar a atividade dos osteoclastos e a reabsorção óssea.Com base na atividade TRAP, a formação de calo externo do osso cortical foi analisada quantitativamente por (E) (1) micro-CT e (2) atividade osteoclástica.(F) 6 semanas após a implantação, imagens de raios X do osso fraturado do negativo exposto (destacado pelo retângulo tracejado vermelho) e LOIS (destacado pelo retângulo tracejado azul).A análise estatística foi realizada por análise de variância unidirecional (ANOVA).*P<0,05.**P<0,01.
Resumindo, LOIS fornece um novo tipo de estratégia de infecção antibacteriana e revestimento de escape imunológico para implantes ortopédicos.Os implantes ortopédicos convencionais com funcionalização SHP apresentam propriedades antibioincrustantes de curto prazo, mas não conseguem manter suas propriedades por muito tempo.A superhidrofobicidade do substrato retém bolhas de ar entre as bactérias e o substrato, formando assim bolsas de ar, prevenindo assim a infecção bacteriana.No entanto, devido à difusão do ar, estas bolsas de ar são facilmente removidas.Por outro lado, LOIS provou bem a sua capacidade de prevenir infecções relacionadas com biofilme.Portanto, devido às propriedades anti-rejeição da camada lubrificante injetada na superfície da micro/nanoestrutura em camadas, a inflamação relacionada à infecção pode ser evitada.Vários métodos de caracterização, incluindo medições SEM, AFM, XPS e CA, são usados ​​para otimizar as condições de fabricação do LOIS.Além disso, LOIS também pode ser aplicado a diversos materiais biológicos comumente utilizados em equipamentos de fixação ortopédica, como PLGA, Ti, PE, POM e PPSU.Em seguida, o LOIS foi testado in vitro para comprovar suas propriedades antibioincrustantes contra bactérias e substâncias biológicas relacionadas à resposta imunológica.Os resultados mostram que possui excelentes efeitos antibacterianos e antibioincrustantes em comparação com o implante simples.Além disso, LOIS apresenta resistência mecânica mesmo após aplicação de estresse mecânico, o que é inevitável em cirurgia plástica.Devido às propriedades de autocura do lubrificante na superfície da estrutura micro/nano, LOIS manteve com sucesso suas propriedades anti-incrustantes biológicas.A fim de estudar a biocompatibilidade e as propriedades antibacterianas do LOIS in vivo, o LOIS foi implantado no fêmur de coelho por 4 semanas.Nenhuma infecção bacteriana foi observada em coelhos implantados com LOIS.Além disso, o uso de IHQ demonstrou um nível reduzido de resposta imune local, indicando que LOIS não inibe o processo de cicatrização óssea.LOIS exibe excelentes propriedades antibacterianas e de evasão imunológica, e foi comprovado que previne eficazmente a formação de biofilme antes e durante a cirurgia ortopédica, especialmente para síntese óssea.Utilizando um modelo de fratura femoral inflamatória da medula óssea de coelho, o efeito de infecções relacionadas ao biofilme no processo de cicatrização óssea induzido por implantes pré-incubados foi profundamente estudado.Como estudo futuro, é necessário um novo modelo in vivo para estudar possíveis infecções após a implantação para compreender e prevenir completamente infecções relacionadas ao biofilme durante todo o processo de cicatrização.Além disso, a osteoindução ainda é um desafio não resolvido na integração com LOIS.Mais pesquisas são necessárias para combinar a adesão seletiva de células osteoindutoras ou medicina regenerativa com LOIS para superar o desafio.No geral, LOIS representa um revestimento de implante ortopédico promissor com robustez mecânica e excelentes propriedades antibioincrustantes, que podem reduzir ISC e efeitos colaterais imunológicos.
Lave o substrato 304 SS de 15 mm x 15 mm x 1 mm (Dong Kang M-Tech Co., Coreia) em acetona, EtOH e água DI por 15 minutos para remover contaminantes.Para formar uma estrutura de nível micro/nano na superfície, o substrato limpo é imerso em uma solução de HF de 48% a 51% (DUKSAN Corp., Coreia do Sul) a 50°C.O tempo de gravação varia de 0 a 60 minutos.Em seguida, o substrato gravado foi limpo com água deionizada e colocado em uma solução de HNO3 a 65% (Korea DUKSAN Corp.) a 50°C por 30 minutos para formar uma camada de passivação de óxido de cromo na superfície.Após a passivação, o substrato é lavado com água deionizada e seco para obter um substrato com estrutura em camadas.Em seguida, o substrato foi exposto a plasma de oxigênio (100 W, 3 minutos) e imediatamente imerso em solução de POTS 8,88 mM (Sigma-Aldrich, Alemanha) em tolueno em temperatura ambiente por 12 horas.Em seguida, o substrato revestido com POTS foi limpo com EtOH e recozido a 150°C durante 2 horas para obter um POTS SAM denso.Após o revestimento SAM, uma camada lubrificante foi formada no substrato aplicando um lubrificante perfluoropoliéter (Krytox 101; DuPont, EUA) com volume de carga de 20 μm/cm 2. Antes de usar, filtre o lubrificante através de um filtro de 0,2 mícron.Remova o excesso de lubrificante inclinando-o em um ângulo de 45° por 15 minutos.O mesmo procedimento de fabricação foi utilizado para implantes ortopédicos confeccionados em aço inoxidável 304 (placa de travamento e parafuso de travamento cortical; Dong Kang M-Tech Co., Coréia).Todos os implantes ortopédicos são projetados para se adaptarem à geometria do fêmur do coelho.
A morfologia da superfície do substrato e dos implantes ortopédicos foi inspecionada por emissão de campo SEM (Inspect F50, FEI, EUA) e AFM (XE-100, Park Systems, Coreia do Sul).A rugosidade superficial (Ra, Rq) é medida multiplicando a área de 20 μm por 20 μm (n=4).Um sistema XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japão) equipado com uma fonte de raios X Al Kα com tamanho de ponto de 100μm2 foi utilizado para analisar a composição química da superfície.Um sistema de medição de CA equipado com uma câmera de captura de imagem dinâmica (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Coreia do Sul) foi utilizado para medir CA e SA líquidos.Para cada medição, 6 a 10 μl de gotículas (água deionizada, sangue de cavalo, EG, etanol a 30% e HD) são colocados na superfície para medir CA.Quando o ângulo de inclinação do substrato aumenta a uma velocidade de 2°/s (n = 4), o SA é medido quando a gota cai.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] e MRSA (ATCC 25923) foram adquiridos da ATCC (Manassas, Virgínia, EUA), e a cultura estoque foi mantida a -80°C.Antes do uso, a cultura congelada foi incubada em caldo de soja descongelado com tripsina (Komed, Coréia) a 37°C por 18 horas e depois transferida duas vezes para ativá-la.Após a incubação, a cultura foi centrifugada a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4°C e lavada duas vezes com solução de PBS (pH 7,3).A cultura centrifugada é então subcultivada em placas de ágar sangue (BAP).MRSA e Pseudomonas aeruginosa foram preparados durante a noite e cultivados em caldo Luria-Bertani.A concentração de Pseudomonas aeruginosa e MRSA no inóculo foi determinada quantitativamente pelas UFC da suspensão em diluições seriadas em ágar.Em seguida, ajuste a concentração bacteriana para 0,5 padrão McFarland, o que equivale a 108 UFC/ml.Em seguida, dilua a suspensão bacteriana de trabalho 100 vezes para 106 UFC/ml.Para testar as propriedades de adesão antibacteriana, o substrato foi esterilizado a 121°C durante 15 minutos antes da utilização.O substrato foi então transferido para 25 ml de suspensão bacteriana e incubado a 37°C com agitação vigorosa (200 rpm) por 12 e 72 horas.Após a incubação, cada substrato foi removido da incubadora e lavado 3 vezes com PBS para remover quaisquer bactérias flutuantes na superfície.Para observar o biofilme no substrato, o biofilme foi fixado com metanol e corado com 1 ml de laranja crimidina por 2 minutos.Em seguida, um microscópio de fluorescência (BX51TR, Olympus, Japão) foi utilizado para tirar fotos do biofilme corado.Para quantificar o biofilme no substrato, as células aderidas foram separadas do substrato pelo método de vórtice de esferas, que foi considerado o método mais adequado para remover bactérias aderidas (n = 4).Usando uma pinça estéril, remova o substrato do meio de crescimento e bata na placa do poço para remover o excesso de líquido.As células frouxamente fixadas foram removidas lavando duas vezes com PBS estéril.Cada substrato foi então transferido para um tubo de ensaio estéril contendo 9 ml de proteína salina ept a 0,1% (PSW) e 2 g de 20 a 25 esferas de vidro estéreis (0,4 a 0,5 mm de diâmetro).Foi então agitado em vórtex durante 3 minutos para separar as células da amostra.Após agitação no vórtex, a suspensão foi diluída em série 10 vezes com PSW a 0,1% e depois inoculou-se 0,1 ml de cada diluição em BAP.Após 24 horas de incubação a 37°C, as UFC foram contadas manualmente.
Para as células, foram utilizados fibroblastos de camundongo NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) e macrófagos de camundongo RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC).Use meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Coréia) para cultivar fibroblastos de camundongo e suplementar com 10% de soro de bezerro (S103-01, Welgene) e 1% de penicilina-estreptomicina (PS; LS202-02, Welgene (Welgene ). Use DMEM para cultivar macrófagos de camundongos, suplementados com 10% de soro bovino fetal (S001-01, Welgene) e 1% de PS. Coloque o substrato em uma placa de cultura de células de seis poços e inocule as células a 105 células/cm2. As células foram incubadas durante a noite a 37°C e 5% de CO2. Para coloração celular, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 20 minutos e colocadas em Triton X a 0,5%. Incubar durante 5 minutos em -100ºC. a 37°C durante 30 minutos Após o processo de incubação, utilizar o substrato com meio de fixação VECTASHIELD 4',6-diamino-2-fenilindole (H -1200, Vector Laboratories, UK) (n = 4 por célula). , fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína-albumina (A9771, Sigma-Aldrich, Alemanha) e plasma humano O fibrinogênio conjugado com Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, EUA) foi dissolvido em PBS (10 mM, pH 7,4).As concentrações de albumina e fibrinogênio foram de 1 e 150 μg/ml, respectivamente.Após o substrato Antes de mergulhar na solução proteica, lave-os com PBS para reidratar a superfície.Em seguida, mergulhe todos os substratos em uma placa de seis poços contendo a solução proteica e incube a 37°C por 30 e 90 minutos.Após a incubação, o substrato foi então removido da solução proteica, lavado suavemente com PBS 3 vezes e fixado com paraformaldeído a 4% (n = 4 para cada proteína).Para cálcio, cloreto de sódio (0,21 M) e fosfato de potássio (3,77 mM) foram dissolvidos em água deionizada.O pH da solução foi ajustado para 2,0 pela adição de solução de cloridrato (1M).Depois dissolveu-se cloreto de cálcio (5,62 mM) na solução.Ao adicionar tris(hidroximetil)-amino metano 1M ajusta o pH da solução para 7,4.Mergulhe todos os substratos em uma placa de seis poços preenchida com solução de fosfato de cálcio 1,5× e retire da solução após 30 minutos.Para coloração, 2 g de Alizarin Red S (CI 58005) Misture com 100 ml de água desionizada.Em seguida, use hidróxido de amônio a 10% para ajustar o pH para 4. Tinja o substrato com solução de Alizarin Red por 5 minutos e, em seguida, sacuda o excesso de corante e seque.Após o processo de agitação, retire o substrato.O material é desidratado, depois imerso em acetona por 5 minutos, depois imerso em solução de acetona-xileno (1:1) por 5 minutos e finalmente lavado com xileno (n = 4).É utilizado microscópio de fluorescência (Axio Imager) com lentes objetivas ×10 e ×20..A2m, Zeiss, Alemanha) cria imagens de todos os substratos.ImageJ/FIJI (//imagej.nih.gov/ij/) foi usado para quantificar os dados de adesão de substâncias biológicas em cada grupo de quatro diferentes áreas de imagem.Converta todas as imagens em imagens binárias com limites fixos para comparação de substrato.
Um microscópio confocal Zeiss LSM 700 foi utilizado para monitorar a estabilidade da camada lubrificante no PBS no modo de reflexão.A amostra de vidro revestida com SAM à base de flúor com uma camada lubrificante injetada foi imersa em uma solução de PBS e testada usando um agitador orbital (SHO-1D; Daihan Scientific, Coreia do Sul) sob condições de agitação suave (120 rpm).Em seguida, pegue a amostra e monitore a perda de lubrificante medindo a perda de luz refletida.Para adquirir imagens de fluorescência em modo de reflexão, a amostra é exposta a um laser de 633 nm e depois coletada, pois a luz será refletida de volta pela amostra.As amostras foram medidas em intervalos de tempo de 0, 30, 60 e 120 horas.
Para determinar a influência do processo de modificação de superfície nas propriedades nanomecânicas de implantes ortopédicos, um nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, EUA) equipado com ponta de diamante Berkovich em formato de pirâmide de três lados foi utilizado para medir a nanoindenediona.A carga de pico é de 10 mN e a área é de 100μmx 100μm.Para todas as medições, o tempo de carga e descarga é de 10 s, e o tempo de retenção sob carga de pico de indentação é de 2 s.Faça medições em cinco locais diferentes e calcule a média.Para avaliar o desempenho da resistência mecânica sob carga, foi realizado um ensaio de flexão transversal de três pontos utilizando uma máquina de ensaios universal (Instron 5966, Instron, EUA).O substrato é comprimido a uma taxa constante de 10 N/s com uma carga aumentada.O programa Bluehill Universal (n = 3) foi utilizado para calcular o módulo de flexão e a tensão de compressão máxima.
Para simular o processo de operação e os danos mecânicos relacionados causados ​​durante a operação, o processo de operação foi realizado in vitro.Os fêmures foram coletados dos coelhos brancos da Nova Zelândia executados.O fêmur foi limpo e fixado em paraformaldeído a 4% por 1 semana.Conforme descrito no método experimental animal, o fêmur fixo foi operado cirurgicamente.Após a operação, o implante ortopédico foi imerso em sangue (sangue de cavalo, KISAN, Coreia) por 10 s para confirmar se ocorreram aderências sanguíneas após a aplicação da lesão mecânica (n = 3).
Um total de 24 coelhos machos brancos da Nova Zelândia (peso de 3,0 a 3,5kg, idade média de 6 meses) foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: nu negativo, nu positivo, SHP e LOIS.Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com os padrões éticos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (aprovado pelo IACUC, KOREA-2017-0159).O implante ortopédico consiste em uma placa bloqueada com cinco furos (comprimento 41 mm, largura 7 mm e espessura 2 mm) e parafusos corticais bloqueadores (comprimento 12 mm, diâmetro 2,7 mm) para fixação da fratura.Com exceção das placas e parafusos utilizados no grupo negativo, todas as placas e parafusos foram incubados em suspensão de MRSA (106 UFC/ml) por 12 horas.O grupo negativo nu (n = 6) foi tratado com implantes de superfície nua sem exposição a suspensão bacteriana, como controle negativo para infecção.O grupo positivo nu (n = 6) foi tratado com um implante de superfície exposta exposto a bactérias como controle positivo para infecção.O grupo SHP (n = 6) foi tratado com implantes SHP expostos a bactérias.Finalmente, o grupo LOIS foi tratado com implantes LOIS expostos a bactérias (n = 6).Todos os animais são mantidos em uma gaiola e são fornecidas muita comida e água.Antes da operação, os coelhos permaneceram em jejum por 12 horas.Os animais foram anestesiados por injeção intramuscular de xilazina (5mg/kg) e injeção intravenosa de paclitaxel (3mg/kg) para indução.Depois disso, forneça 2% de isoflurano e 50% a 70% de oxigênio médico (vazão de 2 L/min) através do sistema respiratório para manter a anestesia.É implantado através de uma abordagem direta ao fêmur lateral.Após a depilação e desinfecção da pele com iodopovidona, foi feita uma incisão de cerca de 6 cm de comprimento na parte externa do fêmur médio esquerdo.Ao abrir o espaço entre os músculos que cobrem o fêmur, o fêmur fica totalmente exposto.Coloque a placa na frente da diáfise femoral e fixe-a com quatro parafusos.Após a fixação, utilize uma lâmina de serra (1 mm de espessura) para criar artificialmente uma fratura na área entre o segundo furo e o quarto furo.Ao final da operação, a ferida foi lavada com soro fisiológico e fechada com suturas.Cada coelho foi injetado subcutaneamente com enrofloxacina (5 mg/kg) diluída em um terço em solução salina.Radiografias pós-operatórias do fêmur foram realizadas em todos os animais (0, 7, 14, 21, 28 e 42 dias) para confirmar a osteotomia do osso.Após anestesia profunda, todos os animais foram mortos com KCl intravenoso (2 mmol/kg) nos 28 e 42 dias.Após a execução, o fêmur foi escaneado por micro-TC para observar e comparar o processo de consolidação óssea e a formação de novo osso entre os quatro grupos.
Após a execução foram coletados os tecidos moles que estavam em contato direto com os implantes ortopédicos.O tecido foi fixado em formalina tamponada neutra a 10% durante a noite e depois desidratado em EtOH.O tecido desidratado foi incluído em parafina e seccionado com espessura de 40 μm em micrótomo (400CS; EXAKT, Alemanha).Para visualizar a infecção, foram realizadas coloração H&E e coloração MT.Para verificar a resposta do hospedeiro, o tecido seccionado foi incubado com anticorpo primário anti-TNF-α de coelho (AB6671, Abcam, EUA) e anti-IL-6 de coelho (AB6672; Abcam, EUA) e depois tratado com raiz-forte.Oxidase.Aplique o sistema de coloração do complexo avidina-biotina (ABC) nas seções de acordo com as instruções do fabricante.Para aparecer como um produto de reação marrom, 3,3-diaminobenzidina foi utilizada em todas as partes.Um scanner digital de slides (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hungria) foi utilizado para visualizar todas as fatias, e pelo menos quatro substratos em cada grupo foram analisados ​​pelo software ImageJ.
Imagens de raios X foram obtidas em todos os animais após a cirurgia e semanalmente para monitorar a consolidação da fratura (n = 6 por grupo).Após a execução, foi utilizada micro-TC de alta resolução para calcular a formação de calo ao redor do fêmur após a cicatrização.O fêmur obtido foi limpo, fixado em paraformaldeído 4% por 3 dias e desidratado em etanol 75%.Os ossos desidratados foram então escaneados usando micro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Bélgica) para gerar imagens voxel 3D (2240×2240 pixels) da amostra óssea.Use filtro Al de 1,0 mm para reduzir o ruído do sinal e aplicar alta resolução a todas as varreduras (E = 133 kVp, I = 60 μA, tempo de integração = 500 ms).O software Nrecon (versão 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Bélgica) foi utilizado para gerar um volume 3D da amostra digitalizada a partir da projeção lateral 2D adquirida.Para análise, a imagem reconstruída em 3D é dividida em cubos de 10mm×10mm×10mm de acordo com o local da fratura.Calcule o calo fora do osso cortical.O software DataViewer (versão 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Bélgica) foi utilizado para redirecionar digitalmente o volume ósseo escaneado, e o software CT-Analyzer (versão 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Bélgica) foi utilizado para análise.Os coeficientes relativos de absorção de raios X no osso maduro e no calo são diferenciados pela sua densidade e, em seguida, o volume do calo é quantificado (n = 4).Para confirmar que a biocompatibilidade do LOIS não atrasa o processo de cicatrização óssea, foram realizadas análises adicionais de raios X e micro-TC em dois coelhos: os grupos nu-negativo e LOIS.Ambos os grupos foram executados na 6ª semana.
Os fêmures dos animais sacrificados foram coletados e fixados em paraformaldeído a 4% por 3 dias.O implante ortopédico é então cuidadosamente removido do fêmur.O fêmur foi descalcificado por 21 dias com EDTA 0,5 M (EC-900, National Diagnostics Corporation).Em seguida, o fêmur descalcificado foi imerso em EtOH para desidratá-lo.O fêmur desidratado foi removido em xileno e embebido em parafina.Em seguida a amostra foi fatiada com um micrótomo rotativo automático (Leica RM2255, Leica Biosystems, Alemanha) com espessura de 3 μm.Para coloração TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Alemanha), as amostras seccionadas foram desparafinizadas, reidratadas e incubadas em reagente TRAP a 37°C por 1 hora.As imagens foram adquiridas utilizando um scanner de slides (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hungria) e quantificadas medindo a cobertura da área manchada.Em cada experimento, pelo menos quatro substratos de cada grupo foram analisados ​​pelo software ImageJ.
A análise de significância estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., EUA).O teste t não pareado e a análise de variância unidirecional (ANOVA) foram utilizados para testar as diferenças entre os grupos de avaliação.O nível de significância está indicado na figura a seguir: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 e ****P<0,0001;NS, nenhuma diferença significativa.
Para materiais suplementares para este artigo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
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Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Os revestimentos antibacterianos e de escape imunológico dos implantes ortopédicos podem reduzir infecções e respostas imunológicas causadas por infecções.
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©2021 Associação Americana para o Avanço da Ciência.todos os direitos reservados.AAAS é parceira de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.