Za paciente, ki so podvrženi operaciji ortopedskih vsadkov, so bakterijske okužbe in imunski odzivi, ki jih povzroči okužba, vedno predstavljali življenjsko nevarna tveganja.Konvencionalni biološki materiali so dovzetni za biološko kontaminacijo, ki povzroči, da bakterije vdrejo v poškodovano območje in povzročijo pooperativno okužbo.Zato je nujno treba razviti protiinfekcijske in imunske prevleke za ortopedske vsadke.Tu smo razvili napredno tehnologijo za spreminjanje površine za ortopedske vsadke, imenovano Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), ki se zgleduje po gladki površini vrčev za rastline.LOIS ima dolgotrajno in močno odpornost na različne tekočine in biološke snovi (vključno s celicami, beljakovinami, kalcijem in bakterijami).Poleg tega smo potrdili mehansko vzdržljivost proti praskam in pritrdilno silo s simulacijo neizogibnih poškodb med operacijo in vitro.Model vnetnega zloma stegnenice kunčjega kostnega mozga je bil uporabljen za temeljito proučevanje sposobnosti LOIS proti biološkemu luščenju in proti okužbam.Predvidevamo, da je LOIS, ki ima lastnosti proti biološkim obraščanjem in mehansko vzdržljivost, korak naprej v ortopedski kirurgiji brez okužb.
Danes se je zaradi vsesplošnega staranja zelo povečalo število bolnikov z ortopedskimi boleznimi (kot so starejši zlomi, degenerativne bolezni sklepov, osteoporoza) (1, 2).Zato zdravstvene ustanove pripisujejo velik pomen ortopedski kirurgiji, vključno z ortopedskimi vsadki vijakov, ploščic, žebljev in umetnih sklepov (3, 4).Vendar so poročali, da so tradicionalni ortopedski vsadki dovzetni za bakterijsko adhezijo in tvorbo biofilma, kar lahko povzroči okužbo na mestu operacije (SSI) po operaciji (5, 6).Ko se na površini ortopedskega vsadka oblikuje biofilm, postane odstranitev biofilma izjemno težavna tudi z uporabo velikih odmerkov antibiotikov.Zato običajno vodi v hude pooperativne okužbe (7, 8).Zaradi navedenih težav mora zdravljenje okuženih vsadkov vključevati ponovno operacijo, vključno z odstranitvijo vseh vsadkov in okoliških tkiv;zato bo bolnik utrpel hude bolečine in določena tveganja (9, 10).
Da bi rešili nekatere od teh težav, so razvili ortopedske vsadke, ki izločajo zdravila, da bi preprečili okužbo z odstranjevanjem bakterij, pritrjenih na površino (11, 12).Vendar strategija še vedno kaže številne omejitve.Poročali so, da je dolgotrajna implantacija vsadkov, ki izločajo zdravilo, povzročila poškodbe okoliških tkiv in povzročila vnetje, ki lahko povzroči nekrozo (13, 14).Poleg tega organska topila, ki lahko obstajajo po proizvodnem procesu ortopedskih vsadkov, ki izločajo zdravila, ki jih ameriška uprava za hrano in zdravila strogo prepoveduje, zahtevajo dodatne korake čiščenja, da izpolnijo njene standarde (15).Vsadki, ki izločajo zdravilo, so zahtevni za nadzorovano sproščanje zdravil in zaradi omejenega nalaganja zdravila dolgotrajna uporaba zdravila ni izvedljiva (16).
Druga pogosta strategija je prevleka implantata s polimerom proti obraščanju, da se prepreči oprijem bioloških snovi in ​​bakterij na površino (17).Na primer, zwitterionski polimeri so pritegnili pozornost zaradi svojih nelepljivih lastnosti v stiku s plazemskimi proteini, celicami in bakterijami.Vendar pa ima nekatere omejitve v zvezi z dolgoročno stabilnostjo in mehansko vzdržljivostjo, ki ovirajo njegovo praktično uporabo v ortopedskih vsadkih, zlasti zaradi mehanskega strganja med kirurškimi posegi (18, 19).Poleg tega so bili ortopedski vsadki iz biološko razgradljivih materialov uporabljeni zaradi visoke biokompatibilnosti, odsotnosti potrebe po operaciji odstranitve in lastnosti čiščenja površine zaradi korozije (20, 21).Med korozijo se kemične vezi med polimerno matriko razgradijo in ločijo od površine, adhezivi pa očistijo površino.Vendar je protibiološko obraščanje s površinskim čiščenjem učinkovito v kratkem času.Poleg tega bo večina vpojnih materialov, vključno s kopolimerom poli(mlečne kisline in glikolne kisline) (PLGA), polimlečno kislino (PLA) in zlitinami na osnovi magnezija, podvržena neenakomerni biorazgradnji in eroziji v telesu, kar bo negativno vplivalo na mehansko stabilnost.(dvaindvajset).Poleg tega delci biorazgradljive plošče zagotavljajo prostor za pritrditev bakterij, kar dolgoročno poveča možnost okužbe.To tveganje mehanske razgradnje in okužbe omejuje praktično uporabo plastične kirurgije (23).
Superhidrofobne (SHP) površine, ki posnemajo hierarhično strukturo lotosovih listov, so postale potencialna rešitev za površine proti obraščanju (24, 25).Ko je površina SHP potopljena v tekočino, se ujamejo zračni mehurčki, ki tvorijo zračne žepke in preprečujejo oprijem bakterij (26).Vendar so nedavne študije pokazale, da ima površina SHP pomanjkljivosti, povezane z mehansko vzdržljivostjo in dolgoročno stabilnostjo, kar ovira njeno uporabo v medicinskih vsadkih.Poleg tega se bodo zračni žepi raztopili in izgubili svoje lastnosti proti obraščanju, kar bo povzročilo širši oprijem bakterij zaradi velike površine površine SHP (27, 28).Pred kratkim so Aizenberg in njegovi sodelavci predstavili inovativno metodo površinskega premaza proti biološkemu obraščanju z razvojem gladke površine po navdihu rastline Nepenthes vrč (29, 30).Gladka površina kaže dolgotrajno stabilnost v hidravličnih pogojih, je izredno tekočinsko odbijajoča biološke tekočine in ima samopopravljive lastnosti.Vendar pa ne obstaja niti metoda za nanašanje prevleke na medicinski vsadek kompleksne oblike, niti ni dokazano, da podpira proces celjenja poškodovanega tkiva po vsaditvi.
Tukaj predstavljamo mazano površino ortopedskega vsadka (LOIS), mikro/nanostrukturirano površino ortopedskega vsadka in tesno povezano s tanko plastjo maziva, da preprečimo, da bi bila povezana z bakterijskimi okužbami plastične kirurgije, kot je fiksacija zloma.Ker struktura na mikro/nano nivoju s fluorom funkcionalizira mazivo trdno pritrdi na strukturo, lahko razviti LOIS v celoti odbija oprijem različnih tekočin in dolgo časa ohranja delovanje proti obraščanju.LOIS prevleke lahko nanesemo na materiale različnih oblik, namenjene sintezi kosti.Odlične lastnosti LOIS proti biološkim obraščanjem proti bakterijam biofilma [Pseudomonas aeruginosa in na meticilin odporni Staphylococcus aureus (MRSA)] in biološkim snovem (celicam, beljakovinam in kalciju) so bile potrjene in vitro.Stopnja adhezije ekstenzivnega oprijema na podlago je manjša od 1 %.Poleg tega tudi po mehanskih obremenitvah, kot je površinsko praskanje, samozdravljenje, ki ga povzroči prodirajoče mazivo, pomaga ohraniti lastnosti proti obraščanju.Rezultati preskusa mehanske vzdržljivosti kažejo, da tudi po strukturni in kemični modifikaciji skupna trdnost ne bo bistveno zmanjšana.Poleg tega je bil izveden poskus in vitro, ki simulira mehansko obremenitev v kirurškem okolju, da bi dokazali, da lahko LOIS prenese različne mehanske obremenitve, ki se pojavijo med plastično operacijo.Nazadnje smo uporabili in vivo model zloma stegnenice na osnovi kuncev, ki je dokazal, da ima LOIS vrhunske antibakterijske lastnosti in biokompatibilnost.Radiološki in histološki rezultati so potrdili, da lahko stabilno obnašanje maziva in lastnosti proti biološkim obraščanjem v 4 tednih po implantaciji dosežejo učinkovito proti okužbam in učinkovitost imunskega pobega brez odlašanja procesa celjenja kosti.
Slika 1A prikazuje shematski diagram razvitega LOIS-a, ki je implantiran s strukturami v mikro/nano merilu v model zloma stegnenice zajca, da potrdi njegove odlične lastnosti proti biološkemu obraščanju in proti okužbam.Izvaja se biomimetična metoda za simulacijo površine vodne lončnice in za preprečevanje biološkega obraščanja z vključitvijo mazalne plasti v mikro/nano strukturo površine.Površina, vbrizgana z mazivom, lahko zmanjša stik med biološkimi snovmi in površino.Zato ima zaradi tvorbe stabilnih kemičnih vezi na površini odlično delovanje proti obraščanju in dolgoročno stabilnost.Zaradi tega lastnosti mazalne površine proti obraščanju omogočajo različne praktične uporabe v biomedicinskih raziskavah.Vendar pa obsežne raziskave o tem, kako ta posebna površina medsebojno deluje v telesu, še niso zaključene.S primerjavo LOIS z golimi substrati in vitro z uporabo albumina in bakterij iz biofilma je mogoče potrditi nelepljivost LOIS (slika 1B).Poleg tega je mogoče z odvaljanjem vodnih kapljic na nagnjeno golo podlago in podlago LOIS (slika S1 in film S1) prikazati učinkovitost biološkega onesnaženja.Kot je prikazano na sliki fluorescenčnega mikroskopa, je izpostavljeni substrat, inkubiran v suspenziji beljakovin in bakterij, pokazal veliko količino biološkega materiala, ki se je oprijel površine.Vendar pa LOIS zaradi svojih odličnih lastnosti proti biološkim obraščanjem skoraj ne fluorescencira.Da bi potrdili njegove lastnosti proti biološkemu obraščanju in proti okužbam, je bil LOIS nanesen na površino ortopedskih vsadkov za sintezo kosti (plošče in vijaki) in nameščen v model zloma zajca.Pred implantacijo sta bila goli ortopedski vsadek in LOIS 12 ur inkubirana v bakterijski suspenziji.Predinkubacija zagotavlja, da se na površini izpostavljenega vsadka oblikuje biofilm za primerjavo.Slika 1C prikazuje fotografijo mesta zloma 4 tedne po implantaciji.Na levi je zajec z golim ortopedskim vsadkom pokazal hudo stopnjo vnetja zaradi tvorbe biofilma na površini vsadka.Nasprotni rezultat so opazili pri kuncih, ki so jim implantirali LOIS, to pomeni, da okoliška tkiva LOIS niso kazala niti znakov okužbe niti znakov vnetja.Poleg tega optična slika na levi označuje kirurško mesto zajca z izpostavljenim vsadkom, kar kaže, da na površini LOIS ni bilo več lepil, ki so prisotna na površini izpostavljenega vsadka.To kaže, da je LOIS dolgoročno stabilen in ima sposobnost ohraniti svoje lastnosti proti biološkemu obraščanju in proti sprijemanju.
(A) Shematski diagram LOIS in njegove implantacije v model zloma stegnenice zajca.(B) Fluorescenčna mikroskopska slika proteinskega in bakterijskega biofilma na goli površini in substratu LOIS.4 tedne po implantaciji (C) fotografska slika mesta zloma in (D) rentgenska slika (poudarjena z rdečim pravokotnikom).Avtor slike: Kyomin Chae, Univerza Yonsei.
Sterilizirani, izpostavljeni negativno vsajeni kunci so pokazali normalen proces celjenja kosti brez znakov vnetja ali okužbe.Po drugi strani pa vsadki SHP, predhodno inkubirani v bakterijski suspenziji, kažejo z okužbo povezano vnetje na okoliških tkivih.To je mogoče pripisati njegovi nezmožnosti dolgotrajnega zaviranja adhezije bakterij (slika S2).Da bi dokazali, da LOIS ne vpliva na proces celjenja, ampak zavira morebitne okužbe, povezane z implantacijo, smo primerjali rentgenske slike izpostavljenega pozitivnega matriksa in LOIS na mestu zloma (slika 1D).Rentgenska slika golega pozitivnega vsadka je pokazala vztrajne linije osteolize, kar kaže, da kost ni bila popolnoma zaceljena.To nakazuje, da se lahko proces okrevanja kosti močno upočasni zaradi vnetja, povezanega z okužbo.Nasprotno, pokazalo je, da so se kunci, ki so jim vsadili LOIS, zacelili in niso pokazali očitnega mesta zloma.
Da bi razvili medicinske vsadke z dolgoročno stabilnostjo in funkcionalnostjo (vključno z odpornostjo na biološko obraščanje), je bilo vloženih veliko truda.Vendar pa prisotnost različnih bioloških substanc in dinamika tkivne adhezije omejujeta razvoj njihovih klinično zanesljivih metod.Da bi premagali te pomanjkljivosti, smo razvili mikro/nano plastno strukturo in kemično modificirano površino, ki je optimizirana zaradi visoke kapilarne sile in kemične afinitete, da v največji meri ohrani najbolj gladko mazivo.Slika 2A prikazuje celoten proizvodni proces LOIS.Najprej pripravite substrat iz nerjavečega jekla (SS) 304 medicinske kakovosti.Drugič, mikro/nano struktura se oblikuje na substratu SS s kemičnim jedkanjem z uporabo raztopine fluorovodikove kisline (HF).Za obnovitev odpornosti nerjavečega jekla proti koroziji se za obdelavo jedkanega substrata uporabi raztopina dušikove kisline (HNO3) (31).Pasivacija poveča korozijsko odpornost substrata iz nerjavečega jekla in znatno upočasni proces korozije, ki lahko zmanjša splošno učinkovitost LOIS.Nato se z oblikovanjem samosestavljenega monosloja (SAM) z 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktiltrietoksisilanom (POTS) površina kemično modificira za izboljšanje kemične interakcije med površino in gladkim mazivom Affinity.Površinska modifikacija bistveno zmanjša površinsko energijo izdelane mikro/nano skale strukturirane površine, ki se ujema s površinsko energijo gladkega maziva.To omogoča, da se mazivo popolnoma zmoči, s čimer na površini nastane stabilen sloj maziva.Modificirana površina kaže povečano hidrofobnost.Rezultati kažejo, da ima spolzko mazivo stabilno obnašanje na LOIS zaradi visoke kemične afinitete in kapilarne sile, ki jo povzroča mikro/nano struktura (32, 33).Proučevali smo optične spremembe na površini SS po površinski modifikaciji in vbrizgavanju maziva.Mikro/nano plastna struktura, oblikovana na površini, lahko povzroči vizualne spremembe in potemni površino.Ta pojav pripisujejo povečanemu učinku sipanja svetlobe na hrapavi površini, ki poveča difuzni odboj, ki ga povzroči mehanizem za lovljenje svetlobe (34).Poleg tega po vbrizganju lubrikanta LOIS postane temnejši.Mazalna plast povzroči, da se od podlage odbije manj svetlobe in s tem potemni LOIS.Da bi optimizirali mikrostrukturo/nanostrukturo za prikaz najmanjšega drsnega kota (SA) za doseganje učinkovitosti proti biološkim obraščanjem, smo uporabili vrstično elektronsko mikroskopijo (SEM) in atomske pare za izvedbo različnih časov HF jedkanja (0, 3)., 15 in 60 minut) mikroskop s silo (AFM) (slika 2B).Slike SEM in AFM kažejo, da je po kratkem času jedkanja (3 minute jedkanja) goli substrat oblikoval neenakomerno hrapavost v nano merilu.Površinska hrapavost se spreminja s časom jedkanja (slika S3).Časovno spremenljiva krivulja kaže, da površinska hrapavost še naprej narašča in doseže vrh pri 15 minutah jedkanja, nato pa opazimo le rahlo zmanjšanje vrednosti hrapavosti pri 30 minutah jedkanja.Na tej točki je hrapavost na nano ravni vgravirana, medtem ko se hrapavost na mikro ravni močno razvija, zaradi česar je sprememba hrapavosti bolj stabilna.Po več kot 30-minutnem jedkanju opazimo nadaljnje povečanje hrapavosti, kar je podrobno razloženo na naslednji način: SS je sestavljen iz jekla, legiranega z elementi, kot so železo, krom, nikelj, molibden in številni drugi elementi.Med temi elementi imajo železo, krom in molibden pomembno vlogo pri oblikovanju hrapavosti v mikronskem/nano merilu na SS s HF jedkanjem.V zgodnjih fazah korozije sta železo in krom večinoma korodirana, ker ima molibden večjo odpornost proti koroziji kot molibden.Ko jedkanje napreduje, raztopina za jedkanje doseže lokalno prenasičenost, pri čemer nastanejo fluoridi in oksidi, ki jih povzroči jedkanje.Fluorid in oksid se obarjata in sčasoma ponovno odlagata na površini, pri čemer tvorita površinsko hrapavost v območju mikronov/nano (31).Ta hrapavost na mikro/nano ravni igra pomembno vlogo pri samozdravilnih lastnostih LOIS.Dvojna površina povzroči sinergistični učinek, ki močno poveča kapilarno silo.Ta pojav omogoča, da mazivo stabilno prodre v površino in prispeva k samozdravilnim lastnostim (35).Nastanek hrapavosti je odvisen od časa jedkanja.Pod 10 minutami jedkanja je na površini le hrapavost v nanometru, ki pa ni dovolj, da bi zadržala dovolj maziva za odpornost proti obraščanju (36).Po drugi strani pa, če čas jedkanja preseže 30 minut, bo hrapavost nanometrskega merila, ki nastane zaradi ponovnega odlaganja železa in kroma, izginila in bo zaradi molibdena ostala samo hrapavost mikro merila.Preveč jedkana površina nima hrapavosti v nano merilu in izgubi sinergistični učinek dvostopenjske hrapavosti, kar negativno vpliva na lastnosti samozdravljenja LOIS.Meritve SA so bile izvedene na podlagah z različnimi časi jedkanja, da se dokaže učinkovitost proti obraščanju.Na podlagi viskoznosti in površinske energije so bile izbrane različne vrste tekočin, vključno z deionizirano (DI) vodo, krvjo, etilen glikolom (EG), etanolom (EtOH) in heksadekanom (HD) (slika S4).Časovno spremenljiv vzorec jedkanja kaže, da je za različne tekočine z različnimi površinskimi energijami in viskoznostmi SA LOIS po 15 minutah jedkanja najnižji.Zato je LOIS optimiziran za 15-minutno jedkanje, da se tvori mikronska in nanometrska hrapavost, ki je primerna za učinkovito ohranjanje obstojnosti maziva in odličnih lastnosti proti obraščanju.
(A) Shematski diagram štiristopenjskega proizvodnega procesa LOIS.Vložek prikazuje SAM, oblikovan na substratu.(B) Slike SEM in AFM, ki se uporabljajo za optimizacijo mikro/nano strukture substrata pri različnih časih jedkanja.Spektri rentgenske fotoelektronske spektroskopije (XPS) za (C) Cr2p in (D) F1s po površinski pasivaciji in prevleki SAM.au, poljubna enota.(E) Reprezentativne slike vodnih kapljic na golih, jedkanih podlagah SHP in LOIS.(F) Merjenje kontaktnega kota (CA) in SA tekočin z različnimi površinskimi napetostmi na SHP in LOIS.Podatki so izraženi kot povprečje ± SD.
Nato smo za potrditev spremembe kemijskih lastnosti površine uporabili rentgensko fotoelektronsko spektroskopijo (XPS) za preučevanje spremembe kemijske sestave površine substrata po vsakem nanosu površine.Slika 2C prikazuje rezultate meritev XPS HF jedkane površine in površine, obdelane s HNO 3 .Dva glavna vrhova pri 587,3 in 577,7 eV lahko pripišemo vezi Cr-O, ki obstaja v plasti kromovega oksida, kar je glavna razlika od HF jedkane površine.To je predvsem posledica porabe železovega in kromovega fluorida na površini s HNO3.Jedkanje na osnovi HNO3 omogoča kromu, da na površini tvori pasivno oksidno plast, zaradi česar je jedkani SS ponovno odporen proti koroziji.Na sliki 2D so bili pridobljeni spektri XPS, ki potrjujejo, da je na površini po nanosu SAM nastal silan na osnovi fluoroogljika, ki ima izredno visoko odpornost na tekočino tudi za EG, kri in EtOH.Prevleka SAM je dokončana z reakcijo silanskih funkcionalnih skupin s hidroksilnimi skupinami, ki nastanejo s plazemsko obdelavo.Posledično so opazili znatno povečanje vrhov CF2 in CF3.Energija vezave med 286 in 296 eV kaže, da je bila kemična modifikacija uspešno zaključena s prevleko SAM.SHP kaže razmeroma velike vrhove CF2 (290,1 ​​eV) in CF3 (293,3 eV), ki jih povzroča silan na osnovi fluoroogljika, ki nastane na površini.Slika 2E prikazuje reprezentativne optične slike meritev kontaktnega kota (CA) za različne skupine deionizirane vode v stiku z golo, jedkano, SHP in LOIS.Te slike kažejo, da jedkana površina postane hidrofilna zaradi mikro/nano strukture, ki nastane s kemičnim jedkanjem, tako da se deionizirana voda absorbira v strukturo.Ko pa je substrat prevlečen s SAM, ima substrat močno vodoodbojnost, tako da nastane površinski SHP in je kontaktna površina med vodo in površino majhna.Končno so opazili zmanjšanje CA pri LOIS, kar je mogoče pripisati prodiranju maziva v mikrostrukturo, s čimer se poveča kontaktna površina.Da bi dokazali, da ima površina odlično sposobnost odbijanja tekočin in nelepljive lastnosti, smo LOIS primerjali s substratom SHP z merjenjem CA in SA z uporabo različnih tekočin (slika 2F).Na podlagi viskoznosti in površinske energije so bile izbrane različne vrste tekočin, vključno z deionizirano vodo, krvjo, EG, EtOH in HD (slika S4).Rezultati meritev CA kažejo, da ko se CA nagiba k HD, je vrednost zmanjšanja CA, kjer ima CA najnižjo površinsko energijo.Poleg tega je LOIS celotnega CA nizek.Vendar meritev SA kaže povsem drugačen pojav.Razen ionizirane vode se vse tekočine oprimejo podlage SHP, ne da bi zdrsnile.Po drugi strani pa LOIS kaže zelo nizek SA, kjer se bo vsa tekočina odkotalila, ko je vsa tekočina nagnjena pod kotom, manjšim od 10° do 15°.To močno dokazuje, da je nelepilnost LOIS boljša kot pri površini SHP.Poleg tega se premazi LOIS nanašajo tudi na različne vrste materialov, vključno s titanom (Ti), polifenilsulfonom (PPSU), polioksimetilenom (POM), polieter eter ketonom (PEEK) in bioabsorbljivimi polimeri (PLGA). So ortopedski materiali za vsaditev (slika S5)).Zaporedne slike kapljic na materialu, obdelanem z LOIS, kažejo, da so lastnosti LOIS proti obraščanju enake na vseh substratih.Poleg tega rezultati meritev CA in SA kažejo, da se nelepilne lastnosti LOIS lahko uporabijo za druge materiale.
Da bi potrdili lastnosti LOIS proti obraščanju, so bile različne vrste substratov (vključno z golimi, jedkanimi, SHP in LOIS) inkubirane s Pseudomonas aeruginosa in MRSA.Ti dve bakteriji sta bili izbrani kot reprezentativni bolnišnični bakteriji, ki lahko povzročita nastanek biofilmov, kar vodi do SSI (37).Slika 3 (A in B) prikazuje slike fluorescenčnega mikroskopa in rezultate merjenja enote za tvorbo kolonij (CFU) substratov, inkubiranih v bakterijski suspenziji kratkoročno (12 ur) oziroma dolgotrajno (72 ur).V kratkem času bodo bakterije oblikovale grozde in se povečale ter se prekrile s sluzi podobnimi snovmi in preprečile njihovo odstranitev.Vendar pa bodo med 72-urno inkubacijo bakterije dozorele in se zlahka razpršijo, da tvorijo več kolonij ali grozdov.Zato lahko štejemo, da je 72-urna inkubacija dolgotrajna in je primeren inkubacijski čas za nastanek močnega biofilma na površini (38).V kratkem času sta jedkana površina in površina SHP pokazali bakterijsko adhezijo, ki se je zmanjšala za približno 25% do 50% v primerjavi z golo podlago.Vendar zaradi svoje odlične učinkovitosti in stabilnosti proti obraščanju LOIS kratkoročno in dolgoročno ni pokazal adhezije bakterijskega biofilma.Shematski diagram (slika 3C) opisuje razlago protibiološkega mehanizma obraščanja raztopine za jedkanje, SHP in LOIS.Predpostavka je, da bo imel jedkan substrat s hidrofilnimi lastnostmi večjo površino kot goli substrat.Zato se bo na jedkani podlagi pojavilo več oprijema bakterij.Vendar ima v primerjavi z golo podlago na površini jedkane podlage nastal bistveno manj biofilma.To je zato, ker se molekule vode trdno vežejo na hidrofilno površino in delujejo kot mazivo za vodo ter tako kratkoročno ovirajo oprijem bakterij (39).Vendar pa je plast vodnih molekul zelo tanka in topna v bakterijskih suspenzijah.Zato vodna molekularna plast izgine za dolgo časa, kar vodi do obsežne bakterijske adhezije in proliferacije.Pri SHP je zaradi njegovih kratkotrajnih lastnosti nemočenja bakterijska adhezija zavrta.Zmanjšano oprijem bakterij je mogoče pripisati zračnim žepom, ujetim v plastno strukturo, in nižji površinski energiji, s čimer se zmanjša stik med bakterijsko suspenzijo in površino.Vendar pa so pri mHE opazili obsežno bakterijsko adhezijo, ker je za dolgo časa izgubila lastnosti proti obraščanju.To je predvsem posledica izginotja zračnih žepov zaradi hidrostatičnega tlaka in raztapljanja zraka v vodi.To je predvsem posledica izginotja zračnih žepkov zaradi raztapljanja in plastne strukture, ki zagotavlja večjo površino za oprijem (27, 40).Za razliko od teh dveh substratov, ki pomembno vplivata na dolgoročno stabilnost, je mazivo, ki ga vsebuje LOIS, vbrizgano v mikro/nano strukturo in ne bo izginilo niti dolgoročno.Maziva, polnjena z mikro/nano strukturami, so zelo stabilna in se zaradi svoje visoke kemijske afinitete močno privlačijo na površino, s čimer dolgotrajno preprečujejo oprijem bakterij.Slika S6 prikazuje refleksijsko konfokalno mikroskopsko sliko substrata, napolnjenega z mazivom, potopljenega v fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS).Neprekinjene slike kažejo, da tudi po 120 urah rahlega tresenja (120 vrtljajev na minuto) plast maziva na LOIS ostane nespremenjena, kar kaže na dolgoročno stabilnost v pogojih pretoka.To je posledica visoke kemične afinitete med prevleko SAM na osnovi fluora in mazivom na osnovi perfluoroogljika, tako da se lahko oblikuje stabilna plast maziva.Zato se ohrani učinkovitost proti obraščanju.Poleg tega je bil substrat testiran proti reprezentativnim beljakovinam (albumin in fibrinogen), ki so v plazmi, celicam, ki so tesno povezane z imunsko funkcijo (makrofagi in fibroblasti), in tistim, ki so povezane s tvorbo kosti.Vsebnost kalcija je zelo visoka.(Slika 3D, 1 in 2 ter Slika S7) (41, 42).Poleg tega so slike fluorescenčnega mikroskopa adhezijskega testa za fibrinogen, albumin in kalcij pokazale različne adhezijske lastnosti vsake skupine substratov (slika S8).Med tvorbo kosti lahko na novo oblikovana kost in kalcijeve plasti obdajajo ortopedski vsadek, kar ne le oteži odstranitve, ampak lahko povzroči tudi nepričakovano škodo pacientu med postopkom odstranitve.Zato so nizke ravni kalcijevih usedlin na kostnih ploščicah in vijakih koristne za ortopedske operacije, ki zahtevajo odstranitev implantata.Na podlagi kvantifikacije pritrjenega območja na podlagi intenzivnosti fluorescence in števila celic smo potrdili, da LOIS kaže odlične lastnosti proti obraščanju za vse biološke snovi v primerjavi z drugimi substrati.Glede na rezultate poskusov in vitro je antibiološko obraščanje LOIS mogoče uporabiti za ortopedske vsadke, ki lahko ne le zavirajo okužbe, ki jih povzročajo bakterije iz biofilma, ampak tudi zmanjšajo vnetje, ki ga povzroča aktivni imunski sistem telesa.
(A) Slike fluorescenčnega mikroskopa vsake skupine (gole, jedkane, SHP in LOIS), inkubirane v suspenziji Pseudomonas aeruginosa in MRSA 12 in 72 ur.(B) Število adherentnih CFU Pseudomonas aeruginosa in MRSA na površini vsake skupine.(C) Shematski diagram protibiološkega mehanizma obraščanja pri kratkotrajnem in dolgotrajnem jedkanju, SHP in LOIS.(D) (1) Število fibroblastov, prilepljenih na vsak substrat, in fluorescenčne mikroskopske slike celic, prilepljenih na golo in LOIS.(2) Adhezijski test imunsko povezanih beljakovin, albumina in kalcija, vključenih v proces celjenja kosti (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 in **** P <0,0001).ns, ni pomembno.
V primeru neizogibnih koncentriranih napetosti je bila mehanska vzdržljivost vedno glavni izziv za nanašanje premazov proti obraščanju.Tradicionalne metode gela proti odplakam temeljijo na polimerih z nizko topnostjo v vodi in krhkostjo.Zato so običajno dovzetni za mehanske obremenitve v biomedicinskih aplikacijah.Zato mehansko obstojni premazi proti obraščanju ostajajo izziv za aplikacije, kot so ortopedski vsadki (43, 44).Slika 4A(1) prikazuje dve glavni vrsti obremenitve ortopedskih vsadkov, vključno s praskanjem (strižna obremenitev) in stiskanjem z optično sliko poškodovanega vsadka, ki jo ustvarijo klešče.Na primer, ko je vijak zategnjen z izvijačem ali ko kirurg trdno drži kostno ploščo s pinceto in uporablja tlačno silo, bo plastična kostna plošča poškodovana in opraskana tako na makro kot mikro/nano lestvici (slika 4A, 2) .Da bi preizkusili, ali lahko proizvedeni LOIS prenese te poškodbe med plastično kirurgijo, je bilo izvedeno nanoindentiranje za primerjavo trdote golega substrata in LOIS na mikro/nano lestvici za proučevanje mehanskih lastnosti mikro/nano strukture Udar (slika 4B).Shematski diagram prikazuje različno deformacijsko obnašanje LOIS zaradi prisotnosti mikro/nano struktur.Na podlagi rezultatov nanoindentiranja je bila narisana krivulja sila-premik (slika 4C).Modra slika predstavlja golo podlago, ki kaže le rahlo deformacijo, kot je razvidno iz največje globine vdolbine 0,26 μm.Po drugi strani pa lahko postopno povečanje sile nanoindentacije in premika, opaženo v LOIS (rdeča krivulja), kaže znake zmanjšanih mehanskih lastnosti, kar ima za posledico globino nanoindentacije 1,61 μm.To je zato, ker mikro/nano struktura, ki je prisotna v LOIS, zagotavlja globlji prostor za napredovanje konice nanoindenterja, zato je njegova deformacija večja od deformacije gole podlage.Konsta-Gdoutos et al.(45) meni, da zaradi prisotnosti nanostruktur nanoindentacija in mikro/nano hrapavost vodita do nepravilnih krivulj nanoindentacije.Osenčeno območje ustreza krivulji nepravilne deformacije, ki je pripisana nanostrukturi, medtem ko je neosenčeno območje pripisano mikrostrukturi.Ta deformacija lahko poškoduje mikrostrukturo/nanostrukturo držalnega maziva in negativno vpliva na njegovo delovanje proti obraščanju.Da bi preučili vpliv poškodbe na LOIS, so neizogibno poškodbo mikro/nano struktur ponovili v telesu med plastično operacijo.Z uporabo testov adhezije krvi in ​​beljakovin je mogoče določiti stabilnost lastnosti LOIS proti biološkemu obraščanju po in vitro (slika 4D).Serija optičnih slik prikazuje poškodbe, ki so nastale v bližini lukenj vsakega substrata.Izveden je bil test adhezije krvi, da bi dokazali učinek mehanskih poškodb na premaz proti obraščanju (slika 4E).Tako kot SHP se lastnosti proti obraščanju izgubijo zaradi poškodbe, LOIS pa kaže odlične lastnosti proti obraščanju z odbijanjem krvi.Ker površinsko energijo poganja kapilarno delovanje, ki pokriva poškodovano območje, tok v mikrostrukturiranem mazalnem mazivu obnovi lastnosti proti obraščanju (35).Enak trend so opazili pri testu adhezije beljakovin z uporabo albumina.Na poškodovanem območju je oprijem beljakovin na površini SHP široko opazen in z merjenjem njegove pokritosti območja ga je mogoče kvantificirati kot polovico stopnje oprijema golega substrata.Po drugi strani pa je LOIS ohranil svoje lastnosti proti obraščanju, ne da bi povzročil oprijem (slika 4, F in G).Poleg tega je površina vijaka pogosto izpostavljena močnim mehanskim obremenitvam, kot je vrtanje, zato smo proučevali sposobnost prevleke LOIS, da ostane nedotaknjena na vijaku in vitro.Slika 4H prikazuje optične slike različnih vijakov, vključno z golimi, SHP in LOIS.Rdeči pravokotnik predstavlja ciljno območje, kjer pride do močne mehanske obremenitve med implantacijo kosti.Podobno kot pri preizkusu proteinske adhezije plošče se uporablja fluorescenčni mikroskop za slikanje proteinske adhezije in merjenje površine pokritosti, da se dokaže celovitost prevleke LOIS, tudi pod močnimi mehanskimi obremenitvami (slika 4, I in J).Vijaki, obdelani z LOIS, izkazujejo odlično učinkovitost proti obraščanju in skoraj nobena beljakovina se ne oprime površine.Po drugi strani pa so opazili adhezijo beljakovin pri golih vijakih in vijakih SHP, kjer je bila pokritost površine vijakov SHP ena tretjina površine golih vijakov.Poleg tega mora biti ortopedski vsadek, ki se uporablja za fiksacijo, mehansko močan, da prenese obremenitev mesta zloma, kot je prikazano na sliki 4K.Zato je bil izveden upogibni test, da bi ugotovili učinek kemične modifikacije na mehanske lastnosti.Poleg tega je to storjeno za vzdrževanje fiksne napetosti vsadka.Uporabite navpično mehansko silo, dokler se implantat popolnoma ne zloži in dobite krivuljo napetosti in deformacije (slika 4L, 1).Dve lastnosti, vključno z Youngovim modulom in upogibno trdnostjo, sta bili primerjani med golimi substrati in substrati LOIS kot indikatorji njihove mehanske trdnosti (slika 4L, 2 in 3).Youngov modul označuje sposobnost materiala, da prenese mehanske spremembe.Youngov modul vsakega substrata je 41,48±1,01 oziroma 40,06±0,96 GPa;opažena razlika je približno 3,4 %.Poleg tega poročajo, da je upogibna trdnost, ki določa žilavost materiala, 102,34±1,51 GPa za golo podlago in 96,99±0,86 GPa za SHP.Gola podlaga je približno 5,3 % višja.Rahlo zmanjšanje mehanskih lastnosti je lahko posledica učinka zareze.Pri učinku zareze lahko mikro/nano hrapavost deluje kot niz zarez, kar vodi do lokalne koncentracije napetosti in vpliva na mehanske lastnosti vsadka (46).Vendar pa na podlagi dejstva, da je togost človeške kortikalne kosti po poročanju med 7,4 in 31,6 GPa in da izmerjeni modul LOIS presega modul človeške kortikalne kosti (47), LOIS zadostuje za podporo zlomu in njegovemu celotnemu spreminjanje površine minimalno vpliva na mehanske lastnosti.
(A) Shematski diagram (1) mehanske obremenitve ortopedskega vsadka med operacijo in (2) optične slike poškodovanega ortopedskega vsadka.(B) Shematski diagram merjenja nanomehanskih lastnosti z nanoindentacijo in LOIS na goli površini.(C) Krivulja sila-pomik nanoindentacije gole površine in LOIS.(D) Po poskusih in vitro simulirajte optične slike različnih vrst ortopedskih ploščic (poškodovano območje je označeno z rdečim pravokotnikom), da simulirate mehansko obremenitev, povzročeno med operacijo.(E) Test adhezije krvi in ​​(F) test adhezije beljakovin skupine poškodovane ortopedske plošče.(G) Izmerite površino, ki jo pokriva beljakovina, ki se drži plošče.(H) Optične slike različnih vrst ortopedskih vijakov po poskusu in vitro.(I) Preskus oprijema beljakovin za preučevanje celovitosti različnih premazov.(J) Izmerite površino, ki jo pokriva beljakovina, ki se drži vijaka.(K) Gibanje zajca je namenjeno ustvarjanju fiksne napetosti na zlomljeni kosti.(L) (1) Rezultati preskusa upogibanja in optične slike pred in po upogibanju.Razlika v (2) Youngovem modulu in (3) upogibni trdnosti med golim vsadkom in SHP.Podatki so izraženi kot povprečje ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 in ****P<0,0001).Avtor slike: Kyomin Chae, Univerza Yonsei.
V kliničnih situacijah večina bakterijskih stikov z biološkimi materiali in mesti izhaja iz zrelih, zrelih biofilmov (48).Zato ameriški Center za nadzor in preprečevanje bolezni ocenjuje, da je 65 % vseh človeških okužb povezanih z biofilmi (49).V tem primeru je treba zagotoviti eksperimentalno zasnovo in vivo, ki zagotavlja dosledno tvorbo biofilma na površini vsadka.Zato smo razvili model zloma stegnenice zajca, v katerem so bili ortopedski vsadki predhodno inkubirani v bakterijski suspenziji in nato implantirani v stegnenice zajca, da bi preučili lastnosti LOIS proti obraščanju in vivo.Zaradi naslednjih treh pomembnih dejstev so bakterijske okužbe inducirane s predkulturo in ne z neposrednim vbrizgavanjem bakterijskih suspenzij: (i) imunski sistem kuncev je naravno močnejši od imunskega sistema ljudi;zato je možno vbrizgavanje bakterijskih suspenzij in planktonskih bakterij Ne vpliva na tvorbo biofilmov.(Ii) Planktonske bakterije so bolj dovzetne za antibiotike, antibiotiki pa se običajno uporabljajo po operaciji;končno, (iii) suspenzijo planktonskih bakterij lahko razredčimo s telesnimi tekočinami živali (50).S predkultivacijo implantata v bakterijski suspenziji pred implantacijo lahko temeljito preučimo škodljive učinke bakterijske okužbe in reakcije na tujek (FBR) na proces celjenja kosti.Zajce so žrtvovali 4 tedne po implantaciji, ker bo oseointegracija, ki je bistvena za proces celjenja kosti, končana v 4 tednih.Nato so bili vsadki odstranjeni iz kuncev za nadaljnje študije.Slika 5A prikazuje mehanizem razmnoževanja bakterij.Okuženi ortopedski vsadek se vnese v telo.Zaradi predinkubacije v bakterijski suspenziji je bilo okuženih šest od šestih kuncev, ki so jim bili vsajeni goli vsadki, medtem ko nobeden od kuncev, ki so jim bili implantirani z vsadki, zdravljenimi z LOIS, ni bil okužen.Bakterijske okužbe potekajo v treh korakih, vključno z rastjo, zorenjem in širjenjem (51).Najprej se pritrjene bakterije razmnožujejo in rastejo na površini, nato pa bakterije tvorijo biofilm, ko izločajo zunajcelični polimer (EPS), amiloid in zunajcelično DNA.Biofilm ne ovira le prodiranja antibiotikov, ampak tudi spodbuja kopičenje encimov, ki razgrajujejo antibiotike (kot je β-laktamaza) (52).Končno, biofilm razširi zrele bakterije v okoliška tkiva.Zato pride do okužbe.Poleg tega, ko tuje telo vstopi v telo, lahko okužba, ki lahko povzroči močan imunski odziv, povzroči hudo vnetje, bolečino in zmanjšano imunost.Slika 5B ponuja pregled FBR, ki ga povzroči vstavitev ortopedskega vsadka, namesto imunskega odziva, ki ga povzroči bakterijska okužba.Imunski sistem prepozna vstavljeni vsadek kot tujek, nato pa povzroči, da celice in tkiva reagirajo tako, da inkapsulirajo tujek (53).V zgodnjih dneh FBR se je na površini ortopedskih vsadkov oblikovala dovodna matrica, kar je povzročilo adsorpcijo fibrinogena.Adsorbirani fibrinogen nato tvori zelo gosto fibrinsko mrežo, ki spodbuja pritrditev levkocitov (54).Ko se fibrinska mreža oblikuje, pride do akutnega vnetja zaradi infiltracije nevtrofilcev.V tem koraku se sprosti vrsta citokinov, kot so faktor tumorske nekroze-α (TNF-α), interlevkin-4 (IL-4) in IL-β, monociti pa se začnejo infiltrirati na mesto implantacije in se diferencirajo v velikanske celice.Fag (41, 55, 56).Zmanjšanje FBR je vedno predstavljalo izziv, saj lahko prekomerna FBR povzroči akutno in kronično vnetje, ki lahko privede do usodnih zapletov.Da bi ocenili vpliv bakterijskih okužb v tkivih, ki obdajajo goli vsadek in LOIS, so uporabili barvanje s hematoksilinom in eozinom (H&E) ter Massonovim trikromom (MT).Pri kuncih, ki so bili implantirani z golimi substrati, so hude bakterijske okužbe napredovale in preparati tkiva H&E so jasno pokazali abscese in nekroze, ki jih povzroča vnetje.Po drugi strani pa izjemno močna površina LOIS proti obraščanju zavira adhezijo bakterij, zato ne kaže znakov okužbe in zmanjšuje vnetje (slika 5C).Rezultati barvanja z MT so pokazali enak trend.Vendar pa je barvanje z MT pokazalo tudi edem pri kuncih, ki jim je bil implantiran LOIS, kar kaže, da bo kmalu prišlo do okrevanja (slika 5D).Da bi preučili stopnjo imunskega odziva, smo izvedli imunohistokemično (IHC) barvanje z uporabo citokinov TNF-α in IL-6, povezanih z imunskim odzivom.Goli negativni vsadek, ki ni bil izpostavljen bakterijam, so primerjali z LOIS, ki je bil izpostavljen bakterijam, vendar ni bil okužen, da bi preučili proces celjenja v odsotnosti bakterijske okužbe.Slika 5E prikazuje optično sliko preparata IHC, ki izraža TNF-α.Rjavo območje predstavlja imunski odziv, kar kaže, da je imunski odziv pri LOIS rahlo zmanjšan.Poleg tega je bila ekspresija IL-6 v LOIS znatno manjša od negativne ekspresije sterilnih golih (slika 5F).Izražanje citokina je bilo kvantificirano z merjenjem površine obarvanja protiteles, ki ustreza citokinu (slika 5G).V primerjavi s kunci, ki so bili izpostavljeni negativnim vsadkom, so bile stopnje izražanja kuncev, ki jim je bil implantiran LOIS, nižje, kar kaže na pomembno razliko.Zmanjšanje izražanja citokinov kaže, da dolgoročne, stabilne lastnosti LOIS proti obraščanju niso povezane le z zaviranjem bakterijskih okužb, ampak tudi z zmanjšanjem FBR, ki ga povzročijo makrofagi, ki se držijo substrata (53, 57 , 58).Zato lahko zmanjšan imunski odziv zaradi lastnosti imunskega izogibanja LOIS reši neželene učinke po implantaciji, kot je čezmeren imunski odziv po plastični operaciji.
(A) Shematski diagram mehanizma nastajanja in širjenja biofilma na površini okuženega ortopedskega vsadka.eDNA, zunajcelična DNA.(B) Shematski diagram imunskega odziva po vstavitvi ortopedskega vsadka.(C) H&E barvanje in (D) MT barvanje okoliških tkiv ortopedskih vsadkov z golim pozitivnim in LOIS.IHC imunsko povezanih citokinov (E) TNF-α in (F) IL-6 sta obarvani sliki golih negativnih kuncev in kuncev z implantacijo LOIS.(G) Kvantifikacija izražanja citokinov z merjenjem pokritosti območja (** P <0,01).
Biokompatibilnost LOIS in njegov učinek na proces celjenja kosti sta bila raziskana in vivo z uporabo diagnostičnega slikanja [rentgenska in mikroračunalniška tomografija (CT)] in IHC osteoklasta.Slika 6A prikazuje proces celjenja kosti, ki vključuje tri različne stopnje: vnetje, popravilo in preoblikovanje.Ko pride do zloma, bodo vnetne celice in fibroblasti prodrli v zlomljeno kost in začeli rasti v žilno tkivo.Med fazo popravljanja se vraščanje žilnega tkiva razširi blizu mesta zloma.Žilno tkivo zagotavlja hranila za tvorbo nove kosti, ki se imenuje kalus.Zadnja stopnja procesa celjenja kosti je faza remodeliranja, v kateri se velikost kalusa zmanjša na velikost normalne kosti s pomočjo povečanja ravni aktiviranih osteoklastov (59).Tridimenzionalno (3D) rekonstrukcijo mesta zloma smo izvedli z mikro-CT skeniranjem, da bi opazovali razlike v stopnji tvorbe kalusa v vsaki skupini.Opazujte prečni prerez stegnenice, da opazite debelino kalusa, ki obdaja zlomljeno kost (slika 6, B in C).Z rentgenskimi žarki so vsak teden pregledali mesta zlomov vseh skupin, da bi opazovali različne procese regeneracije kosti v vsaki skupini (slika S9).Kalus in zrele kosti so prikazane v modri/zeleni oziroma slonovini.Večina mehkih tkiv se filtrira s prednastavljenim pragom.Nude pozitivno in SHP sta potrdila nastanek majhne količine kalusa okoli mesta zloma.Po drugi strani sta izpostavljeni negativ LOIS in mesto zloma obdana z debelim kalusom.Mikro-CT slike so pokazale, da je nastanek kalusa ovirala bakterijska okužba in z okužbo povezano vnetje.To je zato, ker ima imunski sistem prednost celjenje septičnih poškodb, ki jih povzroči vnetje, povezano z okužbo, namesto okrevanja kosti (60).Izvedeno je bilo barvanje z IHC in kislinsko fosfatazo, odporno na tartrat (TRAP), da bi opazovali aktivnost osteoklastov in resorpcijo kosti (slika 6D) (61).V golih pozitivih in SHP je bilo najdenih le nekaj aktiviranih osteoklastov, obarvanih vijolično.Po drugi strani pa so opazili veliko aktiviranih osteoklastov v bližini golih pozitivnih in zrelih kosti LOIS.Ta pojav kaže, da je v prisotnosti osteoklastov kalus okoli mesta zloma podvržen silovitemu procesu preoblikovanja (62).Izmerili smo volumen kosti in osteoklastno ekspresijsko območje kalusa, da bi primerjali stopnjo tvorbe kalusa okoli mesta zloma v vseh skupinah, da bi kvantificirali rezultate mikro-CT skeniranja in IHC (slika 6E, 1 in 2).Kot je bilo pričakovano, so bili goli negativi in ​​tvorba kalusa v LOIS znatno večji kot v drugih skupinah, kar kaže, da je prišlo do pozitivnega preoblikovanja kosti (63).Slika S10 prikazuje optično sliko mesta operacije, rezultat barvanja MT tkiva, zbranega v bližini vijaka, in rezultat barvanja TRAP, ki poudarja vmesnik vijak-kost.Pri golem substratu so opazili močno tvorbo kalusa in fibroze, medtem ko je vsadek, obdelan z LOIS, pokazal razmeroma nesprijeto površino.Podobno so v primerjavi z golimi negativi opazili manjšo fibrozo pri kuncih z implantacijo LOIS, kot kažejo bele puščice.Poleg tega je močan edem (modra puščica) mogoče pripisati lastnostim LOIS, ki se izogibajo imunskemu sistemu, s čimer se zmanjša hudo vnetje.Nelepljiva površina okoli implantata in zmanjšana fibroza nakazujeta, da je postopek odstranitve lažji, kar običajno povzroči druge zlome ali vnetja.Proces celjenja kosti po odstranitvi vijaka je bil ocenjen z aktivnostjo osteoklastov na vmesniku vijak-kost.Tako gola kost kot vmesnik vsadka LOIS sta absorbirala podobne ravni osteoklastov za nadaljnje celjenje kosti, kar kaže, da prevleka LOIS nima negativnega učinka na celjenje kosti ali imunski odziv.Da bi potrdili, da površinska modifikacija, izvedena na LOIS, ne moti procesa celjenja kosti, je bil rentgenski pregled uporabljen za primerjavo celjenja kosti kuncev z izpostavljenimi negativnimi ioni in 6 tednov implantacije LOIS (slika 6F).Rezultati so pokazali, da je v primerjavi z neokuženo golo pozitivno skupino LOIS pokazal enako stopnjo celjenja kosti in v obeh skupinah ni bilo očitnih znakov zloma (neprekinjena linija osteolize).
(A) Shematski diagram procesa celjenja kosti po zlomu.(B) Razlika v stopnji tvorbe kalusa vsake površinske skupine in (C) slika prečnega prereza mesta zloma.(D) Barvanje s TRAP za vizualizacijo aktivnosti osteoklastov in resorpcije kosti.Na podlagi aktivnosti TRAP smo nastanek zunanjega kalusa kortikalne kosti kvantitativno analizirali z (E) (1) mikro-CT in (2) aktivnostjo osteoklastov.(F) 6 tednov po implantaciji, rentgenske slike zlomljene kosti izpostavljenega negativa (poudarjeno z rdečim črtkanim pravokotnikom) in LOIS (poudarjeno z modrim črtkanim pravokotnikom).Statistična analiza je bila izvedena z enosmerno analizo variance (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Skratka, LOIS zagotavlja novo vrsto strategije za preprečevanje bakterijskih okužb in prevleko za imunski izhod za ortopedske vsadke.Konvencionalni ortopedski vsadki s funkcionalizacijo SHP kažejo kratkoročne lastnosti proti biološkim obraščanjem, vendar svojih lastnosti ne morejo ohraniti dolgo časa.Superhidrofobnost substrata ujame zračne mehurčke med bakterije in substrat, s čimer se tvorijo zračni žepki, s čimer se prepreči bakterijska okužba.Zaradi difuzije zraka pa se ti zračni žepki enostavno odstranijo.Po drugi strani pa je LOIS dobro dokazal svojo sposobnost preprečevanja okužb, povezanih z biofilmom.Zato je zaradi lastnosti proti zavrnitvi mazivnega sloja, vbrizganega v večplastno površino mikro/nano strukture, mogoče preprečiti z okužbo povezano vnetje.Za optimizacijo proizvodnih pogojev LOIS se uporabljajo različne metode karakterizacije, vključno z meritvami SEM, AFM, XPS in CA.Poleg tega se lahko LOIS uporablja tudi za različne biološke materiale, ki se običajno uporabljajo v ortopedski pritrdilni opremi, kot so PLGA, Ti, PE, POM in PPSU.Nato so LOIS testirali in vitro, da bi dokazali njegove lastnosti proti biološkim obraščanjem proti bakterijam in biološkim snovem, povezanim z imunskim odzivom.Rezultati kažejo, da ima odlične antibakterijske učinke in učinke proti biološkemu obraščanju v primerjavi z golim vsadkom.Poleg tega LOIS kaže mehansko trdnost tudi po mehanski obremenitvi, ki je v plastični kirurgiji neizogibna.Zaradi samozdravilnih lastnosti maziva na površini mikro/nano strukture je LOIS uspešno ohranil svoje protibiološke lastnosti obraščanja.Da bi preučili biokompatibilnost in antibakterijske lastnosti LOIS in vivo, je bil LOIS vsajen v stegnenico zajca za 4 tedne.Pri kuncih z implantacijo LOIS niso opazili bakterijske okužbe.Poleg tega je uporaba IHC pokazala zmanjšano raven lokalnega imunskega odziva, kar kaže, da LOIS ne zavira procesa celjenja kosti.LOIS ima odlične antibakterijske in imunske lastnosti ter dokazano učinkovito preprečuje nastajanje biofilma pred in med ortopedskimi operacijami, zlasti za sintezo kosti.Z uporabo modela vnetnega zloma stegnenice kunčjega kostnega mozga je bil poglobljeno raziskan učinek okužb, povezanih z biofilmom, na proces celjenja kosti, ki ga sprožijo predhodno inkubirani vsadki.Kot prihodnja študija je potreben nov model in vivo za preučevanje možnih okužb po implantaciji, da bi v celoti razumeli in preprečili okužbe, povezane z biofilmom, med celotnim procesom celjenja.Poleg tega je osteoindukcija še vedno nerešen izziv pri integraciji z LOIS.Potrebne so nadaljnje raziskave za kombinacijo selektivne adhezije osteoinduktivnih celic ali regenerativne medicine z LOIS, da bi premagali izziv.Na splošno LOIS predstavlja obetavno prevleko za ortopedske vsadke z mehansko robustnostjo in odličnimi lastnostmi proti biološkim obraščanjem, kar lahko zmanjša SSI in imunske stranske učinke.
Substrat 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS (Dong Kang M-Tech Co., Koreja) 15 minut spirajte v acetonu, EtOH in DI vodi, da odstranite kontaminante.Da bi na površini oblikovali strukturo na mikro/nanoravni, očiščen substrat potopimo v 48- do 51-odstotno raztopino HF (DUKSAN Corp., Južna Koreja) pri 50 °C.Čas jedkanja se giblje od 0 do 60 minut.Nato je bil jedkan substrat očiščen z deionizirano vodo in postavljen v 65-odstotno raztopino HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) pri 50 °C za 30 minut, da se je na površini oblikovala pasivacijska plast kromovega oksida.Po pasivaciji substrat speremo z deionizirano vodo in posušimo, da dobimo substrat s plastovito strukturo.Nato je bil substrat izpostavljen kisikovi plazmi (100 W, 3 minute) in takoj potopljen v raztopino 8, 88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Nemčija) v toluenu pri sobni temperaturi za 12 ur.Nato smo substrat, prevlečen s POTS, očistili z EtOH in 2 uri žarili pri 150 °C, da smo dobili gosto POTS SAM.Po nanosu SAM je bila na podlago oblikovana plast maziva z nanosom maziva perfluoropolietra (Krytox 101; DuPont, ZDA) z nakladalnim volumnom 20 μm/cm 2. Pred uporabo mazivo filtrirajte skozi 0,2 mikronski filter.Odvečno mazivo odstranite tako, da ga 15 minut nagnete pod kotom 45°.Enak postopek izdelave je bil uporabljen za ortopedske vsadke iz 304 SS (zaklepna plošča in kortikalni zaklepni vijak; Dong Kang M-Tech Co., Koreja).Vsi ortopedski vsadki so zasnovani tako, da ustrezajo geometriji stegnenice zajca.
Površinsko morfologijo substrata in ortopedskih vsadkov smo pregledali s poljsko emisijskim SEM (Inspect F50, FEI, ZDA) in AFM (XE-100, Park Systems, Južna Koreja).Hrapavost površine (Ra, Rq) se meri tako, da se površina 20 μm pomnoži z 20 μm (n=4).Za analizo kemične sestave površine je bil uporabljen sistem XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japonska), opremljen z virom rentgenskih žarkov Al Kα z velikostjo točke 100 μm2.Za merjenje tekočega CA in SA je bil uporabljen merilni sistem CA, opremljen s kamero za dinamično zajemanje slike (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Južna Koreja).Za vsako meritev se na površino položi 6 do 10 μl kapljic (deionizirana voda, konjska kri, EG, 30 % etanol in HD) za merjenje CA.Ko se kot nagiba podlage poveča s hitrostjo 2°/s (n = 4), se SA izmeri, ko kapljica pade.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] in MRSA (ATCC 25923) sta bili kupljeni pri ATCC (Manassas, Virginia, ZDA), osnovna kultura pa je bila vzdrževana pri -80 °C.Pred uporabo smo zamrznjeno kulturo inkubirali v sojini brozgi, odmrznjeni s tripsinom (Komed, Koreja) pri 37 °C 18 ur in nato dvakrat prenesli, da jo aktiviramo.Po inkubaciji smo kulturo centrifugirali pri 10.000 obratih na minuto 10 minut pri 4 °C in dvakrat sprali z raztopino PBS (pH 7,3).Centrifugirana kultura se nato subkulturira na ploščah s krvnim agarjem (BAP).MRSA in Pseudomonas aeruginosa smo pripravili čez noč in gojili v juhi Luria-Bertani.Koncentracijo Pseudomonas aeruginosa in MRSA v inokulumu smo kvantitativno določili s CFU suspenzije v serijskih razredčitvah na agarju.Nato prilagodite koncentracijo bakterij na 0,5 McFarlandovega standarda, kar je enako 108 CFU/ml.Nato delovno bakterijsko suspenzijo razredčite 100-krat na 106 CFU/ml.Za testiranje antibakterijskih adhezijskih lastnosti smo substrat pred uporabo 15 minut sterilizirali pri 121 °C.Substrat smo nato prenesli v 25 ml bakterijske suspenzije in inkubirali pri 37 °C z močnim stresanjem (200 rpm) 12 in 72 ur.Po inkubaciji smo vsak substrat odstranili iz inkubatorja in 3-krat sprali s PBS, da smo odstranili morebitne plavajoče bakterije na površini.Da bi opazovali biofilm na substratu, smo biofilm fiksirali z metanolom in 2 minuti obarvali z 1 ml krimidin oranžnega.Nato je bil uporabljen fluorescenčni mikroskop (BX51TR, Olympus, Japonska) za fotografiranje obarvanega biofilma.Da bi kvantificirali biofilm na substratu, smo pritrjene celice ločili od substrata z metodo bead vortex, ki je veljala za najprimernejšo metodo za odstranitev pritrjenih bakterij (n = 4).S sterilnimi kleščami odstranite substrat iz rastnega medija in potrkajte po plošči z vdolbinicami, da odstranite odvečno tekočino.Ohlapno pritrjene celice smo odstranili z dvakratnim izpiranjem s sterilnim PBS.Vsak substrat smo nato prenesli v sterilno epruveto, ki je vsebovala 9 ml 0,1 % proteinske fiziološke raztopine (PSW) in 2 g 20 do 25 sterilnih steklenih kroglic (0,4 do 0,5 mm v premeru).Nato smo ga vrtinčili 3 minute, da smo celice ločili od vzorca.Po vrtinčenju smo suspenzijo serijsko 10-krat razredčili z 0,1 % PSW in nato 0,1 ml vsake razredčine inokulirali na BAP.Po 24 urah inkubacije pri 37 °C smo ročno prešteli CFU.
Za celice smo uporabili mišje fibroblaste NIH/3T3 (CRL-1658; ameriški ATCC) in mišje makrofage RAW 264.7 (TIB-71; ameriški ATCC).Uporabite Dulbeccov spremenjeni medij Eagle (DMEM; LM001-05, Welgene, Koreja) za gojenje mišjih fibroblastov in ga dopolnite z 10 % telečjega seruma (S103-01, Welgene) in 1 % penicilin-streptomicina (PS; LS202-02, Welgene (Welgene) ). Uporabite DMEM za gojenje mišjih makrofagov, dopolnjenih z 10 % govejega seruma (S001-01, Welgene) in 1 % PS. Postavite substrat v ploščo s šestimi jamicami in inokulirajte celice pri 105 celic/cm2. Celice smo inkubirali čez noč pri 37 °C in 5 % CO2, celice smo fiksirali s 4 % paraformaldehidom za 20 minut in jih dali v 0,5 % Triton X Incubate za 5 minut v -100 °C pri 37 °C za 30 minut , fluorescein, fluorescein izotiocianat-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Nemčija) in človeška plazma Alexa Fluor 488-konjugiran fibrinogen (F13191, Invitrogen, ZDA) je bil raztopljen v PBS (10 mM, pH 7,4).Koncentracije albumina in fibrinogena so bile 1 oziroma 150 μg/ml.Po substratu Preden jih potopite v raztopino beljakovin, jih sperite s PBS, da ponovno hidrirate površino.Nato vse substrate potopite v ploščo s šestimi vdolbinicami, ki vsebuje raztopino beljakovin, in inkubirajte pri 37 °C 30 in 90 minut.Po inkubaciji smo substrat nato odstranili iz beljakovinske raztopine, 3-krat nežno sprali s PBS in fiksirali s 4% paraformaldehidom (n = 4 za vsak protein).Za kalcij smo natrijev klorid (0,21 M) in kalijev fosfat (3,77 mM) raztopili v deionizirani vodi.pH raztopine smo naravnali na 2,0 z dodatkom raztopine hidroklorida (1 M).Nato smo v raztopini raztopili kalcijev klorid (5,62 mM).Z dodatkom 1 M tris(hidroksimetil)-amino metan prilagodi pH raztopine na 7,4.Vse substrate potopite v ploščo s šestimi jamicami, napolnjeno z 1,5 × raztopino kalcijevega fosfata, in jih po 30 minutah odstranite iz raztopine.Za barvanje 2 g Alizarin Red S (CI 58005) zmešajte s 100 ml deionizirane vode.Nato uporabite 10 % amonijevega hidroksida, da naravnate pH na 4. Substrat barvajte z raztopino alizarin rdečega 5 minut, nato otresite odvečno barvilo in popivnajte.Po postopku stresanja odstranite substrat.Material dehidriramo, nato za 5 minut potopimo v aceton, nato za 5 minut potopimo v raztopino aceton-ksilen (1:1) in na koncu speremo s ksilenom (n = 4).Uporablja se fluorescenčni mikroskop (Axio Imager) z objektivoma ×10 in ×20..A2m, Zeiss, Nemčija) slike vseh substratov.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) je bil uporabljen za kvantifikacijo podatkov o adheziji bioloških snovi na vsaki skupini štirih različnih področij slikanja.Pretvorite vse slike v binarne slike s fiksnimi pragovi za primerjavo podlage.
Za spremljanje stabilnosti plasti maziva v PBS v refleksijskem načinu je bil uporabljen konfokalni mikroskop Zeiss LSM 700.Vzorec stekla, prevlečenega s SAM na osnovi fluora, z vbrizgano mazalno plastjo je bil potopljen v raztopino PBS in testiran z uporabo orbitalnega stresalnika (SHO-1D; Daihan Scientific, Južna Koreja) pri blagih pogojih stresanja (120 vrt / min).Nato vzemite vzorec in spremljajte izgubo maziva z merjenjem izgube odbite svetlobe.Za pridobitev fluorescenčnih slik v odbojnem načinu je vzorec izpostavljen laserju 633 nm in nato zbran, ker se bo svetloba odbila nazaj od vzorca.Vzorce smo merili v časovnih intervalih 0, 30, 60 in 120 ur.
Da bi ugotovili vpliv postopka površinske modifikacije na nanomehanske lastnosti ortopedskih vsadkov, smo za merjenje nanoindendiona uporabili nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, ZDA), opremljen s tristrano piramidno Berkovichovo diamantno konico.Najvišja obremenitev je 10 mN in površina je 100 μm x 100 μm.Za vse meritve je čas nalaganja in razkladanja 10 s, čas zadrževanja pod največjo obremenitvijo vdolbine pa 2 s.Izvedite meritve na petih različnih lokacijah in vzemite povprečje.Za ovrednotenje mehanske trdnosti pod obremenitvijo je bil izveden prečni tritočkovni upogibni test z uporabo univerzalnega preskusnega stroja (Instron 5966, Instron, ZDA).Substrat se stisne s konstantno hitrostjo 10 N/s s povečano obremenitvijo.Za izračun upogibnega modula in maksimalne tlačne napetosti smo uporabili programsko opremo Bluehill Universal (n = 3).
Da bi simulirali postopek operacije in s tem povezane mehanske poškodbe, nastale med operacijo, je bil postopek operacije izveden in vitro.Stegnenice so bile zbrane usmrtitvi novozelandskih belih zajcev.Stegnenico smo očistili in fiksirali v 4% paraformaldehidu za 1 teden.Kot je opisano v poskusni metodi na živalih, je bila fiksna stegnenica kirurško operirana.Po operaciji je bil ortopedski vsadek potopljen v kri (konjska kri, KISAN, Koreja) za 10 s, da bi potrdili, ali je po mehanski poškodbi prišlo do krvnih adhezij (n = 3).
Skupaj 24 samcev novozelandskih belih kuncev (teža od 3,0 do 3,5 kg, povprečna starost 6 mesecev) je bilo naključno razdeljenih v štiri skupine: goli negativni, goli pozitivni, SHP in LOIS.Vsi postopki, ki vključujejo živali, so bili izvedeni v skladu z etičnimi standardi Odbora za institucionalno oskrbo in uporabo živali (odobreno IACUC, KOREA-2017-0159).Ortopedski vsadek je sestavljen iz zaklepne plošče s petimi luknjami (dolžina 41 mm, širina 7 mm in debelina 2 mm) in kortikalni zaklepni vijaki (dolžina 12 mm, premer 2,7 mm) za fiksacijo zloma.Razen tistih ploščic in vijakov, ki so bili uporabljeni v goli negativni skupini, so vse plošče in vijake inkubirali v suspenziji MRSA (106 CFU/ml) 12 ur.Golo negativno skupino (n = 6) smo zdravili z golimi površinskimi vsadki brez izpostavljenosti bakterijski suspenziji kot negativno kontrolo okužbe.Golo pozitivno skupino (n = 6) smo zdravili z golim površinskim vsadkom, izpostavljenim bakterijam, kot pozitivno kontrolo za okužbo.Skupina SHP (n = 6) je bila zdravljena z bakterijsko izpostavljenimi vsadki SHP.Končno je bila skupina LOIS zdravljena z vsadki LOIS, izpostavljenimi bakterijam (n = 6).Vse živali so v kletki, zagotovljene pa so tudi veliko hrane in vode.Pred operacijo so bili kunci tešči 12 ur.Živali smo anestezirali z intramuskularno injekcijo ksilazina (5 mg/kg) in intravensko injekcijo paklitaksela (3 mg/kg) za indukcijo.Nato dovedite 2 % izoflurana in 50 % do 70 % medicinskega kisika (pretok 2 L/min) skozi dihalni sistem za vzdrževanje anestezije.Implantira se z neposrednim pristopom na stransko stegnenico.Po odstranitvi dlak in dezinfekciji kože s povidon-jodom smo na zunanji strani leve srednje stegnenice naredili približno 6 cm dolg rez.Z odpiranjem reže med mišicama, ki prekrivata stegnenico, je stegnenica popolnoma izpostavljena.Postavite ploščo pred stegensko steblo in jo pritrdite s štirimi vijaki.Po fiksaciji z žaginim listom (debeline 1 mm) umetno naredimo prelom v predelu med drugo in četrto luknjo.Na koncu operacije je bila rana sprana s fiziološko raztopino in zaprta s šivi.Vsakemu kuncu je bil subkutano injiciran enrofloksacin (5 mg/kg), ki je bil tretjinsko razredčen v fiziološki raztopini.Pooperativne rentgenske slike stegnenice so bile narejene pri vseh živalih (0, 7, 14, 21, 28 in 42 dni), da bi potrdili osteotomijo kosti.Po globoki anesteziji so vse živali usmrtili z intravenskim KCl (2 mmol/kg) 28 in 42 dni.Po usmrtitvi je bila stegnenica skenirana z mikro-CT, da bi opazovali in primerjali proces celjenja kosti in tvorbo nove kosti med štirimi skupinami.
Po usmrtitvi so bila zbrana mehka tkiva, ki so bila v neposrednem stiku z ortopedskimi vsadki.Tkivo smo čez noč fiksirali v 10% nevtralnem pufriranem formalinu in nato dehidrirali v EtOH.Dehidrirano tkivo je bilo vstavljeno v parafin in razrezano na debelino 40 μm z uporabo mikrotoma (400CS; EXAKT, Nemčija).Da bi vizualizirali okužbo, smo izvedli barvanje s H&E in barvanje z MT.Da bi preverili odziv gostitelja, je bilo razrezano tkivo inkubirano s kunčjim anti-TNF-α primarnim protitelesom (AB6671, Abcam, ZDA) in kunčjim anti-IL-6 (AB6672; Abcam, ZDA), nato pa obdelano s hrenom.Oksidaza.V skladu z navodili proizvajalca na odrezke nanesite sistem obarvanja avidin-biotin kompleks (ABC).Da bi bil videti kot rjav reakcijski produkt, je bil v vseh delih uporabljen 3,3-diaminobenzidin.Digitalni diapozitivni skener (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Madžarska) je bil uporabljen za vizualizacijo vseh rezin, vsaj štiri substrate v vsaki skupini pa so analizirali s programsko opremo ImageJ.
Rentgenske slike so bile posnete pri vseh živalih po operaciji in vsak teden za spremljanje celjenja zlomov (n=6 na skupino).Po usmrtitvi je bil mikro-CT z visoko ločljivostjo uporabljen za izračun nastanka kalusa okoli stegnenice po celjenju.Dobljeno stegnenico smo očistili, fiksirali v 4% paraformaldehidu 3 dni in dehidrirali v 75% etanolu.Dehidrirane kosti so nato skenirali z mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgija), da so ustvarili 3D voxel slike (2240 ​​× 2240 slikovnih pik) vzorca kosti.Uporabite 1,0 mm Al filter za zmanjšanje šuma signala in uporabo visoke ločljivosti za vsa skeniranja (E = 133 kVp, I = 60 μA, integracijski čas = 500 ms).Programska oprema Nrecon (različica 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgija) je bila uporabljena za ustvarjanje 3D volumna skeniranega vzorca iz pridobljene 2D stranske projekcije.Za analizo je 3D rekonstruirana slika razdeljena na kocke 10 mm × 10 mm × 10 mm glede na mesto zloma.Izračunajte kalus zunaj kortikalne kosti.Za digitalno preusmeritev skeniranega volumna kosti je bila uporabljena programska oprema DataViewer (različica 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgija), za analizo pa programska oprema CT-Analyzer (različica 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgija).Relativni koeficienti absorpcije rentgenskih žarkov v zreli kosti in kalusu se ločijo po njihovi gostoti, nato pa se kvantificira volumen kalusa (n = 4).Da bi potrdili, da biokompatibilnost LOIS ne upočasni procesa celjenja kosti, so bile izvedene dodatne rentgenske in mikro-CT analize pri dveh kuncih: goli negativni skupini in skupini LOIS.Obe skupini sta bili usmrčeni v 6. tednu.
Stegnenice žrtvovanih živali so bile zbrane in 3 dni fiksirane v 4% paraformaldehidu.Nato se ortopedski vsadek previdno odstrani iz stegnenice.Femur je bil dekalcificiran 21 dni z uporabo 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Nato smo dekalcificirano stegnenico potopili v EtOH, da smo jo dehidrirali.Dehidrirano stegnenico smo odstranili v ksilenu in vdelali v parafin.Nato smo vzorec narezali z avtomatskim rotacijskim mikrotomom (Leica RM2255, Leica Biosystems, Nemčija) z debelino 3 μm.Za barvanje s TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Nemčija) so bili razrezani vzorci deparafinizirani, rehidrirani in inkubirani v reagentu TRAP pri 37 °C 1 uro.Slike so bile pridobljene z diapozitivnim skenerjem (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Madžarska) in kvantificirane z merjenjem pokritosti območja obarvanega območja.V vsakem poskusu so bili vsaj štirje substrati v vsaki skupini analizirani s programsko opremo ImageJ.
Analiza statistične pomembnosti je bila izvedena z uporabo GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., ZDA).Za testiranje razlik med ocenjevalnima skupinama sta bila uporabljena neparni t-test in enosmerna analiza variance (ANOVA).Raven pomembnosti je na sliki prikazana takole: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 in ****P<0,0001;NS, ni bistvene razlike.
Za dodatna gradiva za ta članek si oglejte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
To je članek z odprtim dostopom, ki se distribuira pod pogoji licence Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ki dovoljuje uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju, če uporaba ni v komercialne namene in je predpostavka, da izvirnik delo je pravilno.Referenca.
Opomba: E-poštni naslov prosimo le, da oseba, ki jo priporočite na strani, ve, da želite, da vidi e-pošto, in da e-pošta ni neželena pošta.E-poštnih naslovov ne bomo zajeli.
To vprašanje se uporablja za preverjanje, ali ste človeški obiskovalec, in za preprečevanje samodejnega pošiljanja neželene pošte.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Protibakterijski in imunski zaščitni premazi ortopedskih vsadkov lahko zmanjšajo okužbe in imunske odzive, ki jih povzročajo okužbe.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Protibakterijski in imunski zaščitni premazi ortopedskih vsadkov lahko zmanjšajo okužbe in imunske odzive, ki jih povzročajo okužbe.
©2021 Ameriško združenje za napredek znanosti.vse pravice pridržane.AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef in COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.