Para os pacientes sometidos a cirurxía de implantes ortopédicos, as infeccións bacterianas e as respostas inmunitarias inducidas pola infección sempre foron riscos que poñen en perigo a vida.Os materiais biolóxicos convencionais son susceptibles á contaminación biolóxica, o que fai que as bacterias invadan a zona lesionada e causen infección postoperatoria.Polo tanto, hai unha necesidade urxente de desenvolver revestimentos antiinfecciosos e de escape inmune para implantes ortopédicos.Aquí, desenvolvemos unha tecnoloxía avanzada de modificación da superficie para implantes ortopédicos chamada Superficie de implante ortopédico lubricado (LOIS), que está inspirada na superficie lisa dos cántaros de plantas de cántaro.LOIS ten unha repelencia de líquidos forte e duradeira a unha variedade de líquidos e substancias biolóxicas (incluíndo células, proteínas, calcio e bacterias).Ademais, confirmamos a durabilidade mecánica contra arañazos e forza de fixación simulando o dano inevitable durante a cirurxía in vitro.O modelo de fractura femoral inflamatoria da medula ósea do coello utilizouse para estudar a fondo a escala antibiolóxica e a capacidade anti-infección do LOIS.Imaxinamos que LOIS, que ten propiedades anti-biofouling e durabilidade mecánica, é un paso adiante na cirurxía ortopédica libre de infeccións.
Hoxe, debido ao envellecemento xeral, o número de pacientes que padecen enfermidades ortopédicas (como fracturas de anciáns, enfermidades articulares dexenerativas e osteoporose) aumentou moito (1, 2).Polo tanto, as institucións médicas conceden gran importancia á cirurxía ortopédica, incluíndo implantes ortopédicos de parafusos, placas, cravos e articulacións artificiais (3, 4).Non obstante, informouse que os implantes ortopédicos tradicionais son susceptibles á adhesión bacteriana e á formación de biopelículas, que poden causar infección do sitio cirúrxico (ISC) despois da cirurxía (5, 6).Unha vez que o biofilm se forma na superficie do implante ortopédico, a eliminación do biofilm faise extremadamente difícil mesmo co uso de grandes doses de antibióticos.Polo tanto, adoita levar a infeccións postoperatorias graves (7, 8).Debido aos problemas anteriores, o tratamento dos implantes infectados debe incluír a reoperación, incluíndo a eliminación de todos os implantes e tecidos circundantes;polo tanto, o paciente sufrirá dor intensa e algúns riscos (9, 10).
Para resolver algúns destes problemas, desenvolvéronse implantes ortopédicos de liberación de fármacos para previr a infección eliminando as bacterias adheridas á superficie (11, 12).Non obstante, a estratexia aínda mostra varias limitacións.Informeuse de que a implantación a longo prazo de implantes liberadores de fármacos causou danos nos tecidos circundantes e causou inflamación, o que pode provocar necrose (13, 14).Ademais, os disolventes orgánicos que poden existir despois do proceso de fabricación de implantes ortopédicos liberadores de fármacos, que están estrictamente prohibidos pola Food and Drug Administration dos Estados Unidos, requiren pasos de purificación adicionais para cumprir os seus estándares (15).Os implantes de liberación de fármacos son un reto para a liberación controlada de fármacos e, debido á súa carga limitada de fármacos, a aplicación a longo prazo do fármaco non é factible (16).
Outra estratexia común é recubrir o implante cun polímero antiincrustante para evitar que a materia biolóxica e as bacterias se adhiran á superficie (17).Por exemplo, os polímeros zwitteriónicos chamaron a atención debido ás súas propiedades non adhesivas cando están en contacto con proteínas plasmáticas, células e bacterias.Non obstante, presenta algunhas limitacións relacionadas coa estabilidade a longo prazo e a durabilidade mecánica, que dificultan a súa aplicación práctica en implantes ortopédicos, especialmente por mor do raspado mecánico durante os procedementos cirúrxicos (18, 19).Ademais, debido á súa alta biocompatibilidade, a falta de necesidade de cirurxía de extirpación e as propiedades de limpeza da superficie mediante corrosión, utilizáronse implantes ortopédicos feitos con materiais biodegradables (20, 21).Durante a corrosión, os enlaces químicos entre a matriz polimérica rompen e desprenden da superficie, e os adherentes limpan a superficie.Non obstante, o ensuciamento antibiolóxico pola limpeza da superficie é eficaz nun curto período de tempo.Ademais, a maioría dos materiais absorbibles, incluído o copolímero de poli(ácido láctico-ácido glicólico) (PLGA), ácido poliláctico (PLA) e aliaxes a base de magnesio, sufrirán unha biodegradación e erosión irregulares no corpo, o que afectará negativamente á estabilidade mecánica.(Vinte dous).Ademais, os fragmentos de placas biodegradables proporcionan un lugar para que as bacterias se adhiran, o que aumenta a posibilidade de infección a longo prazo.Este risco de degradación mecánica e infección limita a aplicación práctica da cirurxía plástica (23).
As superficies superhidrofóbicas (SHP) que imitan a estrutura xerárquica das follas de loto convertéronse nunha solución potencial para as superficies antiincrustantes (24, 25).Cando a superficie do SHP está inmersa en líquido, as burbullas de aire quedarán atrapadas, formando bolsas de aire e evitando a adhesión bacteriana (26).Non obstante, estudos recentes demostraron que a superficie SHP presenta desvantaxes relacionadas coa durabilidade mecánica e a estabilidade a longo prazo, o que dificulta a súa aplicación en implantes médicos.Ademais, as bolsas de aire disolveranse e perderán as súas propiedades antiincrustantes, resultando así unha maior adhesión bacteriana debido á gran superficie da superficie SHP (27, 28).Recentemente, Aizenberg e os seus colegas presentaron un método innovador de revestimento de superficie anti-biofouling desenvolvendo unha superficie lisa inspirada na planta de cántaros Nepenthes (29, 30).A superficie lisa mostra estabilidade a longo prazo en condicións hidráulicas, é extremadamente repelente de líquidos para líquidos biolóxicos e ten propiedades de autorreparación.Non obstante, non existe un método para aplicar un revestimento a un implante médico de forma complexa, nin está demostrado que apoie o proceso de curación do tecido danado despois da implantación.
Aquí, introducimos unha superficie de implante ortopédico lubricado (LOIS), unha superficie de implante ortopédico micro/nanoestruturada e ben combinada cunha fina capa de lubricante para evitar que se asocie á cirurxía plástica. Infeccións bacterianas, como a fixación de fracturas.Debido a que a estrutura de micro/nano nivel funcionalizada con flúor fixa firmemente o lubricante na estrutura, o LOIS desenvolvido pode repeler completamente a adhesión de varios líquidos e manter o rendemento antiincrustante durante moito tempo.Os revestimentos LOIS pódense aplicar a materiais de varias formas destinados á síntese ósea.Confirmáronse in vitro as excelentes propiedades anti-biofouling de LOIS contra bacterias de biofilm [Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus resistente á meticilina (MRSA)] e substancias biolóxicas (células, proteínas e calcio).A taxa de adhesión de adhesión extensa ao substrato é inferior ao 1%.Ademais, mesmo despois de que se produza un estrés mecánico como o rascado superficial, a autocuración provocada polo lubricante penetrante axuda a manter as súas propiedades antiincrustantes.Os resultados das probas de durabilidade mecánica mostran que mesmo despois da modificación estrutural e química, a resistencia total non se verá reducida significativamente.Ademais, realizouse un experimento in vitro que simula a tensión mecánica no entorno cirúrxico para demostrar que a LOIS pode soportar diversas tensións mecánicas que se producen durante a cirurxía plástica.Finalmente, utilizamos un modelo de fractura femoral in vivo baseado en coello, que demostrou que a LOIS ten propiedades antibacterianas e biocompatibilidade superiores.Os resultados radiolóxicos e histolóxicos confirmaron que o comportamento estable do lubricante e as propiedades anti-biofouling dentro de 4 semanas despois da implantación poden lograr un rendemento eficaz contra a infección e escape inmune sen atrasar o proceso de cicatrización ósea.
A figura 1A mostra un diagrama esquemático do LOIS desenvolvido, que se implanta con estruturas a micro/nano escala no modelo de fractura femoral de coello para confirmar as súas excelentes propiedades anti-incrustantes e anti-infección biolóxicas.Realízase un método biomimético para simular a superficie dunha planta de maceta de auga e evitar a bioincrustación incorporando unha capa lubricante dentro da micro/nano estrutura da superficie.A superficie inxectada con lubricante pode minimizar o contacto entre as substancias biolóxicas e a superficie.Polo tanto, debido á formación de enlaces químicos estables na superficie, ten un excelente rendemento antifouling e estabilidade a longo prazo.Como resultado, as propiedades anti-biofouling da superficie lubricante permiten diversas aplicacións prácticas na investigación biomédica.Non obstante, aínda non se completou unha ampla investigación sobre como interactúa esta superficie especial no corpo.Ao comparar LOIS con substratos espidos in vitro usando bacterias de albúmina e biofilm, pódese confirmar a non adherencia de LOIS (Figura 1B).Ademais, ao arrolar as pingas de auga sobre o substrato espido inclinado e o substrato LOIS (Figura S1 e Película S1), pódese demostrar o rendemento da contaminación biolóxica.Como se mostra na imaxe do microscopio de fluorescencia, o substrato exposto incubado nunha suspensión de proteínas e bacterias mostrou unha gran cantidade de material biolóxico adherido á superficie.Non obstante, debido ás súas excelentes propiedades anti-biofouling, LOIS apenas mostra fluorescencia.Para confirmar as súas propiedades anti-biofouling e anti-infección, aplicouse LOIS á superficie de implantes ortopédicos para síntese ósea (placas e parafusos) e colocouse nun modelo de fractura de coello.Antes da implantación, o implante ortopédico espido e o LOIS foron incubados nunha suspensión bacteriana durante 12 horas.A preincubación garante que se forme unha biopelícula na superficie do implante exposto para a súa comparación.A figura 1C mostra unha foto do lugar da fractura 4 semanas despois da implantación.Á esquerda, un coello cun implante ortopédico espido mostrou un nivel grave de inflamación debido á formación dunha biopelícula na superficie do implante.O resultado contrario observouse en coellos implantados con LOIS, é dicir, os tecidos circundantes de LOIS non mostraban nin signos de infección nin signos de inflamación.Ademais, a imaxe óptica da esquerda indica o lugar cirúrxico do coello co implante exposto, o que indica que non se atoparon múltiples adhesivos presentes na superficie do implante exposto na superficie do LOIS.Isto demostra que LOIS ten estabilidade a longo prazo e ten a capacidade de manter as súas propiedades anti-encrustantes e anti-adhesión.
(A) Diagrama esquemático de LOIS e a súa implantación nun modelo de fractura femoral de coello.(B) Imaxe de microscopía de fluorescencia de biopelícula de proteínas e bacterias na superficie núa e no substrato LOIS.4 semanas despois da implantación, (C) unha imaxe fotográfica do lugar da fractura e (D) unha imaxe de raios X (resaltada por un rectángulo vermello).Imaxe cortesía: Kyomin Chae, Universidade de Yonsei.
Os coellos esterilizados e expostos implantados negativamente mostraron un proceso de cicatrización ósea normal sen signos de inflamación ou infección.Por outra banda, os implantes SHP pre-incubados nunha suspensión bacteriana presentan inflamación relacionada coa infección nos tecidos circundantes.Isto pódese atribuír á súa incapacidade para inhibir a adhesión bacteriana durante moito tempo (Figura S2).Para demostrar que a LOIS non afecta o proceso de curación, senón que inhibe posibles infeccións relacionadas coa implantación, comparáronse imaxes de raios X da matriz positiva exposta e a LOIS no lugar da fractura (Figura 1D).A imaxe de raios X do implante positivo espido mostraba liñas de osteólise persistentes, o que indicaba que o óso non estaba completamente curado.Isto suxire que o proceso de recuperación ósea pode ser moi atrasado debido á inflamación relacionada coa infección.Pola contra, mostrou que os coellos implantados con LOIS curaran e non mostraban ningún sitio de fractura evidente.
Co fin de desenvolver implantes médicos con estabilidade e funcionalidade a longo prazo (incluída a resistencia ao biofouling), fixéronse moitos esforzos.Non obstante, a presenza de varias substancias biolóxicas e a dinámica da adhesión dos tecidos limita o desenvolvemento dos seus métodos clínicamente fiables.Para superar estas deficiencias, desenvolvemos unha estrutura en capas micro/nano e unha superficie modificada químicamente, que se optimiza debido á alta forza capilar e á afinidade química para manter o lubricante máis suave na maior medida.A Figura 2A mostra o proceso global de fabricación de LOIS.En primeiro lugar, prepare un substrato de aceiro inoxidable (SS) 304 de grao médico.En segundo lugar, a estrutura micro/nano fórmase no substrato de SS mediante gravado químico usando solución de ácido fluorhídrico (HF).Para restaurar a resistencia á corrosión do SS, úsase unha solución de ácido nítrico (HNO3) (31) para procesar o substrato gravado.A pasivación mellora a resistencia á corrosión do substrato SS e ralentiza significativamente o proceso de corrosión que pode reducir o rendemento global de LOIS.A continuación, formando unha monocapa autoensamblada (SAM) con 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltrietoxisilano (POTS), a superficie é modificada quimicamente para mellorar a interacción química entre a superficie e o lubricante suave Affinity.A modificación da superficie reduce significativamente a enerxía superficial da superficie estruturada a micro/nano-escala fabricada, que coincide coa enerxía superficial do lubricante liso.Isto permite que o lubricante estea completamente mollado, formando así unha capa de lubricante estable na superficie.A superficie modificada presenta unha maior hidrofobicidade.Os resultados mostran que o lubricante escorregadizo presenta un comportamento estable na LOIS debido á alta afinidade química e á forza capilar causada pola estrutura micro/nano (32, 33).Estudáronse os cambios ópticos na superficie do SS despois da modificación superficial e da inxección de lubricante.A estrutura en capas micro/nano formada na superficie pode causar cambios visuais e escurecer a superficie.Este fenómeno atribúese ao efecto de dispersión da luz mellorada na superficie rugosa, o que aumenta a reflexión difusa causada polo mecanismo de captura da luz (34).Ademais, despois de que se inxecte o lubricante, o LOIS faise máis escuro.A capa lubricante fai que se reflicta menos luz do substrato, escurecendo así o LOIS.Co fin de optimizar a microestrutura/nanoestrutura para mostrar o menor ángulo de deslizamento (SA) para lograr un rendemento anti-biofouling, utilizáronse microscopía electrónica de varrido (SEM) e pares atómicos para realizar diferentes tempos de gravado HF (0, 3)., 15 e 60 minutos) Microscopio de forza (AFM) (Figura 2B).As imaxes SEM e AFM mostran que despois dun curto período de tempo (3 minutos de gravado), o substrato espido formou rugosidade desigual a nanoescala.A rugosidade da superficie cambia co tempo de gravado (Figura S3).A curva que varía no tempo mostra que a rugosidade da superficie segue aumentando e alcanza un pico aos 15 minutos de gravado, e despois só se observa unha lixeira diminución do valor de rugosidade aos 30 minutos de gravado.Neste punto, a rugosidade de nivel nano está gravada, mentres que a rugosidade de nivel micro se desenvolve vigorosamente, facendo que o cambio de rugosidade sexa máis estable.Despois de gravar durante máis de 30 minutos, obsérvase un novo aumento da rugosidade, que se explica detalladamente do seguinte xeito: SS está composto por aceiro, aliado con elementos que inclúen ferro, cromo, níquel, molibdeno e moitos outros elementos.Entre estes elementos, o ferro, o cromo e o molibdeno xogan un papel importante na formación de rugosidades a escala de micras/nano-escala no SS mediante o gravado HF.Nas primeiras fases da corrosión, o ferro e o cromo están corroídos principalmente porque o molibdeno ten unha maior resistencia á corrosión que o molibdeno.A medida que avanza o gravado, a solución de gravado alcanza unha sobresaturación local, formando fluoruros e óxidos causados ​​polo gravado.O flúor e o óxido precipitan e, finalmente, se depositan de novo na superficie, formando unha rugosidade superficial no rango de micras/nano (31).Esta rugosidade de micro/nano nivel xoga un papel importante nas propiedades de autocuración de LOIS.A superficie de dobre escala produce un efecto sinérxico, aumentando moito a forza capilar.Este fenómeno permite que o lubricante penetre na superficie de forma estable e contribúe ás propiedades de autocuración (35).A formación da rugosidade depende do tempo de gravado.Menos de 10 minutos de gravado, a superficie só contén rugosidade a nanoescala, que non é suficiente para conter o lubricante suficiente para ter resistencia ao biofouling (36).Por outra banda, se o tempo de gravado supera os 30 minutos, a rugosidade a nanoescala formada pola redeposición de ferro e cromo desaparecerá e só permanecerá a rugosidade a microescala debido ao molibdeno.A superficie sobregrabada carece de rugosidade a nanoescala e perde o efecto sinérxico da rugosidade en dúas etapas, o que afecta negativamente ás características de autocuración de LOIS.Realizáronse medicións de SA en substratos con diferentes tempos de gravado para probar o rendemento antifouling.Seleccionáronse varios tipos de líquidos en función da viscosidade e da enerxía superficial, incluíndo auga desionizada (DI), sangue, etilenglicol (EG), etanol (EtOH) e hexadecano (HD) (Figura S4).O patrón de gravado variable no tempo mostra que para varios líquidos con diferentes enerxías de superficie e viscosidades, o SA de LOIS despois de 15 minutos de gravado é o máis baixo.Polo tanto, LOIS está optimizado para gravar durante 15 minutos para formar rugosidade de micras e nanoescala, o que é axeitado para manter eficazmente a durabilidade do lubricante e excelentes propiedades antiincrustantes.
(A) Diagrama esquemático do proceso de fabricación de catro pasos de LOIS.O recuadro mostra o SAM formado no substrato.(B) Imaxes SEM e AFM, utilizadas para optimizar a estrutura micro/nano do substrato en diferentes tempos de gravado.Espectros de espectroscopia de fotoelectróns de raios X (XPS) de (C) Cr2p e (D) F1s despois da pasivación superficial e revestimento SAM.au, unidade arbitraria.(E) Imaxes representativas de pingas de auga sobre substratos espidos, gravados, SHP e LOIS.(F) A medición do ángulo de contacto (CA) e SA de líquidos con diferentes tensións superficiais en SHP e LOIS.Os datos exprésanse como media ± SD.
Despois, para confirmar o cambio nas propiedades químicas da superficie, utilizouse a espectroscopia de fotoelectróns de raios X (XPS) para estudar o cambio na composición química da superficie do substrato despois de cada revestimento superficial.A figura 2C mostra os resultados da medición XPS da superficie gravada con HF e da superficie tratada con HNO 3 .Os dous picos principais a 587,3 e 577,7 eV pódense atribuír ao enlace Cr-O existente na capa de óxido de cromo, que é a principal diferenza coa superficie gravada en HF.Isto débese principalmente ao consumo de ferro e fluoruro de cromo na superficie por parte do HNO3.O gravado baseado en HNO3 permite que o cromo forme unha capa de óxido de pasivación na superficie, o que fai que o SS gravado sexa de novo resistente á corrosión.Na Figura 2D, obtivéronse espectros XPS para confirmar que se formou silano a base de fluorocarbonos na superficie despois do revestimento SAM, que ten unha repelencia de líquidos extremadamente alta mesmo para EG, sangue e EtOH.O revestimento SAM complétase facendo reaccionar grupos funcionais silano con grupos hidroxilo formados por tratamento con plasma.Como resultado, observouse un aumento significativo nos picos CF2 e CF3.A enerxía de unión entre 286 e 296 eV indica que a modificación química foi completada con éxito polo revestimento SAM.SHP mostra picos CF2 (290,1 eV) e CF3 (293,3 eV) relativamente grandes, que son causados ​​polo silano a base de fluorocarbono formado na superficie.A figura 2E mostra imaxes ópticas representativas das medicións do ángulo de contacto (CA) para diferentes grupos de auga desionizada en contacto con SHP, SHP e LOIS.Estas imaxes mostran que a superficie gravada vólvese hidrófila debido á micro/nano estrutura formada por gravado químico para que a auga desionizada sexa absorbida pola estrutura.Non obstante, cando o substrato está revestido con SAM, o substrato presenta unha forte repelencia á auga, polo que se forma un SHP superficial e a área de contacto entre a auga e a superficie é pequena.Finalmente, observouse unha diminución da CA en LOIS, que se pode atribuír á penetración de lubricante na microestrutura, aumentando así a área de contacto.Para demostrar que a superficie ten unha excelente repelencia de líquidos e propiedades non adhesivas, o LOIS foi comparado co substrato SHP medindo CA e SA usando varios líquidos (Figura 2F).Seleccionáronse varios tipos de líquidos en función da viscosidade e da enerxía superficial, incluíndo auga desionizada, sangue, EG, EtOH e HD (Figura S4).Os resultados da medición de CA mostran que cando CA tende a HD, o valor de redución de CA, onde CA ten a enerxía superficial máis baixa.Ademais, o LOIS da CA global é baixo.Non obstante, a medición de SA mostra un fenómeno completamente diferente.Excepto a auga ionizada, todos os líquidos adhírense ao substrato SHP sen escorregar.Por outra banda, LOIS mostra un SA moi baixo, onde cando todo o líquido está inclinado nun ángulo inferior a 10° a 15°, todo o líquido sairá.Isto demostra claramente que a non adherencia de LOIS é mellor que a da superficie SHP.Ademais, os revestimentos LOIS tamén se aplican a varios tipos de materiais, incluíndo titanio (Ti), polifenilsulfona (PPSU), polioximetileno (POM), poliéter éter cetona (PEEK) e polímeros bioabsorbibles (PLGA). Son materiais ortopédicos implantables (Figura). S5)).As imaxes secuenciais das gotículas sobre o material tratado por LOIS mostran que as propiedades anti-biofouling de LOIS son as mesmas en todos os substratos.Ademais, os resultados das medicións de CA e SA mostran que as propiedades non adhesivas de LOIS pódense aplicar a outros materiais.
Para confirmar as propiedades antiincrustantes de LOIS, incubáronse varios tipos de substratos (incluídos espidos, gravados, SHP e LOIS) con Pseudomonas aeruginosa e MRSA.Estas dúas bacterias foron seleccionadas como bacterias hospitalarias representativas, o que pode levar á formación de biopelículas, que provocan SSI (37).A Figura 3 (A e B) mostra as imaxes do microscopio de fluorescencia e os resultados da medición da unidade formadora de colonias (CFU) dos substratos incubados na suspensión bacteriana a curto prazo (12 horas) e a longo prazo (72 horas), respectivamente.Nun curto período de tempo, as bacterias formarán racimos e crecerán de tamaño, cubríndose de substancias parecidas ao moco e impedindo a súa eliminación.Non obstante, durante as 72 horas de incubación, as bacterias madurarán e serán fáciles de dispersar para formar máis colonias ou grupos.Polo tanto, pódese considerar que a incubación de 72 horas é a longo prazo e é o tempo de incubación adecuado para formar unha biopelícula forte na superficie (38).Nun curto período de tempo, a superficie gravada e a superficie do SHP mostraron adhesión bacteriana, que se reduciu entre un 25% e un 50% en comparación co substrato espido.Non obstante, debido ao seu excelente rendemento e estabilidade anti-biofouling, LOIS non mostrou adhesión ao biofilm bacteriano a curto e longo prazo.O diagrama esquemático (Figura 3C) describe a explicación do mecanismo de ensuciamento antibiolóxico da solución de gravado, SHP e LOIS.A suposición é que o substrato gravado con propiedades hidrófilas terá unha superficie maior que o substrato espido.Polo tanto, producirase máis adhesión bacteriana no substrato gravado.Non obstante, en comparación co substrato espido, o substrato gravado ten moito menos biopelícula formada na superficie.Isto débese a que as moléculas de auga únense firmemente á superficie hidrófila e actúan como lubricante para a auga, interferindo así coa adhesión das bacterias a curto prazo (39).Non obstante, a capa de moléculas de auga é moi delgada e soluble en suspensións bacterianas.Polo tanto, a capa molecular de auga desaparece durante moito tempo, o que leva a unha extensa adhesión e proliferación bacteriana.Para SHP, debido ás súas propiedades non humectantes a curto prazo, inhibe a adhesión bacteriana.A reducida adhesión bacteriana pódese atribuír ás bolsas de aire atrapadas na estrutura en capas e á menor enerxía superficial, minimizando así o contacto entre a suspensión bacteriana e a superficie.Non obstante, observouse unha extensa adhesión bacteriana na SHP porque perdeu as súas propiedades antiincrustantes durante moito tempo.Isto débese principalmente á desaparición das bolsas de aire debido á presión hidrostática e á disolución do aire na auga.Isto débese principalmente á desaparición das bolsas de aire debido á disolución e á estrutura en capas que proporciona unha maior superficie de adhesión (27, 40).A diferenza destes dous substratos que teñen un efecto importante na estabilidade a longo prazo, o lubricante lubricante contido en LOIS inxéctase na estrutura micro/nano e non desaparecerá nin sequera a longo prazo.Os lubricantes cheos de micro/nano estruturas son moi estables e son fortemente atraídos pola superficie debido á súa alta afinidade química, evitando así a adhesión bacteriana durante moito tempo.A figura S6 mostra unha imaxe de microscopio confocal de reflexión dun substrato infundido con lubricante inmerso en solución salina tamponada con fosfato (PBS).As imaxes continuas mostran que mesmo despois de 120 horas de leve axitación (120 rpm), a capa de lubricante no LOIS permanece inalterada, o que indica unha estabilidade a longo prazo en condicións de fluxo.Isto débese á alta afinidade química entre o revestimento SAM a base de flúor e o lubricante a base de perfluorocarbono, polo que se pode formar unha capa de lubricante estable.Polo tanto, mantense o rendemento antiincrustante.Ademais, probouse o substrato contra proteínas representativas (albúmina e fibrinóxeno), que están no plasma, células moi relacionadas coa función inmunolóxica (macrófagos e fibroblastos) e as relacionadas coa formación ósea.O contido de calcio é moi alto.(Figura 3D, 1 e 2, e Figura S7) (41, 42).Ademais, as imaxes do microscopio de fluorescencia da proba de adhesión para fibrinóxeno, albúmina e calcio mostraron diferentes características de adhesión de cada grupo de substrato (Figura S8).Durante a formación ósea, as capas óseas e de calcio recén formadas poden rodear o implante ortopédico, o que non só dificulta a eliminación, senón que tamén pode causar danos inesperados ao paciente durante o proceso de eliminación.Polo tanto, os baixos niveis de depósitos de calcio nas placas óseas e os parafusos son beneficiosos para a cirurxía ortopédica que require a eliminación de implantes.Baseándonos na cuantificación da área adxunta baseada na intensidade da fluorescencia e no reconto de células, confirmamos que LOIS mostra excelentes propiedades anti-biofouling para todas as substancias biolóxicas en comparación con outros substratos.Segundo os resultados de experimentos in vitro, o LOIS antibiolóxico pódese aplicar aos implantes ortopédicos, que non só poden inhibir as infeccións causadas por bacterias de biofilm, senón que tamén reducen a inflamación causada polo sistema inmunitario activo do corpo.
(A) Imaxes de microscopio de fluorescencia de cada grupo (espida, gravada, SHP e LOIS) incubadas en suspensións de Pseudomonas aeruginosa e MRSA durante 12 e 72 horas.(B) O número de CFU adherentes de Pseudomonas aeruginosa e MRSA na superficie de cada grupo.(C) Diagrama esquemático do mecanismo de ensuciamento antibiolóxico do gravado a curto e longo prazo, SHP e LOIS.(D) (1) O número de fibroblastos adheridos a cada substrato e as imaxes de microscopio de fluorescencia das células adheridas ao espido e ao LOIS.(2) Proba de adhesión de proteínas relacionadas co sistema inmunitario, albúmina e calcio implicadas no proceso de cicatrización ósea (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 e **** P <0,0001).ns, non é importante.
No caso de esforzos concentrados inevitables, a durabilidade mecánica foi sempre o principal reto para a aplicación de revestimentos antiincrustantes.Os métodos tradicionais de xel contra as augas residuais baséanse en polímeros con baixa solubilidade en auga e fraxilidade.Polo tanto, adoitan ser susceptibles ao estrés mecánico en aplicacións biomédicas.Polo tanto, os revestimentos antiincrustantes mecánicamente duradeiros seguen sendo un reto para aplicacións como implantes ortopédicos (43, 44).A figura 4A(1) mostra os dous tipos principais de tensión aplicada aos implantes ortopédicos, incluíndo o rascado (esfuerzo cortante) e a compresión coa imaxe óptica do implante danado producida polas pinzas.Por exemplo, cando se aperte o parafuso cun desaparafusador ou cando o cirurxián suxeita a placa ósea con pinzas e aplica forza de compresión, a placa ósea de plástico danarase e rascarase tanto nas escalas macro como micro/nano (Figura 4A, 2).Co fin de probar se o LOIS fabricado pode soportar estes danos durante a cirurxía plástica, realizouse a nanoindentación para comparar a dureza do substrato espido e a LOIS a escala micro/nano para estudar as propiedades mecánicas da micro/nano estrutura Impacto (Figura 4B).O diagrama esquemático mostra o diferente comportamento de deformación de LOIS debido á presenza de micro/nano estruturas.Debuxouse unha curva forza-desprazamento en función dos resultados da nanoindentación (Figura 4C).A imaxe azul representa o substrato espido, que só mostra unha lixeira deformación, como se ve pola profundidade de sangría máxima de 0,26 μm.Por outra banda, o aumento gradual da forza de nanoindentación e do desprazamento observado en LOIS (curva vermella) pode mostrar sinais de propiedades mecánicas reducidas, o que resulta nunha profundidade de nanoindentación de 1,61 μm.Isto débese a que a estrutura micro/nano presente no LOIS proporciona un espazo de avance máis profundo para a punta do nanoindentador, polo que a súa deformación é maior que a do substrato espido.Konsta-Gdoutos et al.(45) cre que, debido á presenza de nanoestruturas, a nanoindentación e a micro/nano rugosidade conducen a curvas de nanoindentación irregulares.A área sombreada corresponde á curva de deformación irregular atribuída á nanoestrutura, mentres que a área non sombreada atribúese á microestrutura.Esta deformación pode danar a microestrutura/nanoestrutura do lubricante de retención e afectar negativamente o seu rendemento antiincrustante.Para estudar o impacto do dano na LOIS, replicáronse os danos inevitables en micro/nano estruturas no corpo durante a cirurxía plástica.Usando probas de adhesión de sangue e proteínas, pódese determinar a estabilidade das propiedades anti-biofouling de LOIS despois de in vitro (Figura 4D).Unha serie de imaxes ópticas mostra os danos que se producían preto dos buratos de cada substrato.Realizouse unha proba de adhesión sanguínea para demostrar o efecto do dano mecánico no revestimento anti-biofouling (Figura 4E).Do mesmo xeito que SHP, as propiedades antiincrustantes pérdense debido ao dano e LOIS presenta excelentes propiedades antiincrustantes ao repeler o sangue.Isto débese a que, debido a que a enerxía superficial é impulsada pola acción capilar que cobre a área danada, o fluxo no lubricante lubricante microestruturado restaura as propiedades antiincrustantes (35).A mesma tendencia observouse na proba de adhesión a proteínas usando albúmina.Na zona danada, obsérvase amplamente a adhesión da proteína na superficie do SHP e, medindo a súa cobertura de área, pódese cuantificar como a metade do nivel de adhesión do substrato espido.Por outra banda, LOIS mantivo as súas propiedades anti-biofouling sen causar adhesión (Figura 4, F e G).Ademais, a superficie do parafuso adoita estar sometida a fortes estrés mecánicos, como a perforación, polo que estudamos a capacidade do revestimento LOIS para permanecer intacto no parafuso in vitro.A figura 4H mostra imaxes ópticas de diferentes parafusos, incluídos os desnudos, SHP e LOIS.O rectángulo vermello representa a área de destino onde se produce unha forte tensión mecánica durante a implantación ósea.Do mesmo xeito que a proba de adhesión á proteína da placa, utilízase un microscopio de fluorescencia para obter imaxes da adhesión á proteína e medir a área de cobertura para probar a integridade do revestimento LOIS, incluso baixo unha forte tensión mecánica (Figura 4, I e J).Os parafusos tratados con LOIS presentan un excelente rendemento antiincrustante e case ningunha proteína se adhire á superficie.Por outra banda, observouse adhesión de proteínas en parafusos espidos e parafusos SHP, onde a cobertura de área dos parafusos SHP era un terzo da dos parafusos espidos.Ademais, o implante ortopédico utilizado para a fixación debe ser mecánicamente resistente para soportar o estrés aplicado ao lugar da fractura, como se mostra na Figura 4K.Por iso, realizouse unha proba de flexión para determinar o efecto da modificación química sobre as propiedades mecánicas.Ademais, isto faise para manter a tensión fixa do implante.Aplique forza mecánica vertical ata que o implante estea totalmente dobrado e se obteña unha curva tensión-deformación (Figura 4L, 1).Comparáronse dúas propiedades, incluíndo o módulo de Young e a resistencia á flexión, entre substratos espidos e LOIS como indicadores da súa resistencia mecánica (Figura 4L, 2 e 3).O módulo de Young indica a capacidade dun material para soportar cambios mecánicos.O módulo de Young de cada substrato é de 41,48±1,01 e 40,06±0,96 GPa, respectivamente;a diferenza observada é dun 3,4%.Ademais, infórmase de que a resistencia á flexión, que determina a dureza do material, é de 102,34±1,51 GPa para o substrato espido e de 96,99±0,86 GPa para o SHP.O substrato espido é aproximadamente un 5,3% máis alto.A lixeira diminución das propiedades mecánicas pode ser causada polo efecto entalladura.No efecto de muesca, a rugosidade micro/nano pode actuar como un conxunto de muescas, o que leva á concentración local de tensión e afecta ás propiedades mecánicas do implante (46).Non obstante, baseándose no feito de que se informa que a rixidez do óso cortical humano está entre 7,4 e 31,6 GPa, e que o módulo LOIS medido supera o do óso cortical humano (47), o LOIS é suficiente para soportar a fractura e a súa totalidade. as propiedades mecánicas están mínimamente afectadas pola modificación da superficie.
(A) Diagrama esquemático de (1) a tensión mecánica aplicada ao implante ortopédico durante a operación e (2) a imaxe óptica do implante ortopédico danado.(B) Diagrama esquemático da medición de propiedades nanomecánicas mediante nanoindentación e LOIS na superficie núa.(C) Curva forza-desprazamento de nanoindentación da superficie núa e LOIS.(D) Despois de experimentos in vitro, simular as imaxes ópticas de diferentes tipos de placas ortopédicas (a zona danada está resaltada cun rectángulo vermello) para simular a tensión mecánica causada durante a operación.(E) Proba de adhesión de sangue e (F) Proba de adhesión de proteínas do grupo de placas ortopédicas danadas.(G) Mida a cobertura de área da proteína adherida á placa.(H) Imaxes ópticas de diferentes tipos de parafusos ortopédicos despois do experimento in vitro.(I) Proba de adhesión de proteínas para estudar a integridade de diferentes recubrimentos.(J) Mida a cobertura da área da proteína adherida ao parafuso.(K) O movemento do coello pretende xerar unha tensión fixa no óso fracturado.(L) (1) Resultados das probas de curvatura e imaxes ópticas antes e despois de dobrar.A diferenza no (2) módulo de Young e (3) resistencia á flexión entre o implante nu e o SHP.Os datos exprésanse como media ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 e ****P<0,0001).Imaxe cortesía: Kyomin Chae, Universidade de Yonsei.
En situacións clínicas, a maioría do contacto bacteriano con materiais biolóxicos e sitios de feridas procede de biopelículas maduras e maduras (48).Polo tanto, os Centros de Control e Prevención de Enfermidades dos EUA estiman que o 65% de todas as infeccións humanas están relacionadas con biopelículas (49).Neste caso, é necesario proporcionar un deseño experimental in vivo que proporcione unha formación consistente de biopelícula na superficie do implante.Por iso, desenvolvemos un modelo de fractura de fémur de coello no que se preincubaban implantes ortopédicos nunha suspensión bacteriana e despois se implantaban en fémures de coello para estudar as propiedades antiincrustantes de LOIS in vivo.Debido aos seguintes tres feitos importantes, as infeccións bacterianas son inducidas polo precultivo en lugar da inxección directa de suspensións bacterianas: (i) O sistema inmunitario dos coellos é naturalmente máis forte que o dos humanos;polo tanto, é posible a inxección de suspensións bacterianas e bacterias planctónicas Non ten ningún efecto na formación de biopelículas.(Ii) As bacterias planctónicas son máis susceptibles aos antibióticos, e os antibióticos adoitan usarse despois da cirurxía;finalmente, (iii) a suspensión de bacterias planctónicas pode ser diluída polos fluídos corporais do animal (50).Ao cultivar previamente o implante nunha suspensión bacteriana antes da implantación, podemos estudar a fondo os efectos nocivos da infección bacteriana e a reacción de corpo estraño (FBR) no proceso de cicatrización dos ósos.Os coellos sacrificáronse 4 semanas despois da implantación, porque a osteointegración esencial para o proceso de cicatrización dos ósos completarase en 4 semanas.Despois, os implantes foron retirados dos coellos para estudos augas abaixo.A figura 5A mostra o mecanismo de proliferación das bacterias.O implante ortopédico infectado introdúcese no corpo.Como resultado da preincubación en suspensión bacteriana, seis dos seis coellos implantados con implantes espidos foron infectados, mentres que ningún dos coellos implantados con implantes tratados con LOIS estaba infectado.As infeccións bacterianas prodúcense en tres etapas, incluíndo crecemento, maduración e dispersión (51).Primeiro, as bacterias unidas reprodúcense e crecen na superficie, e despois as bacterias forman unha biopelícula cando excretan polímero extracelular (EPS), amiloide e ADN extracelular.O biofilm non só interfire coa penetración dos antibióticos, senón que tamén promove a acumulación de encimas que degradan os antibióticos (como a β-lactamasa) (52).Finalmente, o biofilm espalla as bacterias maduras nos tecidos circundantes.Polo tanto, prodúcese a infección.Ademais, cando un corpo estraño entra no corpo, unha infección que pode causar unha forte resposta inmune pode causar inflamación severa, dor e diminución da inmunidade.A figura 5B ofrece unha visión xeral do FBR causado pola inserción dun implante ortopédico, en lugar da resposta inmune causada por unha infección bacteriana.O sistema inmunitario recoñece o implante inserido como un corpo estraño e, a continuación, fai que as células e os tecidos reaccionen para encapsular o corpo estraño (53).Nos primeiros días do FBR, formouse unha matriz de subministración na superficie dos implantes ortopédicos, o que provocou a adsorción de fibrinóxeno.O fibrinóxeno adsorbido forma entón unha rede de fibrina moi densa, que promove a unión de leucocitos (54).Unha vez formada a rede de fibrina, producirase unha inflamación aguda debido á infiltración de neutrófilos.Neste paso, liberanse unha variedade de citocinas como o factor de necrose tumoral-α (TNF-α), a interleucina-4 (IL-4) e a IL-β, e os monocitos comezan a infiltrarse no lugar de implantación e a diferenciarse en células xigantes.Fago (41, 55, 56).Reducir a FBR sempre foi un desafío porque o exceso de FBR pode causar inflamación aguda e crónica, o que pode provocar complicacións mortais.Para avaliar o impacto das infeccións bacterianas nos tecidos que rodean o implante espido e LOIS, utilizáronse a tinción con hematoxilina e eosina (H&E) e tricrómico de Masson (MT).Para os coellos implantados con substratos espidos, as infeccións bacterianas graves progresaron e os tecidos H&E mostraban claramente abscesos e necrose causadas pola inflamación.Por outra banda, a superficie extremadamente forte anti-biofouling LOIS inhibe a adhesión bacteriana, polo que non mostra signos de infección e reduce a inflamación (Figura 5C).Os resultados da tinción con MT mostraron a mesma tendencia.Non obstante, a tinción con MT tamén mostrou edema nos coellos implantados con LOIS, o que indica que a recuperación está a piques de producirse (Figura 5D).Para estudar o grao de resposta inmune, realizouse unha tinción inmunohistoquímica (IHC) utilizando citocinas TNF-α e IL-6 relacionadas coa resposta inmune.Comparouse un implante negativo espido que non estivo exposto a bacterias cun LOIS que estivo exposto a bacterias pero non infectado para estudar o proceso de curación en ausencia de infección bacteriana.A figura 5E mostra unha imaxe óptica dunha diapositiva IHC que expresa TNF-α.A área marrón representa a resposta inmune, o que indica que a resposta inmune en LOIS está lixeiramente reducida.Ademais, a expresión de IL-6 en LOIS foi significativamente menor que a expresión negativa de espido estéril (Figura 5F).A expresión da citocina cuantificouse medindo a área de tinción de anticorpos correspondente á citocina (Figura 5G).En comparación cos coellos expostos aos implantes negativos, os niveis de expresión dos coellos implantados con LOIS foron máis baixos, mostrando unha diferenza significativa.A diminución da expresión de citocinas indica que as propiedades antiincrustantes estables a longo prazo de LOIS non só están relacionadas coa inhibición das infeccións bacterianas, senón tamén coa diminución do FBR, que é inducida polos macrófagos que se adhiren ao substrato (53, 57, 58).Polo tanto, a resposta inmune reducida debido ás propiedades de evasión inmune de LOIS pode resolver os efectos secundarios despois da implantación, como unha resposta inmune excesiva despois da cirurxía plástica.
(A) Un diagrama esquemático do mecanismo de formación e propagación da biopelícula na superficie dun implante ortopédico infectado.eDNA, ADN extracelular.(B) Diagrama esquemático da resposta inmune despois da inserción do implante ortopédico.(C) Tinción H&E e (D) Tinción MT dos tecidos circundantes de implantes ortopédicos con positivo e LOIS.IHC de citocinas relacionadas co sistema inmune (E) TNF-α e (F) IL-6 son imaxes tinguidas de coellos espidos negativos e implantados con LOIS.(G) Cuantificación da expresión de citocinas mediante a medición da cobertura de área (** P <0,01).
A biocompatibilidade de LOIS e o seu efecto no proceso de cicatrización ósea examináronse in vivo mediante diagnóstico por imaxe [raios X e tomografía microcomputadora (TC)] e IHC de osteoclastos.A figura 6A mostra o proceso de cicatrización ósea que implica tres etapas diferentes: inflamación, reparación e remodelación.Cando se produce unha fractura, as células inflamatorias e os fibroblastos penetrarán no óso fracturado e comezarán a crecer no tecido vascular.Durante a fase de reparación, o crecemento interno do tecido vascular esténdese preto do lugar da fractura.O tecido vascular proporciona nutrientes para a formación de óso novo, que se chama callo.A etapa final do proceso de cicatrización ósea é a fase de remodelación, na que o tamaño do callo redúcese ao tamaño do óso normal coa axuda dun aumento do nivel de osteoclastos activados (59).Realizouse a reconstrución tridimensional (3D) do lugar da fractura mediante micro-TC para observar as diferenzas no nivel de formación de callos en cada grupo.Observe a sección transversal do fémur para observar o grosor do callo que rodea o óso fracturado (Figura 6, B e C).Tamén se utilizaron raios X para examinar os sitios de fracturas de todos os grupos cada semana para observar os diferentes procesos de rexeneración ósea en cada grupo (Figura S9).O callo e os ósos maduros móstranse en azul/verde e marfil, respectivamente.A maioría dos tecidos brandos son filtrados cun limiar preestablecido.Desnudo positivo e SHP confirmaron a formación dunha pequena cantidade de callo ao redor do lugar da fractura.Por outra banda, o negativo exposto de LOIS e o lugar da fractura están rodeados de callos grosos.As imaxes de micro-TC mostraron que a formación de callos estaba obstaculizada pola infección bacteriana e a inflamación relacionada coa infección.Isto débese a que o sistema inmunitario prioriza a curación das lesións sépticas causadas pola inflamación relacionada coa infección, en lugar da recuperación ósea (60).Realizáronse a tinción de IHC e de fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) para observar a actividade dos osteoclastos e a reabsorción ósea (Figura 6D) (61).Só se atoparon algúns osteoclastos activados tinguidos de violeta en positivos espidos e SHP.Por outra banda, observáronse moitos osteoclastos activados preto dos ósos positivos e maduros espidos de LOIS.Este fenómeno indica que, en presenza de osteoclastos, o callo ao redor do lugar da fractura está a sufrir un violento proceso de remodelación (62).O volume óseo e a área de expresión dos osteoclastos do callo foron medidos para comparar o nivel de formación de callos ao redor do lugar da fractura en todos os grupos, para cuantificar os resultados da micro-TC e IHC (Figura 6E, 1 e 2).Como era de esperar, os negativos espidos e a formación de callos en LOIS foron significativamente máis altos que nos outros grupos, o que indica que se produciu unha remodelación ósea positiva (63).A figura S10 mostra a imaxe óptica do sitio cirúrxico, o resultado da tinción MT do tecido recollido preto do parafuso e o resultado da tinción TRAP destacando a interface parafuso-óso.No substrato espido, observouse unha forte formación de callos e fibrose, mentres que o implante tratado con LOIS mostrou unha superficie relativamente sen adherencia.Do mesmo xeito, en comparación cos negativos espidos, observouse unha menor fibrose nos coellos implantados con LOIS, como indican as frechas brancas.Ademais, o edema firme (frecha azul) pódese atribuír ás propiedades de evasión inmune de LOIS, reducindo así a inflamación grave.A superficie antiadherente ao redor do implante e a reducida fibrose suxiren que o proceso de eliminación é máis sinxelo, o que adoita producir outras fracturas ou inflamacións.O proceso de cicatrización ósea despois da eliminación do parafuso foi avaliado pola actividade dos osteoclastos na interface óso-parafuso.Tanto o óso espido como a interface do implante LOIS absorberon niveis similares de osteoclastos para unha maior cicatrización ósea, o que indica que o revestimento LOIS non ten ningún efecto negativo na cicatrización ósea nin na resposta inmune.Para confirmar que a modificación da superficie realizada no LOIS non interfire co proceso de cicatrización ósea, utilizouse un exame de raios X para comparar a curación ósea dos coellos con ións negativos expostos e 6 semanas de implantación de LOIS (Figura 6F).Os resultados mostraron que, en comparación co grupo espido positivo non infectado, LOIS mostrou o mesmo grao de cicatrización ósea e non había signos obvios de fractura (liña de osteólise continua) en ambos os grupos.
(A) Diagrama esquemático do proceso de cicatrización ósea despois da fractura.(B) A diferenza no grao de formación de callos de cada grupo de superficie e (C) a imaxe en sección transversal do lugar da fractura.(D) Tinción TRAP para visualizar a actividade dos osteoclastos e a reabsorción ósea.En base á actividade TRAP, a formación de callos externos do óso cortical foi analizada cuantitativamente mediante (E) (1) micro-TC e (2) actividade dos osteoclastos.(F) 6 semanas despois da implantación, imaxes de raios X do óso fracturado do negativo exposto (resaltado polo rectángulo discontinuo vermello) e LOIS (resaltado polo rectángulo trazado azul).A análise estatística realizouse mediante análise unidireccional da varianza (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
En resumo, LOIS ofrece un novo tipo de estratexia de infección antibacteriana e revestimento de escape inmune para implantes ortopédicos.Os implantes ortopédicos convencionais con funcionalización SHP presentan propiedades anti-biofouling a curto prazo, pero non poden manter as súas propiedades durante moito tempo.A superhidrofobicidade do substrato atrapa as burbullas de aire entre as bacterias e o substrato, formando bolsas de aire, evitando así a infección bacteriana.Non obstante, debido á difusión do aire, estas bolsas de aire son facilmente eliminadas.Por outra banda, LOIS demostrou ben a súa capacidade para previr infeccións relacionadas co biofilm.Polo tanto, debido ás propiedades anti-rexeite da capa de lubricante inxectada na superficie da micro/nano estrutura en capas, pódese evitar a inflamación relacionada coa infección.Utilízanse varios métodos de caracterización, incluíndo medicións SEM, AFM, XPS e CA para optimizar as condicións de fabricación de LOIS.Ademais, LOIS tamén se pode aplicar a varios materiais biolóxicos usados ​​habitualmente en equipos de fixación ortopédica, como PLGA, Ti, PE, POM e PPSU.Despois, LOIS probouse in vitro para demostrar as súas propiedades anti-biofouling contra bacterias e substancias biolóxicas relacionadas coa resposta inmune.Os resultados mostran que ten excelentes efectos antibacterianos e anti-biofouling en comparación co implante nu.Ademais, LOIS mostra resistencia mecánica mesmo despois de aplicar unha tensión mecánica, que é inevitable en cirurxía plástica.Debido ás propiedades de autocuración do lubricante na superficie da estrutura micro/nano, LOIS mantivo con éxito as súas propiedades anti-encrassemento biolóxica.Para estudar a biocompatibilidade e as propiedades antibacterianas de LOIS in vivo, implantouse LOIS no fémur de coello durante 4 semanas.Non se observou infección bacteriana en coellos implantados con LOIS.Ademais, o uso de IHC demostrou un nivel reducido de resposta inmune local, o que indica que a LOIS non inhibe o proceso de curación dos ósos.LOIS presenta excelentes propiedades antibacterianas e de evasión inmune, e comprobouse que prevén eficazmente a formación de biopelículas antes e durante a cirurxía ortopédica, especialmente para a síntese ósea.Usando un modelo de fractura femoral inflamatoria da medula ósea de coello, estudouse profundamente o efecto das infeccións relacionadas co biofilm sobre o proceso de cicatrización ósea inducida por implantes pre-incubados.Como estudo futuro, é necesario un novo modelo in vivo para estudar posibles infeccións despois da implantación para comprender e previr completamente as infeccións relacionadas co biofilm durante todo o proceso de curación.Ademais, a osteoindución aínda é un desafío sen resolver na integración con LOIS.Necesítanse máis investigacións para combinar a adhesión selectiva de células osteoindutivas ou a medicina rexenerativa con LOIS para superar o desafío.En xeral, LOIS representa un revestimento de implante ortopédico prometedor con robustez mecánica e excelentes propiedades anti-biofouling, que poden reducir SSI e os efectos secundarios inmunes.
Lave o substrato 304 SS de 15 mm x 15 mm x 1 mm (Dong Kang M-Tech Co., Corea) en acetona, EtOH e auga DI durante 15 minutos para eliminar os contaminantes.Co fin de formar unha estrutura de micro/nano-nivel na superficie, o substrato limpo é inmerso nunha solución de HF do 48% ao 51% (DUKSAN Corp., Corea do Sur) a 50 °C.O tempo de gravado varía de 0 a 60 minutos.Despois, o substrato gravado limpouse con auga desionizada e colocouse nunha solución ao 65% de HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) a 50 °C durante 30 minutos para formar unha capa de pasivación de óxido de cromo na superficie.Despois da pasivación, o substrato lávase con auga desionizada e sécase para obter un substrato cunha estrutura en capas.A continuación, o substrato foi exposto a plasma de osíxeno (100 W, 3 minutos) e inmediatamente mergullo nunha solución de 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Alemaña) en tolueno a temperatura ambiente durante 12 horas.Despois, o substrato revestido con POTS foi limpo con EtOH e recocido a 150 ° C durante 2 horas para obter un denso POTS SAM.Despois do revestimento SAM, formouse unha capa de lubricante sobre o substrato aplicando un lubricante perfluoropoliéter (Krytox 101; DuPont, EUA) cun volume de carga de 20 μm/cm 2. Antes do seu uso, filtrar o lubricante a través dun filtro de 0,2 micras.Retire o exceso de lubricante inclinando un ángulo de 45° durante 15 minutos.O mesmo procedemento de fabricación utilizouse para implantes ortopédicos feitos de 304 SS (placa de bloqueo e parafuso de bloqueo cortical; Dong Kang M-Tech Co., Corea).Todos os implantes ortopédicos están deseñados para adaptarse á xeometría do fémur do coello.
Inspeccionouse a morfoloxía superficial do substrato e dos implantes ortopédicos mediante SEM de emisión de campo (Inspect F50, FEI, EUA) e AFM (XE-100, Park Systems, Corea do Sur).A rugosidade da superficie (Ra, Rq) mídese multiplicando a área de 20 μm por 20 μm (n=4).Utilizouse un sistema XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Xapón) equipado cunha fonte de raios X Al Kα cun tamaño de punto de 100 μm2 para analizar a composición química da superficie.Utilizouse un sistema de medición de CA equipado cunha cámara de captura de imaxe dinámica (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Corea do Sur) para medir CA e SA líquidos.Para cada medición, colócanse na superficie de 6 a 10 μl de gotículas (auga desionizada, sangue de cabalo, EG, etanol ao 30% e HD) para medir CA.Cando o ángulo de inclinación do substrato aumenta a unha velocidade de 2°/s (n = 4), o SA mídese cando a gota cae.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] e MRSA (ATCC 25923) foron adquiridos de ATCC (Manassas, Virginia, EUA), e o cultivo de stock mantívose a -80 °C.Antes do seu uso, o cultivo conxelado foi incubado en caldo de soia desconxelado con tripsina (Komed, Corea) a 37 °C durante 18 horas e despois transferiuse dúas veces para activalo.Despois da incubación, o cultivo foi centrifugado a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C e lavado dúas veces cunha solución de PBS (pH 7,3).A continuación, o cultivo centrifugado subcultivo en placas de agar sangue (BAP).MRSA e Pseudomonas aeruginosa preparáronse durante a noite e cultiváronse en caldo Luria-Bertani.A concentración de Pseudomonas aeruginosa e MRSA no inóculo determinouse cuantitativamente mediante a CFU da suspensión en dilucións en serie sobre agar.A continuación, axuste a concentración bacteriana a 0,5 estándar de McFarland, o que equivale a 108 CFU/ml.A continuación, dilúa a suspensión bacteriana de traballo 100 veces ata 106 CFU/ml.Para probar as propiedades de adhesión antibacteriana, o substrato esterilizause a 121 °C durante 15 minutos antes do uso.Despois, o substrato foi transferido a 25 ml de suspensión bacteriana e incubouse a 37 ° C con axitación vigorosa (200 rpm) durante 12 e 72 horas.Despois da incubación, cada substrato foi eliminado da incubadora e lavado 3 veces con PBS para eliminar as bacterias flotantes na superficie.Para observar o biofilm no substrato, o biofilm foi fixado con metanol e tinguiuse con 1 ml de crimidina laranxa durante 2 minutos.Despois utilizouse un microscopio de fluorescencia (BX51TR, Olympus, Xapón) para tomar fotografías da biopelícula manchada.Para cuantificar a biopelícula no substrato, as células adheridas separáronse do substrato polo método de vórtice de perlas, que se considerou o método máis adecuado para eliminar as bacterias adheridas (n = 4).Usando pinzas estériles, retire o substrato do medio de crecemento e toque a placa do pozo para eliminar o exceso de líquido.As células lixeiramente unidas foron eliminadas lavando dúas veces con PBS estéril.Despois, cada substrato foi transferido a un tubo de ensaio estéril que contiña 9 ml de solución salina ept de proteína (PSW) ao 0,1% e 2 g de 20 a 25 perlas de vidro estériles (de 0,4 a 0,5 mm de diámetro).A continuación, vórtexouse durante 3 minutos para separar as células da mostra.Despois do vórtex, a suspensión diluíuse en serie 10 veces con PSW ao 0,1% e despois inoculáronse 0,1 ml de cada dilución en BAP.Despois de 24 horas de incubación a 37 °C, o CFU foi contado manualmente.
Para as células utilizáronse fibroblastos de rato NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) e macrófagos de rato RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC).Use o medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Corea) para cultivar fibroblastos de rato e complemente cun 10% de soro de becerro (S103-01, Welgene) e 1% de penicilina-estreptomicina (PS; LS202-02, Welgene (Welgene). Use DMEM para cultivar macrófagos de rato, complementado con 10% de soro fetal bovino (S001-01, Welgene) e 1% de PS. Coloque o substrato nunha placa de cultivo celular de seis pozos e inocule as células a 105 células/cm2. As células incubáronse durante a noite a 37 °C e 5% de CO2. Para a tinción das células, as células foron fixadas con paraformaldehído ao 4% durante 20 minutos e colocáronse en 0,5% de Triton X Incube durante 5 minutos en -100 de tetrametilrodamina a 37 °C durante 30 minutos Despois do proceso de incubación, use o substrato con medio de fixación VECTASHIELD de 4′,6-diamino-2-phenylindol (H -1200, Vector Laboratories, UK) (n = 4 por célula). , fluoresceína, isotiocianato-albúmina de fluoresceína (A9771, Sigma-Aldrich, Alemaña) e plasma humano O fibrinóxeno conxugado con Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, EUA) foi disolto en PBS (10 mM, pH 7,4).As concentracións de albúmina e fibrinóxeno foron de 1 e 150 μg/ml, respectivamente.Despois do substrato Antes de mergullarse na solución proteica, enxágüeos con PBS para rehidratar a superficie.A continuación, mergullo todos os substratos nunha placa de seis pozos que contén a solución proteica e incúbalo a 37 °C durante 30 e 90 minutos.Despois da incubación, retirouse o substrato da solución proteica, lavouse suavemente con PBS 3 veces e fixouse con paraformaldehido ao 4% (n = 4 para cada proteína).Para o calcio, o cloruro de sodio (0,21 M) e o fosfato de potasio (3,77 mM) disolvéronse en auga desionizada.O pH da solución axustouse a 2,0 engadindo solución de clorhidrato (1 M).A continuación, disolveuse cloruro de calcio (5,62 mM) na solución.Engadindo 1M tris(hidroximetil)-amino Metano axústase o pH da solución a 7,4.Mergullo todos os substratos nunha placa de seis pozos chea de solución de fosfato cálcico 1,5 × e retira da solución despois de 30 minutos.Para a cor, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Mestura con 100 ml de auga desionizada.A continuación, use hidróxido de amonio ao 10% para axustar o pH a 4. Tinga o substrato con solución de vermello de alizarina durante 5 minutos, e despois sacuda o exceso de colorante e seque.Despois do proceso de axitación, retire o substrato.O material é deshidratado, despois mergullado en acetona durante 5 minutos, despois mergullado nunha solución de acetona-xileno (1:1) durante 5 minutos e, finalmente, lávase con xileno (n = 4).Utilízase un microscopio de fluorescencia (Axio Imager) con lentes obxectivos ×10 e ×20..A2m, Zeiss, Alemaña) imaxes de todos os substratos.Utilizouse ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) para cuantificar os datos de adhesión de substancias biolóxicas en cada grupo de catro áreas de imaxe diferentes.Converte todas as imaxes en imaxes binarias con limiares fixos para a comparación de substratos.
Utilizouse un microscopio confocal Zeiss LSM 700 para controlar a estabilidade da capa lubricante no PBS en modo de reflexión.A mostra de vidro revestida de SAM a base de flúor cunha capa lubricante inxectada foi inmersa nunha solución de PBS e probouse cun agitador orbital (SHO-1D; Daihan Scientific, Corea do Sur) en condicións de axitación suave (120 rpm).Despois colle a mostra e monitoriza a perda de lubricante medindo a perda de luz reflectida.Para adquirir imaxes de fluorescencia en modo de reflexión, a mostra exponse a un láser de 633 nm e despois recóllese, porque a luz será reflectida de volta pola mostra.As mostras midéronse en intervalos de tempo de 0, 30, 60 e 120 horas.
Para determinar a influencia do proceso de modificación da superficie nas propiedades nanomecánicas dos implantes ortopédicos, utilizouse un nanoindentador (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, EUA) equipado cunha punta de diamante Berkovich en forma de pirámide de tres lados para medir a nanoindendiona.A carga máxima é de 10 mN e a área é de 100 μmx 100 μm.Para todas as medicións, o tempo de carga e descarga é de 10 s e o tempo de retención baixo a carga máxima de indentación é de 2 s.Fai medicións de cinco lugares diferentes e fai a media.Para avaliar o rendemento da resistencia mecánica baixo carga, realizouse unha proba de flexión transversal de tres puntos utilizando unha máquina de proba universal (Instron 5966, Instron, EUA).O substrato comprime a unha velocidade constante de 10 N/s cunha carga aumentada.Utilizouse o programa de software Bluehill Universal (n = 3) para calcular o módulo de flexión e a tensión máxima de compresión.
Co fin de simular o proceso de operación e os danos mecánicos relacionados causados ​​durante a operación, o proceso de operación realizouse in vitro.Os fémures foron recollidos dos coellos brancos de Nova Zelanda executados.O fémur foi limpo e fixado en paraformaldehido ao 4% durante 1 semana.Tal e como se describe no método experimental con animais, o fémur fixo foi operado cirurxicamente.Despois da operación, o implante ortopédico foi inmerso en sangue (sangue de cabalo, KISAN, Corea) durante 10 s para confirmar se se producían adherencias de sangue despois da aplicación da lesión mecánica (n = 3).
Un total de 24 coellos brancos machos de Nova Zelanda (peso de 3,0 a 3,5 kg, idade media de 6 meses) foron divididos aleatoriamente en catro grupos: espidos negativos, espidos positivos, SHP e LOIS.Todos os procedementos que implican animais realizáronse de acordo cos estándares éticos do Comité Institucional de Coidado e Uso de Animais (aprobado IACUC, KOREA-2017-0159).O implante ortopédico consta dunha placa de bloqueo con cinco orificios (longitud 41 mm, ancho 7 mm e grosor 2 mm) e parafusos de bloqueo cortical (longitud 12 mm, diámetro 2,7 mm) para a fixación da fractura.Agás aquelas placas e parafusos utilizados no grupo negativo, todas as placas e parafusos incubáronse en suspensión de MRSA (106 CFU/ml) durante 12 horas.O grupo espido-negativo (n=6) foi tratado con implantes de superficie espido sen exposición a suspensión bacteriana, como control negativo para a infección.O grupo positivo espido (n = 6) foi tratado cun implante de superficie espida exposto a bacterias como control positivo da infección.O grupo SHP (n = 6) foi tratado con implantes SHP expostos a bacterias.Finalmente, o grupo LOIS foi tratado con implantes LOIS expostos a bacterias (n = 6).Todos os animais están gardados nunha gaiola, e ofrécese moita comida e auga.Antes da operación, os coellos estiveron en xaxún durante 12 horas.Os animais foron anestesiados mediante inxección intramuscular de xilazina (5 mg/kg) e inxección intravenosa de paclitaxel (3 mg/kg) para a indución.Despois diso, administre 2% de isoflurano e 50% a 70% de osíxeno médico (taxa de fluxo 2 L/min) a través do sistema respiratorio para manter a anestesia.Implántase mediante unha aproximación directa ao fémur lateral.Despois da depilación e da desinfección da pel con povidona iodada, realizouse unha incisión duns 6 cm de longo no exterior do fémur medio esquerdo.Ao abrir o espazo entre os músculos que cobren o fémur, o fémur queda totalmente exposto.Coloque a placa diante do eixe femoral e fíxaa con catro parafusos.Despois da fixación, use unha folla de serra (1 mm de espesor) para crear artificialmente unha fractura na zona entre o segundo burato e o cuarto burato.Ao final da operación, a ferida foi lavada con solución salina e pechada con suturas.Cada coello foi inxectado por vía subcutánea con enrofloxacina (5 mg/kg) diluída nun terzo en solución salina.Tomáronse radiografías postoperatorias do fémur en todos os animais (0, 7, 14, 21, 28 e 42 días) para confirmar a osteotomía do óso.Despois da anestesia profunda, todos os animais foron asasinados por KCl intravenoso (2 mmol/kg) nos 28 e 42 días.Despois da execución, o fémur foi dixitalizado mediante micro-TC para observar e comparar o proceso de cicatrización dos ósos e a formación de novos ósos entre os catro grupos.
Despois da execución, recolléronse os tecidos brandos que estaban en contacto directo cos implantes ortopédicos.O tecido fixouse en formalina tamponada neutra ao 10% durante a noite e despois deshidratouse en EtOH.O tecido deshidratado foi incrustado en parafina e seccionado cun espesor de 40 μm usando un micrótomo (400CS; EXAKT, Alemaña).Para visualizar a infección, realizouse a tinción H&E e a tinción MT.Para comprobar a resposta do hóspede, o tecido seccionado foi incubado con anticorpo primario anti-TNF-α de coello (AB6671, Abcam, EUA) e coello anti-IL-6 (AB6672; Abcam, EUA), e despois tratouse con rábano picante.Oxidase.Aplique o sistema de tinción do complexo de avidina-biotina (ABC) ás seccións segundo as instrucións do fabricante.Para aparecer como un produto de reacción marrón, utilizouse 3,3-diaminobencidina en todas as partes.Utilizouse un escáner de diapositivas dixital (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hungría) para visualizar todos os cortes, e polo menos catro substratos en cada grupo foron analizados polo software ImageJ.
Tomáronse imaxes de raios X en todos os animais despois da cirurxía e cada semana para controlar a curación da fractura (n=6 por grupo).Despois da execución, utilizouse micro-TC de alta resolución para calcular a formación de callos ao redor do fémur despois da cicatrización.O fémur obtido foi limpo, fixado en paraformaldehido ao 4% durante 3 días e deshidratado en etanol ao 75%.Despois escaneáronse os ósos deshidratados mediante micro-TC (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Bélxica) para xerar imaxes de voxel 3D (2240 ​​× 2240 píxeles) da mostra ósea.Use un filtro de Al de 1,0 mm para reducir o ruído do sinal e aplique unha alta resolución a todas as exploracións (E = 133 kVp, I = 60 μA, tempo de integración = 500 ms).Utilizouse o software Nrecon (versión 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Bélxica) para xerar un volume 3D da mostra dixitalizada a partir da proxección lateral 2D adquirida.Para a análise, a imaxe reconstruída en 3D divídese en cubos de 10 mm × 10 mm × 10 mm segundo o lugar da fractura.Calcula o callo fóra do óso cortical.Utilizouse o software DataViewer (versión 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Bélxica) para redirixir dixitalmente o volume óseo dixitalizado e para a análise utilizouse o software CT-Analyzer (versión 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Bélxica).Os coeficientes relativos de absorción de raios X no óso maduro e no callo distínguense pola súa densidade e, a continuación, cuantificase o volume do callo (n = 4).Para confirmar que a biocompatibilidade de LOIS non atrasa o proceso de cicatrización ósea, realizáronse análises de raios X e micro-TC adicional en dous coellos: o grupo espido-negativo e o grupo LOIS.Ambos os grupos foron executados na sexta semana.
Os fémures dos animais sacrificados foron recollidos e fixados en paraformaldehido ao 4% durante 3 días.O implante ortopédico retírase coidadosamente do fémur.Descalcificouse o fémur durante 21 días mediante EDTA 0,5 M (EC-900, National Diagnostics Corporation).Despois mergúllase o fémur descalcificado en EtOH para que se deshidratase.O fémur deshidratado foi eliminado en xileno e incrustado en parafina.A continuación, a mostra foi cortada cun micrótomo rotativo automático (Leica RM2255, Leica Biosystems, Alemaña) cun espesor de 3 μm.Para a tinción con TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Alemaña), as mostras seccionadas foron desparafinadas, rehidratadas e incubadas en reactivo TRAP a 37 °C durante 1 hora.As imaxes foron adquiridas mediante un escáner de diapositivas (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hungría) e cuantificáronse medindo a cobertura de área da área manchada.En cada experimento, polo menos catro substratos en cada grupo foron analizados polo software ImageJ.
A análise de significación estatística realizouse mediante GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., EUA).Utilizáronse a proba t non pareada e a análise unidireccional da varianza (ANOVA) para probar as diferenzas entre os grupos de avaliación.O nivel de significación indícase na figura do seguinte xeito: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 e ****P<0,0001;NS, ningunha diferenza significativa.
Para obter materiais complementarios para este artigo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Trátase dun artigo de acceso aberto distribuído baixo os termos da licenza Creative Commons Recoñecemento-Non Comercial, que permite o uso, distribución e reprodución en calquera medio, sempre que o uso non sexa con fins comerciais e a premisa sexa que o orixinal o traballo é correcto.Referencia.
Nota: só che pedimos que proporciones un enderezo de correo electrónico para que a persoa que recomendas á páxina saiba que queres que vexa o correo electrónico e que o correo electrónico non é spam.Non capturaremos ningún enderezo de correo electrónico.
Esta pregunta úsase para comprobar se es un visitante humano e para evitar envíos automáticos de spam.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Os revestimentos antibacterianos e de escape inmune dos implantes ortopédicos poden reducir as infeccións e as respostas inmunitarias causadas por infeccións.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Os revestimentos antibacterianos e de escape inmune dos implantes ortopédicos poden reducir as infeccións e as respostas inmunitarias causadas por infeccións.
©2021 Asociación Americana para o Avance da Ciencia.todos os dereitos reservados.AAAS é socio de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.