Para los pacientes sometidos a cirugía de implantes ortopédicos, las infecciones bacterianas y las respuestas inmunitarias inducidas por infecciones siempre han sido riesgos mortales.Los materiales biológicos convencionales son susceptibles a la contaminación biológica, lo que hace que las bacterias invadan el área lesionada y provoquen una infección posoperatoria.Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar recubrimientos antiinfecciosos y de escape inmunológico para implantes ortopédicos.Aquí, hemos desarrollado una tecnología avanzada de modificación de superficies para implantes ortopédicos llamada Superficie de Implante Ortopédico Lubricada (LOIS), que está inspirada en la superficie lisa de los cántaros de las plantas carnívoras.LOIS tiene una fuerte y duradera repelencia a una variedad de líquidos y sustancias biológicas (incluidas células, proteínas, calcio y bacterias).Además, confirmamos la durabilidad mecánica contra rayones y la fuerza de fijación simulando el daño inevitable durante la cirugía in vitro.Se utilizó el modelo de fractura femoral inflamatoria de médula ósea de conejo para estudiar en profundidad la capacidad antiincrustante y antiinfecciosa de LOIS.Prevemos que LOIS, que tiene propiedades antibioincrustantes y durabilidad mecánica, sea un paso adelante en la cirugía ortopédica libre de infecciones.
Hoy en día, debido al envejecimiento general, el número de pacientes que padecen enfermedades ortopédicas (como fracturas en personas mayores, enfermedades degenerativas de las articulaciones y osteoporosis) ha aumentado considerablemente (1, 2).Por lo tanto, las instituciones médicas conceden gran importancia a la cirugía ortopédica, incluidos los implantes ortopédicos de tornillos, placas, clavos y articulaciones artificiales (3, 4).Sin embargo, se ha informado que los implantes ortopédicos tradicionales son susceptibles a la adhesión bacteriana y a la formación de biopelículas, lo que puede causar infección del sitio quirúrgico (ISQ) después de la cirugía (5, 6).Una vez que se forma la biopelícula en la superficie del implante ortopédico, su eliminación se vuelve extremadamente difícil incluso con el uso de grandes dosis de antibióticos.Por tanto, suele provocar infecciones postoperatorias graves (7, 8).Debido a los problemas anteriores, el tratamiento de implantes infectados debe incluir una reoperación, incluida la extracción de todos los implantes y los tejidos circundantes;por lo tanto, el paciente sufrirá dolores intensos y algunos riesgos (9, 10).
Para resolver algunos de estos problemas, se han desarrollado implantes ortopédicos liberadores de fármacos para prevenir infecciones eliminando las bacterias adheridas a la superficie (11, 12).Sin embargo, la estrategia todavía muestra varias limitaciones.Se ha informado que la implantación a largo plazo de implantes liberadores de fármacos ha causado daño a los tejidos circundantes y ha provocado inflamación, lo que puede provocar necrosis (13, 14).Además, los disolventes orgánicos que puedan existir después del proceso de fabricación de implantes ortopédicos liberadores de fármacos, que están estrictamente prohibidos por la Administración de Alimentos y Medicamentos de EE. UU., requieren pasos de purificación adicionales para cumplir con sus estándares (15).Los implantes liberadores de fármacos suponen un desafío para la liberación controlada de fármacos y, debido a su carga limitada de fármaco, la aplicación a largo plazo del fármaco no es factible (16).
Otra estrategia común es recubrir el implante con un polímero antiincrustante para evitar que la materia biológica y las bacterias se adhieran a la superficie (17).Por ejemplo, los polímeros zwitteriónicos han llamado la atención debido a sus propiedades no adhesivas cuando entran en contacto con proteínas plasmáticas, células y bacterias.Sin embargo, tiene algunas limitaciones relacionadas con la estabilidad a largo plazo y la durabilidad mecánica, que dificultan su aplicación práctica en implantes ortopédicos, especialmente debido al raspado mecánico durante los procedimientos quirúrgicos (18, 19).Además, debido a su alta biocompatibilidad, la ausencia de necesidad de cirugía de extracción y sus propiedades de limpieza de superficies mediante corrosión, se han utilizado implantes ortopédicos fabricados con materiales biodegradables (20, 21).Durante la corrosión, los enlaces químicos entre la matriz polimérica se rompen y se desprenden de la superficie, y los adherentes limpian la superficie.Sin embargo, la contaminación antibiológica mediante la limpieza de superficies es eficaz en un corto período de tiempo.Además, la mayoría de los materiales absorbibles, incluidos el poli(copolímero de ácido láctico y ácido glicólico) (PLGA), el ácido poliláctico (PLA) y las aleaciones a base de magnesio, sufrirán una biodegradación y erosión desigual en el cuerpo, lo que afectará negativamente a la estabilidad mecánica.(Veintidós).Además, los fragmentos de placa biodegradables proporcionan un lugar para que se adhieran las bacterias, lo que aumenta las posibilidades de infección a largo plazo.Este riesgo de degradación mecánica e infección limita la aplicación práctica de la cirugía plástica (23).
Las superficies superhidrófobas (SHP) que imitan la estructura jerárquica de las hojas de loto se han convertido en una solución potencial para las superficies antiincrustantes (24, 25).Cuando la superficie del SHP se sumerge en líquido, las burbujas de aire quedarán atrapadas, formando así bolsas de aire y previniendo la adhesión bacteriana (26).Sin embargo, estudios recientes han demostrado que la superficie SHP tiene desventajas relacionadas con la durabilidad mecánica y la estabilidad a largo plazo, lo que dificulta su aplicación en implantes médicos.Además, las bolsas de aire se disolverán y perderán sus propiedades antiincrustantes, lo que dará como resultado una adhesión bacteriana más amplia debido a la gran superficie de la superficie SHP (27, 28).Recientemente, Aizenberg y sus colegas introdujeron un método innovador de recubrimiento de superficies antibioincrustantes mediante el desarrollo de una superficie lisa inspirada en la planta carnívora Nepenthes (29, 30).La superficie lisa muestra estabilidad a largo plazo en condiciones hidráulicas, es extremadamente repelente de líquidos biológicos y tiene propiedades de autorreparación.Sin embargo, no existe un método para aplicar un recubrimiento a un implante médico de forma compleja, ni está demostrado que apoye el proceso de curación del tejido dañado después de la implantación.
Aquí, presentamos una superficie de implante ortopédico lubricada (LOIS), una superficie de implante ortopédico micro/nanoestructurada y estrechamente combinada con una fina capa lubricante para evitar que se asocie con cirugía plástica e infecciones bacterianas, como la fijación de fracturas.Debido a que la estructura de nivel micro/nano funcionalizada con flúor fija firmemente el lubricante en la estructura, el LOIS desarrollado puede repeler completamente la adhesión de varios líquidos y mantener el rendimiento antiincrustante durante mucho tiempo.Los recubrimientos LOIS se pueden aplicar a materiales de diversas formas destinados a la síntesis ósea.Las excelentes propiedades antibioincrustantes de LOIS contra bacterias de biopelículas [Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA)] y sustancias biológicas (células, proteínas y calcio) se han confirmado in vitro.La tasa de adhesión de adhesión extensa al sustrato es inferior al 1%.Además, incluso después de que se produzcan tensiones mecánicas, como rayaduras en la superficie, la autocuración provocada por el lubricante penetrante ayuda a mantener sus propiedades antiincrustantes.Los resultados de las pruebas de durabilidad mecánica muestran que incluso después de modificaciones estructurales y químicas, la resistencia total no se reducirá significativamente.Además, se llevó a cabo un experimento in vitro que simula el estrés mecánico en el entorno quirúrgico para demostrar que LOIS puede soportar diversos esfuerzos mecánicos que ocurren durante la cirugía plástica.Finalmente, utilizamos un modelo de fractura femoral in vivo basado en conejos, que demostró que LOIS tiene propiedades antibacterianas y biocompatibilidad superiores.Los resultados radiológicos e histológicos confirmaron que el comportamiento lubricante estable y las propiedades antibioincrustantes dentro de las 4 semanas posteriores a la implantación pueden lograr un rendimiento eficaz contra las infecciones y el escape inmunológico sin retrasar el proceso de curación ósea.
La Figura 1A muestra un diagrama esquemático del LOIS desarrollado, al que se le implantan estructuras a escala micro/nano en el modelo de fractura femoral de conejo para confirmar sus excelentes propiedades antiincrustantes y antiinfecciosas.Se lleva a cabo un método biomimético para simular la superficie de una planta en maceta de agua y prevenir la bioincrustación incorporando una capa lubricante dentro de la micro/nanoestructura de la superficie.La superficie inyectada con lubricante puede minimizar el contacto entre sustancias biológicas y la superficie.Por lo tanto, debido a la formación de enlaces químicos estables en la superficie, tiene un excelente rendimiento antiincrustante y estabilidad a largo plazo.Como resultado, las propiedades antibioincrustantes de la superficie lubricante permiten diversas aplicaciones prácticas en la investigación biomédica.Sin embargo, aún no se han completado investigaciones exhaustivas sobre cómo interactúa esta superficie especial en el cuerpo.Al comparar LOIS con sustratos desnudos in vitro utilizando albúmina y bacterias de biopelícula, se puede confirmar la falta de adhesividad de LOIS (Figura 1B).Además, al hacer rodar las gotas de agua sobre el sustrato desnudo inclinado y el sustrato LOIS (Figura S1 y Película S1), se puede demostrar el rendimiento de la contaminación biológica.Como se muestra en la imagen del microscopio de fluorescencia, el sustrato expuesto incubado en una suspensión de proteínas y bacterias mostró una gran cantidad de material biológico adherido a la superficie.Sin embargo, debido a sus excelentes propiedades antibioincrustantes, LOIS apenas muestra fluorescencia.Para confirmar sus propiedades antibioincrustantes y antiinfecciosas, se aplicó LOIS a la superficie de implantes ortopédicos para síntesis ósea (placas y tornillos) y se colocó en un modelo de fractura de conejo.Antes de la implantación, el implante ortopédico desnudo y LOIS se incubaron en una suspensión bacteriana durante 12 horas.La preincubación garantiza que se forme una biopelícula en la superficie del implante expuesto para su comparación.La Figura 1C muestra una fotografía del sitio de la fractura 4 semanas después de la implantación.A la izquierda, un conejo con un implante ortopédico desnudo mostró un nivel severo de inflamación debido a la formación de una biopelícula en la superficie del implante.Se observó el resultado opuesto en conejos a los que se les implantó LOIS, es decir, los tejidos circundantes de LOIS no mostraron signos de infección ni de inflamación.Además, la imagen óptica de la izquierda indica el sitio quirúrgico del conejo con el implante expuesto, lo que indica que no se encontraron adhesivos múltiples presentes en la superficie del implante expuesto en la superficie del LOIS.Esto demuestra que LOIS tiene estabilidad a largo plazo y tiene la capacidad de mantener sus propiedades antiincrustantes y antiadhesivas.
(A) Diagrama esquemático de LOIS y su implantación en un modelo de fractura femoral de conejo.(B) Imagen de microscopía de fluorescencia de proteínas y biopelículas bacterianas en la superficie desnuda y el sustrato LOIS.4 semanas después de la implantación, (C) una imagen fotográfica del sitio de la fractura y (D) una imagen de rayos X (resaltada por un rectángulo rojo).Imagen cortesía de Kyomin Chae, Universidad Yonsei.
Los conejos esterilizados y expuestos con implantes negativos mostraron un proceso de curación ósea normal sin ningún signo de inflamación o infección.Por otro lado, los implantes SHP preincubados en una suspensión bacteriana presentan inflamación relacionada con la infección en los tejidos circundantes.Esto puede atribuirse a su incapacidad para inhibir la adhesión bacteriana durante mucho tiempo (Figura S2).Para demostrar que LOIS no afecta el proceso de curación, pero inhibe posibles infecciones relacionadas con la implantación, se compararon imágenes de rayos X de la matriz positiva expuesta y LOIS en el sitio de la fractura (Figura 1D).La imagen de rayos X del implante positivo desnudo mostró líneas de osteólisis persistentes, lo que indica que el hueso no estaba completamente curado.Esto sugiere que el proceso de recuperación ósea puede retrasarse considerablemente debido a la inflamación relacionada con la infección.Por el contrario, demostró que los conejos a los que se les implantó LOIS habían sanado y no mostraban ningún sitio de fractura obvio.
Se han realizado muchos esfuerzos para desarrollar implantes médicos con estabilidad y funcionalidad a largo plazo (incluida la resistencia a la bioincrustación).Sin embargo, la presencia de diversas sustancias biológicas y la dinámica de la adhesión tisular limitan el desarrollo de sus métodos clínicamente fiables.Para superar estas deficiencias, hemos desarrollado una estructura de micro/nanocapa y una superficie modificada químicamente, que se optimiza debido a la alta fuerza capilar y la afinidad química para mantener el lubricante más suave en la mayor medida posible.La Figura 2A muestra el proceso de fabricación general de LOIS.Primero, prepare un sustrato de acero inoxidable (SS) 304 de grado médico.En segundo lugar, la micro/nanoestructura se forma sobre el sustrato SS mediante grabado químico utilizando una solución de ácido fluorhídrico (HF).Para restaurar la resistencia a la corrosión del SS, se utiliza una solución de ácido nítrico (HNO3) (31) para procesar el sustrato grabado.La pasivación mejora la resistencia a la corrosión del sustrato de acero inoxidable y ralentiza significativamente el proceso de corrosión que puede reducir el rendimiento general de LOIS.Luego, al formar una monocapa autoensamblada (SAM) con 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltrietoxisilano (POTS), la superficie se modifica químicamente para mejorar la interacción química entre la superficie y el lubricante suave Affinity.La modificación de la superficie reduce significativamente la energía superficial de la superficie estructurada a micro/nanoescala fabricada, que coincide con la energía superficial del lubricante suave.Esto permite que el lubricante se humedezca completamente, formando así una capa de lubricante estable en la superficie.La superficie modificada exhibe una hidrofobicidad mejorada.Los resultados muestran que el lubricante resbaladizo exhibe un comportamiento estable en LOIS debido a la alta afinidad química y la fuerza capilar causada por la micro/nanoestructura (32, 33).Se estudiaron los cambios ópticos en la superficie de SS después de la modificación de la superficie y la inyección de lubricante.La estructura de micro/nanocapas formada en la superficie puede provocar cambios visuales y oscurecer la superficie.Este fenómeno se atribuye al efecto mejorado de dispersión de la luz en la superficie rugosa, lo que aumenta la reflexión difusa causada por el mecanismo de captura de luz (34).Además, después de inyectar el lubricante, el LOIS se vuelve más oscuro.La capa lubricante hace que se refleje menos luz desde el sustrato, oscureciendo así el LOIS.Con el fin de optimizar la microestructura/nanoestructura para mostrar el ángulo de deslizamiento (SA) más pequeño para lograr un rendimiento antiincrustante, se utilizaron microscopía electrónica de barrido (SEM) y pares atómicos para realizar diferentes tiempos de grabado con HF (0, 3)., 15 y 60 minutos) Microscopio de Fuerza (AFM) (Figura 2B).Las imágenes SEM y AFM muestran que después de un corto tiempo de grabado (3 minutos de grabado), el sustrato desnudo ha formado una rugosidad desigual a escala nanométrica.La rugosidad de la superficie cambia con el tiempo de grabado (Figura S3).La curva que varía con el tiempo muestra que la rugosidad de la superficie continúa aumentando y alcanza un pico a los 15 minutos de grabado, y luego sólo se observa una ligera disminución en el valor de rugosidad a los 30 minutos de grabado.En este punto, la rugosidad a nivel nano se elimina, mientras que la rugosidad a nivel micro se desarrolla vigorosamente, haciendo que el cambio de rugosidad sea más estable.Después de grabar durante más de 30 minutos, se observa un aumento adicional en la rugosidad, que se explica en detalle a continuación: el SS está compuesto de acero, aleado con elementos que incluyen hierro, cromo, níquel, molibdeno y muchos otros elementos.Entre estos elementos, el hierro, el cromo y el molibdeno desempeñan un papel importante en la formación de rugosidad a escala micrométrica/nano en el SS mediante grabado con HF.En las primeras etapas de la corrosión, el hierro y el cromo se corroen principalmente porque el molibdeno tiene una mayor resistencia a la corrosión que el molibdeno.A medida que avanza el grabado, la solución de grabado alcanza una sobresaturación local, formando fluoruros y óxidos causados ​​por el grabado.El fluoruro y el óxido precipitan y finalmente se vuelven a depositar en la superficie, formando una rugosidad superficial en el rango de micrones/nano (31).Esta rugosidad a nivel micro/nano juega un papel importante en las propiedades de autocuración de LOIS.La superficie de doble escala produce un efecto sinérgico, aumentando considerablemente la fuerza capilar.Este fenómeno permite que el lubricante penetre en la superficie de manera estable y contribuye a las propiedades de autocuración (35).La formación de rugosidad depende del tiempo de grabado.Después de 10 minutos de grabado, la superficie contiene solo rugosidad a nanoescala, que no es suficiente para contener suficiente lubricante para tener resistencia a la bioincrustación (36).Por otro lado, si el tiempo de grabado supera los 30 minutos, la rugosidad a nanoescala formada por la redeposición de hierro y cromo desaparecerá, y solo quedará la rugosidad a microescala debida al molibdeno.La superficie sobregrabada carece de rugosidad a nanoescala y pierde el efecto sinérgico de la rugosidad de dos etapas, lo que afecta negativamente las características de autocuración de LOIS.Se realizaron mediciones de SA en sustratos con diferentes tiempos de grabado para demostrar el rendimiento antiincrustante.Se seleccionaron varios tipos de líquidos en función de la viscosidad y la energía superficial, incluidos agua desionizada (DI), sangre, etilenglicol (EG), etanol (EtOH) y hexadecano (HD) (Figura S4).El patrón de grabado que varía con el tiempo muestra que para varios líquidos con diferentes energías superficiales y viscosidades, la SA de LOIS después de 15 minutos de grabado es la más baja.Por lo tanto, LOIS está optimizado para grabar durante 15 minutos para formar una rugosidad a escala micrométrica y nanométrica, que es adecuada para mantener eficazmente la durabilidad del lubricante y excelentes propiedades antiincrustantes.
(A) Diagrama esquemático del proceso de fabricación de cuatro pasos de LOIS.El recuadro muestra el SAM formado en el sustrato.(B) Imágenes SEM y AFM, utilizadas para optimizar la micro/nanoestructura del sustrato en diferentes tiempos de grabado.Espectros de espectroscopia fotoelectrónica de rayos X (XPS) de (C) Cr2p y (D) F1 después de la pasivación de la superficie y el recubrimiento SAM.au, unidad arbitraria.(E) Imágenes representativas de gotas de agua sobre sustratos desnudos, grabados, SHP y LOIS.(F) El ángulo de contacto (CA) y la medición de SA de líquidos con diferentes tensiones superficiales en SHP y LOIS.Los datos se expresan como media ± DE.
Luego, para confirmar el cambio en las propiedades químicas de la superficie, se utilizó espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS) para estudiar el cambio en la composición química de la superficie del sustrato después de cada recubrimiento de la superficie.La Figura 2C muestra los resultados de la medición XPS de la superficie grabada con HF y la superficie tratada con HNO 3.Los dos picos principales a 587,3 y 577,7 eV se pueden atribuir al enlace Cr-O existente en la capa de óxido de cromo, que es la principal diferencia con la superficie grabada con HF.Esto se debe principalmente al consumo de fluoruro de hierro y cromo en la superficie por parte del HNO3.El grabado a base de HNO3 permite que el cromo forme una capa de óxido pasivante en la superficie, lo que hace que el SS grabado vuelva a ser resistente a la corrosión.En la Figura 2D, se obtuvieron espectros XPS para confirmar que se formó silano a base de fluorocarbono en la superficie después del recubrimiento SAM, que tiene una repelencia a líquidos extremadamente alta incluso para EG, sangre y EtOH.El recubrimiento SAM se completa haciendo reaccionar grupos funcionales silano con grupos hidroxilo formados mediante tratamiento con plasma.Como resultado, se observó un aumento significativo en los picos de CF2 y CF3.La energía de enlace entre 286 y 296 eV indica que el recubrimiento SAM ha completado con éxito la modificación química.SHP muestra picos relativamente grandes de CF2 (290,1 ​​eV) y CF3 (293,3 eV), que son causados ​​por el silano a base de fluorocarbono que se forma en la superficie.La Figura 2E muestra imágenes ópticas representativas de mediciones del ángulo de contacto (CA) para diferentes grupos de agua desionizada en contacto con desnudo, grabado, SHP y LOIS.Estas imágenes muestran que la superficie grabada se vuelve hidrófila debido a la estructura micro/nano formada por el grabado químico, de modo que el agua desionizada se absorbe en la estructura.Sin embargo, cuando el sustrato está recubierto con SAM, el sustrato exhibe una fuerte repelencia al agua, por lo que se forma un SHP superficial y el área de contacto entre el agua y la superficie es pequeña.Finalmente, se observó una disminución en CA en LOIS, que puede atribuirse a la penetración del lubricante en la microestructura, aumentando así el área de contacto.Para demostrar que la superficie tiene una excelente repelencia a los líquidos y propiedades no adhesivas, se comparó el LOIS con el sustrato SHP midiendo CA y SA usando varios líquidos (Figura 2F).Se seleccionaron varios tipos de líquidos en función de la viscosidad y la energía superficial, incluidos agua desionizada, sangre, EG, EtOH y HD (Figura S4).Los resultados de la medición de CA muestran que cuando CA tiende a HD, el valor de reducción de CA, donde CA tiene la energía superficial más baja.Además, la LOIS de la CA general es baja.Sin embargo, la medición SA muestra un fenómeno completamente diferente.Excepto el agua ionizada, todos los líquidos se adhieren al sustrato SHP sin resbalar.Por otro lado, LOIS muestra una SA muy baja, donde cuando todo el líquido se inclina en un ángulo inferior a 10° a 15°, todo el líquido se deslizará.Esto muestra claramente que la falta de adhesividad de LOIS es mejor que la de la superficie SHP.Además, los recubrimientos LOIS también se aplican a varios tipos de materiales, incluidos titanio (Ti), polifenilsulfona (PPSU), polioximetileno (POM), poliéter éter cetona (PEEK) y polímeros bioabsorbibles (PLGA). Son materiales ortopédicos implantables (Figura T5)).Las imágenes secuenciales de las gotas sobre el material tratado con LOIS muestran que las propiedades antibioincrustantes de LOIS son las mismas en todos los sustratos.Además, los resultados de las mediciones de CA y SA muestran que las propiedades no adhesivas de LOIS se pueden aplicar a otros materiales.
Para confirmar las propiedades antiincrustantes de LOIS, se incubaron varios tipos de sustratos (incluidos desnudos, grabados, SHP y LOIS) con Pseudomonas aeruginosa y MRSA.Estas dos bacterias fueron seleccionadas como bacterias hospitalarias representativas, que pueden conducir a la formación de biopelículas que conducen a SSI (37).La Figura 3 (A y B) muestra las imágenes del microscopio de fluorescencia y los resultados de la medición de la unidad formadora de colonias (UFC) de los sustratos incubados en la suspensión bacteriana a corto plazo (12 horas) y largo plazo (72 horas), respectivamente.En poco tiempo, las bacterias se agruparán y crecerán en tamaño, cubriéndose de sustancias parecidas a las mucosas e impidiendo su eliminación.Sin embargo, durante las 72 horas de incubación, las bacterias madurarán y serán fáciles de dispersar para formar más colonias o grupos.Por lo tanto, se puede considerar que la incubación de 72 horas es a largo plazo y es el tiempo de incubación adecuado para formar una biopelícula fuerte en la superficie (38).En un corto período de tiempo, la superficie grabada y la superficie del SHP exhibieron adhesión bacteriana, que se redujo aproximadamente entre un 25% y un 50% en comparación con el sustrato desnudo.Sin embargo, debido a su excelente rendimiento y estabilidad antibioincrustantes, LOIS no mostró adhesión de biopelículas bacterianas a corto y largo plazo.El diagrama esquemático (Figura 3C) describe la explicación del mecanismo antiincrustante biológico de la solución de grabado, SHP y LOIS.Se supone que el sustrato grabado con propiedades hidrófilas tendrá una superficie mayor que el sustrato desnudo.Por lo tanto, se producirá una mayor adhesión bacteriana sobre el sustrato grabado.Sin embargo, en comparación con el sustrato desnudo, el sustrato grabado tiene significativamente menos biopelícula formada en la superficie.Esto se debe a que las moléculas de agua se unen firmemente a la superficie hidrofílica y actúan como lubricante para el agua, interfiriendo así con la adhesión de las bacterias a corto plazo (39).Sin embargo, la capa de moléculas de agua es muy fina y soluble en suspensiones bacterianas.Por lo tanto, la capa molecular del agua desaparece durante mucho tiempo, lo que provoca una amplia adhesión y proliferación bacteriana.Para SHP, debido a sus propiedades no humectantes a corto plazo, se inhibe la adhesión bacteriana.La reducida adhesión bacteriana se puede atribuir a las bolsas de aire atrapadas en la estructura en capas y a la menor energía superficial, minimizando así el contacto entre la suspensión bacteriana y la superficie.Sin embargo, se observó una amplia adhesión bacteriana en SHP porque perdió sus propiedades antiincrustantes durante mucho tiempo.Esto se debe principalmente a la desaparición de las bolsas de aire debido a la presión hidrostática y a la disolución del aire en el agua.Esto se debe principalmente a la desaparición de las bolsas de aire debido a la disolución y a la estructura en capas que proporciona una mayor superficie de adhesión (27, 40).A diferencia de estos dos sustratos que tienen un efecto importante en la estabilidad a largo plazo, el lubricante contenido en LOIS se inyecta en la micro/nanoestructura y no desaparecerá ni siquiera a largo plazo.Los lubricantes llenos de micro/nanoestructuras son muy estables y son fuertemente atraídos hacia la superficie debido a su alta afinidad química, evitando así la adhesión bacteriana durante mucho tiempo.La Figura S6 muestra una imagen de microscopio confocal de reflexión de un sustrato con infusión de lubricante sumergido en solución salina tamponada con fosfato (PBS).Las imágenes continuas muestran que incluso después de 120 horas de ligera agitación (120 rpm), la capa de lubricante del LOIS permanece sin cambios, lo que indica estabilidad a largo plazo en condiciones de flujo.Esto se debe a la alta afinidad química entre el recubrimiento SAM a base de flúor y el lubricante a base de perfluorocarbono, de modo que se puede formar una capa lubricante estable.Por tanto, se mantiene el rendimiento antiincrustante.Además, el sustrato se probó frente a proteínas representativas (albúmina y fibrinógeno) que se encuentran en el plasma, células estrechamente relacionadas con la función inmune (macrófagos y fibroblastos) y aquellas relacionadas con la formación ósea.El contenido de calcio es muy alto.(Figura 3D, 1 y 2, y Figura S7) (41, 42).Además, las imágenes del microscopio de fluorescencia de la prueba de adhesión para fibrinógeno, albúmina y calcio mostraron diferentes características de adhesión de cada grupo de sustrato (Figura S8).Durante la formación del hueso, las capas de calcio y hueso recién formadas pueden rodear el implante ortopédico, lo que no sólo dificulta la extracción, sino que también puede causar daños inesperados al paciente durante el proceso de extracción.Por lo tanto, los niveles bajos de depósitos de calcio en placas y tornillos óseos son beneficiosos para la cirugía ortopédica que requiere la extracción de implantes.Basándonos en la cuantificación del área adherida en función de la intensidad de la fluorescencia y el recuento de células, confirmamos que LOIS muestra excelentes propiedades antibioincrustantes para todas las sustancias biológicas en comparación con otros sustratos.Según los resultados de experimentos in vitro, el antiincrustante LOIS se puede aplicar a implantes ortopédicos, que no sólo pueden inhibir las infecciones causadas por bacterias de biopelículas, sino también reducir la inflamación causada por el sistema inmunológico activo del cuerpo.
(A) Imágenes de microscopio de fluorescencia de cada grupo (desnudo, grabado, SHP y LOIS) incubadas en suspensiones de Pseudomonas aeruginosa y MRSA durante 12 y 72 horas.(B) El número de UFC adherentes de Pseudomonas aeruginosa y MRSA en la superficie de cada grupo.(C) Diagrama esquemático del mecanismo antiincrustante del grabado a corto y largo plazo, SHP y LOIS.(D) (1) El número de fibroblastos adheridos a cada sustrato y las imágenes de microscopio de fluorescencia de las células adheridas al desnudo y al LOIS.(2) Prueba de adhesión de proteínas, albúmina y calcio relacionados con el sistema inmunológico implicados en el proceso de curación ósea (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 y **** P <0,0001).ns, no es importante.
En el caso de tensiones concentradas inevitables, la durabilidad mecánica siempre ha sido el principal desafío para la aplicación de recubrimientos antiincrustantes.Los métodos tradicionales de gel anti-aguas residuales se basan en polímeros con baja solubilidad en agua y fragilidad.Por tanto, suelen ser susceptibles al estrés mecánico en aplicaciones biomédicas.Por lo tanto, los recubrimientos antiincrustantes mecánicamente duraderos siguen siendo un desafío para aplicaciones como los implantes ortopédicos (43, 44).La Figura 4A(1) demuestra los dos tipos principales de tensión aplicada a los implantes ortopédicos, incluido el rayado (esfuerzo cortante) y la compresión con la imagen óptica del implante dañado producida por las pinzas.Por ejemplo, cuando se aprieta el tornillo con un destornillador, o cuando el cirujano sujeta firmemente la placa ósea con unas pinzas y aplica fuerza de compresión, la placa ósea de plástico se dañará y rayará tanto en la escala macro como en la micro/nano (Figura 4A, 2).Para probar si el LOIS fabricado puede resistir estos daños durante la cirugía plástica, se realizó nanoindentación para comparar la dureza del sustrato desnudo y el LOIS en la escala micro/nano para estudiar las propiedades mecánicas de la micro/nanoestructura Impacto (Figura 4B).El diagrama esquemático muestra el diferente comportamiento de deformación de LOIS debido a la presencia de micro/nanoestructuras.Se dibujó una curva de fuerza-desplazamiento basada en los resultados de la nanoindentación (Figura 4C).La imagen azul representa el sustrato desnudo, que muestra solo una ligera deformación, como se ve en la profundidad máxima de indentación de 0,26 μm.Por otro lado, el aumento gradual de la fuerza de nanoindentación y el desplazamiento observado en LOIS (curva roja) puede mostrar signos de propiedades mecánicas reducidas, lo que da como resultado una profundidad de nanoindentación de 1,61 μm.Esto se debe a que la micro/nanoestructura presente en el LOIS proporciona un espacio de avance más profundo para la punta del nanoindentador, por lo que su deformación es mayor que la del sustrato desnudo.Konsta-Gdoutos et al.(45) cree que debido a la presencia de nanoestructuras, la nanoindentación y la micro/nano rugosidad conducen a curvas de nanoindentación irregulares.El área sombreada corresponde a la curva de deformación irregular atribuida a la nanoestructura, mientras que el área no sombreada se atribuye a la microestructura.Esta deformación puede dañar la microestructura/nanoestructura del lubricante de retención y afectar negativamente su rendimiento antiincrustante.Para estudiar el impacto del daño en LOIS, el daño inevitable a las micro/nanoestructuras se replicó en el cuerpo durante la cirugía plástica.Mediante el uso de pruebas de adhesión de sangre y proteínas, se puede determinar la estabilidad de las propiedades antibioincrustantes de LOIS después de in vitro (Figura 4D).Una serie de imágenes ópticas muestra los daños ocurridos cerca de los agujeros de cada sustrato.Se realizó una prueba de adhesión a la sangre para demostrar el efecto del daño mecánico en el revestimiento antibioincrustante (Figura 4E).Al igual que SHP, las propiedades antiincrustantes se pierden debido al daño y LOIS exhibe excelentes propiedades antiincrustantes al repeler la sangre.Esto se debe a que, debido a que la energía superficial es impulsada por la acción capilar que cubre el área dañada, el flujo en el lubricante microestructurado restaura las propiedades antiincrustantes (35).La misma tendencia se observó en la prueba de adhesión de proteínas utilizando albúmina.En el área dañada, la adhesión de la proteína a la superficie del SHP se observa ampliamente y midiendo su área de cobertura, se puede cuantificar como la mitad del nivel de adhesión del sustrato desnudo.Por otro lado, LOIS mantuvo sus propiedades antibioincrustantes sin causar adhesión (Figura 4, F y G).Además, la superficie del tornillo suele estar sometida a fuertes tensiones mecánicas, como la perforación, por lo que estudiamos la capacidad del revestimiento LOIS para permanecer intacto en el tornillo in vitro.La Figura 4H muestra imágenes ópticas de diferentes tornillos, incluidos los desnudos, SHP y LOIS.El rectángulo rojo representa el área objetivo donde se produce una fuerte tensión mecánica durante la implantación ósea.De manera similar a la prueba de adhesión de proteínas de la placa, se utiliza un microscopio de fluorescencia para obtener imágenes de la adhesión de proteínas y medir el área de cobertura para demostrar la integridad del recubrimiento LOIS, incluso bajo una fuerte tensión mecánica (Figura 4, I y J).Los tornillos tratados con LOIS exhiben un excelente rendimiento antiincrustante y casi ninguna proteína se adhiere a la superficie.Por otro lado, se observó adhesión de proteínas en tornillos desnudos y tornillos SHP, donde el área de cobertura de los tornillos SHP fue un tercio de la de los tornillos desnudos.Además, el implante ortopédico utilizado para la fijación debe ser mecánicamente fuerte para soportar la tensión aplicada al sitio de la fractura, como se muestra en la Figura 4K.Por lo tanto, se realizó una prueba de flexión para determinar el efecto de la modificación química sobre las propiedades mecánicas.Además, esto se hace para mantener la tensión fija del implante.Aplique fuerza mecánica vertical hasta que el implante esté completamente plegado y se obtenga una curva de tensión-deformación (Figura 4L, 1).Se compararon dos propiedades, incluido el módulo de Young y la resistencia a la flexión, entre sustratos desnudos y LOIS como indicadores de su resistencia mecánica (Figura 4L, 2 y 3).El módulo de Young indica la capacidad de un material para resistir cambios mecánicos.El módulo de Young de cada sustrato es 41,48±1,01 y 40,06±0,96 GPa, respectivamente;la diferencia observada es de alrededor del 3,4%.Además, se informa que la resistencia a la flexión, que determina la tenacidad del material, es de 102,34 ± 1,51 GPa para el sustrato desnudo y de 96,99 ± 0,86 GPa para SHP.El sustrato desnudo es aproximadamente un 5,3% más alto.La ligera disminución de las propiedades mecánicas puede deberse al efecto entalla.En el efecto de muesca, la rugosidad micro/nano puede actuar como un conjunto de muescas, lo que lleva a una concentración de tensión local y afecta las propiedades mecánicas del implante (46).Sin embargo, basándose en el hecho de que se informa que la rigidez del hueso cortical humano está entre 7,4 y 31,6 GPa, y que el módulo LOIS medido excede el del hueso cortical humano (47), el LOIS es suficiente para soportar la fractura y su estructura general. Las propiedades mecánicas se ven mínimamente afectadas por la modificación de la superficie.
(A) Diagrama esquemático de (1) la tensión mecánica aplicada al implante ortopédico durante la operación y (2) la imagen óptica del implante ortopédico dañado.(B) Diagrama esquemático de la medición de propiedades nanomecánicas mediante nanoindentación y LOIS en la superficie desnuda.(C) Curva de fuerza-desplazamiento de nanoindentación de la superficie desnuda y LOIS.(D) Después de experimentos in vitro, simule las imágenes ópticas de diferentes tipos de placas ortopédicas (el área dañada se resalta con un rectángulo rojo) para simular la tensión mecánica causada durante la operación.(E) Prueba de adhesión a la sangre y (F) prueba de adhesión a proteínas del grupo de placas ortopédicas dañadas.(G) Mida el área de cobertura de la proteína adherida a la placa.(H) Imágenes ópticas de diferentes tipos de tornillos ortopédicos después del experimento in vitro.(I) Prueba de adhesión de proteínas para estudiar la integridad de diferentes recubrimientos.(J) Mida la cobertura del área de la proteína adherida al tornillo.(K) El movimiento del conejo tiene como objetivo generar una tensión fija sobre el hueso fracturado.(L) (1) Resultados de la prueba de flexión e imágenes ópticas antes y después de la flexión.La diferencia en (2) módulo de Young y (3) resistencia a la flexión entre el implante desnudo y el SHP.Los datos se expresan como media ± DE (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 y ****P<0,0001).Imagen cortesía de Kyomin Chae, Universidad Yonsei.
En situaciones clínicas, la mayor parte del contacto bacteriano con materiales biológicos y sitios de heridas proviene de biopelículas maduras y maduras (48).Por lo tanto, los Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades de EE. UU. estiman que el 65% de todas las infecciones humanas están relacionadas con biopelículas (49).En este caso, es necesario proporcionar un diseño experimental in vivo que proporcione una formación consistente de biopelícula en la superficie del implante.Por lo tanto, desarrollamos un modelo de fractura femoral de conejo en el que los implantes ortopédicos se preincubaron en una suspensión bacteriana y luego se implantaron en fémures de conejos para estudiar las propiedades antiincrustantes de LOIS in vivo.Debido a los siguientes tres hechos importantes, las infecciones bacterianas se inducen mediante precultivo en lugar de inyección directa de suspensiones bacterianas: (i) el sistema inmunológico de los conejos es naturalmente más fuerte que el de los humanos;por lo tanto, es posible la inyección de suspensiones bacterianas y bacterias planctónicas. No tiene ningún efecto sobre la formación de biopelículas.(Ii) Las bacterias planctónicas son más susceptibles a los antibióticos, y los antibióticos generalmente se usan después de la cirugía;finalmente, (iii) la suspensión de bacterias planctónicas puede diluirse con los fluidos corporales del animal (50).Al precultivar el implante en una suspensión bacteriana antes de la implantación, podemos estudiar en profundidad los efectos nocivos de la infección bacteriana y la reacción a cuerpo extraño (FBR) en el proceso de curación ósea.Los conejos fueron sacrificados 4 semanas después de la implantación, porque la osteointegración esencial para el proceso de curación ósea se completará en 4 semanas.Luego, se retiraron los implantes de los conejos para realizar estudios posteriores.La Figura 5A muestra el mecanismo de proliferación de bacterias.El implante ortopédico infectado se introduce en el cuerpo.Como resultado de la preincubación en suspensión bacteriana, seis de los seis conejos a los que se les implantaron implantes desnudos se infectaron, mientras que ninguno de los conejos a los que se les implantaron implantes tratados con LOIS se infectó.Las infecciones bacterianas se desarrollan en tres pasos, que incluyen crecimiento, maduración y dispersión (51).Primero, las bacterias adheridas se reproducen y crecen en la superficie, y luego las bacterias forman una biopelícula cuando excretan polímero extracelular (EPS), amiloide y ADN extracelular.El biofilm no sólo interfiere con la penetración de los antibióticos, sino que también promueve la acumulación de enzimas que los degradan (como la β-lactamasa) (52).Finalmente, la biopelícula propaga las bacterias maduras a los tejidos circundantes.Por tanto, se produce la infección.Además, cuando un cuerpo extraño ingresa al cuerpo, una infección que puede causar una fuerte respuesta inmune puede causar inflamación severa, dolor y disminución de la inmunidad.La Figura 5B proporciona una descripción general de la FBR causada por la inserción de un implante ortopédico, en lugar de la respuesta inmune causada por una infección bacteriana.El sistema inmunológico reconoce el implante insertado como un cuerpo extraño y luego hace que las células y los tejidos reaccionen para encapsular el cuerpo extraño (53).En los primeros días de la FBR, se formaba una matriz de suministro en la superficie de los implantes ortopédicos, lo que provocaba la adsorción de fibrinógeno.El fibrinógeno absorbido forma entonces una red de fibrina muy densa que favorece la fijación de los leucocitos (54).Una vez que se forma la red de fibrina, se producirá una inflamación aguda debido a la infiltración de neutrófilos.En este paso, se liberan una variedad de citoquinas como el factor de necrosis tumoral α (TNF-α), la interleucina-4 (IL-4) y la IL-β, y los monocitos comienzan a infiltrarse en el sitio de implantación y diferenciarse en células gigantes.Fago (41, 55, 56).Reducir la FBR siempre ha sido un desafío porque la FBR excesiva puede causar inflamación aguda y crónica, lo que puede provocar complicaciones fatales.Para evaluar el impacto de las infecciones bacterianas en los tejidos que rodean el implante desnudo y LOIS, se utilizaron tinciones con hematoxilina y eosina (H&E) y tricrómico de Masson (MT).En el caso de los conejos a los que se les implantaron sustratos desnudos, progresaron infecciones bacterianas graves y los portaobjetos de tejido H&E mostraron claramente abscesos y necrosis causados ​​por la inflamación.Por otro lado, la superficie antibioincrustante LOIS extremadamente fuerte inhibe la adhesión bacteriana, por lo que no muestra signos de infección y reduce la inflamación (Figura 5C).Los resultados de la tinción con MT mostraron la misma tendencia.Sin embargo, la tinción con MT también mostró edema en conejos a los que se les implantó LOIS, lo que indica que la recuperación está a punto de ocurrir (Figura 5D).Para estudiar el grado de respuesta inmune, se realizó tinción inmunohistoquímica (IHC) utilizando citocinas TNF-α e IL-6 relacionadas con la respuesta inmune.Se comparó un implante negativo desnudo que no estuvo expuesto a bacterias con un LOIS que estuvo expuesto a bacterias pero no infectado para estudiar el proceso de curación en ausencia de infección bacteriana.La Figura 5E muestra una imagen óptica de un portaobjetos de IHC que expresa TNF-α.El área marrón representa la respuesta inmune, lo que indica que la respuesta inmune en LOIS está ligeramente reducida.Además, la expresión de IL-6 en LOIS fue significativamente menor que la expresión negativa de desnudos estériles (Figura 5F).La expresión de citocina se cuantificó midiendo el área de tinción de anticuerpo correspondiente a la citocina (Figura 5G).En comparación con los conejos expuestos a los implantes negativos, los niveles de expresión de los conejos a los que se les implantó LOIS fueron más bajos, lo que muestra una diferencia significativa.La disminución en la expresión de citoquinas indica que las propiedades antiincrustantes estables a largo plazo de LOIS no solo están relacionadas con la inhibición de infecciones bacterianas, sino también con la disminución de FBR, que es inducida por macrófagos que se adhieren al sustrato (53, 57, 58).Por lo tanto, la respuesta inmune reducida debido a las propiedades de evasión inmune de LOIS puede resolver los efectos secundarios después de la implantación, como la respuesta inmune excesiva después de la cirugía plástica.
(A) Un diagrama esquemático del mecanismo de formación de biopelículas y extensión en la superficie de un implante ortopédico infectado.ADNe, ADN extracelular.(B) Diagrama esquemático de la respuesta inmune después de la inserción de un implante ortopédico.(C) Tinción H&E y (D) Tinción MT de los tejidos circundantes de implantes ortopédicos con positivo desnudo y LOIS.La IHC de citocinas relacionadas con el sistema inmunitario (E) TNF-α y (F) IL-6 son imágenes teñidas de conejos desnudos negativos e implantados con LOIS.(G) Cuantificación de la expresión de citocinas mediante medición de cobertura de área (** P <0,01).
La biocompatibilidad de LOIS y su efecto sobre el proceso de curación ósea se examinaron in vivo mediante diagnóstico por imágenes [rayos X y tomografía microcomputarizada (TC)] y IHC de osteoclastos.La Figura 6A muestra el proceso de curación ósea que involucra tres etapas diferentes: inflamación, reparación y remodelación.Cuando se produce una fractura, las células inflamatorias y los fibroblastos penetrarán en el hueso fracturado y comenzarán a crecer en el tejido vascular.Durante la fase de reparación, el crecimiento interno de tejido vascular se extiende cerca del sitio de la fractura.El tejido vascular proporciona nutrientes para la formación de hueso nuevo, que se llama callo.La etapa final del proceso de curación ósea es la etapa de remodelación, en la que el tamaño del callo se reduce al tamaño del hueso normal con la ayuda de un aumento en el nivel de osteoclastos activados (59).La reconstrucción tridimensional (3D) del sitio de la fractura se realizó mediante micro-CT para observar las diferencias en el nivel de formación de callo en cada grupo.Observe la sección transversal del fémur para observar el espesor del callo que rodea el hueso fracturado (Figura 6, B y C).También se utilizaron rayos X para examinar los sitios de fractura de todos los grupos cada semana para observar los diferentes procesos de regeneración ósea en cada grupo (Figura S9).Los callos y los huesos maduros se muestran en azul/verde y marfil, respectivamente.La mayoría de los tejidos blandos se filtran con un umbral preestablecido.Desnudo positivo y SHP confirmaron la formación de una pequeña cantidad de callo alrededor del sitio de la fractura.Por otro lado, el negativo expuesto de LOIS y el sitio de la fractura están rodeados por un callo grueso.Las imágenes de micro-CT mostraron que la formación de callos se vio obstaculizada por una infección bacteriana y una inflamación relacionada con la infección.Esto se debe a que el sistema inmunológico prioriza la curación de lesiones sépticas causadas por inflamación relacionada con infecciones, en lugar de la recuperación ósea (60).Se realizaron tinciones con IHC y fosfatasa ácida resistente a tartrato (TRAP) para observar la actividad de los osteoclastos y la resorción ósea (Figura 6D) (61).Sólo se encontraron unos pocos osteoclastos activados teñidos de color púrpura en positivos desnudos y SHP.Por otro lado, se observaron muchos osteoclastos activados cerca de los huesos desnudos positivos y maduros de LOIS.Este fenómeno indica que, en presencia de osteoclastos, el callo alrededor del sitio de la fractura está experimentando un violento proceso de remodelación (62).Se midieron el volumen óseo y el área de expresión de osteoclastos del callo para comparar el nivel de formación de callo alrededor del sitio de la fractura en todos los grupos, a fin de cuantificar la micro-CT y los resultados de IHC (Figura 6E, 1 y 2).Como era de esperar, los negativos desnudos y la formación de callos en LOIS fueron significativamente mayores que en los otros grupos, lo que indica que se produjo una remodelación ósea positiva (63).La Figura S10 muestra la imagen óptica del sitio quirúrgico, el resultado de la tinción MT del tejido recolectado cerca del tornillo y el resultado de la tinción TRAP que resalta la interfaz tornillo-hueso.En el sustrato desnudo se observó una fuerte formación de callos y fibrosis, mientras que el implante tratado con LOIS mostró una superficie relativamente no adherida.De manera similar, en comparación con los negativos desnudos, se observó una menor fibrosis en los conejos a los que se les implantó LOIS, como lo indican las flechas blancas.Además, el edema firme (flecha azul) puede atribuirse a las propiedades de evasión inmunitaria de LOIS, lo que reduce la inflamación grave.La superficie antiadherente alrededor del implante y la fibrosis reducida sugieren que el proceso de extracción es más fácil, lo que generalmente resulta en otras fracturas o inflamación.El proceso de curación ósea después de la extracción del tornillo se evaluó mediante la actividad de los osteoclastos en la interfaz tornillo-hueso.Tanto el hueso desnudo como la interfaz del implante LOIS absorbieron niveles similares de osteoclastos para promover la curación ósea, lo que indica que el recubrimiento LOIS no tiene ningún efecto negativo sobre la curación ósea o la respuesta inmune.Para confirmar que la modificación de la superficie realizada en el LOIS no interfiere con el proceso de curación ósea, se utilizó un examen de rayos X para comparar la curación ósea de los conejos con iones negativos expuestos y 6 semanas de implantación de LOIS (Figura 6F).Los resultados mostraron que, en comparación con el grupo positivo desnudo no infectado, LOIS mostró el mismo grado de curación ósea y no hubo signos evidentes de fractura (línea de osteólisis continua) en ambos grupos.
(A) Diagrama esquemático del proceso de curación ósea después de una fractura.(B) La diferencia en el grado de formación de callo de cada grupo de superficie y (C) la imagen transversal del sitio de la fractura.(D) Tinción TRAP para visualizar la actividad de los osteoclastos y la resorción ósea.Con base en la actividad TRAP, la formación de callo externo de hueso cortical se analizó cuantitativamente mediante (E) (1) micro-CT y (2) actividad de osteoclastos.(F) 6 semanas después de la implantación, imágenes de rayos X del hueso fracturado del negativo expuesto (resaltado por el rectángulo discontinuo rojo) y LOIS (resaltado por el rectángulo discontinuo azul).El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza unidireccional (ANOVA).*P<0,05.**P<0,01.
En resumen, LOIS proporciona un nuevo tipo de estrategia de infección antibacteriana y revestimiento de escape inmunológico para implantes ortopédicos.Los implantes ortopédicos convencionales con funcionalización SHP exhiben propiedades antibioincrustantes a corto plazo, pero no pueden mantener sus propiedades durante mucho tiempo.La superhidrofobicidad del sustrato atrapa burbujas de aire entre las bacterias y el sustrato, formando así bolsas de aire y previniendo así la infección bacteriana.Sin embargo, debido a la difusión del aire, estas bolsas de aire se eliminan fácilmente.Por otro lado, LOIS ha demostrado su capacidad para prevenir infecciones relacionadas con biopelículas.Por lo tanto, debido a las propiedades anti-rechazo de la capa lubricante inyectada en la superficie de la micro/nanoestructura en capas, se puede prevenir la inflamación relacionada con infecciones.Se utilizan varios métodos de caracterización, incluidas mediciones SEM, AFM, XPS y CA, para optimizar las condiciones de fabricación de LOIS.Además, LOIS también se puede aplicar a diversos materiales biológicos comúnmente utilizados en equipos de fijación ortopédica, como PLGA, Ti, PE, POM y PPSU.Luego, LOIS se probó in vitro para demostrar sus propiedades antibioincrustantes contra bacterias y sustancias biológicas relacionadas con la respuesta inmune.Los resultados muestran que tiene excelentes efectos antibacterianos y antibioincrustantes en comparación con el implante simple.Además, LOIS muestra resistencia mecánica incluso después de aplicar tensión mecánica, lo cual es inevitable en la cirugía plástica.Debido a las propiedades de autocuración del lubricante en la superficie de la micro/nanoestructura, LOIS mantuvo con éxito sus propiedades antiincrustantes.Para estudiar la biocompatibilidad y las propiedades antibacterianas de LOIS in vivo, se implantó LOIS en el fémur de un conejo durante 4 semanas.No se observó infección bacteriana en conejos a los que se les implantó LOIS.Además, el uso de IHC demostró un nivel reducido de respuesta inmune local, lo que indica que LOIS no inhibe el proceso de curación ósea.LOIS exhibe excelentes propiedades antibacterianas y de evasión inmune, y se ha demostrado que previene eficazmente la formación de biopelículas antes y durante la cirugía ortopédica, especialmente para la síntesis ósea.Mediante el uso de un modelo de fractura femoral inflamatoria de médula ósea de conejo, se estudió en profundidad el efecto de las infecciones relacionadas con biopelículas en el proceso de curación ósea inducido por implantes preincubados.Como estudio futuro, se necesita un nuevo modelo in vivo para estudiar posibles infecciones después de la implantación para comprender y prevenir completamente las infecciones relacionadas con las biopelículas durante todo el proceso de curación.Además, la osteoinducción sigue siendo un desafío sin resolver en la integración con LOIS.Se necesita más investigación para combinar la adhesión selectiva de células osteoinductivas o la medicina regenerativa con LOIS para superar el desafío.En general, LOIS representa un recubrimiento para implantes ortopédicos prometedor con robustez mecánica y excelentes propiedades antibioincrustantes, que pueden reducir la SSI y los efectos secundarios inmunológicos.
Lave el sustrato SS 304 de 15 mm x 15 mm x 1 mm (Dong Kang M-Tech Co., Corea) en acetona, EtOH y agua desionizada durante 15 minutos para eliminar los contaminantes.Para formar una estructura de nivel micro/nano en la superficie, el sustrato limpio se sumerge en una solución de HF del 48 % al 51 % (DUKSAN Corp., Corea del Sur) a 50 °C.El tiempo de grabado varía de 0 a 60 minutos.Luego, el sustrato grabado se limpió con agua desionizada y se colocó en una solución de HNO3 al 65 % (Korea DUKSAN Corp.) a 50 °C durante 30 minutos para formar una capa de pasivación de óxido de cromo en la superficie.Después de la pasivación, el sustrato se lava con agua desionizada y se seca para obtener un sustrato con una estructura en capas.A continuación, el sustrato se expuso a plasma de oxígeno (100 W, 3 minutos) y se sumergió inmediatamente en una solución de POTS 8,88 mM (Sigma-Aldrich, Alemania) en tolueno a temperatura ambiente durante 12 horas.Luego, el sustrato recubierto con POTS se limpió con EtOH y se recoció a 150 °C durante 2 horas para obtener un POTS SAM denso.Después del recubrimiento SAM, se formó una capa de lubricante sobre el sustrato aplicando un lubricante de perfluoropoliéter (Krytox 101; DuPont, EE. UU.) con un volumen de carga de 20 μm/cm 2. Antes de su uso, filtre el lubricante a través de un filtro de 0,2 micrones.Retire el exceso de lubricante inclinándolo en un ángulo de 45° durante 15 minutos.Se utilizó el mismo procedimiento de fabricación para los implantes ortopédicos fabricados con acero inoxidable 304 (placa de bloqueo y tornillo de bloqueo cortical; Dong Kang M-Tech Co., Corea).Todos los implantes ortopédicos están diseñados para adaptarse a la geometría del fémur del conejo.
La morfología de la superficie del sustrato y los implantes ortopédicos se inspeccionó mediante emisión de campo SEM (Inspect F50, FEI, EE. UU.) y AFM (XE-100, Park Systems, Corea del Sur).La rugosidad de la superficie (Ra, Rq) se mide multiplicando el área de 20 μm por 20 μm (n=4).Se utilizó un sistema XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japón) equipado con una fuente de rayos X Al Kα con un tamaño de punto de 100 μm2 para analizar la composición química de la superficie.Se utilizó un sistema de medición de CA equipado con una cámara de captura de imágenes dinámica (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Corea del Sur) para medir CA y SA líquidos.Para cada medición, se colocan de 6 a 10 µl de gotitas (agua desionizada, sangre de caballo, EG, etanol al 30 % y HD) en la superficie para medir la CA.Cuando el ángulo de inclinación del sustrato aumenta a una velocidad de 2°/s (n = 4), se mide el SA cuando cae la gota.
Pseudomonas aeruginosa [Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) 27853] y MRSA (ATCC 25923) se adquirieron de ATCC (Manassas, Virginia, EE. UU.) y el cultivo madre se mantuvo a -80 °C.Antes de su uso, el cultivo congelado se incubó en caldo de soja descongelado con tripsina (Komed, Corea) a 37°C durante 18 horas y luego se transfirió dos veces para activarlo.Después de la incubación, el cultivo se centrifugó a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4°C y se lavó dos veces con una solución de PBS (pH 7,3).A continuación, el cultivo centrifugado se subcultiva en placas de agar sangre (BAP).Se prepararon MRSA y Pseudomonas aeruginosa durante la noche y se cultivaron en caldo Luria-Bertani.La concentración de Pseudomonas aeruginosa y MRSA en el inóculo se determinó cuantitativamente mediante las UFC de la suspensión en diluciones seriadas en agar.Luego, ajuste la concentración bacteriana a 0,5 estándar de McFarland, lo que equivale a 108 UFC/ml.Luego diluya la suspensión bacteriana de trabajo 100 veces a 106 UFC/ml.Para probar las propiedades de adhesión antibacteriana, el sustrato se esterilizó a 121°C durante 15 minutos antes de su uso.Luego se transfirió el sustrato a 25 ml de suspensión bacteriana y se incubó a 37°C con agitación vigorosa (200 rpm) durante 12 y 72 horas.Después de la incubación, cada sustrato se retiró de la incubadora y se lavó 3 veces con PBS para eliminar las bacterias flotantes en la superficie.Para observar la biopelícula sobre el sustrato, la biopelícula se fijó con metanol y se tiñó con 1 ml de naranja crimidina durante 2 minutos.Luego se utilizó un microscopio de fluorescencia (BX51TR, Olympus, Japón) para tomar fotografías de la biopelícula teñida.Para cuantificar la biopelícula sobre el sustrato, las células adheridas se separaron del sustrato mediante el método de vórtice de cuentas, que se consideró el método más adecuado para eliminar las bacterias adheridas (n = 4).Con unas pinzas estériles, retire el sustrato del medio de crecimiento y golpee ligeramente la placa del pozo para eliminar el exceso de líquido.Las células ligeramente adheridas se eliminaron lavando dos veces con PBS estéril.Luego, cada sustrato se transfirió a un tubo de ensayo estéril que contenía 9 ml de solución salina ept de proteína (PSW) al 0,1% y 2 g de 20 a 25 perlas de vidrio estériles (de 0,4 a 0,5 mm de diámetro).Luego se agitó durante 3 minutos para separar las células de la muestra.Después de agitar, la suspensión se diluyó en serie 10 veces con PSW al 0,1% y luego se inocularon 0,1 ml de cada dilución en BAP.Después de 24 horas de incubación a 37°C, las UFC se contaron manualmente.
Para las células, se utilizaron fibroblastos de ratón NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) y macrófagos de ratón RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC).Utilice medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Corea) para cultivar fibroblastos de ratón y complemente con suero de ternera al 10 % (S103-01, Welgene) y penicilina-estreptomicina al 1 % (PS; LS202-02, Welgene (Welgene ). Utilice DMEM para cultivar macrófagos de ratón, suplementados con suero bovino fetal al 10% (S001-01, Welgene) y PS al 1%. Coloque el sustrato en una placa de cultivo celular de seis pocillos e inocule las células a 105 células/cm2. Las células se incubaron durante la noche a 37 °C y 5 % de CO2. Para la tinción celular, las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 20 minutos y se colocaron en Triton X Incubate al 0,5 % durante 5 minutos a -100ºC. a 37 ° C durante 30 minutos Después del proceso de incubación, utilice el sustrato con medio de fijación VECTASHIELD 4′,6-diamino-2-fenilindol (H -1200, Vector Laboratories, Reino Unido) (n = 4 por célula). , fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína-albúmina (A9771, Sigma-Aldrich, Alemania) y plasma humano. El fibrinógeno conjugado con Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, EE. UU.) se disolvió en PBS (10 mM, pH 7,4).Las concentraciones de albúmina y fibrinógeno fueron de 1 y 150 μg/ml, respectivamente.Después del sustrato Antes de sumergirlos en la solución proteica, enjuáguelos con PBS para rehidratar la superficie.Luego sumerja todos los sustratos en una placa de seis pocillos que contenga la solución de proteínas e incube a 37°C durante 30 y 90 minutos.Después de la incubación, se eliminó el sustrato de la solución de proteína, se lavó suavemente con PBS 3 veces y se fijó con paraformaldehído al 4% (n = 4 para cada proteína).Para el calcio, se disolvieron cloruro de sodio (0,21 M) y fosfato de potasio (3,77 mM) en agua desionizada.El pH de la solución se ajustó a 2,0 añadiendo solución de clorhidrato (1 M).Luego se disolvió cloruro de calcio (5,62 mM) en la solución.Al agregar tris (hidroximetil) -amino metano 1 M, se ajusta el pH de la solución a 7,4.Sumerja todos los sustratos en una placa de seis pocillos llena de solución de fosfato cálcico 1,5 × y retírela de la solución después de 30 minutos.Para la tinción, mezclar 2 g de rojo de alizarina S (CI 58005) con 100 ml de agua desionizada.Luego, use hidróxido de amonio al 10 % para ajustar el pH a 4. Tiñe el sustrato con una solución de rojo de alizarina durante 5 minutos y luego sacuda el exceso de tinte y seque.Después del proceso de agitación, retire el sustrato.El material se deshidrata, luego se sumerge en acetona durante 5 minutos, luego se sumerge en una solución de acetona-xileno (1:1) durante 5 minutos y finalmente se lava con xileno (n = 4).Se utiliza un microscopio de fluorescencia (Axio Imager) con lentes objetivos de ×10 y ×20..A2m, Zeiss, Alemania) toma imágenes de todos los sustratos.Se utilizó ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) para cuantificar los datos de adhesión de sustancias biológicas en cada grupo de cuatro áreas de imágenes diferentes.Convierta todas las imágenes en imágenes binarias con umbrales fijos para comparar sustratos.
Se utilizó un microscopio confocal Zeiss LSM 700 para controlar la estabilidad de la capa de lubricante en el PBS en modo de reflexión.La muestra de vidrio recubierta con SAM a base de flúor con una capa lubricante inyectada se sumergió en una solución de PBS y se probó utilizando un agitador orbital (SHO-1D; Daihan Scientific, Corea del Sur) en condiciones de agitación suave (120 rpm).Luego tome la muestra y controle la pérdida de lubricante midiendo la pérdida de luz reflejada.Para adquirir imágenes de fluorescencia en modo de reflexión, la muestra se expone a un láser de 633 nm y luego se recoge, porque la luz se reflejará en la muestra.Las muestras se midieron en intervalos de tiempo de 0, 30, 60 y 120 horas.
Para determinar la influencia del proceso de modificación de la superficie en las propiedades nanomecánicas de los implantes ortopédicos, se utilizó un nanoindentador (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, EE. UU.) equipado con una punta de diamante Berkovich de tres lados en forma de pirámide para medir la nanoindenediona.La carga máxima es de 10 mN y el área es de 100 μmx 100 μm.Para todas las mediciones, el tiempo de carga y descarga es de 10 s, y el tiempo de mantenimiento bajo carga máxima de indentación es de 2 s.Tome medidas de cinco lugares diferentes y tome el promedio.Para evaluar el rendimiento de resistencia mecánica bajo carga, se realizó una prueba de flexión transversal de tres puntos utilizando una máquina de prueba universal (Instron 5966, Instron, EE. UU.).El sustrato se comprime a una velocidad constante de 10 N/s con una carga aumentada.Se utilizó el programa de software Bluehill Universal (n = 3) para calcular el módulo de flexión y la tensión de compresión máxima.
Para simular el proceso de operación y el daño mecánico relacionado causado durante la operación, el proceso de operación se realizó in vitro.Los fémures fueron recolectados de los conejos blancos de Nueva Zelanda ejecutados.El fémur se limpió y se fijó en paraformaldehído al 4% durante 1 semana.Como se describe en el método del experimento con animales, el fémur fijo fue operado quirúrgicamente.Después de la operación, el implante ortopédico se sumergió en sangre (sangre de caballo, KISAN, Corea) durante 10 s para confirmar si se produjeron adherencias sanguíneas después de aplicar la lesión mecánica (n = 3).
Un total de 24 conejos blancos machos de Nueva Zelanda (peso de 3,0 a 3,5 kg, edad promedio de 6 meses) se dividieron aleatoriamente en cuatro grupos: desnudo negativo, desnudo positivo, SHP y LOIS.Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los estándares éticos del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (aprobado por IACUC, COREA-2017-0159).El implante ortopédico consta de una placa de bloqueo con cinco orificios (41 mm de largo, 7 mm de ancho y 2 mm de espesor) y tornillos de bloqueo corticales (12 mm de largo, 2,7 mm de diámetro) para la fijación de fracturas.Excepto las placas y tornillos utilizados en el grupo negativo, todas las placas y tornillos se incubaron en suspensión de MRSA (106 UFC/ml) durante 12 horas.El grupo negativo desnudo (n=6) se trató con implantes de superficie desnuda sin exposición a suspensión bacteriana, como control negativo para la infección.El grupo positivo desnudo (n = 6) fue tratado con un implante de superficie desnuda expuesto a bacterias como control positivo de la infección.El grupo SHP (n = 6) fue tratado con implantes SHP expuestos a bacterias.Finalmente, el grupo LOIS fue tratado con implantes LOIS expuestos a bacterias (n = 6).Todos los animales se mantienen en una jaula y se les proporciona mucha comida y agua.Antes de la operación, los conejos estuvieron en ayunas durante 12 horas.Los animales fueron anestesiados mediante inyección intramuscular de xilazina (5 mg/kg) e inyección intravenosa de paclitaxel (3 mg/kg) para la inducción.Después de eso, administre 2% de isoflurano y 50% a 70% de oxígeno médico (caudal 2 L/min) a través del sistema respiratorio para mantener la anestesia.Se implanta mediante un abordaje directo al fémur lateral.Después de la depilación y la desinfección de la piel con povidona yodada, se realizó una incisión de aproximadamente 6 cm de largo en la parte exterior del fémur medio izquierdo.Al abrir el espacio entre los músculos que cubren el fémur, éste queda completamente expuesto.Coloque la placa delante de la diáfisis femoral y fíjela con cuatro tornillos.Después de la fijación, utilice una hoja de sierra (de 1 mm de grosor) para crear artificialmente una fractura en el área entre el segundo y el cuarto orificio.Al final de la operación, la herida se lavó con solución salina y se cerró con suturas.A cada conejo se le inyectó por vía subcutánea enrofloxacina (5 mg/kg) diluida a un tercio en solución salina.Se tomaron radiografías postoperatorias del fémur en todos los animales (0, 7, 14, 21, 28 y 42 días) para confirmar la osteotomía del hueso.Después de una anestesia profunda, todos los animales fueron sacrificados mediante KCl intravenoso (2 mmol/kg) los días 28 y 42.Después de la ejecución, el fémur fue escaneado mediante micro-CT para observar y comparar el proceso de curación ósea y la formación de hueso nuevo entre los cuatro grupos.
Tras la ejecución se recogieron los tejidos blandos que estuvieron en contacto directo con los implantes ortopédicos.El tejido se fijó en formalina tamponada neutra al 10% durante la noche y luego se deshidrató en EtOH.El tejido deshidratado se embebió en parafina y se seccionó con un espesor de 40 μm utilizando un micrótomo (400CS; EXAKT, Alemania).Para visualizar la infección, se realizaron tinciones H&E y MT.Para comprobar la respuesta del huésped, el tejido seccionado se incubó con anticuerpo primario de conejo anti-TNF-α (AB6671, Abcam, EE. UU.) y anti-IL-6 de conejo (AB6672; Abcam, EE. UU.) y luego se trató con rábano picante.Oxidasa.Aplique el sistema de tinción del complejo avidina-biotina (ABC) a las secciones según las instrucciones del fabricante.Para que apareciera como un producto de reacción marrón, se utilizó 3,3-diaminobencidina en todas las partes.Se utilizó un escáner de diapositivas digital (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hungría) para visualizar todos los cortes, y el software ImageJ analizó al menos cuatro sustratos en cada grupo.
Se tomaron imágenes de rayos X de todos los animales después de la cirugía y cada semana para controlar la curación de las fracturas (n = 6 por grupo).Después de la ejecución, se utilizó micro-CT de alta resolución para calcular la formación de callo alrededor del fémur después de la curación.El fémur obtenido se limpió, se fijó en paraformaldehído al 4% durante 3 días y se deshidrató en etanol al 75%.Luego, los huesos deshidratados se escanearon mediante micro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Bélgica) para generar imágenes de vóxeles en 3D (2240 ​​× 2240 píxeles) de la muestra de hueso.Utilice un filtro Al de 1,0 mm para reducir el ruido de la señal y aplicar alta resolución a todos los escaneos (E = 133 kVp, I = 60 μA, tiempo de integración = 500 ms).Se utilizó el software Nrecon (versión 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Bélgica) para generar un volumen 3D de la muestra escaneada a partir de la proyección lateral 2D adquirida.Para el análisis, la imagen reconstruida en 3D se divide en cubos de 10 mm × 10 mm × 10 mm según el sitio de la fractura.Calcule el callo fuera del hueso cortical.Se utilizó el software DataViewer (versión 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Bélgica) para redirigir digitalmente el volumen óseo escaneado, y el software CT-Analyzer (versión 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Bélgica) para el análisis.Los coeficientes relativos de absorción de rayos X en hueso maduro y callo se distinguen por su densidad y luego se cuantifica el volumen del callo (n = 4).Para confirmar que la biocompatibilidad de LOIS no retrasa el proceso de curación ósea, se realizaron análisis adicionales de rayos X y micro-CT en dos conejos: los grupos desnudo negativo y LOIS.Ambos grupos fueron ejecutados en la sexta semana.
Los fémures de los animales sacrificados se recogieron y se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 3 días.Luego se retira con cuidado el implante ortopédico del fémur.El fémur se descalcificó durante 21 días utilizando EDTA 0,5 M (EC-900, National Diagnostics Corporation).Luego, el fémur descalcificado se sumergió en EtOH para deshidratarlo.El fémur deshidratado se extrajo en xileno y se embebió en parafina.Luego la muestra se cortó con un microtomo rotatorio automático (Leica RM2255, Leica Biosystems, Alemania) con un espesor de 3 μm.Para la tinción TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Alemania), las muestras seccionadas se desparafinaron, se rehidrataron y se incubaron en reactivo TRAP a 37 °C durante 1 hora.Las imágenes se adquirieron utilizando un escáner de diapositivas (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hungría) y se cuantificaron midiendo la cobertura del área teñida.En cada experimento, el software ImageJ analizó al menos cuatro sustratos en cada grupo.
El análisis de significación estadística se realizó utilizando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., EE. UU.).Se utilizaron la prueba t no pareada y el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para probar las diferencias entre los grupos de evaluación.El nivel de significancia se indica en la figura de la siguiente manera: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 y ****P<0,0001;NS, sin diferencias significativas.
Para obtener materiales complementarios para este artículo, consulte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
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Los recubrimientos antibacterianos y de escape inmunológico de los implantes ortopédicos pueden reducir las infecciones y las respuestas inmunes causadas por infecciones.
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