Az ortopédiai implantátum műtéten átesett betegek számára a bakteriális fertőzések és a fertőzések által kiváltott immunválasz mindig életveszélyes kockázatot jelentett.A hagyományos biológiai anyagok érzékenyek a biológiai szennyeződésre, ami a baktériumok behatolását okozza a sérült területre, és posztoperatív fertőzést okoz.Ezért sürgősen szükség van az ortopédiai implantátumok fertőzés elleni és immunvédett bevonatainak kifejlesztésére.Itt fejlesztettük ki az ortopéd implantátumok korszerű felületmódosítási technológiáját, az úgynevezett Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS) nevet, amelyet a kancsó kancsók sima felülete ihletett.A LOIS hosszan tartó és erős folyadéktaszító képességgel rendelkezik számos folyadékkal és biológiai anyaggal szemben (beleértve a sejteket, fehérjéket, kalciumot és baktériumokat).Ezen túlmenően az in vitro műtét során bekövetkező elkerülhetetlen sérülések szimulálásával igazoltuk a mechanikai karcállóságot és a rögzítőerőt.A nyúl csontvelő-gyulladásos combcsonttörési modelljét alkalmaztuk a LOIS antibiológiai hámló és fertőzésellenes képességének alapos tanulmányozására.Úgy gondoljuk, hogy a LOIS, amely anti-biofouling tulajdonságokkal és mechanikai tartóssággal rendelkezik, előrelépést jelent a fertőzésmentes ortopédiai sebészetben.
Napjainkra az általános öregedés következtében jelentősen megnőtt az ortopédiai betegségekben (például időskori törésekben, degeneratív ízületi betegségekben, csontritkulásban) szenvedők száma (1, 2).Ezért az egészségügyi intézmények nagy jelentőséget tulajdonítanak az ortopédiai sebészetnek, beleértve a csavarok, lemezek, szögek és műízületek ortopédiai implantátumait (3, 4).A hagyományos ortopéd implantátumokról azonban beszámoltak arról, hogy érzékenyek a bakteriális adhézióra és a biofilm képződésére, ami műtét után műtéti hely fertőzést (SSI) okozhat (5, 6).Miután a biofilm kialakul az ortopédiai implantátum felületén, a biofilm eltávolítása még nagy dózisú antibiotikumok alkalmazása esetén is rendkívül nehézkessé válik.Ezért általában súlyos posztoperatív fertőzésekhez vezet (7, 8).A fenti problémák miatt a fertőzött implantátumok kezelésének tartalmaznia kell az újraműtétet, beleértve az összes implantátum és a környező szövet eltávolítását;ezért a beteg súlyos fájdalmat és bizonyos kockázatokat fog szenvedni (9, 10).
E problémák némelyikének megoldására gyógyszerkibocsátó ortopédiai implantátumokat fejlesztettek ki, amelyek megakadályozzák a fertőzést a felülethez tapadt baktériumok eltávolításával (11, 12).A stratégia azonban továbbra is számos korlátot mutat.Beszámoltak arról, hogy a gyógyszert eluáló implantátumok hosszú távú beültetése károsította a környező szöveteket és gyulladást okozott, ami nekrózishoz vezethet (13, 14).Ezenkívül az Egyesült Államok Élelmiszer- és Gyógyszerügyi Hatósága által szigorúan tiltott, gyógyszerkibocsátó ortopédiai implantátumok gyártási folyamata után esetlegesen létező szerves oldószerek további tisztítási lépéseket igényelnek, hogy megfeleljenek a szabványoknak (15).A gyógyszerkibocsátó implantátumok kihívást jelentenek a gyógyszerek szabályozott felszabadulása szempontjából, és korlátozott gyógyszerterhelésük miatt a gyógyszer hosszú távú alkalmazása nem kivitelezhető (16).
Egy másik elterjedt stratégia az implantátum lerakódásgátló polimerrel való bevonása, hogy megakadályozzák a biológiai anyagok és a baktériumok felülethez tapadását (17).Például az ikerionos polimerek a plazmafehérjékkel, sejtekkel és baktériumokkal érintkezve nem tapadó tulajdonságaik miatt vonzották magukra a figyelmet.Vannak azonban bizonyos korlátai a hosszú távú stabilitással és a mechanikai tartóssággal kapcsolatban, amelyek hátráltatják gyakorlati alkalmazását ortopédiai implantátumokban, különösen a sebészeti beavatkozások során bekövetkező mechanikai kaparás miatt (18, 19).Ezen túlmenően magas biokompatibilitása, az eltávolítási műtéti igény hiánya és a korróziós felülettisztító tulajdonságai miatt biológiailag lebomló anyagokból készült ortopédiai implantátumokat alkalmaztak (20, 21).A korrózió során a polimer mátrix közötti kémiai kötések felbomlanak és leválik a felületről, a tapadó anyagok pedig megtisztítják a felületet.A felülettisztítással végzett antibiológiai elszennyeződés azonban rövid időn belül hatásos.Ezenkívül a legtöbb felszívódó anyag, köztük a poli(tejsav-glikolsav kopolimer) (PLGA), a tejsav (PLA) és a magnézium alapú ötvözetek egyenetlen biológiai lebomláson és erózión megy keresztül a szervezetben, ami negatívan befolyásolja a mechanikai stabilitást.(húszonkettő).Emellett a biológiailag lebomló lemeztöredékek helyet biztosítanak a baktériumok megtapadásához, ami hosszú távon növeli a fertőzés esélyét.A mechanikai lebomlás és fertőzés veszélye korlátozza a plasztikai sebészet gyakorlati alkalmazását (23).
A szuperhidrofób (SHP) felületek, amelyek a lótuszlevelek hierarchikus szerkezetét utánozzák, potenciális megoldást jelentenek a lerakódásgátló felületekre (24, 25).Amikor az SHP felületét folyadékba merítik, a légbuborékok beszorulnak, ezáltal légzsákok keletkeznek, és megakadályozzák a baktériumok tapadását (26).A legújabb tanulmányok azonban kimutatták, hogy az SHP felületnek vannak hátrányai a mechanikai tartósság és a hosszú távú stabilitás miatt, ami akadályozza annak alkalmazását orvosi implantátumokban.Ezenkívül a légzsákok feloldódnak és elveszítik lerakódásgátló tulajdonságaikat, ezáltal szélesebb bakteriális tapadást eredményeznek az SHP felületének nagy felülete miatt (27, 28).A közelmúltban Aizenberg és munkatársai egy innovatív módszert mutattak be a biopiszkálódással szembeni felületbevonatban a Nepenthes kancsó növény által ihletett sima felület kifejlesztésével (29, 30).A sima felület hosszú távú stabilitást mutat hidraulikus körülmények között, rendkívül folyadéktaszító a biológiai folyadékokkal szemben, és önjavító tulajdonságokkal rendelkezik.Nincs azonban módszer arra, hogy egy komplex alakú orvosi implantátum bevonatot vigyen fel, és nem is bizonyítottan támogatja a sérült szövetek beültetés utáni gyógyulási folyamatát.
Itt bemutatunk egy síkosított ortopéd implantátum felületet (LOIS), egy mikro/nano szerkezetű ortopéd implantátum felületet, és egy vékony síkosító réteggel szorosan kombinálva megakadályozzuk, hogy plasztikai sebészettel járjon együtt Bakteriális fertőzések, például törésrögzítés.Mivel a fluor funkcionalizált mikro/nanoszintű szerkezet szilárdan rögzíti a kenőanyagot a szerkezeten, a kifejlesztett LOIS teljes mértékben taszítja a különböző folyadékok tapadását, és hosszú ideig megőrzi a lerakódásgátló teljesítményt.A LOIS bevonatokat különféle formájú csontszintézisre szánt anyagokra lehet felvinni.A LOIS kiváló biofouling-gátló tulajdonságait biofilm baktériumok [Pseudomonas aeruginosa és meticillinrezisztens Staphylococcus aureus (MRSA)] és biológiai anyagok (sejtek, fehérjék és kalcium) ellen in vitro igazolták.Az alapfelülethez való kiterjedt tapadás esetén a tapadási arány kevesebb, mint 1%.Ezen túlmenően, még mechanikai igénybevételek, például felületi karcolások után is, a behatoló kenőanyag által okozott öngyógyulás segít megőrizni lerakódásgátló tulajdonságait.A mechanikai tartóssági vizsgálat eredményei azt mutatják, hogy a szerkezeti és kémiai módosítások után sem fog jelentősen csökkenni az összszilárdság.Ezen túlmenően egy in vitro kísérletet végeztek, amely szimulálja a műtéti környezet mechanikai igénybevételét annak bizonyítására, hogy a LOIS képes ellenállni a plasztikai műtétek során fellépő különféle mechanikai igénybevételeknek.Végül egy nyúl alapú in vivo combcsonttörési modellt alkalmaztunk, amely bebizonyította, hogy a LOIS kiváló antibakteriális tulajdonságokkal és biokompatibilitással rendelkezik.A radiológiai és szövettani eredmények megerősítették, hogy a beültetést követő 4 héten belül stabil kenőanyag-viselkedés és biofouling-gátló tulajdonságok hatékony fertőzésgátló és immunszökési teljesítményt érhetnek el anélkül, hogy késleltetnék a csontgyógyulási folyamatot.
Az 1A. ábra a kifejlesztett LOIS sematikus diagramját mutatja be, amelyet mikro/nano léptékű struktúrákkal ültettek be a nyúl combcsonttörési modelljébe, hogy megerősítsék kiváló biológiai elszennyeződés- és fertőzésgátló tulajdonságait.Egy biomimetikus módszerrel szimulálják a cserepes növény felületét, és megakadályozzák a biológiai elszennyeződést egy kenőanyag réteg beépítésével a felület mikro/nano szerkezetébe.A kenőanyaggal fecskendezett felület minimálisra csökkentheti a biológiai anyagok és a felület közötti érintkezést.Ezért a felületen kialakuló stabil kémiai kötések miatt kiváló lerakódásgátló tulajdonságokkal és hosszú távú stabilitással rendelkezik.Ennek eredményeként a kenőfelület biofouling-gátló tulajdonságai különféle gyakorlati alkalmazásokat tesznek lehetővé az orvosbiológiai kutatásokban.Ennek a különleges felületnek a testben való kölcsönhatására vonatkozó kiterjedt kutatása azonban még nem fejeződött be.A LOIS-nak a csupasz szubsztrátokkal való in vitro összehasonlításával albumin és biofilm baktériumok segítségével megerősíthető a LOIS tapadásmentessége (1B. ábra).Ezenkívül a ferde csupasz hordozón és a LOIS szubsztrátumon (S1 ábra és S1 film) lévő vízcseppek legördülésével kimutatható a biológiai szennyeződési teljesítmény.Amint a fluoreszcens mikroszkóp képén látható, a fehérje- és baktériumszuszpenzióban inkubált exponált szubsztrát nagy mennyiségű biológiai anyagot tapadt a felületre.Kitűnő biofouling-gátló tulajdonságainak köszönhetően azonban a LOIS alig mutat fluoreszcenciát.Annak érdekében, hogy megerősítsük biofouling- és fertőzésgátló tulajdonságait, a LOIS-t a csontszintézis céljára szolgáló ortopéd implantátumok felületére (lemezek és csavarok) alkalmazták, és nyúltörési modellbe helyezték.A beültetés előtt a csupasz ortopédiai implantátumot és a LOIS-t bakteriális szuszpenzióban 12 órán át inkubáltuk.Az előinkubáció biztosítja, hogy összehasonlítás céljából biofilm képződjön a kitett implantátum felületén.Az 1C. ábra a törés helyének fényképét mutatja 4 héttel a beültetés után.A bal oldalon egy csupasz ortopéd implantátummal rendelkező nyúlon súlyos mértékű gyulladás mutatkozott az implantátum felületén kialakuló biofilm miatt.Ellentétes eredményt figyeltek meg a LOIS-szal beültetett nyulakban, vagyis a LOIS környező szövetei nem mutattak sem fertőzés, sem gyulladás jeleit.Ezenkívül a bal oldali optikai kép jelzi a nyúl műtéti helyét a szabaddá tett implantátummal, jelezve, hogy a LOIS felületén nem találtak több ragasztót a szabaddá tett implantátum felületén.Ez azt mutatja, hogy a LOIS hosszú távú stabilitással rendelkezik, és képes megőrizni biológiai szennyeződés- és tapadásgátló tulajdonságait.
(A) A LOIS sematikus diagramja és beültetése nyúl combcsonttörési modellben.(B) Fehérje és bakteriális biofilm fluoreszcens mikroszkópos képe csupasz felületen és LOIS szubsztrátumon.4 héttel a beültetés után (C) fényképes kép a törés helyéről és (D) röntgenkép (piros téglalappal kiemelve).A kép jóvoltából: Kyomin Chae, Yonsei Egyetem.
A sterilizált, exponált negatívan beültetett nyulak normál csontgyógyulást mutattak, gyulladás vagy fertőzés jelei nélkül.Másrészt a bakteriális szuszpenzióban előinkubált SHP implantátumok fertőzéssel összefüggő gyulladást mutatnak a környező szöveteken.Ez annak tudható be, hogy nem képes hosszú ideig gátolni a bakteriális adhéziót (S2 ábra).Annak bizonyítására, hogy a LOIS nem befolyásolja a gyógyulási folyamatot, de gátolja az implantációval kapcsolatos lehetséges fertőzéseket, összehasonlítottuk a feltárt pozitív mátrix és a törés helyén lévő LOIS röntgenfelvételeit (1D ábra).A csupasz pozitív implantátum röntgenfelvétele tartós oszteolízis vonalakat mutatott, ami azt jelzi, hogy a csont nem gyógyult meg teljesen.Ez arra utal, hogy a csont helyreállítási folyamata nagymértékben késhet a fertőzéssel összefüggő gyulladás miatt.Éppen ellenkezőleg, azt mutatta, hogy a LOIS-szal beültetett nyulak meggyógyultak, és nem mutattak nyilvánvaló törési helyet.
Sok erőfeszítést tettek annak érdekében, hogy hosszú távú stabilitást és funkcionalitást (beleértve a bioszennyeződéssel szembeni ellenálló képességet) rendelkező orvosi implantátumokat fejlesszenek ki.A különféle biológiai anyagok jelenléte és a szöveti adhézió dinamikája azonban korlátozza klinikailag megbízható módszereik kidolgozását.Ezen hiányosságok kiküszöbölésére egy mikro/nano réteges szerkezetet és kémiailag módosított felületet fejlesztettünk ki, amely a nagy kapilláris erő és a kémiai affinitás miatt optimalizálva van a lehető legsimább kenőanyag megtartására.A 2A. ábra a LOIS teljes gyártási folyamatát mutatja.Először készítsen elő egy orvosi minőségű rozsdamentes acél (SS) 304 hordozót.Másodszor, a mikro/nano szerkezetet hidrogén-fluorsav (HF) oldattal kémiai maratással alakítják ki az SS hordozón.Az SS korrózióállóságának helyreállítása érdekében salétromsav (HNO3) oldatot (31) használnak a maratott hordozó feldolgozására.A passziválás növeli az SS hordozó korrózióállóságát, és jelentősen lelassítja a korróziós folyamatot, ami csökkentheti a LOIS általános teljesítményét.Ezután az 1H, 1H, 2H, 2H-perfluor-oktil-trietoxiszilán (POTS) önszerveződő egyrétegű (SAM) kialakításával a felületet kémiailag módosítják, hogy javítsák a felület és a sima kenőanyag Affinitása közötti kémiai kölcsönhatást.A felületmódosítás jelentősen csökkenti a gyártott mikro/nano léptékű strukturált felület felületi energiáját, ami megegyezik a sima kenőanyag felületi energiájával.Ez lehetővé teszi a kenőanyag teljes átnedvesedését, ezáltal stabil kenőanyag réteget képez a felületen.A módosított felület fokozott hidrofóbitást mutat.Az eredmények azt mutatják, hogy a csúszós kenőanyag stabil viselkedést mutat a LOIS-on a mikro/nano szerkezet által okozott nagy kémiai affinitás és kapilláris erő miatt (32, 33).Vizsgálták az SS felületén bekövetkező optikai változásokat felületmódosítás és kenőanyag-injektálás után.A felületen kialakuló mikro/nano réteges szerkezet vizuális elváltozásokat okozhat és elsötétítheti a felületet.Ez a jelenség a durva felületen megnövekedett fényszórási hatásnak tulajdonítható, amely növeli a fénybefogó mechanizmus (34) által okozott diffúz visszaverődést.Ezenkívül a kenőanyag befecskendezése után a LOIS sötétebbé válik.A kenőréteg miatt kevesebb fény verődik vissza az aljzatról, ezáltal elsötétíti a LOIS-t.A mikrostruktúra/nanostruktúra optimalizálása érdekében, hogy a legkisebb csúszási szöget (SA) mutassák a biofouling-ellenes teljesítmény elérése érdekében, pásztázó elektronmikroszkópiát (SEM) és atompárokat alkalmaztunk a különböző HF maratási idők elvégzésére (0, 3)., 15 és 60 perc) Erőmikroszkóp (AFM) (2B. ábra).A SEM és AFM képek azt mutatják, hogy rövid maratási idő (3 perc maratás) után a csupasz hordozó egyenetlen nanoméretű érdesség alakult ki.A felületi érdesség a maratási idővel változik (S3 ábra).Az időben változó görbe azt mutatja, hogy a felületi érdesség tovább növekszik, és 15 perces maratáskor éri el a csúcsot, majd 30 perces maratás után már csak enyhe érdességcsökkenés figyelhető meg.Ezen a ponton a nanoszintű érdesség kimaródik, míg a mikroszintű érdesség erőteljesen fejlődik, így az érdességváltozás stabilabbá válik.Több mint 30 perces maratás után az érdesség további növekedése figyelhető meg, amelyet a következőképpen magyarázunk meg részletesen: Az SS acélból áll, amely ötvözött elemekkel, beleértve a vasat, krómot, nikkelt, molibdént és sok más elemet.Ezen elemek közül a vas, a króm és a molibdén fontos szerepet játszanak a mikron/nano léptékű érdesség kialakításában az SS-en HF maratással.A korrózió korai szakaszában a vas és a króm főleg korrodálódik, mivel a molibdénnek nagyobb a korrózióállósága, mint a molibdénnek.A maratás előrehaladtával a maratóoldat helyi túltelítettséget ér el, és a maratás által okozott fluoridok és oxidok képződnek.A fluor és az oxid kicsapódik, és végül újra lerakódik a felületen, így mikron/nano tartományba eső felületi érdesség alakul ki (31).Ez a mikro/nano szintű érdesség fontos szerepet játszik a LOIS öngyógyító tulajdonságaiban.A kettős léptékű felület szinergikus hatást fejt ki, nagymértékben növelve a kapilláris erőt.Ez a jelenség lehetővé teszi, hogy a kenőanyag stabilan behatoljon a felületbe, és hozzájárul az öngyógyító tulajdonságokhoz (35).Az érdesség kialakulása a maratási időtől függ.10 perc maratás alatt a felület csak nanoméretű érdességeket tartalmaz, ami nem elegendő ahhoz, hogy elegendő kenőanyagot tartson a biológiai szennyeződésekkel szemben (36).Másrészt, ha a maratási idő meghaladja a 30 percet, akkor a vas és króm újralerakódása következtében kialakuló nanoméretű érdesség eltűnik, és a molibdén miatt csak a mikro léptékű érdesség marad meg.A túlmaratott felületből hiányzik a nanoméretű érdesség, és elveszti a kétlépcsős érdesség szinergikus hatását, ami negatívan befolyásolja a LOIS öngyógyító tulajdonságait.Az SA méréseket különböző maratási idővel rendelkező szubsztrátumokon végeztük a lerakódásgátló teljesítmény bizonyítására.A viszkozitás és a felületi energia alapján különféle típusú folyadékokat választottak ki, beleértve az ionmentesített (DI) vizet, a vért, az etilénglikolt (EG), az etanolt (EtOH) és a hexadekánt (HD) (S4 ábra).Az időben változó maratási minta azt mutatja, hogy különböző felületi energiájú és viszkozitású folyadékok esetén a LOIS SA értéke 15 perces maratás után a legalacsonyabb.Ezért a LOIS 15 perces maratásra van optimalizálva, hogy mikro- és nanoméretű érdességeket hozzon létre, amely alkalmas a kenőanyag tartósságának és kiváló lerakódásgátló tulajdonságainak hatékony megőrzésére.
(A) A LOIS négylépéses gyártási folyamatának sematikus diagramja.A betéten a hordozón képződött SAM látható.(B) SEM és AFM képek, amelyek a hordozó mikro/nano szerkezetének optimalizálására szolgálnak különböző maratási idő alatt.A (C) Cr2p és (D) F1s röntgen fotoelektron spektroszkópiai (XPS) spektrumai felület passziválás és SAM bevonat után.au, tetszőleges egység.(E) Reprezentatív képek vízcseppekről csupasz, maratott, SHP és LOIS hordozókon.(F) Különböző felületi feszültségű folyadékok érintkezési szöge (CA) és SA mérése SHP-n és LOIS-on.Az adatokat átlag ± SD-ben fejezzük ki.
Ezután a felület kémiai tulajdonságaiban bekövetkezett változás igazolására röntgen fotoelektron spektroszkópiával (XPS) vizsgáltuk a hordozófelület kémiai összetételének változását minden felületi bevonat után.A 2C ábra a HF maratott felület és a HNO 3 kezelt felület XPS mérési eredményeit mutatja.A két fő csúcs 587,3 és 577,7 eV-nál a króm-oxid rétegben lévő Cr-O kötésnek tulajdonítható, ami a fő különbség a HF-vel maratott felülettől.Ennek oka elsősorban a HNO3 felületi vas- és króm-fluorid fogyasztása.A HNO3 alapú maratás lehetővé teszi, hogy a króm passziváló oxidréteget képezzen a felületen, ami a maratott SS-t ismét ellenállóvá teszi a korrózióval szemben.A 2D ábrán XPS-spektrumokat kaptunk annak igazolására, hogy a SAM bevonat után fluor-szénhidrogén alapú szilán keletkezett a felületen, amely rendkívül magas folyadéktaszító képességgel rendelkezik még EG, vér és EtOH esetében is.A SAM bevonatot a szilán funkciós csoportok plazmakezeléssel képződött hidroxilcsoportokkal való reagáltatásával teszik teljessé.Ennek eredményeként a CF2 és CF3 csúcsok jelentős növekedését figyelték meg.A 286 és 296 eV közötti kötési energia azt jelzi, hogy a kémiai módosítást sikeresen befejezte a SAM bevonat.Az SHP viszonylag nagy CF2 (290,1 eV) és CF3 (293,3 eV) csúcsokat mutat, amelyeket a felszínen képződő fluor-szénhidrogén alapú szilán okoz.A 2E. ábra az érintkezési szög (CA) méréseinek reprezentatív optikai képeit mutatja csupasz, maratott, SHP-vel és LOIS-szal érintkező ionmentesített víz különböző csoportjainál.Ezek a képek azt mutatják, hogy a maratott felület a kémiai maratással kialakított mikro/nano szerkezetnek köszönhetően hidrofilné válik, így az ionmentesített víz felszívódik a szerkezetbe.Ha azonban az aljzatot SAM-mel vonják be, az aljzat erős vízlepergető képességet mutat, így felületi SHP képződik, és kicsi a víz és a felület érintkezési felülete.Végül a CA csökkenése volt megfigyelhető a LOIS-ban, ami a kenőanyag mikrostruktúrába való behatolásának tulajdonítható, ezáltal megnőtt az érintkezési felület.Annak bizonyítására, hogy a felület kiváló folyadéklepergető és nem tapadó tulajdonságokkal rendelkezik, a LOIS-t összehasonlítottuk az SHP szubsztrátummal CA és SA mérésével különböző folyadékok segítségével (2F ábra).A viszkozitás és a felületi energia alapján különféle típusú folyadékokat választottak ki, beleértve az ionmentesített vizet, vért, EG-t, EtOH-t és HD-t (S4 ábra).A CA mérési eredmények azt mutatják, hogy amikor a CA hajlamos HD-ra, akkor a CA csökkentési értéke, ahol a CA a legalacsonyabb felületi energiával rendelkezik.Ezenkívül a teljes CA LOIS-ja alacsony.Az SA mérés azonban egészen más jelenséget mutat.Az ionizált víz kivételével minden folyadék lecsúszás nélkül tapad az SHP aljzatához.Másrészt a LOIS nagyon alacsony SA-t mutat, ahol ha az összes folyadékot 10–15°-nál kisebb szögben megdöntjük, az összes folyadék elgurul.Ez erősen mutatja, hogy a LOIS tapadásmentessége jobb, mint az SHP felületé.Ezenkívül a LOIS bevonatokat különféle típusú anyagokra is alkalmazzák, beleértve a titánt (Ti), a polifenilszulfont (PPSU), a polioximetilént (POM), a poliéter-éter-ketont (PEEK) és a biológiailag felszívódó polimereket (PLGA). Ezek beültethető ortopédiai anyagok (ábra). S5)).A LOIS-szal kezelt anyagon lévő cseppek egymás utáni képei azt mutatják, hogy a LOIS biofouling-gátló tulajdonságai minden hordozón azonosak.Emellett a CA és SA mérési eredményei azt mutatják, hogy a LOIS nem tapadó tulajdonságai más anyagokra is alkalmazhatók.
A LOIS lerakódásgátló tulajdonságainak megerősítése érdekében különféle típusú szubsztrátumokat (beleértve a csupasz, maratott, SHP és LOIS) inkubáltunk Pseudomonas aeruginosa és MRSA baktériummal.Ezt a két baktériumot reprezentatív kórházi baktériumnak választották, amely biofilmek kialakulásához vezethet, ami SSI-hez vezethet (37).A 3. (A és B) ábra a baktériumszuszpenzióban rövid ideig (12 óra), illetve hosszú ideig (72 óra) inkubált szubsztrátok fluoreszcens mikroszkópos képeit és a telepképző egység (CFU) mérési eredményeit mutatja.A baktériumok rövid időn belül klasztereket képeznek és megnőnek, nyálkaszerű anyagokkal borítják be magukat, és megakadályozzák azok eltávolítását.A 72 órás inkubáció során azonban a baktériumok megérnek, és könnyen eloszlanak, így további kolóniákat vagy klasztereket képeznek.Ezért úgy tekinthető, hogy a 72 órás inkubáció hosszú távú, és ez a megfelelő inkubációs idő ahhoz, hogy erős biofilm alakuljon ki a felületen (38).Rövid időn belül a maratott felület és az SHP felülete bakteriális adhéziót mutatott, amely körülbelül 25-50%-kal csökkent a csupasz hordozóhoz képest.Kiváló biofouling-gátló teljesítménye és stabilitása miatt azonban a LOIS rövid és hosszú távon nem mutatott bakteriális biofilm tapadást.A sematikus diagram (3C. ábra) leírja a maratóoldat, az SHP és a LOIS biológiai elszennyeződés elleni mechanizmusának magyarázatát.Az a feltételezés, hogy a hidrofil tulajdonságokkal rendelkező maratott hordozó felülete nagyobb, mint a csupasz hordozóé.Ezért a maratott aljzaton több baktérium tapad meg.A csupasz hordozóhoz képest azonban a maratott szubsztrátum felületén lényegesen kevesebb biofilm képződik.Ennek az az oka, hogy a vízmolekulák szilárdan kötődnek a hidrofil felülethez, és a víz kenőanyagaként működnek, így rövid távon megzavarják a baktériumok megtapadását (39).A vízmolekulák rétege azonban nagyon vékony, és baktériumszuszpenziókban oldódik.Ezért a vízmolekuláris réteg hosszú időre eltűnik, ami kiterjedt bakteriális adhézióhoz és proliferációhoz vezet.Az SHP esetében rövid távú, nem nedvesítő tulajdonságai miatt a bakteriális adhézió gátolt.A csökkent bakteriális adhézió a réteges szerkezetben megrekedt légzsákoknak és az alacsonyabb felületi energiának tudható be, ezáltal minimalizálva a baktériumszuszpenzió és a felület közötti érintkezést.Az SHP-ben azonban kiterjedt bakteriális adhéziót figyeltek meg, mivel hosszú időre elvesztette lerakódásgátló tulajdonságait.Ennek oka elsősorban a hidrosztatikus nyomás miatti légzsákok eltűnése és a levegő vízben való oldódása.Ennek oka elsősorban az oldódás miatti légzsákok eltűnése és a réteges szerkezet, amely nagyobb felületet biztosít a tapadáshoz (27, 40).Ezzel a két szubsztrátummal ellentétben, amelyek fontos hatással vannak a hosszú távú stabilitásra, a LOIS-ban lévő kenőanyagot a mikro/nano szerkezetbe fecskendezik, és még hosszú távon sem tűnik el.A mikro/nano szerkezetekkel töltött kenőanyagok nagyon stabilak, és nagy kémiai affinitásuk miatt erősen vonzzák a felületet, ezáltal hosszú ideig megakadályozzák a baktériumok megtapadását.Az S6. ábra egy foszfáttal pufferolt sóoldatba (PBS) merített, kenőanyaggal átitatott szubsztrátum reflexiós konfokális mikroszkópos képe.A folyamatos képek azt mutatják, hogy még 120 óra enyhe rázás (120 ford./perc) után is változatlan marad a kenőanyag réteg a LOIS-on, ami hosszú távú stabilitást jelez áramlási körülmények között.Ez a fluor alapú SAM bevonat és a perfluor-szénhidrogén alapú kenőanyag közötti nagy kémiai affinitásnak köszönhető, így stabil kenőanyag réteg képződik.Ezért a lerakódásgátló teljesítmény megmarad.Ezenkívül a szubsztrátot a plazmában, az immunfunkcióval szorosan összefüggő sejtekben (makrofágok és fibroblasztok), valamint a csontképződéshez kapcsolódó reprezentatív fehérjék (albumin és fibrinogén) ellen is tesztelték.A kalcium tartalma nagyon magas.(3D, 1. és 2. ábra, valamint S7. ábra) (41, 42).Ezenkívül a fibrinogén, albumin és kalcium adhéziós tesztjének fluoreszcens mikroszkópos képei az egyes szubsztrátcsoportok eltérő adhéziós jellemzőit mutatták (S8 ábra).A csontképződés során újonnan képződött csont- és kalciumrétegek veszik körül az ortopédiai implantátumot, ami nemcsak megnehezíti az eltávolítást, de az eltávolítás során váratlan károkat is okozhat a páciensben.Ezért a csontlemezeken és a csavarokon lévő alacsony kalcium-lerakódások előnyösek az implantátum eltávolítását igénylő ortopédiai műtéteknél.A csatolt terület fluoreszcencia intenzitása és sejtszáma alapján történő kvantifikálása alapján megerősítettük, hogy a LOIS kiváló biofouling-ellenes tulajdonságokat mutat minden biológiai anyagra, összehasonlítva más szubsztrátokkal.Az in vitro kísérletek eredményei szerint az antibiológiai szennyeződést gátló LOIS alkalmazható ortopédiai implantátumokra, amely nemcsak a biofilmbaktériumok okozta fertőzések gátlására, hanem a szervezet aktív immunrendszere által okozott gyulladások csökkentésére is alkalmas.
(A) Fluoreszcens mikroszkópos képek minden csoportról (csupasz, maratott, SHP és LOIS), amelyeket Pseudomonas aeruginosa és MRSA szuszpenziókban 12 és 72 órán át inkubáltunk.(B) A Pseudomonas aeruginosa és az MRSA tapadt CFU-jának száma az egyes csoportok felületén.(C) A rövid és hosszú távú maratás, SHP és LOIS biológiai elszennyeződés elleni mechanizmusának sematikus diagramja.(D) (1) Az egyes szubsztrátumokhoz tapadt fibroblasztok száma és a sejtek fluoreszcens mikroszkópos felvételei a csupasz és a LOIS-hoz tapadva.(2) A csontgyógyulásban részt vevő immunrendszeri eredetű fehérjék, albumin és kalcium adhéziós tesztje (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 és **** P <0,0001).ns, nem fontos.
Az elkerülhetetlen koncentrált igénybevételek esetén mindig is a mechanikai tartósság jelentette a fő kihívást a lerakódásgátló bevonatok felhordásakor.A hagyományos szennyvízgél elleni módszerek alacsony vízoldékonyságú és törékeny polimereken alapulnak.Ezért az orvosbiológiai alkalmazásokban általában érzékenyek a mechanikai igénybevételre.Ezért a mechanikailag tartós lerakódásgátló bevonatok továbbra is kihívást jelentenek az olyan alkalmazásoknál, mint az ortopédiai implantátumok (43, 44).A 4A(1) ábra az ortopédiai implantátumokra alkalmazott feszültség két fő típusát mutatja be, beleértve a karcolást (nyírófeszültség) és a kompressziót a sérült implantátum csipesz által előállított optikai képével.Például, ha a csavart csavarhúzóval húzzuk meg, vagy ha a sebész szorosan tartja a csontlemezt csipesszel és nyomóerőt fejt ki, a műanyag csontlemez megsérül és megkarcolódik mind a makro-, mind a mikro/nano mérlegen (4A. ábra, 2) .Annak tesztelésére, hogy a legyártott LOIS ellenáll-e ezeknek a plasztikai sebészeti beavatkozások során bekövetkező sérüléseknek, nanobenyomódást végeztünk a csupasz szubsztrátum és a LOIS keménységének mikro/nano skálán történő összehasonlítására, hogy tanulmányozzuk a mikro/nano szerkezet mechanikai tulajdonságait Impact (ábra). 4B).A sematikus diagram a LOIS eltérő deformációs viselkedését mutatja a mikro/nano szerkezetek jelenléte miatt.A nanoindentáció eredményei alapján erő-elmozdulás görbét rajzoltunk (4C. ábra).A kék kép a csupasz szubsztrátumot ábrázolja, amely csak enyhe deformációt mutat, amint azt a 0, 26 μm-es maximális bemélyedési mélység mutatja.Másrészt a LOIS-ban (vörös görbe) megfigyelt nanobenyomódási erő és elmozdulás fokozatos növekedése csökkent mechanikai tulajdonságokat mutathat, ami 1,61 μm nanobenyomódási mélységet eredményez.Ennek az az oka, hogy a LOIS-ban jelenlévő mikro/nano szerkezet mélyebb előrehaladási teret biztosít a nanoindenter csúcsának, így annak deformációja nagyobb, mint a csupasz hordozóé.Konsta-Gdoutos et al.(45) úgy véli, hogy a nanostruktúrák jelenléte miatt a nanobenyomódás és a mikro/nano érdesség szabálytalan nanobenyomódási görbéket eredményez.Az árnyékolt terület a nanoszerkezetnek tulajdonított szabálytalan deformációs görbének felel meg, míg a nem árnyékolt terület a mikrostruktúrának tulajdonítható.Ez a deformáció károsíthatja a tartókenőanyag mikroszerkezetét/nanoszerkezetét, és negatívan befolyásolhatja annak lerakódásgátló teljesítményét.A károsodás LOIS-ra gyakorolt ​​hatásának tanulmányozása érdekében a mikro/nano struktúrák elkerülhetetlen károsodását reprodukálták a szervezetben a plasztikai műtétek során.Vér- és fehérjeadhéziós tesztekkel meghatározható a LOIS biofouling-gátló tulajdonságainak stabilitása in vitro után (4D. ábra).Az optikai képek sorozata mutatja az egyes szubsztrátumok furatai közelében bekövetkezett sérüléseket.Vér tapadási tesztet végeztek a mechanikai károsodás hatásának kimutatására a biofouling bevonaton (4E. ábra).Az SHP-hez hasonlóan a lerakódásgátló tulajdonságok elvesznek a sérülés miatt, és a LOIS kiváló lerakódásgátló tulajdonságokkal rendelkezik, mivel taszítja a vért.Ennek az az oka, hogy mivel a felületi energiát a sérült területet lefedő kapilláris hatás hajtja, a mikrostrukturált kenőanyagban lévő áramlás visszaállítja a lerakódásgátló tulajdonságokat (35).Ugyanez a tendencia volt megfigyelhető az albuminnal végzett fehérjeadhéziós tesztben is.A sérült területen széles körben megfigyelhető a fehérje megtapadása az SHP felületén, melynek területi lefedettségét mérve a csupasz szubsztrát tapadási szintjének feleként számszerűsíthető.Másrészt a LOIS megőrizte biolerakódás-gátló tulajdonságait anélkül, hogy adhéziót okozott volna (4. ábra, F és G).Emellett a csavar felülete gyakran erős mechanikai igénybevételnek van kitéve, mint például fúrás, ezért vizsgáltuk a LOIS bevonat azon képességét, hogy épségben maradjon a csavaron in vitro.A 4H ábra különböző csavarok optikai képét mutatja, beleértve a csupasz, SHP és LOIS csavarokat.A piros téglalap azt a célterületet jelöli, ahol erős mechanikai igénybevétel lép fel a csontbeültetés során.A lemez fehérje adhéziós tesztjéhez hasonlóan fluoreszcens mikroszkóppal is leképezzük a fehérje adhézióját, és mérjük a lefedett területet, hogy igazoljuk a LOIS bevonat integritását, még erős mechanikai igénybevétel esetén is (4. ábra, I és J).A LOIS-kezelt csavarok kiváló lerakódásgátló teljesítményt mutatnak, és szinte semmilyen fehérje nem tapad a felülethez.Másrészt fehérje adhéziót figyeltek meg a csupasz csavaroknál és SHP csavaroknál, ahol az SHP csavarok területlefedettsége a csupasz csavaroké egyharmada volt.Ezenkívül a rögzítéshez használt ortopéd implantátumnak mechanikailag erősnek kell lennie ahhoz, hogy ellenálljon a törés helyére ható igénybevételnek, ahogy az a 4K ábrán látható.Ezért hajlítási tesztet végeztek a kémiai módosítás mechanikai tulajdonságokra gyakorolt ​​hatásának meghatározására.Ezenkívül ez azért történik, hogy fenntartsák az implantátum fix feszültségét.Alkalmazzon függőleges mechanikai erőt, amíg az implantátum teljesen be nem hajtódik, és feszültség-nyúlás görbét nem kap (4L, 1. ábra).Két tulajdonságot, köztük a Young-modulust és a hajlítószilárdságot hasonlítottuk össze a csupasz és a LOIS szubsztrátumok között a mechanikai szilárdság mutatójaként (4L, 2. és 3. ábra).A Young-modulus azt jelzi, hogy az anyag mennyire képes ellenállni a mechanikai változásoknak.Az egyes hordozók Young-modulusa 41,48±1,01, illetve 40,06±0,96 GPa;a megfigyelt különbség körülbelül 3,4%.Ezenkívül a jelentések szerint a hajlítószilárdság, amely meghatározza az anyag szívósságát, 102,34±1,51 GPa a csupasz aljzat és 96,99±0,86 GPa az SHP esetében.A csupasz aljzat körülbelül 5,3%-kal magasabb.A mechanikai tulajdonságok enyhe csökkenését a bevágás hatás okozhatja.A bevágás hatásában a mikro/nano érdesség bevágások halmazaként működhet, ami helyi feszültségkoncentrációhoz vezethet, és befolyásolja az implantátum mechanikai tulajdonságait (46).Abból a tényből kiindulva azonban, hogy az emberi kéregcsont merevsége 7,4 és 31,6 GPa között van, és a mért LOIS-modulus meghaladja az emberi agykérgi csontét (47), a LOIS elegendő a törés alátámasztására és annak általános. a mechanikai tulajdonságokat minimálisan befolyásolja a felületmódosítás.
(A) sematikus diagram (1) az ortopédiai implantátumra a műtét során kifejtett mechanikai igénybevételről, és (2) a sérült ortopédiai implantátum optikai képe.(B) A nanomechanikai tulajdonságok mérésének sematikus diagramja nanobehúzással és LOIS-szel a csupasz felületen.(C) A csupasz felület és a LOIS nanobenyomódási erő-elmozdulás görbéje.(D) In ​​vitro kísérletek után szimulálja a különböző típusú ortopéd lemezek optikai képét (a sérült területet piros téglalap jelzi), hogy szimulálja a műtét során keletkező mechanikai igénybevételt.(E) Véradhéziós vizsgálat és (F) fehérje adhéziós teszt a sérült ortopéd lemezcsoporton.(G) Mérje meg a lemezhez tapadt fehérje területi lefedettségét.(H) Különböző típusú ortopéd csavarok optikai felvételei az in vitro kísérlet után.(I) Fehérje adhéziós teszt a különböző bevonatok integritásának vizsgálatára.(J) Mérje meg a csavarhoz tapadt fehérje területi lefedettségét.(K) A nyúl mozgásának célja, hogy rögzített feszültséget hozzon létre a törött csonton.(L) (1) Hajlítási tesztek eredményei és optikai képek hajlítás előtt és után.A (2) Young-modulus és (3) a hajlítószilárdság különbsége a csupasz implantátum és az SHP között.Az adatokat átlag ± SD-ben fejeztük ki (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 és ****P<0,0001).A kép jóvoltából: Kyomin Chae, Yonsei Egyetem.
Klinikai helyzetekben a legtöbb bakteriális érintkezés biológiai anyagokkal és sebhelyekkel érett, érett biofilmekből származik (48).Ezért az Egyesült Államok Betegségellenőrzési és Megelőzési Központja becslése szerint az összes emberi fertőzés 65%-a biofilmekkel kapcsolatos (49).Ebben az esetben olyan in vivo kísérleti tervet kell biztosítani, amely egyenletes biofilm képződést biztosít az implantátum felületén.Ezért kifejlesztettünk egy nyúl combcsonttörési modellt, amelyben ortopéd implantátumokat előinkubáltunk bakteriális szuszpenzióban, majd nyúl combcsontjába ültettük be, hogy in vivo tanulmányozzuk a LOIS lerakódásgátló tulajdonságait.A következő három fontos tény miatt a bakteriális fertőzéseket előtenyésztés váltja ki, nem pedig a baktériumszuszpenziók közvetlen injektálása: (i) A nyulak immunrendszere természetesen erősebb, mint az embereké;ezért baktériumszuszpenziók és planktonbaktériumok injektálása lehetséges A biofilmek képződésére nincs hatással.(Ii) A planktonbaktériumok érzékenyebbek az antibiotikumokra, és az antibiotikumokat általában műtét után alkalmazzák;végül (iii) a planktonbaktérium-szuszpenziót hígíthatjuk az állat testnedveivel (50).Az implantátum beültetés előtti bakteriális szuszpenzióban történő előtenyésztésével alaposan tanulmányozhatjuk a bakteriális fertőzés és az idegentest-reakció (FBR) csontgyógyulási folyamatra gyakorolt ​​káros hatásait.A nyulakat a beültetés után 4 héttel leöltük, mert a csontgyógyulási folyamathoz nélkülözhetetlen osseointegráció 4 héten belül befejeződik.Ezután az implantátumokat eltávolítottuk a nyulakról a downstream vizsgálatokhoz.Az 5A. ábra a baktériumok proliferációs mechanizmusát mutatja.A fertőzött ortopéd implantátumot bevezetik a szervezetbe.A bakteriális szuszpenzióban végzett előinkubálás eredményeként a csupasz implantátummal beültetett hat nyúl közül hat fertőződött meg, míg a LOIS-kezelt implantátumokkal beültetett nyulak egyike sem fertőződött meg.A bakteriális fertőzések három lépésben zajlanak, beleértve a növekedést, az érést és a diszperziót (51).Először a megtapadt baktériumok szaporodnak és szaporodnak a felszínen, majd a baktériumok biofilmet képeznek, amikor extracelluláris polimert (EPS), amiloidot és extracelluláris DNS-t választanak ki.A biofilm nemcsak az antibiotikumok bejutását akadályozza meg, hanem elősegíti az antibiotikumokat lebontó enzimek (például a β-laktamáz) felhalmozódását is (52).Végül a biofilm az érett baktériumokat a környező szövetekbe terjeszti.Ezért fertőzés lép fel.Ezen túlmenően, ha idegen test kerül a szervezetbe, az erős immunválaszt kiváltó fertőzés súlyos gyulladást, fájdalmat és csökkent immunitást okozhat.Az 5B. ábra az ortopéd implantátum behelyezése által okozott FBR áttekintést nyújt, nem pedig a bakteriális fertőzés által okozott immunválaszt.Az immunrendszer idegen testként ismeri fel a behelyezett implantátumot, majd a sejteket és a szöveteket reagálásra készteti, hogy bezárják az idegen testet (53).Az FBR korai időszakában az ortopédiai implantátumok felületén egy ellátó mátrix alakult ki, ami a fibrinogén adszorpcióját eredményezte.Az adszorbeált fibrinogén ekkor egy nagyon sűrű fibrin hálózatot képez, amely elősegíti a leukociták kötődését (54).A fibrinhálózat kialakulása után akut gyulladás lép fel a neutrofilek beszivárgása miatt.Ebben a lépésben számos citokin szabadul fel, mint például a tumor nekrózis faktor-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) és IL-β, és a monociták elkezdenek beszivárogni az implantációs helyre, és óriássejtekké differenciálódnak.Phage (41, 55, 56).Az FBR csökkentése mindig is kihívás volt, mert a túlzott FBR akut és krónikus gyulladást okozhat, amely végzetes szövődményekhez vezethet.A csupasz implantátumot és a LOIS-t körülvevő szövetekben a bakteriális fertőzések hatásának felmérésére hematoxilin és eozin (H&E) és Masson trikróm (MT) festést alkalmaztunk.A csupasz szubsztráttal beültetett nyulak esetében súlyos bakteriális fertőzések haladtak előre, és a H&E szövetlemezeken egyértelműen gyulladás okozta tályogok és nekrózisok mutatkoztak.Másrészt a rendkívül erős anti-biofouling felület LOIS gátolja a bakteriális adhéziót, így nem mutat fertőzésre utaló jeleket és csökkenti a gyulladást (5C. ábra).Az MT festés eredményei ugyanezt a tendenciát mutatták.Az MT-festés azonban ödémát is mutatott a LOIS-szal beültetett nyulakban, ami azt jelzi, hogy a gyógyulás hamarosan bekövetkezik (5D. ábra).Az immunválasz mértékének vizsgálata érdekében immunhisztokémiai (IHC) festést végeztünk az immunválaszhoz kapcsolódó TNF-α és IL-6 citokinek felhasználásával.Egy csupasz negatív implantátumot, amely nem volt kitéve a baktériumoknak, összehasonlítottak egy olyan LOIS-szal, amely baktériumoknak volt kitéve, de nem volt fertőzött, hogy tanulmányozzák a gyógyulási folyamatot bakteriális fertőzés hiányában.Az 5E. ábra egy TNF-α-t expresszáló IHC tárgylemez optikai képét mutatja.A barna terület az immunválaszt jelzi, jelezve, hogy a LOIS immunválasza kissé csökkent.Ezenkívül az IL-6 expressziója a LOIS-ban szignifikánsan kisebb volt, mint a steril csupasz negatív expressziója (5F. ábra).A citokin expresszióját a citokinnek megfelelő antitestfestődés területének mérésével határoztuk meg (5G. ábra).A negatív implantátumoknak kitett nyulakhoz képest a LOIS-szal beültetett nyulak expressziós szintje alacsonyabb volt, ami jelentős különbséget mutat.A citokin expresszió csökkenése azt jelzi, hogy a LOIS hosszú távú, stabil lerakódásgátló tulajdonságai nemcsak a bakteriális fertőzések gátlásával, hanem az FBR csökkenésével is összefüggenek, amit a szubsztráthoz tapadt makrofágok indukálnak (53, 57, 58).Ezért a LOIS immunelkerülő tulajdonságai miatt csökkent immunválasz megoldhatja a beültetés utáni mellékhatásokat, például a plasztikai műtétek utáni túlzott immunválaszt.
(A) A fertőzött ortopédiai implantátum felszínén a biofilm képződésének és terjedésének mechanizmusának sematikus diagramja.eDNS, extracelluláris DNS.(B) Az ortopédiai implantátum beültetése utáni immunválasz sematikus diagramja.(C) ortopédiai implantátumok környező szöveteinek H&E festése és (D) MT festése csupasz pozitív és LOIS esetén.Az immunrendszerrel kapcsolatos citokinek (E) TNF-α és (F) IL-6 IHC-je csupasz-negatív és LOIS-beültetett nyulak festett képei.(G) A citokin expresszió mennyiségi meghatározása területi lefedettség mérésével (** P <0,01).
A LOIS biokompatibilitását és a csontgyógyulási folyamatra gyakorolt ​​hatását in vivo vizsgálták diagnosztikus képalkotás [röntgen és mikro-számítógépes tomográfia (CT)] és osteoclast IHC segítségével.A 6A. ábra a csontgyógyulási folyamatot mutatja be, amely három különböző szakaszból áll: gyulladás, helyreállítás és remodelling.Törés esetén a gyulladásos sejtek és a fibroblasztok behatolnak a törött csontba, és elkezdenek benőni az érszövetbe.A javítási szakaszban a vaszkuláris szövet benövése a törés helyéhez közel terjed.Az érszövet tápanyagot biztosít az új csont kialakulásához, amelyet kallusznak neveznek.A csontgyógyulási folyamat utolsó szakasza a remodelling szakasz, amelyben az aktivált oszteoklasztok szintjének növelésével a kallusz mérete a normál csont méretére csökken (59).A törési hely háromdimenziós (3D) rekonstrukcióját mikro-CT-vizsgálatokkal végeztük, hogy megfigyeljük a kalluszképződés szintjében mutatkozó különbségeket az egyes csoportokban.Figyelje meg a combcsont keresztmetszetét, hogy megfigyelje a törött csontot körülvevő kallusz vastagságát (6. ábra, B és C).Röntgenfelvételeket is alkalmaztunk az összes csoport törési helyének hetente történő vizsgálatára, hogy megfigyeljük az egyes csoportokban a különböző csontregenerációs folyamatokat (S9 ábra).A kallusz és az érett csontok kék/zöld, illetve elefántcsont színnel láthatók.A legtöbb lágyszövetet egy előre beállított küszöbértékkel szűrik ki.Nude pozitív és SHP megerősítette, hogy kis mennyiségű kallusz képződött a törés helyén.Másrészt a LOIS exponált negatívját és a törés helyét vastag kallusz veszi körül.A mikro-CT felvételek kimutatták, hogy a kallusz kialakulását bakteriális fertőzés és fertőzéssel összefüggő gyulladás akadályozza.Ennek az az oka, hogy az immunrendszer a fertőzéssel összefüggő gyulladások által okozott szeptikus sérülések gyógyulását helyezi előtérbe, nem pedig a csontok felépülését (60).IHC és tartarát-rezisztens savfoszfatáz (TRAP) festést végeztünk az oszteoklasztaktivitás és a csontreszorpció megfigyelésére (6D. ábra) (61).Csak néhány aktivált, lilára festett oszteoklasztot találtak csupasz pozitív és SHP-ben.Másrészt sok aktivált oszteoklasztot figyeltek meg a LOIS csupasz pozitív és érett csontjai közelében.Ez a jelenség arra utal, hogy oszteoklasztok jelenlétében a törés helye körüli kallusz heves átalakulási folyamaton megy keresztül (62).Megmértük a kallusz csonttérfogatát és oszteoklaszt expressziós területét, hogy összehasonlítsuk a törés helye körüli kalluszképződés szintjét minden csoportban, hogy számszerűsítsük a mikro-CT-vizsgálatot és az IHC-eredményeket (6E, 1. és 2. ábra).Ahogy az várható volt, a csupasz negatívok és a kalluszképződés a LOIS-ban szignifikánsan magasabb volt, mint a többi csoportban, ami azt jelzi, hogy pozitív csontremodelláció történt (63).Az S10 ábra a műtéti hely optikai képe, a csavar közelében gyűjtött szövet MT festési eredménye, valamint a csavar-csont határfelületet kiemelő TRAP festési eredmény.A csupasz szubsztrátban erős kallusz és fibrózis képződés volt megfigyelhető, míg a LOIS-kezelt implantátum viszonylag tapadásmentes felületet mutatott.Hasonlóképpen, a csupasz negatívokhoz képest alacsonyabb fibrózist figyeltek meg a LOIS-szal beültetett nyulakban, amint azt a fehér nyilak jelzik.Ezenkívül a szilárd ödéma (kék nyíl) a LOIS immunelkerülő tulajdonságainak tulajdonítható, ezáltal csökkentve a súlyos gyulladást.Az implantátum körüli tapadásmentes felület és a fibrózis csökkenése azt sugallja, hogy az eltávolítási folyamat könnyebb, ami általában más törésekhez vagy gyulladásokhoz vezet.A csavar eltávolítása utáni csontgyógyulási folyamatot a csavar-csont határfelületen lévő oszteoklaszt aktivitás alapján értékelték.Mind a csupasz csont, mind a LOIS implantátum határfelülete hasonló mennyiségű oszteoklasztot szív fel a további csontgyógyulás érdekében, ami azt jelzi, hogy a LOIS bevonatnak nincs negatív hatása a csontgyógyulásra vagy az immunválaszra.Annak igazolására, hogy a LOIS-on végzett felületmódosítás nem zavarja a csontgyógyulási folyamatot, röntgenvizsgálatot alkalmaztunk a nyulak csontgyógyulásának összehasonlítására negatív ionokkal és 6 hetes LOIS implantációval (6F ábra).Az eredmények azt mutatták, hogy a nem fertőzött meztelen pozitív csoporthoz képest a LOIS ugyanolyan mértékű csontgyógyulást mutatott, és nem voltak nyilvánvaló törési jelek (folyamatos oszteolízis vonal) mindkét csoportban.
(A) A csonttörés utáni gyógyulási folyamat sematikus diagramja.(B) Az egyes felületi csoportok kalluszképződés mértékének különbsége és (C) a törési hely keresztmetszeti képe.(D) TRAP festés az oszteoklaszt aktivitás és a csontreszorpció megjelenítésére.A TRAP aktivitás alapján a kortikális csont külső kalluszának kialakulását kvantitatívan elemeztük (E) (1) mikro-CT és (2) oszteoklaszt aktivitással.(F) 6 héttel a beültetés után röntgenfelvételek a megvilágított negatív csonttöréséről (a piros szaggatott téglalappal kiemelve) és a LOIS-ról (a kék szaggatott téglalappal kiemelve).A statisztikai elemzést egytényezős varianciaanalízissel (ANOVA) végeztük.* P <0,05.** P <0,01.
Röviden, a LOIS új típusú antibakteriális fertőzési stratégiát és immunszökő bevonatot biztosít az ortopédiai implantátumokhoz.Az SHP funkcionalizálású hagyományos ortopédiai implantátumok rövid távú biofouling-gátló tulajdonságokkal rendelkeznek, de hosszú ideig nem tudják megőrizni tulajdonságaikat.A szubsztrátum szuperhidrofóbsága megfogja a légbuborékokat a baktériumok és a szubsztrát között, ezáltal légzsákokat képezve ezzel megelőzve a bakteriális fertőzést.A levegő diffúziója miatt azonban ezek a légzsákok könnyen eltávolíthatók.Másrészt a LOIS jól bebizonyította, hogy képes megelőzni a biofilmmel kapcsolatos fertőzéseket.Ezért a réteges mikro/nano szerkezeti felületbe injektált kenőanyag réteg kilökődésgátló tulajdonságainak köszönhetően megelőzhető a fertőzéssel összefüggő gyulladás.A LOIS gyártási feltételeinek optimalizálására különféle jellemzési módszereket alkalmaznak, beleértve a SEM, AFM, XPS és CA méréseket.Ezenkívül a LOIS alkalmazható az ortopédiai rögzítő berendezésekben általánosan használt különféle biológiai anyagokra is, mint például a PLGA, Ti, PE, POM és PPSU.Ezután a LOIS-t in vitro tesztelték, hogy igazolják a baktériumokkal és az immunválaszhoz kapcsolódó biológiai anyagokkal szembeni biofouling-ellenes tulajdonságait.Az eredmények azt mutatják, hogy a csupasz implantátumhoz képest kiváló antibakteriális és anti-biofouling hatással rendelkezik.Ráadásul a LOIS mechanikai szilárdságot mutat még mechanikai igénybevétel után is, ami a plasztikai sebészetben elkerülhetetlen.A mikro/nano szerkezet felületén lévő kenőanyag öngyógyító tulajdonságainak köszönhetően a LOIS sikeresen megőrizte biológiai szennyeződésgátló tulajdonságait.A LOIS biokompatibilitásának és antibakteriális tulajdonságainak in vivo tanulmányozása érdekében a LOIS-t nyúl combcsontjába ültettük be 4 hétig.A LOIS-szal beültetett nyulakban nem figyeltek meg bakteriális fertőzést.Ezen túlmenően, az IHC alkalmazása csökkentett szintű helyi immunválaszt mutatott, ami azt jelzi, hogy a LOIS nem gátolja a csontgyógyulási folyamatot.A LOIS kiváló antibakteriális és immunelkerülő tulajdonságokkal rendelkezik, és bizonyítottan hatékonyan megakadályozza a biofilm képződést ortopédiai műtétek előtt és alatt, különösen a csontszintézisnél.Nyúl csontvelői gyulladásos combcsonttörési modell alkalmazásával mélyrehatóan tanulmányozták a biofilmmel összefüggő fertőzések hatását az előinkubált implantátumok által kiváltott csontgyógyulási folyamatra.Jövőbeli tanulmányként új in vivo modellre van szükség a beültetés utáni lehetséges fertőzések tanulmányozására, hogy teljes mértékben megértsük és megelőzzük a biofilmmel kapcsolatos fertőzéseket a teljes gyógyulási folyamat során.Ezenkívül az oszteoindukció még mindig megoldatlan kihívás a LOIS-szal való integráció során.További kutatásokra van szükség az oszteoinduktív sejtek szelektív adhéziójának vagy a regeneratív gyógyászatnak a LOIS-szal való kombinálására a kihívás leküzdése érdekében.Összességében a LOIS egy ígéretes ortopédiai implantátumbevonat mechanikai robusztussággal és kiváló biofouling-gátló tulajdonságokkal, amely csökkentheti az SSI és az immunrendszer mellékhatásait.
Mossa a 15 mm x 15 mm x 1 mm méretű 304 SS szubsztrátot (Dong Kang M-Tech Co., Korea) acetonban, EtOH-ban és DI vízben 15 percig a szennyeződések eltávolítása érdekében.A felületen mikro/nanoszintű szerkezet kialakítása érdekében a megtisztított aljzatot 48-51%-os HF oldatba (DUKSAN Corp., Dél-Korea) 50°C-on merítjük.A maratási idő 0 és 60 perc között változik.Ezután a maratott szubsztrátumot ionmentesített vízzel megtisztítottuk, és 65%-os HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) oldatba helyeztük 50 °C-on 30 percre, hogy a felületén króm-oxid passzivációs réteg jöjjön létre.A passziválás után az aljzatot ionmentes vízzel mossuk és szárítjuk, így réteges szerkezetű szubsztrátumot kapunk.Ezután a szubsztrátot oxigénplazmának (100 W, 3 perc) tettük ki, és azonnal 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Németország) toluolos oldatába merítettük szobahőmérsékleten 12 órára.Ezután a POTS-szal bevont szubsztrátot EtOH-val megtisztítottuk, és 150 °C-on 2 órán át lágyítottuk, hogy sűrű POTS SAM-ot kapjunk.SAM bevonat után 20 μm/cm 2 töltési térfogatú perfluor-poliéter kenőanyag (Krytox 101; DuPont, USA) felvitelével síkosítóréteget alakítottunk ki az alapfelületen. Használat előtt a kenőanyagot 0,2 mikronos szűrőn szűrjük át.Távolítsa el a felesleges kenőanyagot úgy, hogy 45°-os szögben dönti 15 percig.Ugyanezt a gyártási eljárást alkalmazták a 304 SS-ből készült ortopédiai implantátumokhoz (zárólemez és kortikális rögzítőcsavar; Dong Kang M-Tech Co., Korea).Minden ortopédiai implantátumot úgy terveztek, hogy illeszkedjen a nyúl combcsontjának geometriájához.
A szubsztrátum és az ortopédiai implantátumok felszíni morfológiáját terepi emissziós SEM (Inspect F50, FEI, USA) és AFM (XE-100, Park Systems, Dél-Korea) segítségével vizsgáltuk.A felületi érdességet (Ra, Rq) úgy mérjük, hogy a 20 μm-es területet megszorozzuk 20 μm-rel (n=4).A felület kémiai összetételének elemzéséhez XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japán) rendszert használtunk, amely 100 μm2 foltméretű Al Kα röntgenforrással volt felszerelve.A folyékony CA és SA mérésére egy dinamikus képrögzítő kamerával felszerelt CA mérőrendszert (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Dél-Korea) használtak.Minden méréshez 6-10 μl cseppeket (ionmentesített víz, lóvér, EG, 30% etanol és HD) helyezünk a felületre a CA mérésére.Ha a szubsztrátum dőlésszöge 2°/s sebességgel növekszik (n = 4), akkor az SA mérhető, amikor a csepp leesik.
A Pseudomonas aeruginosa-t [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] és az MRSA-t (ATCC 25923) az ATCC-től (Manassas, Virginia, USA) vásároltuk, és a törzstenyészetet -80 °C-on tartottuk.Felhasználás előtt a fagyasztott tenyészetet tripszinnel felolvasztott szójabab lében (Komed, Korea) 37 °C-on 18 órán át inkubáltuk, majd kétszer átvittük, hogy aktiváljuk.Inkubálás után a tenyészetet 10 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk 10 percig 4 °C-on, és kétszer mostuk PBS (pH 7,3) oldattal.A centrifugált tenyészetet ezután véragar lemezeken (BAP) tenyésztjük.Az MRSA-t és a Pseudomonas aeruginosát egy éjszakán át készítettük, és Luria-Bertani táplevesben tenyésztettük.A Pseudomonas aeruginosa és az MRSA koncentrációját az oltóanyagban kvantitatívan a szuszpenzió CFU-jával határoztuk meg sorozathígításokban agaron.Ezután állítsa be a baktériumkoncentrációt 0,5 McFarland standardra, ami 108 CFU/ml-nek felel meg.Ezután hígítsa fel a működő baktériumszuszpenziót 100-szor 106 CFU/ml-re.Az antibakteriális adhéziós tulajdonságok tesztelésére a szubsztrátumot felhasználás előtt 121 °C-on 15 percig sterilizáltuk.A szubsztrátumot ezután 25 ml baktériumszuszpenzióba vittük át, és 37 °C-on, erőteljes rázás közben (200 fordulat/perc) 12 és 72 órán át inkubáltuk.Inkubálás után minden szubsztrátot eltávolítottunk az inkubátorból, és háromszor mostuk PBS-sel, hogy eltávolítsuk a felületen lebegő baktériumokat.A szubsztrátumon lévő biofilm megfigyelése érdekében a biofilmet metanollal rögzítettük, és 2 percig 1 ml krimidinnarancssárgával festettük.Ezt követően fluoreszcens mikroszkóppal (BX51TR, Olympus, Japán) készítettük el a képeket a megfestett biofilmről.A szubsztrátumon lévő biofilm mennyiségi meghatározásához a megtapadt sejteket gyöngyörvényes módszerrel választottuk el a szubsztráttól, amelyet a legmegfelelőbb módszernek tartottak a megtapadt baktériumok eltávolítására (n = 4).Steril csipesszel távolítsa el a szubsztrátumot a táptalajból, és ütögesse meg a lyuklemezt a felesleges folyadék eltávolításához.A lazán kötődő sejteket steril PBS-sel kétszeri mosással távolítottuk el.Az egyes szubsztrátumokat ezután egy steril kémcsőbe vittük át, amely 9 ml 0,1%-os protein ept sóoldatot (PSW) és 2 g 20-25 steril üveggyöngyöt (0,4-0,5 mm átmérőjű) tartalmazott.Ezután 3 percig vortexeljük, hogy a sejteket leválasszuk a mintáról.Vortexelés után a szuszpenziót 10-szeres sorozathígítással hígítottuk 0,1% PSW-vel, majd mindegyik hígításból 0,1 ml-t oltottunk be BAP-ra.24 órás 37 °C-on végzett inkubálás után a CFU-t manuálisan megszámoltuk.
A sejtekhez NIH/3T3 egér fibroblasztokat (CRL-1658; amerikai ATCC) és RAW 264.7 egér makrofágokat (TIB-71; amerikai ATCC) használtunk.Használja Dulbecco módosított Eagle táptalajt (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) egér fibroblasztok tenyésztéséhez, és egészítse ki 10% borjúszérummal (S103-01, Welgene) és 1% penicillin-sztreptomicinnel (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene). Használjon DMEM-et az egér makrofágok tenyésztéséhez, kiegészítve 10% borjúmagzati szérummal (S001-01, Welgene) és 1% PS-sel. Helyezze a szubsztrátot egy hatlyukú sejttenyésztő lemezre, és oltsa be a sejteket 105 sejt/cm2-rel. A sejteket egy éjszakán át 37 °C-on és 5% CO2-on inkubáltuk. A sejtfestéshez a sejteket 4% paraformaldehiddel fixáltuk 20 percig, majd 0,5% Triton X Incubate-ba helyeztük 5 percre -100 nM tetrametil-rodaminba 37°C-on 30 percig , fluoreszcein, fluoreszcein izotiocianát-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Németország) és humán plazma Az Alexa Fluor 488-zal konjugált fibrinogént (F13191, Invitrogen, USA) PBS-ben (10 mM, pH 7,4) oldottuk.Az albumin és a fibrinogén koncentrációja 1, illetve 150 μg/ml volt.Az aljzat után Mielőtt a fehérjeoldatba merítené, öblítse le őket PBS-sel a felület rehidratálásához.Ezután merítse az összes szubsztrátot egy hatlyukú lemezbe, amely tartalmazza a fehérjeoldatot, és inkubálja 37 °C-on 30 és 90 percig.Inkubálás után a szubsztrátot eltávolítottuk a fehérjeoldatból, háromszor óvatosan mostuk PBS-sel, és 4%-os paraformaldehiddel fixáltuk (n = 4 minden fehérjéhez).Kalcium esetében nátrium-kloridot (0,21 M) és kálium-foszfátot (3,77 mM) ionmentes vízben oldottunk.Az oldat pH-ját 2,0-ra állítottuk be 1 M hidroklorid oldat hozzáadásával.Ezután kalcium-kloridot (5,62 mM) oldunk az oldatban.1 M trisz(hidroxi-metil)-amino hozzáadásával a metán az oldat pH-ját 7,4-re állítja be.Merítse az összes szubsztrátumot egy hatlyukú lemezbe, amely 1,5-szeres kalcium-foszfát oldattal van megtöltve, és 30 perc elteltével távolítsa el az oldatból.A festéshez 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Keverjünk össze 100 ml ionmentesített vízzel.Ezután 10%-os ammónium-hidroxiddal állítsa be a pH-t 4-re. Festse a szubsztrátumot Alizarin Red oldattal 5 percig, majd rázza le a felesleges festéket, és itassa fel.A rázási folyamat után távolítsa el az aljzatot.Az anyagot dehidratáljuk, majd 5 percre acetonba merítjük, majd 5 percre aceton-xilol (1:1) oldatba merítjük, végül xilollal mossuk (n=4).Fluoreszcencia mikroszkóp (Axio Imager) × 10 és × 20 objektívekkel..A2m, Zeiss, Németország) minden hordozót leképez.Az ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) segítségével számszerűsítettük a biológiai anyagok adhéziós adatait négy különböző képalkotó terület minden csoportjában.Konvertálja az összes képet bináris képpé, rögzített küszöbértékekkel a szubsztrátum összehasonlításához.
Zeiss LSM 700 konfokális mikroszkópot használtunk a PBS-ben lévő kenőanyagréteg stabilitásának ellenőrzésére reflexiós módban.A fluor alapú SAM-bevonatú üvegmintát befecskendezett kenőréteggel PBS-oldatba merítettük, és orbitális rázógéppel (SHO-1D; Daihan Scientific, Dél-Korea) enyhe rázási körülmények között (120 ford./perc) teszteltük.Ezután vegye ki a mintát, és ellenőrizze a kenőanyag veszteségét a visszavert fény veszteségének mérésével.A reflexiós módban fluoreszcens képek készítéséhez a mintát 633 nm-es lézerrel exponáljuk, majd összegyűjtjük, mert a fény visszaverődik a mintáról.A mintákat 0, 30, 60 és 120 órás időközönként mértük.
A felületmódosítási folyamat ortopédiai implantátumok nanomechanikai tulajdonságaira gyakorolt ​​hatásának meghatározására egy háromoldali piramis alakú Berkovich gyémántcsúccsal felszerelt nanoindentert (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) alkalmaztunk a nanoindéndion mérésére.A csúcsterhelés 10 mN, a terület pedig 100μmx 100μm.Minden mérésnél a be- és kirakodási idő 10 s, a tartási idő benyomódási csúcsterhelés mellett 2 s.Végezzen méréseket öt különböző helyről, és vegye fel az átlagot.A terhelés alatti mechanikai szilárdsági teljesítmény értékelésére egy univerzális vizsgálógéppel (Instron 5966, Instron, USA) keresztirányú hárompontos hajlítási tesztet végeztünk.A hordozót állandó 10 N/s sebességgel, megnövelt terhelés mellett összenyomják.A Bluehill Universal szoftvert (n = 3) használtuk a hajlítási modulus és a maximális nyomófeszültség kiszámítására.
A műveleti folyamat és az ezzel kapcsolatos, a műtét során keletkezett mechanikai sérülések szimulálása érdekében a műveleti folyamatot in vitro végeztük.A combcsontokat a kivégzett új-zélandi fehér nyulakról gyűjtöttük össze.A combcsontot megtisztítottuk és 4%-os paraformaldehidben fixáltuk 1 hétig.Az állatkísérleti módszerben leírtak szerint a rögzített combcsontot sebészetileg operáltuk.A műtét után az ortopédiai implantátumot 10 másodpercre vérbe merítettük (lóvér, KISAN, Korea), hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a mechanikai sérülés után történt-e vér adhézió (n = 3).
Összesen 24 hím új-zélandi fehér nyulat (3,0-3,5 kg súlyú, átlagéletkor 6 hónap) véletlenszerűen négy csoportra osztottak: nude negatív, nude pozitív, SHP és LOIS.Az állatokkal végzett összes eljárást az intézményi állatgondozói és -használati bizottság etikai normái szerint hajtották végre (IACUC jóváhagyva, KOREA-2017-0159).Az ortopéd implantátum öt lyukkal (hossz 41 mm, szélesség 7 mm és vastagság 2 mm) és agykérgi rögzítőcsavarokból (hosszúság 12 mm, átmérő 2,7 mm) áll a törés rögzítéséhez.A csupasz negatív csoportban használt lemezek és csavarok kivételével minden lemezt és csavart MRSA szuszpenzióban (106 CFU/ml) inkubáltunk 12 órán át.A csupasz-negatív csoportot (n=6) csupasz felületű implantátumokkal kezeltük, baktériumszuszpenziónak kitéve, a fertőzés negatív kontrolljaként.A csupasz pozitív csoportot (n = 6) a fertőzés pozitív kontrolljaként baktériumoknak kitett csupasz felületű implantátummal kezeltük.Az SHP csoportot (n = 6) bakteriálisnak kitett SHP implantátumokkal kezeltük.Végül a LOIS csoportot bakteriálisnak kitett LOIS implantátumokkal kezeltük (n = 6).Minden állatot ketrecben tartanak, sok élelmet és vizet biztosítanak.A műtét előtt a nyulakat 12 órán át koplalták.Az állatokat xilazin intramuszkuláris injekciójával (5 mg/kg) és intravénás paclitaxel injekcióval (3 mg/kg) érzéstelenítettük az indukció céljából.Ezután 2% izofluránt és 50-70% orvosi oxigént (áramlási sebesség 2 l/perc) szállítson a légzőrendszeren keresztül az érzéstelenítés fenntartása érdekében.Az oldalsó combcsont közvetlen megközelítésével ültetik be.A szőrtelenítés és a bőr povidon-jódos fertőtlenítése után a bal középső combcsont külső oldalán kb. 6 cm hosszú bemetszést ejtettünk.A combcsontot fedő izmok közötti rés megnyitásával a combcsont teljesen szabaddá válik.Helyezze a lemezt a combcsont tengelye elé, és rögzítse négy csavarral.Rögzítés után fűrészlappal (1 mm vastag) mesterségesen hozzon létre törést a második és a negyedik furat közötti területen.A műtét végén a sebet fiziológiás sóoldattal mostuk és varratokkal lezártuk.Minden nyulat szubkután injekcióztunk enrofloxacinnal (5 mg/kg), amelyet egyharmadára sóoldattal hígítottunk.Minden állatnál (0, 7, 14, 21, 28 és 42 nap) a combcsontról műtét utáni röntgenfelvételt készítettek a csont osteotómiájának megerősítésére.Mély érzéstelenítés után az összes állatot intravénás KCl-dal (2 mmol/kg) leölték a 28. és a 42. napon.A végrehajtás után a combcsontot mikro-CT-vel szkennelték, hogy megfigyeljék és összehasonlítsák a csontgyógyulási folyamatot és az új csontképződést a négy csoport között.
A végrehajtás után összegyűjtöttük azokat a lágyrészeket, amelyek közvetlenül érintkeztek az ortopédiai implantátumokkal.A szövetet 10%-os semleges pufferolt formalinban fixáltuk egy éjszakán át, majd EtOH-ban dehidratáltuk.A dehidratált szövetet paraffinba ágyaztuk, és 40 μm vastagságban metszettek egy mikrotom segítségével (400CS; EXAKT, Németország).A fertőzés vizualizálása érdekében H&E festést és MT festést végeztünk.A gazdaválasz ellenőrzésére a metszett szövetet nyúl anti-TNF-α primer antitesttel (AB6671, Abcam, USA) és nyúl anti-IL-6-tal (AB6672; Abcam, USA) inkubáltuk, majd tormával kezeltük.Oxidáz.Vigye fel az avidin-biotin komplex (ABC) festőrendszert a metszetekre a gyártó utasításai szerint.Annak érdekében, hogy barna reakciótermékként jelenjen meg, minden részében 3,3-diaminobenzidint használtunk.Az összes szelet megjelenítéséhez digitális diaszkennert (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Magyarország) használtunk, és mindegyik csoportban legalább négy szubsztrátot elemeztünk ImageJ szoftverrel.
A műtét után és hetente minden állatról röntgenfelvételeket készítettünk a törések gyógyulásának nyomon követésére (n=6 csoportonként).A végrehajtás után nagy felbontású mikro-CT-vel számították ki a gyógyulás után a combcsont körüli kallusz képződését.A kapott combcsontot megtisztítottuk, 4%-os paraformaldehidben 3 napig fixáltuk, majd 75%-os etanolban dehidratáltuk.A kiszáradt csontokat ezután mikro-CT-vel (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgium) szkennelték, hogy 3D-s voxel-képeket (2240×2240 pixel) hozzunk létre a csontmintáról.Használjon 1,0 mm-es Al-szűrőt a jelzaj csökkentésére, és alkalmazzon nagy felbontást minden letapogatásra (E = 133 kVp, I = 60 μA, integrációs idő = 500 ms).Az Nrecon szoftvert (1.6.9.8-as verzió, Bruker microCT, Kontich, Belgium) használtuk a beolvasott minta 3D-s térfogatának előállításához a megszerzett 2D oldalvetítésből.Az elemzéshez a 3D rekonstruált képet 10 mm×10 mm×10 mm-es kockákra osztjuk a törés helyének megfelelően.Számítsa ki a kalluszokat a kéregcsonton kívül.A beolvasott csonttérfogat digitális átirányítására a DataViewer (1.5.1.2-es verzió; Bruker microCT, Kontich, Belgium) szoftvert, az elemzéshez pedig a CT-Analyzer (1.14.4.1-es verzió; Bruker microCT, Kontich, Belgium) szoftvert használtuk.Az érett csont és kallusz relatív röntgenabszorpciós együtthatóit sűrűségük alapján különböztetjük meg, majd a kallusz térfogatát számszerűsítjük (n = 4).Annak igazolására, hogy a LOIS biokompatibilitása nem késlelteti a csontgyógyulási folyamatot, további röntgen és mikro-CT analízist végeztünk két nyúlon: a csupasz-negatív és a LOIS csoportban.Mindkét csoportot a 6. héten kivégezték.
Az elpusztított állatok combcsontjait összegyűjtöttük, és 3 napig 4%-os paraformaldehidben rögzítettük.Ezután az ortopéd implantátumot óvatosan eltávolítják a combcsontból.A combcsontot 21 napig vízkőtelenítettük 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation) alkalmazásával.Ezután a vízkőmentesített combcsontot EtOH-ba merítettük, hogy kiszáradjon.A dehidratált combcsontot xilolban eltávolítottuk és paraffinba ágyaztuk.Ezután a mintát automata rotációs mikrotommal (Leica RM2255, Leica Biosystems, Németország) 3 μm vastagságban szeleteltük.A TRAP festéshez (F6760, Sigma-Aldrich, Németország) a metszett mintákat paraffinmentesítettük, rehidratáltuk és TRAP reagensben inkubáltuk 37 °C-on 1 órán át.A képeket diaszkennerrel (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Magyarország) vettük fel, és a festett terület területi lefedettségének mérésével számszerűsítettük.Minden kísérletben minden csoportban legalább négy szubsztrátot elemeztek ImageJ szoftverrel.
A statisztikai szignifikancia analízist GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA) segítségével végeztük.Páratlan t-próbát és egytényezős varianciaanalízist (ANOVA) alkalmaztunk az értékelő csoportok közötti különbségek tesztelésére.A szignifikancia szintje az ábrán a következőképpen látható: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 és ****P<0,0001;NS, nincs jelentős különbség.
A cikkhez kapcsolódó kiegészítő anyagokért lásd: http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Ez egy nyílt hozzáférésű cikk, amelyet a Creative Commons Nevezd meg! Nem kereskedelmi licenc feltételei szerint terjesztenek, és amely lehetővé teszi a felhasználást, terjesztést és reprodukálást bármilyen médiában, mindaddig, amíg a felhasználás nem kereskedelmi haszonszerzés céljából történik, és az a feltevés, hogy az eredeti a munka korrekt.Referencia.
Megjegyzés: Csak azért kérünk e-mail címet, hogy az oldalra ajánlott személy tudja, hogy szeretné látni az e-mailt, és hogy az e-mail nem spam.E-mail címeket nem rögzítünk.
Ez a kérdés annak tesztelésére szolgál, hogy Ön emberi látogató-e, és megakadályozza az automatikus spamküldést.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Az ortopédiai implantátumok antibakteriális és immunvédő bevonata csökkentheti a fertőzéseket és a fertőzések által okozott immunválaszokat.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Az ortopédiai implantátumok antibakteriális és immunvédő bevonata csökkentheti a fertőzéseket és a fertőzések által okozott immunválaszokat.
©2021 American Association for the Advancement of Science.minden jog fenntartva.Az AAAS a HINARI, az AGORA, az OARE, a CHORUS, a CLOCKSS, a CrossRef és a COUNTER partnere.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.