بالنسبة للمرضى الذين يخضعون لجراحة زراعة العظام، كانت الالتهابات البكتيرية والاستجابات المناعية الناجمة عن العدوى دائمًا بمثابة مخاطر تهدد حياتهم.المواد البيولوجية التقليدية عرضة للتلوث البيولوجي، مما يتسبب في غزو البكتيريا للمنطقة المصابة وتسبب العدوى بعد العملية الجراحية.ولذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير الطلاءات المضادة للعدوى والهروب المناعي لزراعة العظام.هنا، قمنا بتطوير تقنية متقدمة لتعديل السطح لزراعة العظام تسمى سطح زراعة العظام المشحم (LOIS)، وهي مستوحاة من السطح الأملس لأباريق نبات الإبريق.يتمتع LOIS بطارد سائل قوي وطويل الأمد لمجموعة متنوعة من السوائل والمواد البيولوجية (بما في ذلك الخلايا والبروتينات والكالسيوم والبكتيريا).بالإضافة إلى ذلك، أكدنا المتانة الميكانيكية ضد الخدوش وقوة التثبيت من خلال محاكاة الضرر الحتمي أثناء الجراحة في المختبر.تم استخدام نموذج كسر عظم الفخذ الالتهابي لنخاع عظم الأرنب لإجراء دراسة شاملة لقدرة LOIS على التحجيم المضاد للبيولوجيا ومكافحة العدوى.نحن نتصور أن LOIS، الذي يتمتع بخصائص مضادة للحشف الحيوي ومتانة ميكانيكية، يعد خطوة إلى الأمام في جراحة العظام الخالية من العدوى.
اليوم، وبسبب الشيخوخة بشكل عام، ارتفع بشكل كبير عدد المرضى الذين يعانون من أمراض العظام (مثل كسور كبار السن، وأمراض المفاصل التنكسية، وهشاشة العظام) (1، 2).ولذلك، تولي المؤسسات الطبية أهمية كبيرة لجراحة العظام، بما في ذلك زراعة العظام من المسامير والصفائح والأظافر والمفاصل الاصطناعية (3، 4).ومع ذلك، تم الإبلاغ عن أن زراعة العظام التقليدية تكون عرضة للالتصاق البكتيري وتكوين الأغشية الحيوية، مما قد يسبب عدوى الموقع الجراحي (SSI) بعد الجراحة (5، 6).بمجرد تشكيل الغشاء الحيوي على سطح الغرسة العظمية، تصبح إزالة الغشاء الحيوي صعبة للغاية حتى مع استخدام جرعات كبيرة من المضادات الحيوية.ولذلك، فإنه عادة ما يؤدي إلى التهابات حادة بعد العملية الجراحية (7، 8).بسبب المشاكل المذكورة أعلاه، يجب أن يشمل علاج الغرسات المصابة إعادة العملية، بما في ذلك إزالة جميع الغرسات والأنسجة المحيطة بها؛ولذلك سيعاني المريض من آلام شديدة وبعض المخاطر (9، 10).
ولحل بعض هذه المشاكل، تم تطوير غرسات عظمية مملوءة بالأدوية لمنع العدوى عن طريق القضاء على البكتيريا المرتبطة بالسطح (11، 12).ومع ذلك، لا تزال الاستراتيجية تظهر العديد من القيود.تم الإبلاغ عن أن زرع الغرسات المحملة بالأدوية على المدى الطويل قد تسبب في تلف الأنسجة المحيطة وتسبب في التهاب، مما قد يؤدي إلى النخر (13، 14).بالإضافة إلى ذلك، فإن المذيبات العضوية التي قد تكون موجودة بعد عملية تصنيع غرسات العظام الممتصة للأدوية، والتي تحظرها إدارة الغذاء والدواء الأمريكية منعًا باتًا، تتطلب خطوات تنقية إضافية للوفاء بمعاييرها (15).تمثل الغرسات المتخلصة من الدواء تحديًا بالنسبة للإفراج المتحكم فيه عن الأدوية، ونظرًا لتحميلها المحدود للأدوية، فإن تطبيق الدواء على المدى الطويل غير ممكن (16).
هناك إستراتيجية شائعة أخرى تتمثل في تغطية الغرسة ببوليمر مضاد للحشف لمنع المواد البيولوجية والبكتيريا من الالتصاق بالسطح (17).على سبيل المثال، جذبت البوليمرات الزويتيريونية الانتباه بسبب خصائصها غير اللاصقة عند ملامستها لبروتينات البلازما والخلايا والبكتيريا.ومع ذلك، لديها بعض القيود المتعلقة بالثبات على المدى الطويل والمتانة الميكانيكية، مما يعيق تطبيقها العملي في زراعة العظام، خاصة بسبب الكشط الميكانيكي أثناء العمليات الجراحية (18، 19).بالإضافة إلى ذلك، ونظرًا لتوافقها الحيوي العالي، وعدم الحاجة إلى جراحة الإزالة، وخصائص تنظيف السطح من خلال التآكل، فقد تم استخدام زراعة العظام المصنوعة من مواد قابلة للتحلل (20، 21).أثناء التآكل، يتم تكسير الروابط الكيميائية بين مصفوفة البوليمر وفصلها عن السطح، وتقوم المواد الملتصقة بتنظيف السطح.ومع ذلك، فإن مكافحة التلوث البيولوجي عن طريق تنظيف السطح تكون فعالة في فترة قصيرة من الزمن.بالإضافة إلى ذلك، فإن معظم المواد القابلة للامتصاص بما في ذلك بولي (حمض اللاكتيك وحمض الجليكوليك كوبوليمر) (PLGA)، وحمض البوليلاكتيك (PLA) والسبائك القائمة على المغنيسيوم سوف تخضع لتحلل بيولوجي وتآكل غير متساوٍ في الجسم، مما سيؤثر سلبًا على الاستقرار الميكانيكي.(إثنان وعشرون).بالإضافة إلى ذلك، توفر أجزاء اللوحة القابلة للتحلل مكانًا لالتصاق البكتيريا، مما يزيد من فرصة الإصابة بالعدوى على المدى الطويل.يحد خطر التدهور الميكانيكي والعدوى من التطبيق العملي للجراحة التجميلية (23).
أصبحت الأسطح فائقة الكارهة للماء (SHP) التي تحاكي البنية الهرمية لأوراق اللوتس حلاً محتملاً للأسطح المضادة للقاذورات (24، 25).عندما يتم غمر سطح SHP في السائل، سيتم محاصرة فقاعات الهواء، وبالتالي تشكيل جيوب هوائية ومنع التصاق البكتيريا (26).ومع ذلك، فقد أظهرت الدراسات الحديثة أن سطح SHP له عيوب تتعلق بالمتانة الميكانيكية والاستقرار طويل المدى، مما يعيق تطبيقه في الغرسات الطبية.علاوة على ذلك، فإن جيوب الهواء سوف تذوب وتفقد خصائصها المضادة للقاذورات، مما يؤدي إلى التصاق بكتيري أوسع بسبب المساحة السطحية الكبيرة لسطح SHP (27، 28).في الآونة الأخيرة، قدم أيزنبرج وزملاؤه طريقة مبتكرة لطلاء الأسطح المضادة للحشف الحيوي من خلال تطوير سطح أملس مستوحى من نبات إبريق Nepenthes (29، 30).يُظهر السطح الأملس ثباتًا طويل الأمد في ظل الظروف الهيدروليكية، وهو طارد للغاية للسوائل البيولوجية، وله خصائص الإصلاح الذاتي.ومع ذلك، لا توجد طريقة لتطبيق الطلاء على الغرسة الطبية ذات الشكل المعقد، ولم يثبت أنها تدعم عملية شفاء الأنسجة التالفة بعد الزرع.
نقدم هنا سطحًا مزروعًا لتقويم العظام (LOIS)، وهو سطح مزروع لتقويم العظام بهيكل دقيق/نانوي ومدمج بإحكام مع طبقة تشحيم رقيقة لمنع ارتباطه بالجراحة التجميلية والالتهابات البكتيرية، مثل تثبيت الكسور.نظرًا لأن الهيكل على مستوى ميكرو/نانو الذي يعمل بالفلور يعمل على تثبيت مادة التشحيم على الهيكل بقوة، فإن LOIS المطور يمكنه صد التصاق السوائل المختلفة بشكل كامل والحفاظ على أداء مضاد للقاذورات لفترة طويلة.يمكن تطبيق طلاءات LOIS على مواد ذات أشكال مختلفة مخصصة لتركيب العظام.تم تأكيد الخصائص الممتازة المضادة للحشف الحيوي لـ LOIS ضد بكتيريا الأغشية الحيوية [Pseudomonas aeruginosa والمكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA)] والمواد البيولوجية (الخلايا والبروتينات والكالسيوم) في المختبر.معدل الالتصاق للالتصاق الواسع بالركيزة أقل من 1٪.بالإضافة إلى ذلك، حتى بعد حدوث إجهاد ميكانيكي مثل خدش السطح، فإن الشفاء الذاتي الناتج عن مادة التشحيم المخترقة يساعد في الحفاظ على خصائصها المضادة للقاذورات.تظهر نتائج اختبار المتانة الميكانيكية أنه حتى بعد التعديل الهيكلي والكيميائي، لن تنخفض القوة الإجمالية بشكل كبير.بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء تجربة في المختبر تحاكي الإجهاد الميكانيكي في البيئة الجراحية لإثبات أن LOIS يمكنه تحمل الضغوط الميكانيكية المختلفة التي تحدث أثناء الجراحة التجميلية.أخيرًا، استخدمنا نموذجًا لكسر الفخذ في الجسم الحي يعتمد على الأرانب، والذي أثبت أن LOIS يتمتع بخصائص مضادة للجراثيم متفوقة وتوافق حيوي.أكدت النتائج الإشعاعية والنسيجية أن سلوك التشحيم المستقر والخصائص المضادة للحشف الحيوي خلال 4 أسابيع بعد الزرع يمكن أن يحقق أداء فعالًا في مكافحة العدوى والهروب المناعي دون تأخير عملية شفاء العظام.
يُظهر الشكل 1A رسمًا تخطيطيًا لـ LOIS المطور، والذي تم زرعه بهياكل صغيرة/نانوية الحجم في نموذج كسر فخذي الأرانب لتأكيد خصائصه الممتازة المضادة للقاذورات البيولوجية والمضادة للعدوى.يتم تنفيذ طريقة المحاكاة الحيوية لمحاكاة سطح نبات وعاء الماء، ولمنع الحشف الحيوي من خلال دمج طبقة تشحيم داخل البنية الدقيقة/ النانوية للسطح.يمكن للسطح المحقون بمواد التشحيم تقليل الاتصال بين المواد البيولوجية والسطح.ولذلك، بسبب تكوين روابط كيميائية مستقرة على السطح، فإنه يتمتع بأداء ممتاز مضاد للحشف على السفن واستقرار طويل الأمد.ونتيجة لذلك، فإن الخصائص المضادة للحشف الحيوي لسطح التشحيم تسمح بتطبيقات عملية مختلفة في أبحاث الطب الحيوي.ومع ذلك، لم تكتمل بعد الأبحاث المكثفة حول كيفية تفاعل هذا السطح الخاص في الجسم.من خلال مقارنة LOIS مع ركائز عارية في المختبر باستخدام بكتيريا الزلال والأغشية الحيوية، يمكن تأكيد عدم التصاق LOIS (الشكل 1B).بالإضافة إلى ذلك، من خلال طرح قطرات الماء على الركيزة العارية المائلة والركيزة LOIS (الشكل S1 والفيلم S1)، يمكن إثبات أداء التلوث البيولوجي.كما هو موضح في صورة المجهر الفلوري، أظهرت الركيزة المكشوفة المحتضنة في معلق من البروتين والبكتيريا كمية كبيرة من المواد البيولوجية الملتصقة بالسطح.ومع ذلك، نظرًا لخصائصه الممتازة المضادة للحشف الحيوي، فإن LOIS لا يكاد يعرض أي مضان.من أجل تأكيد خصائصه المضادة للحشف الحيوي والمضادة للعدوى، تم تطبيق LOIS على سطح غرسات العظام لتخليق العظام (الألواح والمسامير) ووضعها في نموذج كسر الأرانب.قبل الزرع، تم تحضين زرع العظام المجردة وLOIS في تعليق بكتيري لمدة 12 ساعة.تضمن مرحلة ما قبل الحضانة تكوين غشاء حيوي على سطح الزرعة المكشوفة للمقارنة.ويبين الشكل 1C صورة لموقع الكسر بعد 4 أسابيع من الزرع.على اليسار، أظهر أرنب ذو غرسة عظمية عارية مستوى شديد من الالتهاب بسبب تكوين غشاء حيوي على سطح الزرع.وقد لوحظت النتيجة المعاكسة في الأرانب المزروعة بـ LOIS، أي أن الأنسجة المحيطة بـ LOIS لم تظهر عليها علامات العدوى ولا علامات الالتهاب.بالإضافة إلى ذلك، تشير الصورة البصرية الموجودة على اليسار إلى الموقع الجراحي للأرنب مع الزرعة المكشوفة، مما يشير إلى أنه لم يتم العثور على أي مواد لاصقة متعددة موجودة على سطح الزرعة المكشوفة على سطح LOIS.وهذا يدل على أن LOIS يتمتع باستقرار طويل الأمد ولديه القدرة على الحفاظ على خصائصه المضادة للقاذورات البيولوجية والمضادة للالتصاق.
(أ) رسم تخطيطي لـ LOIS وغرسه في نموذج كسر فخذي أرنب.(ب) صورة مجهرية مضان للبروتين والأغشية الحيوية البكتيرية على السطح العاري والركيزة LOIS.بعد 4 أسابيع من الزرع، (C) صورة فوتوغرافية لموقع الكسر و (D) صورة بالأشعة السينية (مبرزة بمستطيل أحمر).الصورة مجاملة: كيومين تشاي، جامعة يونسي.
أظهرت الأرانب المعقمة والمكشوفة المزروعة بشكل سلبي عملية شفاء طبيعية للعظام دون أي علامات التهاب أو عدوى.من ناحية أخرى، تظهر غرسات SHP المحتضنة مسبقًا في معلق بكتيري التهابًا مرتبطًا بالعدوى في الأنسجة المحيطة.يمكن أن يعزى ذلك إلى عدم قدرته على منع التصاق البكتيريا لفترة طويلة (الشكل S2).من أجل إثبات أن LOIS لا يؤثر على عملية الشفاء، ولكنه يمنع الالتهابات المحتملة المتعلقة بالزرع، تمت مقارنة صور الأشعة السينية للمصفوفة الإيجابية المكشوفة وLOIS في موقع الكسر (الشكل 1D).أظهرت صورة الأشعة السينية للزرعة الإيجابية العارية خطوط انحلال العظم المستمرة، مما يشير إلى أن العظم لم يلتئم بالكامل.يشير هذا إلى أن عملية تعافي العظام قد تتأخر كثيرًا بسبب الالتهاب المرتبط بالعدوى.على العكس من ذلك، فقد أظهر أن الأرانب المزروعة بـ LOIS قد شفيت ولم تظهر أي موقع كسر واضح.
من أجل تطوير غرسات طبية تتمتع باستقرار وفعالية طويلة الأمد (بما في ذلك مقاومة الحشف الحيوي)، تم بذل العديد من الجهود.ومع ذلك، فإن وجود مواد بيولوجية مختلفة وديناميكيات التصاق الأنسجة يحد من تطوير أساليبها الموثوقة سريريًا.من أجل التغلب على أوجه القصور هذه، قمنا بتطوير بنية ذات طبقات ميكرو/نانو وسطح معدل كيميائيًا، والذي تم تحسينه بسبب القوة الشعرية العالية والتقارب الكيميائي للحفاظ على أكثر مواد التشحيم سلاسة إلى أقصى حد.ويبين الشكل 2A عملية التصنيع الشاملة لـ LOIS.أولاً، قم بإعداد الركيزة الطبية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ (SS) 304.ثانيًا، يتم تشكيل البنية الدقيقة/ النانوية على الركيزة SS عن طريق الحفر الكيميائي باستخدام محلول حمض الهيدروفلوريك (HF).من أجل استعادة مقاومة التآكل لـ SS، يتم استخدام محلول حمض النيتريك (HNO3) (31) لمعالجة الركيزة المحفورة.يعزز التخميل مقاومة التآكل للركيزة SS ويبطئ بشكل كبير عملية التآكل التي قد تقلل من الأداء العام لـ LOIS.بعد ذلك، من خلال تكوين طبقة أحادية ذاتية التجميع (SAM) تحتوي على 1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyltriethoxysilane (POTS)، يتم تعديل السطح كيميائيًا لتحسين التفاعل الكيميائي بين السطح وتقارب مواد التشحيم الملساء.يؤدي تعديل السطح إلى تقليل الطاقة السطحية للسطح الهيكلي المصنوع على نطاق صغير/نانوي بشكل كبير، والذي يطابق الطاقة السطحية لمادة التشحيم الناعمة.وهذا يسمح بترطيب مادة التشحيم بالكامل، وبالتالي تشكيل طبقة تشحيم ثابتة على السطح.يعرض السطح المعدل الكارهة للماء.أظهرت النتائج أن مادة التشحيم الزلقة تظهر سلوكًا مستقرًا على LOIS بسبب التقارب الكيميائي العالي والقوة الشعرية الناتجة عن البنية الدقيقة/ النانوية (32، 33).تمت دراسة التغيرات البصرية على سطح SS بعد تعديل السطح وحقن مواد التشحيم.يمكن أن يتسبب هيكل الطبقات الدقيقة/ النانوية المتكون على السطح في حدوث تغييرات بصرية وتغميق السطح.تُعزى هذه الظاهرة إلى تأثير تشتت الضوء المعزز على السطح الخشن، مما يزيد من الانعكاس المنتشر الناتج عن آلية محاصرة الضوء (34).بالإضافة إلى ذلك، بعد حقن مادة التشحيم، يصبح لون LOIS أكثر قتامة.تتسبب طبقة التشحيم في انعكاس ضوء أقل من الركيزة، مما يؤدي إلى تعتيم LOIS.من أجل تحسين البنية المجهرية/البنية النانوية لإظهار أصغر زاوية انزلاقية (SA) لتحقيق أداء مضاد للحشف الحيوي، تم استخدام المجهر الإلكتروني المسح (SEM) والأزواج الذرية لأداء أوقات حفر HF مختلفة (0، 3).، 15 و 60 دقيقة) مجهر القوة (AFM) (الشكل 2B).تظهر صور SEM وAFM أنه بعد وقت قصير من النقش (3 دقائق من النقش)، شكلت الركيزة العارية خشونة متفاوتة على نطاق النانو.تتغير خشونة السطح مع وقت الحفر (الشكل S3).يوضح منحنى التغير الزمني أن خشونة السطح تستمر في الزيادة وتصل إلى ذروتها عند 15 دقيقة من النقش، وبعد ذلك يتم ملاحظة انخفاض طفيف فقط في قيمة الخشونة عند 30 دقيقة من النقش.عند هذه النقطة، يتم حفر خشونة المستوى النانوي بعيدًا، بينما تتطور خشونة المستوى الجزئي بقوة، مما يجعل تغيير الخشونة أكثر استقرارًا.بعد الحفر لأكثر من 30 دقيقة، لوحظ زيادة أخرى في الخشونة، وهو ما يتم شرحه بالتفصيل على النحو التالي: يتكون SS من الفولاذ، وسبائك مع عناصر بما في ذلك الحديد والكروم والنيكل والموليبدينوم والعديد من العناصر الأخرى.من بين هذه العناصر، يلعب الحديد والكروم والموليبدينوم دورًا مهمًا في تكوين خشونة ميكرون/نانو على SS بواسطة النقش HF.في المراحل المبكرة من التآكل، يتآكل الحديد والكروم بشكل رئيسي لأن الموليبدينوم لديه مقاومة أعلى للتآكل من الموليبدينوم.مع تقدم عملية النقش، يصل محلول النقش إلى التشبع الزائد المحلي، مما يؤدي إلى تكوين الفلوريدات والأكاسيد الناتجة عن النقش.يترسب الفلورايد والأكسيد ثم يترسبان مرة أخرى على السطح في النهاية، مما يشكل خشونة سطحية في نطاق الميكرون/النانو (31).تلعب هذه الخشونة على المستوى الجزئي/النانو دورًا مهمًا في خصائص الشفاء الذاتي لـ LOIS.ينتج السطح المزدوج تأثيرًا تآزريًا، مما يزيد بشكل كبير من قوة الشعيرات الدموية.تسمح هذه الظاهرة لمادة التشحيم باختراق السطح بشكل ثابت وتساهم في خصائص الشفاء الذاتي (35).يعتمد تكوين الخشونة على وقت النقش.في أقل من 10 دقائق من الحفر، يحتوي السطح فقط على خشونة بمقياس النانو، وهي ليست كافية لاحتواء ما يكفي من مواد التشحيم للحصول على مقاومة للحشف الحيوي (36).من ناحية أخرى، إذا تجاوز وقت النقش 30 دقيقة، فإن الخشونة النانوية الناتجة عن إعادة ترسيب الحديد والكروم ستختفي، وستبقى فقط الخشونة الدقيقة بسبب الموليبدينوم.يفتقر السطح المحفور بشكل مفرط إلى خشونة النانو ويفقد التأثير التآزري للخشونة على مرحلتين، مما يؤثر سلبًا على خصائص الشفاء الذاتي لـ LOIS.تم إجراء قياسات SA على ركائز ذات أوقات حفر مختلفة لإثبات الأداء المضاد للقاذورات.تم اختيار أنواع مختلفة من السوائل بناءً على اللزوجة والطاقة السطحية، بما في ذلك الماء منزوع الأيونات (DI) والدم والإيثيلين جلايكول (EG) والإيثانول (EtOH) والهيكساديكان (HD) (الشكل S4).يوضح نمط النقش المتغير بمرور الوقت أنه بالنسبة للسوائل المختلفة ذات الطاقات واللزوجة السطحية المختلفة، فإن SA لـ LOIS بعد 15 دقيقة من النقش هو الأدنى.لذلك، تم تحسين LOIS للحفر لمدة 15 دقيقة لتشكيل خشونة ميكرون ونانو، وهو مناسب للحفاظ بشكل فعال على متانة مادة التشحيم وخصائص ممتازة مضادة للقاذورات.
(أ) رسم تخطيطي لعملية التصنيع المكونة من أربع خطوات لـ LOIS.يُظهر الشكل الداخلي SAM المتكون على الركيزة.(ب) صور SEM وAFM، المستخدمة لتحسين البنية الدقيقة/النانو للركيزة في أوقات الحفر المختلفة.التحليل الطيفي للأشعة السينية الضوئية (XPS) لأطياف (C) Cr2p و (D) F1s بعد التخميل السطحي وطلاء SAM.الاتحاد الأفريقي، وحدة تعسفية.(ه) صور تمثيلية لقطرات الماء على ركائز عارية، محفورة، SHP وLOIS.(F) زاوية التلامس (CA) وقياس SA للسوائل ذات التوترات السطحية المختلفة على SHP وLOIS.يتم التعبير عن البيانات على أنها تعني ± SD.
بعد ذلك، من أجل تأكيد التغير في الخواص الكيميائية للسطح، تم استخدام التحليل الطيفي للأشعة السينية الضوئية (XPS) لدراسة التغير في التركيب الكيميائي لسطح الركيزة بعد كل طلاء سطحي.ويبين الشكل 2C نتائج قياس XPS للسطح المحفور HF والسطح المعالج بـ HNO 3.يمكن أن تعزى القمتان الرئيسيتان عند 587.3 و577.7 فولت إلى رابطة Cr-O الموجودة في طبقة أكسيد الكروم، وهو الفرق الرئيسي عن السطح المحفور HF.ويرجع ذلك أساسًا إلى استهلاك الحديد وفلوريد الكروم على السطح بواسطة HNO3.يسمح النقش القائم على HNO3 للكروم بتكوين طبقة أكسيد تخميلية على السطح، مما يجعل SS المحفور مقاومًا للتآكل مرة أخرى.في الشكل 2D، تم الحصول على أطياف XPS للتأكد من أن سيلاني الفلوروكربوني قد تشكل على السطح بعد طلاء SAM، الذي يتمتع بطارد سائل عالي للغاية حتى بالنسبة للـ EG والدم وEtOH.يتم الانتهاء من طلاء SAM عن طريق تفاعل المجموعات الوظيفية السيلانية مع مجموعات الهيدروكسيل المتكونة عن طريق معالجة البلازما.ونتيجة لذلك، لوحظت زيادة كبيرة في قمم CF2 وCF3.تشير طاقة الربط بين 286 و296 فولت إلى أن التعديل الكيميائي قد اكتمل بنجاح بواسطة طلاء SAM.يُظهر SHP قمم كبيرة نسبيًا من CF2 (290.1 ​​فولت) وCF3 (293.3 فولت)، والتي تنتج عن السيلاني المعتمد على الفلوروكربون المتكون على السطح.ويبين الشكل 2E صورًا بصرية تمثيلية لقياسات زاوية التلامس (CA) لمجموعات مختلفة من الماء منزوع الأيونات عند ملامستها العارية، والمحفورة، وSHP، وLOIS.تُظهر هذه الصور أن السطح المحفور يصبح محبًا للماء بسبب البنية الدقيقة/ النانوية التي تشكلها الحفر الكيميائي بحيث يتم امتصاص الماء منزوع الأيونات في الهيكل.ومع ذلك، عندما يتم طلاء الركيزة بمادة SAM، تظهر الركيزة مقاومة قوية للماء، لذلك يتم تشكيل SHP السطحي وتكون منطقة الاتصال بين الماء والسطح صغيرة.وأخيرا، لوحظ انخفاض في CA في LOIS، والذي يمكن أن يعزى إلى اختراق مواد التشحيم في البنية المجهرية، وبالتالي زيادة منطقة الاتصال.من أجل إثبات أن السطح لديه طارد سائل ممتاز وخصائص غير لاصقة، تمت مقارنة LOIS مع الركيزة SHP عن طريق قياس CA وSA باستخدام سوائل مختلفة (الشكل 2F).تم اختيار أنواع مختلفة من السوائل بناءً على اللزوجة والطاقة السطحية، بما في ذلك الماء منزوع الأيونات والدم وEG وEtOH وHD (الشكل S4).تظهر نتائج قياس CA أنه عندما يميل CA إلى HD، فإن قيمة التخفيض لـ CA، حيث يكون CA أقل طاقة سطحية.بالإضافة إلى ذلك، فإن LOIS الخاص بـ CA الإجمالي منخفض.ومع ذلك، فإن قياس SA يظهر ظاهرة مختلفة تماما.باستثناء الماء المتأين، تلتصق جميع السوائل بالركيزة SHP دون الانزلاق.من ناحية أخرى، يُظهر LOIS SA منخفضًا جدًا، حيث عندما يميل كل السائل بزاوية أقل من 10° إلى 15°، فإن كل السائل سوف يتدحرج.وهذا يدل بقوة على أن عدم التصاق LOIS أفضل من سطح SHP.بالإضافة إلى ذلك، يتم تطبيق طلاءات LOIS أيضًا على أنواع مختلفة من المواد، بما في ذلك التيتانيوم (Ti)، والبولي فينيل سلفون (PPSU)، والبولي أوكسي ميثيلين (POM)، وبولي إيثر إيثر كيتون (PEEK) والبوليمرات القابلة للامتصاص الحيوي (PLGA)، وهي مواد تقويمية قابلة للزرع (الشكل 1). س5)).تُظهر الصور المتسلسلة للقطرات الموجودة على المادة المعالجة بواسطة LOIS أن الخصائص المضادة للحشف الحيوي في LOIS هي نفسها على جميع الركائز.بالإضافة إلى ذلك، تظهر نتائج قياس CA وSA أن الخصائص غير اللاصقة لـ LOIS يمكن تطبيقها على مواد أخرى.
من أجل تأكيد الخصائص المضادة للقاذورات لـ LOIS، تم تحضين أنواع مختلفة من الركائز (بما في ذلك العارية والمحفورة وSHP وLOIS) مع Pseudomonas aeruginosa وMRSA.تم اختيار هاتين البكتيريا كبكتيريا مستشفى تمثيلية، والتي يمكن أن تؤدي إلى تكوين الأغشية الحيوية، مما يؤدي إلى مباحث أمن الدولة (37).ويبين الشكل 3 (A و B) صور المجهر الفلوري ونتائج قياس وحدة تشكيل مستعمرة (CFU) للركائز المحتضنة في التعليق البكتيري لمدة قصيرة (12 ساعة) وطويلة الأجل (72 ساعة)، على التوالي.وفي فترة قصيرة من الزمن، ستشكل البكتيريا مجموعات وينمو حجمها، وتغطي نفسها بمواد تشبه المخاط وتمنع إزالتها.ومع ذلك، خلال فترة الحضانة التي تبلغ 72 ساعة، سوف تنضج البكتيريا ويصبح من السهل أن تتفرق لتشكل المزيد من المستعمرات أو المجموعات.لذلك، يمكن اعتبار أن فترة الحضانة لمدة 72 ساعة هي فترة طويلة الأجل وهي فترة الحضانة المناسبة لتكوين غشاء حيوي قوي على السطح (38).في فترة قصيرة من الزمن، أظهر السطح المحفور وسطح SHP التصاق بكتيري، والذي انخفض بحوالي 25% إلى 50% مقارنة بالركيزة العارية.ومع ذلك، نظرًا لأدائه واستقراره الممتاز في مكافحة الحشف الحيوي، لم يُظهر LOIS التصاق الأغشية الحيوية البكتيرية على المدى القصير والطويل.يصف الرسم التخطيطي (الشكل 3C) شرح آلية القاذورات المضادة للبيولوجية لمحلول النقش، SHP وLOIS.الافتراض هو أن الركيزة المحفورة ذات الخصائص المحبة للماء سيكون لها مساحة سطحية أكبر من الركيزة العارية.ولذلك، سوف يحدث المزيد من التصاق البكتيريا على الركيزة المحفورة.ومع ذلك، بالمقارنة مع الركيزة العارية، فإن الركيزة المحفورة تحتوي على بيوفيلم أقل بشكل ملحوظ على السطح.وذلك لأن جزيئات الماء ترتبط بقوة بالسطح المحب للماء وتعمل كمواد تشحيم للماء، وبالتالي تتداخل مع التصاق البكتيريا على المدى القصير (39).ومع ذلك، فإن طبقة جزيئات الماء رقيقة جدًا وقابلة للذوبان في المعلقات البكتيرية.ولذلك، تختفي الطبقة الجزيئية للماء لفترة طويلة، مما يؤدي إلى التصاق البكتيريا وتكاثرها على نطاق واسع.بالنسبة إلى SHP، نظرًا لخصائصه غير المبللة قصيرة المدى، يتم منع التصاق البكتيريا.يمكن أن يعزى انخفاض التصاق البكتيريا إلى جيوب الهواء المحاصرة في هيكل الطبقات وانخفاض الطاقة السطحية، وبالتالي تقليل الاتصال بين التعليق البكتيري والسطح.ومع ذلك، لوحظ التصاق بكتيري واسع النطاق في SHP لأنه فقد خصائصه المضادة للقاذورات لفترة طويلة.ويرجع ذلك أساسًا إلى اختفاء الجيوب الهوائية بسبب الضغط الهيدروستاتيكي وذوبان الهواء في الماء.ويرجع ذلك أساسًا إلى اختفاء الجيوب الهوائية بسبب الذوبان والبنية الطبقية التي توفر مساحة سطحية أكبر للالتصاق (27، 40).على عكس هاتين الركيزتين اللتين لهما تأثير مهم على الاستقرار على المدى الطويل، يتم حقن مادة التشحيم الموجودة في LOIS في البنية الدقيقة/النانو ولن تختفي حتى على المدى الطويل.تعتبر مواد التشحيم المملوءة بهياكل ميكرو/نانو مستقرة للغاية وتنجذب بقوة إلى السطح بسبب تقاربها الكيميائي العالي، وبالتالي تمنع التصاق البكتيريا لفترة طويلة.يُظهر الشكل S6 صورة مجهرية متحد البؤر انعكاسية لركيزة مملوءة بمواد التشحيم مغمورة في محلول ملحي بالفوسفات (PBS).تظهر الصور المستمرة أنه حتى بعد 120 ساعة من الاهتزاز الطفيف (120 دورة في الدقيقة)، تظل طبقة التشحيم الموجودة في LOIS دون تغيير، مما يشير إلى الاستقرار على المدى الطويل في ظل ظروف التدفق.ويرجع ذلك إلى التقارب الكيميائي العالي بين طلاء SAM المعتمد على الفلور ومواد التشحيم المعتمدة على البيرفلوروكربون، بحيث يمكن تشكيل طبقة تشحيم مستقرة.ولذلك، يتم الحفاظ على الأداء المضاد للقاذورات.بالإضافة إلى ذلك، تم اختبار الركيزة ضد البروتينات التمثيلية (الزلال والفيبرينوجين)، الموجودة في البلازما، والخلايا المرتبطة ارتباطًا وثيقًا بوظيفة المناعة (الضامة والخلايا الليفية)، وتلك المرتبطة بتكوين العظام.محتوى الكالسيوم مرتفع جدا.(الشكل ثلاثي الأبعاد، 1 و2، والشكل S7) (41، 42).بالإضافة إلى ذلك، أظهرت صور المجهر الفلوري لاختبار التصاق الفيبرينوجين والألبومين والكالسيوم خصائص التصاق مختلفة لكل مجموعة ركيزة (الشكل S8).أثناء تكوين العظام، قد تحيط طبقات العظام والكالسيوم المتكونة حديثًا بزراعة العظام، الأمر الذي لا يجعل عملية الإزالة صعبة فحسب، بل قد يتسبب أيضًا في ضرر غير متوقع للمريض أثناء عملية الإزالة.ولذلك، فإن المستويات المنخفضة من رواسب الكالسيوم على صفائح العظام والمسامير مفيدة لجراحة العظام التي تتطلب إزالة الزرع.استناداً إلى التحديد الكمي للمنطقة المرفقة استناداً إلى كثافة الأسفار وعدد الخلايا، أكدنا أن LOIS يُظهر خصائص ممتازة مضادة للحشف الحيوي لجميع المواد البيولوجية مقارنة بالركائز الأخرى.وفقًا لنتائج التجارب المختبرية، يمكن تطبيق LOIS المضاد للتلوث البيولوجي على غرسات العظام، والتي لا يمكنها فقط منع العدوى التي تسببها بكتيريا الأغشية الحيوية، ولكن أيضًا تقليل الالتهاب الناجم عن الجهاز المناعي النشط في الجسم.
(أ) صور مجهرية مضان لكل مجموعة (عارية، محفورة، SHP وLOIS) المحتضنة في Pseudomonas aeruginosa وتعليق MRSA لمدة 12 و72 ساعة.(ب) عدد CFU الملتصقة من الزائفة الزنجارية وMRSA على سطح كل مجموعة.(ج) رسم تخطيطي لآلية القاذورات المضادة للبيولوجية للحفر على المدى القصير والطويل، SHP وLOIS.(د) (1) عدد الخلايا الليفية الملتصقة بكل صور مجهرية ركيزة ومضان للخلايا الملتصقة بالعارية ولويس.(2) اختبار التصاق البروتينات المرتبطة بالمناعة والزلال والكالسيوم المشاركة في عملية شفاء العظام (* P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001 و **** P <0.0001).نانوثانية، ليس مهما.
في حالة الضغوط المركزة التي لا يمكن تجنبها، كانت المتانة الميكانيكية دائمًا هي التحدي الرئيسي لتطبيق الطلاءات المضادة للحشف على السفن.تعتمد الطرق التقليدية المضادة لمياه الصرف الصحي على بوليمرات ذات قابلية منخفضة للذوبان في الماء وهشاشة.ولذلك، فهي عادة ما تكون عرضة للإجهاد الميكانيكي في التطبيقات الطبية الحيوية.ولذلك، تظل الطلاءات المضادة للحشف على الحيوانات المتينة ميكانيكيًا تحديًا لتطبيقات مثل زراعة العظام (43، 44).يوضح الشكل 4A(1) النوعين الرئيسيين من الإجهاد المطبق على زراعة العظام، بما في ذلك الخدش (إجهاد القص) والضغط بالصورة البصرية للزرع التالف الناتج عن الملقط.على سبيل المثال، عندما يتم تشديد المسمار بمفك البراغي، أو عندما يمسك الجراح لوحة العظام بإحكام باستخدام ملاقط ويطبق قوة الضغط، فإن لوحة العظام البلاستيكية سوف تتضرر وتخدش على كل من المقاييس الكلية والجزئية/النانو (الشكل 4A، 2) .من أجل اختبار ما إذا كان LOIS المُصنَّع يمكنه تحمل هذه الأضرار أثناء الجراحة التجميلية، تم إجراء تحسس النانو لمقارنة صلابة الركيزة العارية وLOIS على مقياس ميكرو/نانو لدراسة الخواص الميكانيكية لتأثير هيكل مايكرو/نانو (الشكل 4 ب).يُظهر الرسم التخطيطي سلوك التشوه المختلف لـ LOIS بسبب وجود هياكل ميكرو/نانو.تم رسم منحنى قوة النزوح استنادا إلى نتائج nanoindentation (الشكل 4C).تمثل الصورة الزرقاء الركيزة العارية، والتي تظهر تشوهًا طفيفًا فقط، كما يتضح من أقصى عمق للمسافة البادئة يبلغ 0.26 ميكرومتر.من ناحية أخرى، فإن الزيادة التدريجية في قوة التحسس النانوي والإزاحة التي لوحظت في LOIS (المنحنى الأحمر) قد تظهر علامات انخفاض الخواص الميكانيكية، مما يؤدي إلى عمق التحسس النانوي بمقدار 1.61 ميكرومتر.وذلك لأن البنية الدقيقة/ النانوية الموجودة في LOIS توفر مساحة تقدم أعمق لطرف مركز النانو، لذا فإن تشوهه أكبر من تشوه الركيزة العارية.كونستا-جدوتوس وآخرون.(45) يعتقد أنه نظرًا لوجود البنى النانوية، فإن التسنن النانوي والخشونة الدقيقة/النانوية تؤدي إلى منحنيات التسنن النانوي غير المنتظمة.تتوافق المنطقة المظللة مع منحنى التشوه غير المنتظم المنسوب إلى البنية النانوية، بينما تنسب المنطقة غير المظللة إلى البنية المجهرية.قد يؤدي هذا التشوه إلى إتلاف البنية الدقيقة/البنية النانوية لمادة التشحيم القابضة ويؤثر سلبًا على أدائها المضاد للقاذورات.من أجل دراسة تأثير الضرر على LOIS، تم تكرار الضرر الحتمي للهياكل الدقيقة/النانو في الجسم أثناء الجراحة التجميلية.باستخدام اختبارات التصاق الدم والبروتين، يمكن تحديد استقرار الخصائص المضادة للحشف الحيوي لـ LOIS بعد المختبر (الشكل 4D).تُظهر سلسلة من الصور البصرية الضرر الذي حدث بالقرب من فتحات كل ركيزة.تم إجراء اختبار التصاق الدم لإثبات تأثير الأضرار الميكانيكية على الطلاء المضاد للحشف الحيوي (الشكل 4E).مثل SHP، يتم فقدان الخصائص المضادة للقاذورات بسبب التلف، ويظهر LOIS خصائص ممتازة مضادة للقاذورات عن طريق صد الدم.وذلك لأنه نظرًا لأن الطاقة السطحية مدفوعة بالعمل الشعري الذي يغطي المنطقة المتضررة، فإن التدفق في مادة التشحيم ذات البنية الدقيقة يستعيد الخصائص المضادة للقاذورات (35).ولوحظ نفس الاتجاه في اختبار التصاق البروتين باستخدام الألبومين.في المنطقة المتضررة، يتم ملاحظة التصاق البروتين على سطح SHP على نطاق واسع، ومن خلال قياس تغطيته للمساحة، يمكن قياسه على أنه نصف مستوى التصاق الركيزة العارية.من ناحية أخرى، حافظت LOIS على خصائصها المضادة للحشف الحيوي دون التسبب في التصاق (الشكل 4، F وG).بالإضافة إلى ذلك، غالبًا ما يتعرض سطح المسمار لضغط ميكانيكي قوي، مثل الحفر، لذلك قمنا بدراسة قدرة طلاء LOIS على البقاء سليمًا على المسمار في المختبر.ويبين الشكل 4H الصور البصرية للبراغي المختلفة، بما في ذلك البراغي العارية وSHP وLOIS.يمثل المستطيل الأحمر المنطقة المستهدفة التي يحدث فيها إجهاد ميكانيكي قوي أثناء زراعة العظام.على غرار اختبار التصاق البروتين للوحة، يتم استخدام مجهر مضان لتصوير التصاق البروتين وقياس منطقة التغطية لإثبات سلامة طلاء LOIS، حتى في ظل الضغط الميكانيكي القوي (الشكل 4، I وJ).تتميز البراغي المعالجة بـ LOIS بأداء ممتاز مضاد للقاذورات، ولا يلتصق أي بروتين تقريبًا بالسطح.من ناحية أخرى، لوحظ التصاق البروتين في البراغي العارية ومسامير SHP، حيث كانت تغطية مساحة مسامير SHP ثلث مساحة البراغي العارية.بالإضافة إلى ذلك، يجب أن تكون زراعة العظام المستخدمة للتثبيت قوية ميكانيكيًا لتحمل الضغط المطبق على موقع الكسر، كما هو موضح في الشكل 4K.ولذلك، تم إجراء اختبار الانحناء لتحديد تأثير التعديل الكيميائي على الخواص الميكانيكية.بالإضافة إلى ذلك، يتم ذلك للحفاظ على الضغط الثابت الناتج عن الزرعة.تطبيق القوة الميكانيكية العمودية حتى يتم طي الزرع بالكامل ويتم الحصول على منحنى الإجهاد والانفعال (الشكل 4L، 1).وتمت مقارنة خاصيتين بما في ذلك معامل يونغ وقوة الانثناء بين الركائز العارية وLOIS كمؤشرات على قوتها الميكانيكية (الشكل 4L، 2 و3).يشير معامل يونغ إلى قدرة المادة على تحمل التغيرات الميكانيكية.معامل يونج لكل ركيزة هو 41.48 ± 1.01 و 40.06 ± 0.96 GPa، على التوالي؛الفرق الملحوظ هو حوالي 3.4٪.بالإضافة إلى ذلك، يُذكر أن قوة الانحناء، التي تحدد صلابة المادة، تبلغ 102.34 ± 1.51 GPa للركيزة العارية و96.99 ± 0.86 GPa للـ SHP.الركيزة العارية أعلى بنسبة 5.3٪ تقريبًا.قد يكون سبب الانخفاض الطفيف في الخواص الميكانيكية هو تأثير الشق.في تأثير الحز، قد تعمل الخشونة الدقيقة/ النانوية كمجموعة من الحزوز، مما يؤدي إلى تركيز الإجهاد المحلي والتأثير على الخواص الميكانيكية للزرع (46).ومع ذلك، استنادًا إلى حقيقة أن صلابة العظم القشري البشري تتراوح بين 7.4 و31.6 جيجا باسكال، وأن معامل LOIS المقاس يتجاوز نظيره في العظم القشري البشري (47)، فإن LOIS كافٍ لدعم الكسر ومجمله. تتأثر الخواص الميكانيكية بشكل طفيف بتعديل السطح.
(أ) رسم تخطيطي لـ (1) الضغط الميكانيكي المطبق على زراعة العظام أثناء العملية، و(2) الصورة البصرية لزراعة العظام التالفة.(ب) رسم تخطيطي لقياس الخواص الميكانيكية النانوية عن طريق المسافة البادئة النانوية وLOIS على السطح العاري.(C) منحنى قوة النزوح Nanoindentation من السطح العاري وLOIS.(د) بعد التجارب المختبرية، محاكاة الصور البصرية لأنواع مختلفة من لوحات العظام (يتم تمييز المنطقة المتضررة بمستطيل أحمر) لمحاكاة الضغط الميكانيكي الناتج أثناء العملية.(E) اختبار التصاق الدم واختبار التصاق البروتين (F) لمجموعة لوحة العظام التالفة.(ز) قياس مساحة تغطية البروتين الملتصق باللوحة.(ح) الصور البصرية لأنواع مختلفة من مسامير العظام بعد التجربة في المختبر.(I) اختبار التصاق البروتين لدراسة سلامة الطلاءات المختلفة.(ي) قياس مساحة التغطية للبروتين الملتصق بالمسمار.(ك) تهدف حركة الأرنب إلى توليد ضغط ثابت على العظم المكسور.(L) (1) نتائج اختبار الانحناء والصور البصرية قبل وبعد الانحناء.الفرق في (2) معامل يونج و (3) قوة الانحناء بين الغرسة العارية و SHP.يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ​​± SD (* P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001 و **** P <0.0001).الصورة مجاملة: كيومين تشاي، جامعة يونسي.
في الحالات السريرية، يأتي معظم الاتصال البكتيري بالمواد البيولوجية ومواقع الجروح من الأغشية الحيوية الناضجة (48).ولذلك، تقدر المراكز الأمريكية لمكافحة الأمراض والوقاية منها أن 65% من جميع حالات العدوى البشرية مرتبطة بالأغشية الحيوية (49).في هذه الحالة، من الضروري توفير تصميم تجريبي في الجسم الحي يوفر تكوينًا متسقًا للأغشية الحيوية على سطح الزرعة.لذلك، قمنا بتطوير نموذج كسر فخذي أرنب حيث تم حضانة غرسات العظام مسبقًا في معلق بكتيري ثم تم زرعها في عظام الفخذ الأرانب لدراسة الخصائص المضادة للقاذورات لـ LOIS في الجسم الحي.بسبب الحقائق الثلاث الهامة التالية، يتم إحداث الالتهابات البكتيرية عن طريق ما قبل الثقافة بدلا من الحقن المباشر للمعلقات البكتيرية: (ط) جهاز المناعة لدى الأرانب أقوى بشكل طبيعي من جهاز البشر؛لذلك، من الممكن حقن المعلقات البكتيرية والبكتيريا العوالق، وليس لها أي تأثير على تكوين الأغشية الحيوية.(2) البكتيريا العوالق أكثر حساسية للمضادات الحيوية، وعادة ما تستخدم المضادات الحيوية بعد الجراحة؛وأخيرا، (ثالثا) يمكن تخفيف تعليق البكتيريا العوالق بواسطة سوائل جسم الحيوان (50).من خلال الزراعة المسبقة للزرعة في معلق بكتيري قبل الزرع، يمكننا دراسة الآثار الضارة للعدوى البكتيرية ورد فعل الجسم الغريب (FBR) بدقة على عملية شفاء العظام.تم التضحية بالأرانب بعد 4 أسابيع من الزرع، لأن التكامل العظمي الضروري لعملية شفاء العظام سيتم الانتهاء منه في غضون 4 أسابيع.ثم تمت إزالة الغرسات من الأرانب لإجراء الدراسات النهائية.ويبين الشكل 5A آلية انتشار البكتيريا.يتم إدخال الغرسة العظمية المصابة إلى الجسم.نتيجة للحضانة المسبقة في المعلق البكتيري، أصيب ستة من الأرانب الستة المزروعة بغرسات عارية، في حين لم يصب أي من الأرانب المزروعة بغرسات LOIS المعالجة.تتم العدوى البكتيرية في ثلاث خطوات، بما في ذلك النمو والنضج والتشتت (51).أولاً، تتكاثر البكتيريا المرتبطة وتنمو على السطح، ثم تشكل البكتيريا غشاءً حيويًا عندما تفرز البوليمر خارج الخلية (EPS) والأميلويد والحمض النووي خارج الخلية.لا يتداخل الغشاء الحيوي مع تغلغل المضادات الحيوية فحسب، بل يعزز أيضًا تراكم الإنزيمات المهينة للمضادات الحيوية (مثل بيتا لاكتاماز) (52).وأخيرًا، يقوم الغشاء الحيوي بنشر البكتيريا الناضجة في الأنسجة المحيطة.ولذلك تحدث العدوى.بالإضافة إلى ذلك، عندما يدخل جسم غريب إلى الجسم، فإن العدوى التي يمكن أن تسبب استجابة مناعية قوية يمكن أن تسبب التهابًا شديدًا وألمًا وانخفاضًا في المناعة.ويقدم الشكل 5B لمحة عامة عن FBR الناجم عن إدخال زرع العظام، بدلا من الاستجابة المناعية الناجمة عن عدوى بكتيرية.يتعرف الجهاز المناعي على الغرسة المدخلة كجسم غريب، ثم يتسبب في تفاعل الخلايا والأنسجة لتغليف الجسم الغريب (53).في الأيام الأولى لـ FBR، تم تشكيل مصفوفة إمداد على سطح غرسات العظام، مما أدى إلى امتصاص الفيبرينوجين.ثم يشكل الفيبرينوجين الممتز شبكة فيبرين عالية الكثافة، مما يعزز ارتباط الكريات البيض (54).بمجرد تشكيل شبكة الفيبرين، سيحدث التهاب حاد نتيجة لتسلل العدلات.في هذه الخطوة، يتم إطلاق مجموعة متنوعة من السيتوكينات مثل عامل نخر الورم-α (TNF-α)، والإنترلوكين-4 (IL-4) وIL-β، وتبدأ الخلايا الوحيدة في التسلل إلى موقع الزرع والتمايز إلى خلايا عملاقة.فج (41، 55، 56).لقد كان تقليل FBR دائمًا تحديًا لأن الإفراط في FBR يمكن أن يسبب التهابًا حادًا ومزمنًا، مما قد يؤدي إلى مضاعفات قاتلة.من أجل تقييم تأثير الالتهابات البكتيرية في الأنسجة المحيطة بالزرعة العارية وLOIS، تم استخدام تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) وتلطيخ ماسون ثلاثي الألوان (MT).بالنسبة للأرانب المزروعة باستخدام ركائز عارية، تطورت حالات العدوى البكتيرية الشديدة، وأظهرت شرائح الأنسجة H&E بوضوح خراجات ونخرًا ناجمًا عن الالتهاب.من ناحية أخرى، فإن سطح LOIS القوي للغاية المضاد للحشف الحيوي يمنع التصاق البكتيريا، لذلك لا يظهر أي علامات للعدوى ويقلل الالتهاب (الشكل 5C).وأظهرت نتائج تلطيخ MT نفس الاتجاه.ومع ذلك، أظهر تلطيخ MT أيضًا وذمة في الأرانب المزروعة بـ LOIS، مما يشير إلى أن التعافي على وشك الحدوث (الشكل 5D).من أجل دراسة درجة الاستجابة المناعية، تم إجراء تلطيخ المناعي (IHC) باستخدام السيتوكينات TNF-α و IL-6 المتعلقة بالاستجابة المناعية.وتمت مقارنة الغرسة السلبية العارية التي لم تتعرض للبكتيريا مع LOIS التي تعرضت للبكتيريا ولكنها لم تكن مصابة لدراسة عملية الشفاء في غياب العدوى البكتيرية.يوضح الشكل 5E صورة بصرية لشريحة IHC التي تعبر عن TNF-α.تمثل المنطقة البنية الاستجابة المناعية، مما يشير إلى انخفاض الاستجابة المناعية في LOIS قليلاً.وبالإضافة إلى ذلك، كان التعبير عن IL-6 في LOIS أقل بكثير من التعبير السلبي عن العقيمة العارية (الشكل 5F).تم قياس كمية التعبير عن السيتوكين عن طريق قياس مساحة تلطيخ الأجسام المضادة المقابلة للسيتوكين (الشكل 5G).بالمقارنة مع الأرانب المعرضة للزراعات السلبية، كانت مستويات التعبير للأرانب المزروعة بـ LOIS أقل، مما يدل على اختلاف كبير.يشير الانخفاض في تعبير السيتوكين إلى أن الخصائص المضادة للقاذورات المستقرة وطويلة المدى لـ LOIS لا تتعلق فقط بتثبيط الالتهابات البكتيرية، ولكن أيضًا بانخفاض FBR، الذي يحدث بواسطة البلاعم الملتصقة بالركيزة (53، 57، 58).لذلك، فإن الاستجابة المناعية المنخفضة بسبب خصائص التهرب المناعي لـ LOIS قد تحل الآثار الجانبية بعد الزرع، مثل الاستجابة المناعية المفرطة بعد الجراحة التجميلية.
(أ) رسم تخطيطي لآلية تكوين الأغشية الحيوية وانتشارها على سطح زرع العظام المصابة.eDNA، الحمض النووي خارج الخلية.(ب) رسم تخطيطي للاستجابة المناعية بعد إدخال زرع العظام.(C) تلطيخ H&E و(D) تلطيخ MT للأنسجة المحيطة بزراعة العظام مع إيجابية وLOIS.IHC من السيتوكينات المرتبطة بالمناعة (E) TNF-α و (F) IL-6 هي صور ملطخة للأرانب السلبية العارية والمزروعة بـ LOIS.(G) القياس الكمي للتعبير السيتوكين عن طريق قياس تغطية المنطقة (** P <0.01).
تم فحص التوافق الحيوي لـ LOIS وتأثيره على عملية شفاء العظام في الجسم الحي باستخدام التصوير التشخيصي [الأشعة السينية والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق (CT)] وIHC العظمية.ويبين الشكل 6A عملية شفاء العظام التي تنطوي على ثلاث مراحل مختلفة: الالتهاب، والإصلاح، وإعادة البناء.عندما يحدث الكسر، سوف تخترق الخلايا الالتهابية والخلايا الليفية العظم المكسور وتبدأ في النمو في الأنسجة الوعائية.أثناء مرحلة الإصلاح، ينتشر نمو الأنسجة الوعائية بالقرب من موقع الكسر.توفر الأنسجة الوعائية العناصر الغذائية اللازمة لتكوين عظام جديدة تسمى الكالس.المرحلة الأخيرة من عملية شفاء العظام هي مرحلة إعادة التشكيل، حيث يتم تقليل حجم الكالس إلى حجم العظم الطبيعي بمساعدة زيادة مستوى الخلايا العظمية المنشطة (59).تم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لموقع الكسر باستخدام الأشعة المقطعية الدقيقة لمراقبة الاختلافات في مستوى تكوين الكالس في كل مجموعة.مراقبة المقطع العرضي لعظم الفخذ لمراقبة سمك الكالس المحيطة بالعظم المكسور (الشكل 6، B وC).تم استخدام الأشعة السينية أيضًا لفحص مواقع الكسور لجميع المجموعات كل أسبوع لمراقبة عمليات تجديد العظام المختلفة في كل مجموعة (الشكل S9).تظهر الكالس والعظام الناضجة باللون الأزرق/الأخضر والعاجي، على التوالي.يتم ترشيح معظم الأنسجة الرخوة باستخدام عتبة محددة مسبقًا.أكد الفحص الإيجابي و SHP تكوين كمية صغيرة من الكالس حول موقع الكسر.من ناحية أخرى، فإن الجزء السلبي المكشوف من LOIS وموقع الكسر محاطان بنسيج سميك.أظهرت صور الأشعة المقطعية الدقيقة أن تكوين الكالس تم إعاقةه بسبب العدوى البكتيرية والالتهابات المرتبطة بالعدوى.وذلك لأن الجهاز المناعي يعطي الأولوية لشفاء الإصابات الإنتانية الناجمة عن الالتهابات المرتبطة بالعدوى، بدلا من تعافي العظام (60).تم إجراء تلطيخ IHC وحمض الفوسفاتيز المقاوم للطرطرات (TRAP) لمراقبة نشاط ناقضات العظم وارتشاف العظم (الشكل 6D) (61).تم العثور على عدد قليل فقط من الخلايا العظمية المنشطة ذات اللون الأرجواني في الإيجابيات العارية و SHP.من ناحية أخرى، لوحظت العديد من الخلايا الآكلة للعظم المنشطة بالقرب من عظام LOIS العارية الإيجابية والناضجة.تشير هذه الظاهرة إلى أنه في وجود الخلايا العظمية، يخضع الكالس حول موقع الكسر لعملية إعادة تشكيل عنيفة (62).تم قياس حجم العظام ومنطقة التعبير العظمية في الكالس لمقارنة مستوى تكوين الكالس حول موقع الكسر في جميع المجموعات، وذلك لتحديد نتائج الفحص بالأشعة المقطعية الدقيقة ونتائج IHC (الشكل 6E و1 و2).كما هو متوقع، كانت السلبيات العارية وتكوين الكالس في LOIS أعلى بكثير مما كانت عليه في المجموعات الأخرى، مما يشير إلى حدوث إعادة تشكيل إيجابية للعظام (63).يُظهر الشكل S10 الصورة البصرية للموقع الجراحي، ونتيجة تلطيخ MT للأنسجة التي تم جمعها بالقرب من المسمار، ونتيجة تلطيخ TRAP التي تسلط الضوء على واجهة عظم المسمار.في الركيزة العارية، لوحظ تكوين الكالس والتليف القوي، في حين أظهرت الغرسة المعالجة بـ LOIS سطحًا غير ملتصق نسبيًا.وبالمثل، بالمقارنة مع السلبيات العارية، لوحظ انخفاض التليف في الأرانب المزروعة بـ LOIS، كما يتبين من الأسهم البيضاء.بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تعزى الوذمة الصلبة (السهم الأزرق) إلى خصائص التهرب المناعي لـ LOIS، وبالتالي تقليل الالتهاب الشديد.يشير السطح غير اللاصق حول الزرعة والتليف المنخفض إلى أن عملية الإزالة أسهل، مما يؤدي عادةً إلى كسور أو التهابات أخرى.تم تقييم عملية شفاء العظام بعد إزالة المسمار من خلال نشاط ناقضة العظم في واجهة العظم اللولبي.امتص كل من العظم العاري وواجهة زرع LOIS مستويات مماثلة من الخلايا الآكلة لتعزيز شفاء العظام، مما يشير إلى أن طلاء LOIS ليس له أي تأثير سلبي على شفاء العظام أو الاستجابة المناعية.من أجل التأكد من أن تعديل السطح الذي تم إجراؤه على LOIS لا يتعارض مع عملية شفاء العظام، تم استخدام فحص الأشعة السينية لمقارنة شفاء العظام من الأرانب مع الأيونات السالبة المكشوفة و6 أسابيع من غرس LOIS (الشكل 6F).أظهرت النتائج أنه بالمقارنة مع المجموعة الإيجابية العارية غير المصابة، أظهر LOIS نفس درجة شفاء العظام، ولم تكن هناك علامات واضحة للكسر (خط تحلل العظم المستمر) في كلا المجموعتين.
(أ) رسم تخطيطي لعملية شفاء العظام بعد الكسر.(ب) الفرق في درجة تكوين الكالس لكل مجموعة سطحية و (ج) الصورة المقطعية لموقع الكسر.(د) تلطيخ فخ لتصور نشاط ناقضة العظم وارتشاف العظام.استنادًا إلى نشاط TRAP، تم تحليل تكوين الكالس الخارجي للعظم القشري كميًا بواسطة (E) (1) التصوير المقطعي المحوسب الدقيق و(2) نشاط ناقضات العظم.(F) بعد 6 أسابيع من الزرع، صور الأشعة السينية للعظم المكسور السلبي المكشوف (الذي أبرزه المستطيل المتقطع الأحمر) وLOIS (الذي أبرزه المستطيل المتقطع الأزرق).تم إجراء التحليل الإحصائي عن طريق تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA).* ف <0.05.** ف <0.01.
باختصار، يوفر LOIS نوعًا جديدًا من إستراتيجية العدوى المضادة للبكتيريا وطلاء الهروب المناعي لزراعة العظام.تُظهِر غرسات العظام التقليدية المزودة بوظيفة SHP خصائص مضادة للحشف الحيوي على المدى القصير، ولكنها لا تستطيع الحفاظ على خصائصها لفترة طويلة.تعمل الكارهة الفائقة للركيزة على احتجاز فقاعات الهواء بين البكتيريا والركيزة، وبالتالي تشكل جيوب هوائية، وبالتالي تمنع العدوى البكتيرية.ومع ذلك، بسبب انتشار الهواء، يمكن إزالة هذه الجيوب الهوائية بسهولة.من ناحية أخرى، أثبت LOIS قدرته على منع العدوى المرتبطة بالأغشية الحيوية.لذلك، نظرًا للخصائص المضادة للرفض لطبقة التشحيم المحقونة في سطح البنية الدقيقة/ النانوية، يمكن منع الالتهاب المرتبط بالعدوى.تُستخدم طرق التوصيف المختلفة بما في ذلك قياسات SEM وAFM وXPS وCA لتحسين ظروف تصنيع LOIS.بالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضًا تطبيق LOIS على المواد البيولوجية المختلفة المستخدمة بشكل شائع في معدات تثبيت العظام، مثل PLGA، وTi، وPE، وPOM، وPPSU.بعد ذلك، تم اختبار LOIS في المختبر لإثبات خصائصه المضادة للحشف الحيوي ضد البكتيريا والمواد البيولوجية المرتبطة بالاستجابة المناعية.أظهرت النتائج أن لها تأثيرات ممتازة مضادة للبكتيريا ومضادة للحشف الحيوي مقارنة بالزرعة العارية.بالإضافة إلى ذلك، يُظهر LOIS قوة ميكانيكية حتى بعد تطبيق الضغط الميكانيكي، وهو أمر لا مفر منه في الجراحة التجميلية.نظرًا لخصائص الشفاء الذاتي لمواد التشحيم الموجودة على سطح البنية الدقيقة/النانو، نجح LOIS في الحفاظ على خصائصه المضادة للقاذورات البيولوجية.من أجل دراسة التوافق الحيوي والخصائص المضادة للبكتيريا لـ LOIS في الجسم الحي، تم زرع LOIS في عظم فخذ الأرانب لمدة 4 أسابيع.لم يلاحظ أي عدوى بكتيرية في الأرانب المزروعة بـ LOIS.وبالإضافة إلى ذلك، أظهر استخدام IHC انخفاض مستوى الاستجابة المناعية المحلية، مما يشير إلى أن LOIS لا يمنع عملية شفاء العظام.يُظهر LOIS خصائص ممتازة مضادة للبكتيريا والتهرب المناعي، وقد ثبت أنه يمنع بشكل فعال تكوين الأغشية الحيوية قبل وأثناء جراحة العظام، خاصة لتخليق العظام.باستخدام نموذج كسر عظم الفخذ الالتهابي لنخاع عظم الأرنب، تمت دراسة تأثير الالتهابات المرتبطة بالأغشية الحيوية على عملية شفاء العظام الناجمة عن الغرسات المحتضنة مسبقًا بشكل عميق.كدراسة مستقبلية، هناك حاجة إلى نموذج جديد في الجسم الحي لدراسة الالتهابات المحتملة بعد الزرع لفهم ومنع الالتهابات المرتبطة بالأغشية الحيوية أثناء عملية الشفاء بأكملها.بالإضافة إلى ذلك، لا يزال تحريض العظام يمثل تحديًا لم يتم حله في التكامل مع LOIS.هناك حاجة إلى مزيد من البحث للجمع بين الالتصاق الانتقائي للخلايا العظمية أو الطب التجديدي مع LOIS للتغلب على التحدي.بشكل عام، يمثل LOIS طلاءًا واعدًا لزراعة العظام يتمتع بمتانة ميكانيكية وخصائص ممتازة مضادة للحشف الحيوي، والتي يمكن أن تقلل من تأثير مباحث أمن الدولة والآثار الجانبية المناعية.
اغسل الركيزة 304 SS مقاس 15 مم × 15 مم × 1 مم (شركة Dong Kang M-Tech Co.، كوريا) في الأسيتون ومياه EtOH وDI لمدة 15 دقيقة لإزالة الملوثات.من أجل تشكيل بنية على مستوى ميكرو/نانو على السطح، يتم غمر الركيزة المنظفة في محلول عالي التردد بنسبة 48% إلى 51% (شركة DUKSAN، كوريا الجنوبية) عند درجة حرارة 50 درجة مئوية.يتراوح وقت النقش من 0 إلى 60 دقيقة.بعد ذلك، تم تنظيف الركيزة المحفورة بالماء منزوع الأيونات ووضعها في محلول 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) عند درجة حرارة 50 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتكوين طبقة تخميل أكسيد الكروم على السطح.بعد التخميل، يتم غسل الركيزة بالماء منزوع الأيونات وتجفيفها للحصول على ركيزة ذات هيكل متعدد الطبقات.بعد ذلك، تم تعريض الركيزة لبلازما الأكسجين (100 وات، 3 دقائق)، وتم غمرها على الفور في محلول 8.88 ملي مولار (سيجما ألدريتش، ألمانيا) في التولوين عند درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة.بعد ذلك، تم تنظيف الركيزة المطلية بـ POTS باستخدام EtOH، وتصلبها عند 150 درجة مئوية لمدة ساعتين للحصول على POTS SAM كثيفة.بعد طلاء SAM، تم تشكيل طبقة تشحيم على الركيزة من خلال تطبيق مادة تشحيم البيرفلوروبولي إيثر (Krytox 101؛ DuPont، الولايات المتحدة الأمريكية) بحجم تحميل يبلغ 20 ميكرومتر / سم 2. قبل الاستخدام، قم بتصفية مادة التشحيم من خلال مرشح 0.2 ميكرون.قم بإزالة مواد التشحيم الزائدة عن طريق الإمالة بزاوية 45 درجة لمدة 15 دقيقة.تم استخدام نفس إجراء التصنيع لزراعة العظام المصنوعة من 304 SS (لوحة القفل ومسمار القفل القشري؛ شركة Dong Kang M-Tech Co.، كوريا).تم تصميم جميع غرسات العظام لتناسب هندسة عظم فخذ الأرنب.
تم فحص التشكل السطحي للركيزة وزراعة العظام عن طريق الانبعاث الميداني SEM (Inspect F50، FEI، USA) و AFM (XE-100، Park Systems، كوريا الجنوبية).يتم قياس خشونة السطح (Ra، Rq) بضرب مساحة 20 ميكرومتر في 20 ميكرومتر (ن = 4).تم استخدام نظام XPS (PHI 5000 VersaProbe، ULVAC PHI، اليابان) المجهز بمصدر الأشعة السينية Al Kα بحجم موضعي يبلغ 100 ميكرومتر لتحليل التركيب الكيميائي السطحي.تم استخدام نظام قياس CA مجهز بكاميرا التقاط صور ديناميكية (SmartDrop، FEMTOBIOMED، كوريا الجنوبية) لقياس CA السائل وSA.لكل قياس، يتم وضع 6 إلى 10 ميكرولتر من القطرات (الماء منزوع الأيونات، دم الحصان، EG، 30٪ إيثانول، وHD) على السطح لقياس CA.عندما تزيد زاوية ميل الركيزة بسرعة 2°/s (n = 4)، يتم قياس SA عند سقوط القطرة.
تم شراء Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] وMRSA (ATCC 25923) من ATCC (ماناساس، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، وتم الحفاظ على ثقافة المخزون عند -80 درجة مئوية.قبل الاستخدام، تم تحضين المزرعة المجمدة في مرق فول الصويا المذاب بالتربسين (كوميد، كوريا) عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة ثم نقلها مرتين لتنشيطها.بعد الحضانة، تم الطرد المركزي للثقافة عند 10000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وغسلها مرتين بمحلول PBS (الرقم الهيدروجيني 7.3).ومن ثم يتم زراعة ثقافة الطرد المركزي على لوحات أجار الدم (BAP).تم تحضير MRSA وPseudomonas aeruginosa طوال الليل وتم زراعتهما في مرق Luria-Bertani.تم تحديد كمية تركيز Pseudomonas aeruginosa وMRSA في اللقاح بواسطة CFU للتعليق في التخفيفات التسلسلية على أجار.ثم، ضبط تركيز البكتيريا إلى 0.5 معيار ماكفارلاند، وهو ما يعادل 108 CFU / مل.ثم قم بتخفيف المعلق البكتيري العامل 100 مرة إلى 106 CFU/ml.لاختبار خصائص الالتصاق المضادة للبكتيريا، تم تعقيم الركيزة عند 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.تم بعد ذلك نقل الركيزة إلى 25 مل من المعلق البكتيري وحضنت عند 37 درجة مئوية مع رج قوي (200 دورة في الدقيقة) لمدة 12 و72 ساعة.بعد الحضانة، تمت إزالة كل ركيزة من الحاضنة وغسلها 3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة أي بكتيريا عائمة على السطح.من أجل مراقبة الغشاء الحيوي على الركيزة، تم تثبيت الغشاء الحيوي بالميثانول وصبغه بـ 1 مل من برتقال القرميدين لمدة دقيقتين.ثم تم استخدام مجهر مضان (BX51TR، أوليمبوس، اليابان) لالتقاط صور للبيوفيلم الملون.من أجل قياس الأغشية الحيوية على الركيزة، تم فصل الخلايا المرفقة عن الركيزة بطريقة دوامة الخرزة، والتي تعتبر الطريقة الأكثر ملاءمة لإزالة البكتيريا المرفقة (ن = 4).باستخدام ملقط معقم، قم بإزالة الركيزة من وسط النمو واضغط على لوحة البئر لإزالة السائل الزائد.تمت إزالة الخلايا المرتبطة بشكل فضفاض عن طريق الغسيل مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.تم بعد ذلك نقل كل ركيزة إلى أنبوب اختبار معقم يحتوي على 9 مل من 0.1٪ بروتين ملحي (PSW) و 2 جم من 20 إلى 25 خرزة زجاجية معقمة (قطرها 0.4 إلى 0.5 مم).ثم تم تدويره لمدة 3 دقائق لفصل الخلايا من العينة.بعد الدوامة، تم تخفيف المعلق بشكل متسلسل 10 أضعاف مع 0.1٪ PSW، ثم تم تلقيح 0.1 مل من كل تخفيف على BAP.بعد 24 ساعة من الحضانة عند 37 درجة مئوية، تم حساب CFU يدويًا.
بالنسبة للخلايا، تم استخدام الخلايا الليفية الماوس NIH/3T3 (CRL-1658؛ ATCC الأمريكية) والبلاعم الماوس RAW 264.7 (TIB-71؛ ATCC الأمريكية).استخدم وسيط النسر المعدل في Dulbecco (DMEM؛ LM001-05، Welgene، كوريا) لزراعة الخلايا الليفية في الماوس وتكملة مع مصل العجل 10% (S103-01، Welgene) و1% البنسلين-ستربتوميسين (PS؛ LS202-02، Welgene (Welgene) استخدام DMEM لثقافة الضامة الماوس، على أن تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (S001-01، Welgene) و1٪ PS وضع الركيزة في لوحة ثقافة الخلية ستة جيدا، وتطعيم الخلايا في 105 خلية / سم2. تم تحضين الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية و5% من ثاني أكسيد الكربون. بالنسبة لتلطيخ الخلايا، تم تثبيت الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد 4% لمدة 20 دقيقة ووضعها في 0.5% Triton X Incubate لمدة 5 دقائق في -100 عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، بعد عملية الحضانة، استخدم الركيزة مع وسط تثبيت VECTASHIELD 4′,6-diamino-2-phenylindole (H -1200، UK). ، فلوريسئين ، فلوريسئين إيزوثيوسيانات - ألبومين (A9771 ، سيجما ألدريتش ، ألمانيا) والبلازما البشرية تم إذابة الفيبرينوجين المترافق Alexa Fluor 488 (F13191 ، Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية) في PBS (10 مم ، درجة الحموضة 7.4).كانت تركيزات الألبومين والفيبرينوجين 1 و150 ميكروغرام/مل على التوالي.بعد الركيزة قبل الانغماس في محلول البروتين، اشطفها ببرنامج تلفزيوني لترطيب السطح.ثم اغمر جميع الركائز في طبق مكون من ستة آبار يحتوي على محلول البروتين واحضنه عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 و90 دقيقة.بعد الحضانة، تمت إزالة الركيزة بعد ذلك من محلول البروتين، وغسلها بلطف باستخدام برنامج تلفزيوني 3 مرات، وتثبيتها باستخدام بارافورمالدهيد بنسبة 4٪ (ن = 4 لكل بروتين).بالنسبة للكالسيوم، تم إذابة كلوريد الصوديوم (0.21 م) وفوسفات البوتاسيوم (3.77 م) في الماء منزوع الأيونات.تم ضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 2.0 بإضافة محلول هيدروكلوريد (1 م).ثم تم إذابة كلوريد الكالسيوم (5.62 مم) في المحلول.عن طريق إضافة 1M تريس (هيدروكسي ميثيل) - أمينو ميثان يضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول إلى 7.4.تزج جميع الركائز في طبق من ستة بئر مملوء بمحلول فوسفات الكالسيوم × 1.5 ثم قم بإزالته من المحلول بعد 30 دقيقة.للتلوين، امزج 2 جم من Alizarin Red S (CI 58005) مع 100 مل من الماء منزوع الأيونات.بعد ذلك، استخدم 10% من هيدروكسيد الأمونيوم لضبط درجة الحموضة إلى 4. قم بصبغ الركيزة بمحلول Alizarin Red لمدة 5 دقائق، ثم تخلص من الصبغة الزائدة وامسحها.بعد عملية الاهتزاز، قم بإزالة الركيزة.يتم تجفيف المادة، ثم يتم غمرها في الأسيتون لمدة 5 دقائق، ثم يتم غمرها في محلول الأسيتون-زيلين (1:1) لمدة 5 دقائق، وأخيراً يتم غسلها بالزيلين (ن = 4).يتم استخدام المجهر الفلوري (Axio Imager) المزود بعدسات موضوعية ×10 و×20..A2m، Zeiss، Germany) صور جميع الركائز.تم استخدام ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) لقياس بيانات التصاق المواد البيولوجية في كل مجموعة من أربع مناطق تصوير مختلفة.تحويل جميع الصور إلى صور ثنائية ذات عتبات ثابتة لمقارنة الركيزة.
تم استخدام مجهر متحد البؤر Zeiss LSM 700 لمراقبة استقرار طبقة التشحيم في برنامج تلفزيوني في وضع الانعكاس.تم غمر العينة الزجاجية المطلية بـ SAM القائمة على الفلور مع طبقة تشحيم محقونة في محلول PBS، وتم اختبارها باستخدام شاكر مداري (SHO-1D؛ Daihan Scientific، كوريا الجنوبية) في ظل ظروف اهتزاز خفيفة (120 دورة في الدقيقة).ثم خذ العينة وراقب فقدان مادة التشحيم عن طريق قياس فقدان الضوء المنعكس.للحصول على صور مضان في وضع الانعكاس، يتم تعريض العينة لليزر بطول 633 نانومتر ثم يتم جمعها، لأن الضوء سوف ينعكس مرة أخرى من العينة.تم قياس العينات على فترات زمنية 0، 30، 60، و 120 ساعة.
من أجل تحديد تأثير عملية تعديل السطح على الخواص الميكانيكية النانوية لزراعة العظام، تم استخدام جهاز nanoindenter (TI 950 TriboIndenter، Hysitron، USA) المجهز بطرف بيركوفيتش الماسي ثلاثي الجوانب على شكل هرم لقياس النانو إندينيديون.الحمل الأقصى هو 10 mN والمساحة 100μmx 100μm.بالنسبة لجميع القياسات، يكون وقت التحميل والتفريغ 10 ثوانٍ، ووقت التثبيت تحت حمل المسافة البادئة القصوى هو 2 ثانية.خذ قياسات من خمسة مواقع مختلفة وخذ المتوسط.من أجل تقييم أداء القوة الميكانيكية تحت الحمل، تم إجراء اختبار الانحناء المستعرض ثلاثي النقاط باستخدام آلة اختبار عالمية (Instron 5966، Instron، USA).يتم ضغط الركيزة بمعدل ثابت قدره 10 نيوتن/ثانية مع زيادة الحمل.تم استخدام برنامج Bluehill Universal (n = 3) لحساب معامل الانحناء والحد الأقصى لإجهاد الضغط.
ومن أجل محاكاة عملية التشغيل والأضرار الميكانيكية ذات الصلة التي حدثت أثناء العملية، تم إجراء عملية التشغيل في المختبر.تم جمع عظام الفخذ من الأرانب البيضاء النيوزيلندية التي تم إعدامها.تم تنظيف عظم الفخذ وتثبيته في بارافورمالدهيد 4% لمدة أسبوع واحد.كما هو موضح في طريقة التجربة على الحيوانات، تم إجراء عملية جراحية لعظم الفخذ الثابت.بعد العملية، تم غمر زرع العظام في الدم (دم الحصان، كيسان، كوريا) لمدة 10 ثوانٍ للتأكد مما إذا كانت التصاقات الدم قد حدثت بعد تطبيق الإصابة الميكانيكية (ن = 3).
تم تقسيم إجمالي 24 أرنبًا أبيضًا نيوزيلنديًا ذكرًا (الوزن من 3.0 إلى 3.5 كجم، ومتوسط ​​العمر 6 أشهر) بشكل عشوائي إلى أربع مجموعات: سلبية عارية، وإيجابية عارية، وSHP، وLOIS.تم تنفيذ جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوانات وفقًا للمعايير الأخلاقية للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (تمت الموافقة على IACUC، KOREA-2017-0159).تتكون الغرسة العظمية من لوحة قفل بخمسة فتحات (طول 41 مم، عرض 7 مم وسمك 2 مم) ومسامير قفل قشرية (طول 12 مم، قطر 2.7 مم) لتثبيت الكسر.باستثناء تلك الصفائح والمسامير المستخدمة في المجموعة السلبية، تم تحضين جميع الصفائح والمسامير في معلق MRSA (106 وحدة تشكيل مستعمرة/مل) لمدة 12 ساعة.تمت معالجة المجموعة السلبية العارية (العدد = 6) بغرسات سطحية عارية دون التعرض للتعليق البكتيري، كعنصر تحكم سلبي للعدوى.تمت معالجة المجموعة الإيجابية العارية (ن = 6) بزراعة سطحية عارية معرضة للبكتيريا كعنصر تحكم إيجابي للعدوى.تمت معالجة مجموعة SHP (ن = 6) باستخدام غرسات SHP المكشوفة للبكتيريا.أخيرًا، تمت معالجة مجموعة LOIS باستخدام غرسات LOIS المكشوفة للبكتيريا (ن = 6).يتم الاحتفاظ بجميع الحيوانات في قفص، ويتم توفير الكثير من الطعام والماء.قبل العملية، تم صيام الأرانب لمدة 12 ساعة.تم تخدير الحيوانات عن طريق الحقن العضلي للزيلازين (5 مجم / كجم) والحقن في الوريد من باكليتاكسيل (3 مجم / كجم) للتحريض.بعد ذلك، تسليم 2% إيسوفلوراني و 50% إلى 70% الأكسجين الطبي (معدل التدفق 2 لتر/دقيقة) من خلال الجهاز التنفسي للحفاظ على التخدير.يتم زرعها من خلال الاقتراب المباشر من عظم الفخذ الجانبي.بعد إزالة الشعر وتطهير الجلد بالبوفيدون باليود، تم إجراء شق بطول حوالي 6 سم في الجزء الخارجي من عظم الفخذ الأوسط الأيسر.ومن خلال فتح الفجوة بين العضلات التي تغطي عظم الفخذ، ينكشف عظم الفخذ بالكامل.ضع اللوحة أمام عمود الفخذ وقم بإصلاحه بأربعة مسامير.بعد التثبيت، استخدم شفرة المنشار (1 مم) لإنشاء كسر بشكل مصطنع في المنطقة الواقعة بين الفتحة الثانية والفتحة الرابعة.وفي نهاية العملية، تم غسل الجرح بمحلول ملحي وإغلاقه بالغرز.تم حقن كل أرنب تحت الجلد بمادة الإنروفلوكساسين (5 مجم / كجم) المخفف بمقدار الثلث في محلول ملحي.تم أخذ الأشعة السينية بعد العملية الجراحية لعظم الفخذ في جميع الحيوانات (0، 7، 14، 21، 28، و 42 يومًا) لتأكيد قطع العظم.وبعد التخدير العميق، تم قتل جميع الحيوانات عن طريق حقن كلوريد البوتاسيوم في الوريد (2 مليمول/كجم) في 28 و42 يومًا.بعد التنفيذ، تم فحص عظم الفخذ بواسطة الأشعة المقطعية الدقيقة لمراقبة ومقارنة عملية شفاء العظام وتكوين العظام الجديدة بين المجموعات الأربع.
بعد التنفيذ، تم جمع الأنسجة الرخوة التي كانت على اتصال مباشر مع الغرسات العظمية.تم إصلاح الأنسجة في 10٪ من الفورمالين المحايد المخزن طوال الليل ثم تم تجفيفها في EtOH.تم تضمين الأنسجة المجففة في البارافين وتقسيمها بسمك 40 ميكرومتر باستخدام مشراح (400CS؛ EXAKT، ألمانيا).من أجل تصور العدوى، تم إجراء تلطيخ H&E وتلطيخ MT.من أجل التحقق من استجابة المضيف، تم تحضين الأنسجة المقطعية باستخدام الجسم المضاد الأولي للأرنب المضاد لـ TNF-α (AB6671، أبكام، الولايات المتحدة الأمريكية) والأرنب المضاد لـ IL-6 (AB6672؛ أبكام، الولايات المتحدة الأمريكية)، ثم تم علاجه بالفجل الحار.أوكسيديز.تطبيق نظام تلطيخ مجمع أفيدين البيوتين (ABC) على الأقسام وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.لكي يظهر كمنتج تفاعل بني، تم استخدام 3،3-ديامينوبنزيدين في جميع الأجزاء.تم استخدام ماسح ضوئي رقمي للشرائح (Pannoramic 250 Flash III، 3DHISTECH، المجر) لتصور جميع الشرائح، وتم تحليل أربع ركائز على الأقل في كل مجموعة بواسطة برنامج ImageJ.
تم التقاط صور الأشعة السينية لجميع الحيوانات بعد الجراحة وكل أسبوع لمراقبة شفاء الكسور (العدد = 6 لكل مجموعة).بعد التنفيذ، تم استخدام التصوير المقطعي المحوسب عالي الدقة لحساب تكوين الكالس حول عظم الفخذ بعد الشفاء.تم تنظيف عظم الفخذ الناتج، وتثبيته في بارافورمالدهيد 4% لمدة 3 أيام، وتجفيفه في 75% من الإيثانول.تم بعد ذلك فحص العظام المجففة باستخدام التصوير المقطعي المحوسب (SkyScan 1173، Brooke Micro-CT، Kandy، Belgium) لإنشاء صور فوكسل ثلاثية الأبعاد (2240 ​​× 2240 بكسل) لعينة العظام.استخدم مرشح Al 1.0 مم لتقليل ضوضاء الإشارة وتطبيق دقة عالية على جميع عمليات المسح (E = 133 كيلو فولت، I = 60 μA، وقت التكامل = 500 مللي ثانية).تم استخدام برنامج Nrecon (الإصدار 1.6.9.8، Bruker microCT، Kontich، بلجيكا) لإنشاء حجم ثلاثي الأبعاد للعينة الممسوحة ضوئيًا من الإسقاط الجانبي ثنائي الأبعاد الذي تم الحصول عليه.للتحليل، يتم تقسيم الصورة ثلاثية الأبعاد المُعاد بناؤها إلى مكعبات بحجم 10 مم × 10 مم × 10 مم وفقًا لموقع الكسر.حساب الكالس خارج العظم القشري.تم استخدام برنامج DataViewer (الإصدار 1.5.1.2؛ Bruker microCT، Kontich، بلجيكا) لإعادة توجيه حجم العظام الممسوحة ضوئيًا رقميًا، وتم استخدام برنامج CT-Analyzer (الإصدار 1.14.4.1؛ Bruker microCT، Kontich، بلجيكا) للتحليل.تتميز معاملات امتصاص الأشعة السينية النسبية في العظام الناضجة والكالس بكثافتها، ومن ثم يتم قياس حجم الكالس (ن = 4).من أجل التأكد من أن التوافق الحيوي لـ LOIS لا يؤخر عملية شفاء العظام، تم إجراء تحليل إضافي للأشعة السينية والأشعة المقطعية الدقيقة في اثنين من الأرانب: المجموعة السلبية العارية ومجموعات LOIS.تم إعدام المجموعتين في الأسبوع السادس.
تم جمع عظام الفخذ من الحيوانات المضحى بها وتثبيتها في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 3 أيام.ثم تتم إزالة الغرسة العظمية بعناية من عظم الفخذ.تمت إزالة الكالسيوم من عظم الفخذ لمدة 21 يومًا باستخدام 0.5 M EDTA (EC-900، National Diagnostics Corporation).ثم تم غمر عظم الفخذ منزوع الكالسيوم في EtOH لتجفيفه.تمت إزالة عظم الفخذ المجفف في الزيلين وجزءا لا يتجزأ من البارافين.بعد ذلك، تم تقطيع العينة إلى شرائح باستخدام مشراح دوار تلقائي (Leica RM2255، Leica Biosystems، ألمانيا) بسمك 3 ميكرومتر.بالنسبة لتلوين TRAP (F6760، Sigma-Aldrich، ألمانيا)، تمت إزالة الكافيين من العينات المقسمة، وتم ترطيبها واحتضانها في كاشف TRAP عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.تم الحصول على الصور باستخدام ماسح ضوئي للشرائح (Pannoramic 250 Flash III، 3DHISTECH، المجر) وتم قياسها كميًا عن طريق قياس تغطية المنطقة للمنطقة الملطخة.في كل تجربة، تم تحليل أربع ركائز على الأقل في كل مجموعة بواسطة برنامج ImageJ.
تم إجراء تحليل الدلالة الإحصائية باستخدام GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.، الولايات المتحدة الأمريكية).تم استخدام اختبار t غير المقترن وتحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لاختبار الاختلافات بين مجموعات التقييم.يشار إلى مستوى الأهمية في الشكل كما يلي: * P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001 و **** P <0.0001؛NS، لا يوجد فرق كبير.
للحصول على مواد تكميلية لهذه المقالة، يرجى الاطلاع على http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
هذه مقالة ذات وصول مفتوح وموزعة بموجب شروط ترخيص المشاع الإبداعي الإسناد غير التجاري، الذي يسمح بالاستخدام والتوزيع وإعادة الإنتاج في أي وسيط، طالما أن الاستخدام ليس لتحقيق مكاسب تجارية والفرضية هي أن الأصل العمل صحيح .مرجع.
ملحوظة: نحن نطلب منك فقط تقديم عنوان بريد إلكتروني حتى يعرف الشخص الذي توصيه بالصفحة أنك تريده أن يرى البريد الإلكتروني وأن البريد الإلكتروني ليس بريدًا عشوائيًا.لن نقوم بالتقاط أي عناوين بريد إلكتروني.
يُستخدم هذا السؤال لاختبار ما إذا كنت زائرًا بشريًا ولمنع إرسال البريد العشوائي تلقائيًا.
تشوي كيونغ مين، أوه يونغ جانغ، بارك جون جون، لي جين هيوك، كيم هيون تشيول، لي كيونغ مون، لي تشانغ كيو، لي يون تايك، لي سون أوك، جيونغ موروي
يمكن للطبقات المضادة للبكتيريا والمناعة لزراعة العظام أن تقلل من الالتهابات والاستجابات المناعية الناجمة عن العدوى.
تشوي كيونغ مين، أوه يونغ جانغ، بارك جون جون، لي جين هيوك، كيم هيون تشيول، لي كيونغ مون، لي تشانغ كيو، لي يون تايك، لي سون أوك، جيونغ موروي
يمكن للطبقات المضادة للبكتيريا والمناعة لزراعة العظام أن تقلل من الالتهابات والاستجابات المناعية الناجمة عن العدوى.
©2021 الجمعية الأمريكية لتقدم العلوم.كل الحقوق محفوظة.AAAS هي شريك لـ HINARI، وAGORA، وOARE، وCHORUS، وCLOCKSS، وCrossRef، وCOUNTER.تقدم العلوم ISSN 2375-2548.