Voor patiënten die orthopedische implantaatchirurgie ondergaan, zijn bacteriële infecties en door infecties geïnduceerde immuunreacties altijd levensbedreigende risico's geweest.Conventionele biologische materialen zijn gevoelig voor biologische besmetting, waardoor bacteriën het gewonde gebied binnendringen en postoperatieve infecties veroorzaken.Daarom is er een dringende behoefte aan de ontwikkeling van anti-infectie- en immuun-ontsnappingscoatings voor orthopedische implantaten.Hier hebben we een geavanceerde technologie voor oppervlaktemodificatie voor orthopedische implantaten ontwikkeld, genaamd Lubricated Orthopaedic Implant Surface (LOIS), die is geïnspireerd op het gladde oppervlak van bekerplantenbekers.LOIS heeft een langdurige en sterke vloeistofafstotendheid tegen een verscheidenheid aan vloeistoffen en biologische stoffen (waaronder cellen, eiwitten, calcium en bacteriën).Bovendien hebben we de mechanische duurzaamheid tegen krassen en fixatiekracht bevestigd door de onvermijdelijke schade tijdens de in-vitrochirurgie te simuleren.Het konijnenbeenmerg-inflammatoire femurfractuurmodel werd gebruikt om het antibiologische schilfering- en anti-infectievermogen van LOIS grondig te bestuderen.Wij voorzien dat LOIS, dat anti-biofouling-eigenschappen en mechanische duurzaamheid heeft, een stap voorwaarts is in infectievrije orthopedische chirurgie.
Tegenwoordig is, als gevolg van de algehele veroudering, het aantal patiënten dat lijdt aan orthopedische ziekten (zoals fracturen bij ouderen, degeneratieve gewrichtsziekten en osteoporose) sterk toegenomen (1, 2).Daarom hechten medische instellingen groot belang aan orthopedische chirurgie, inclusief orthopedische implantaten van schroeven, platen, spijkers en kunstmatige gewrichten (3, 4).Er is echter gerapporteerd dat traditionele orthopedische implantaten gevoelig zijn voor bacteriële adhesie en biofilmvorming, wat na de operatie een infectie van de operatieplaats (SSI) kan veroorzaken (5, 6).Zodra de biofilm zich op het oppervlak van het orthopedische implantaat heeft gevormd, wordt het verwijderen van de biofilm uiterst moeilijk, zelfs bij gebruik van grote doses antibiotica.Daarom leidt het meestal tot ernstige postoperatieve infecties (7, 8).Vanwege de bovengenoemde problemen moet de behandeling van geïnfecteerde implantaten een heroperatie omvatten, inclusief het verwijderen van alle implantaten en omliggende weefsels;daarom zal de patiënt ernstige pijn en enkele risico's lijden (9, 10).
Om enkele van deze problemen op te lossen zijn medicijn-eluerende orthopedische implantaten ontwikkeld om infectie te voorkomen door bacteriën die zich aan het oppervlak hechten te elimineren (11, 12).De strategie vertoont echter nog steeds verschillende beperkingen.Er is gerapporteerd dat langdurige implantatie van geneesmiddel-eluerende implantaten schade aan omliggende weefsels heeft veroorzaakt en ontstekingen heeft veroorzaakt, wat tot necrose kan leiden (13, 14).Bovendien vereisen de organische oplosmiddelen die kunnen voorkomen na het productieproces van medicijn-eluerende orthopedische implantaten, die ten strengste verboden zijn door de Amerikaanse Food and Drug Administration, aanvullende zuiveringsstappen om aan de normen te voldoen (15).Geneesmiddel-eluerende implantaten vormen een uitdaging voor de gecontroleerde afgifte van medicijnen, en vanwege hun beperkte medicijnlading is langdurige toepassing van het medicijn niet haalbaar (16).
Een andere veel voorkomende strategie is om het implantaat te coaten met een aangroeiwerend polymeer om te voorkomen dat biologisch materiaal en bacteriën zich aan het oppervlak hechten (17).Zwitterionische polymeren hebben bijvoorbeeld de aandacht getrokken vanwege hun niet-klevende eigenschappen bij contact met plasma-eiwitten, cellen en bacteriën.Het heeft echter enkele beperkingen die verband houden met de stabiliteit op lange termijn en mechanische duurzaamheid, die de praktische toepassing ervan in orthopedische implantaten belemmeren, vooral vanwege mechanisch schrapen tijdens chirurgische ingrepen (18, 19).Bovendien zijn, vanwege de hoge biocompatibiliteit, het ontbreken van een verwijderingsoperatie en de oppervlaktereinigende eigenschappen door corrosie, orthopedische implantaten gemaakt van biologisch afbreekbare materialen gebruikt (20, 21).Tijdens corrosie worden de chemische bindingen tussen de polymeermatrix afgebroken en losgemaakt van het oppervlak, en reinigen de aanhangers het oppervlak.Anti-biologische vervuiling door oppervlaktereiniging is echter in korte tijd effectief.Bovendien zullen de meeste absorbeerbare materialen, waaronder poly(melkzuur-glycolzuurcopolymeer) (PLGA), polymelkzuur (PLA) en legeringen op magnesiumbasis, ongelijkmatige biologische afbraak en erosie in het lichaam ondergaan, wat de mechanische stabiliteit negatief zal beïnvloeden.(tweeëntwintig).Bovendien bieden de biologisch afbreekbare plaatfragmenten een plek voor bacteriën om zich te hechten, wat de kans op infectie op de lange termijn vergroot.Dit risico op mechanische degradatie en infectie beperkt de praktische toepassing van plastische chirurgie (23).
Superhydrofobe (SHP) oppervlakken die de hiërarchische structuur van lotusbladeren nabootsen zijn een potentiële oplossing geworden voor aangroeiwerende oppervlakken (24, 25).Wanneer het SHP-oppervlak in vloeistof wordt ondergedompeld, worden luchtbellen opgevangen, waardoor luchtzakken worden gevormd en bacteriële hechting wordt voorkomen (26).Recente onderzoeken hebben echter aangetoond dat het SHP-oppervlak nadelen heeft met betrekking tot mechanische duurzaamheid en stabiliteit op lange termijn, wat de toepassing ervan in medische implantaten belemmert.Bovendien zullen de luchtzakken oplossen en hun aangroeiwerende eigenschappen verliezen, wat resulteert in een bredere bacteriële hechting vanwege het grote oppervlak van het SHP-oppervlak (27, 28).Onlangs introduceerden Aizenberg en collega's een innovatieve methode voor oppervlaktecoating tegen biofouling door een glad oppervlak te ontwikkelen, geïnspireerd op de Nepenthes-bekerplant (29, 30).Het gladde oppervlak vertoont langdurige stabiliteit onder hydraulische omstandigheden, is extreem vloeistofafstotend voor biologische vloeistoffen en heeft zelfherstellende eigenschappen.Er bestaat echter geen methode om een ​​coating aan te brengen op een medisch implantaat met een complexe vorm, en het is ook niet bewezen dat het het genezingsproces van beschadigd weefsel na implantatie ondersteunt.
Hier introduceren we een gesmeerd orthopedisch implantaatoppervlak (LOIS), een micro/nano-gestructureerd orthopedisch implantaatoppervlak en nauw gecombineerd met een dunne smeermiddellaag om te voorkomen dat dit geassocieerd wordt met plastische chirurgie. Bacteriële infecties, zoals fractuurfixatie.Omdat de met fluor gefunctionaliseerde structuur op micro-/nanoniveau het smeermiddel stevig op de structuur fixeert, kan de ontwikkelde LOIS de hechting van verschillende vloeistoffen volledig afstoten en de aangroeiwerende werking gedurende lange tijd behouden.LOIS-coatings kunnen worden aangebracht op materialen met verschillende vormen die bedoeld zijn voor botsynthese.De uitstekende anti-biofouling eigenschappen van LOIS tegen biofilmbacteriën [Pseudomonas aeruginosa en methicilline-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)] en biologische stoffen (cellen, eiwitten en calcium) zijn in vitro bevestigd.Het hechtingspercentage bij uitgebreide hechting aan het substraat bedraagt ​​minder dan 1%.Bovendien helpt het zelfherstel dat door het penetrerende smeermiddel wordt veroorzaakt, zelfs nadat mechanische belasting zoals krassen op het oppervlak optreedt, de aangroeiwerende eigenschappen ervan te behouden.De resultaten van de mechanische duurzaamheidstests laten zien dat zelfs na structurele en chemische modificatie de totale sterkte niet significant zal afnemen.Daarnaast werd een in vitro experiment uitgevoerd dat de mechanische spanningen in de chirurgische omgeving simuleert om te bewijzen dat LOIS bestand is tegen verschillende mechanische spanningen die optreden tijdens plastische chirurgie.Ten slotte hebben we een op konijnen gebaseerd in vivo femurfractuurmodel gebruikt, waaruit bleek dat LOIS superieure antibacteriële eigenschappen en biocompatibiliteit heeft.Radiologische en histologische resultaten bevestigden dat stabiel smeermiddelgedrag en anti-biofouling-eigenschappen binnen 4 weken na implantatie effectieve anti-infectie- en immuun-ontsnappingsprestaties kunnen bereiken zonder het botgenezingsproces te vertragen.
Figuur 1A toont een schematisch diagram van de ontwikkelde LOIS, die is geïmplanteerd met structuren op micro-/nanoschaal in het femurfractuurmodel van konijnen om de uitstekende anti-biologische vervuilings- en anti-infectie-eigenschappen te bevestigen.Er wordt een biomimetische methode uitgevoerd om het oppervlak van een waterpotplant te simuleren en om biofouling te voorkomen door een smeermiddellaag in de micro/nanostructuur van het oppervlak op te nemen.Het met smeermiddel geïnjecteerde oppervlak kan het contact tussen biologische stoffen en het oppervlak minimaliseren.Daarom heeft het, dankzij de vorming van stabiele chemische bindingen op het oppervlak, uitstekende aangroeiwerende eigenschappen en stabiliteit op lange termijn.Als gevolg hiervan maken de anti-biofouling-eigenschappen van het smeeroppervlak verschillende praktische toepassingen in biomedisch onderzoek mogelijk.Uitgebreid onderzoek naar de interactie van dit speciale oppervlak in het lichaam is echter nog niet afgerond.Door LOIS in vitro te vergelijken met naakte substraten met behulp van albumine- en biofilmbacteriën, kan de niet-kleefkracht van LOIS worden bevestigd (Figuur 1B).Door de waterdruppels op het hellende kale substraat en het LOIS-substraat (Figuur S1 en Film S1) af te rollen, kunnen bovendien de biologische verontreinigingsprestaties worden aangetoond.Zoals blijkt uit het fluorescentiemicroscoopbeeld vertoonde het blootgestelde substraat, geïncubeerd in een suspensie van eiwitten en bacteriën, een grote hoeveelheid biologisch materiaal dat aan het oppervlak hechtte.Door de uitstekende anti-biofouling eigenschappen vertoont LOIS echter nauwelijks fluorescentie.Om de anti-biofouling- en anti-infectie-eigenschappen te bevestigen, werd LOIS aangebracht op het oppervlak van orthopedische implantaten voor botsynthese (platen en schroeven) en in een konijnenfractuurmodel geplaatst.Vóór implantatie werden het naakte orthopedische implantaat en LOIS gedurende 12 uur in een bacteriële suspensie geïncubeerd.De pre-incubatie zorgt ervoor dat er ter vergelijking een biofilm wordt gevormd op het oppervlak van het blootgestelde implantaat.Figuur 1C toont een foto van de fractuurplaats 4 weken na implantatie.Links vertoonde een konijn met een kaal orthopedisch implantaat een ernstige mate van ontsteking als gevolg van de vorming van een biofilm op het oppervlak van het implantaat.Het tegenovergestelde resultaat werd waargenomen bij konijnen bij wie LOIS was geïmplanteerd, dat wil zeggen dat de omliggende weefsels van LOIS noch tekenen van infectie, noch tekenen van ontsteking vertoonden.Bovendien geeft het optische beeld aan de linkerkant de operatieplaats aan van het konijn met het blootliggende implantaat, wat aangeeft dat er geen meerdere kleefstoffen op het oppervlak van het blootliggende implantaat op het oppervlak van de LOIS zijn aangetroffen.Dit toont aan dat LOIS stabiliteit op lange termijn heeft en het vermogen heeft om zijn anti-biologische vervuilings- en anti-adhesie-eigenschappen te behouden.
(A) Schematisch diagram van LOIS en de implantatie ervan in een femurfractuurmodel van een konijn.(B) Fluorescentiemicroscopiebeeld van eiwit- en bacteriële biofilm op kaal oppervlak en LOIS-substraat.4 weken na implantatie, (C) een fotografisch beeld van de fractuurlocatie en (D) een röntgenfoto (gemarkeerd door een rode rechthoek).Met dank aan: Kyomin Chae, Yonsei Universiteit.
De gesteriliseerde, blootgestelde, negatief geïmplanteerde konijnen vertoonden een normaal botgenezingsproces zonder enige tekenen van ontsteking of infectie.Aan de andere kant vertonen SHP-implantaten die vooraf zijn geïncubeerd in een bacteriële suspensie infectiegerelateerde ontstekingen in de omliggende weefsels.Dit kan worden toegeschreven aan het onvermogen om bacteriële adhesie gedurende lange tijd te remmen (Figuur S2).Om te bewijzen dat LOIS het genezingsproces niet beïnvloedt, maar mogelijke infecties remt die verband houden met implantatie, werden röntgenbeelden van de blootgestelde positieve matrix en LOIS op de fractuurplaats vergeleken (Figuur 1D).Op de röntgenfoto van het kale positieve implantaat waren aanhoudende osteolyselijnen te zien, wat erop wees dat het bot niet volledig genezen was.Dit suggereert dat het botherstelproces aanzienlijk kan worden vertraagd als gevolg van infectiegerelateerde ontstekingen.Integendeel, het toonde aan dat de konijnen bij wie LOIS was geïmplanteerd, waren genezen en geen duidelijke breukplaats vertoonden.
Om medische implantaten te ontwikkelen met stabiliteit en functionaliteit op lange termijn (inclusief weerstand tegen biofouling), zijn er veel inspanningen geleverd.De aanwezigheid van verschillende biologische stoffen en de dynamiek van weefseladhesie beperken echter de ontwikkeling van hun klinisch betrouwbare methoden.Om deze tekortkomingen te ondervangen, hebben we een micro/nano-gelaagde structuur en een chemisch gemodificeerd oppervlak ontwikkeld, dat is geoptimaliseerd vanwege de hoge capillaire kracht en chemische affiniteit om het soepelste smeermiddel zo goed mogelijk te behouden.Figuur 2A toont het algehele productieproces van LOIS.Bereid eerst een substraat van roestvrij staal (SS) 304 van medische kwaliteit voor.Ten tweede wordt de micro-/nanostructuur op het SS-substraat gevormd door chemisch etsen met behulp van waterstoffluoride (HF)-oplossing.Om de corrosieweerstand van RVS te herstellen wordt een salpeterzuur (HNO3) oplossing (31) gebruikt om het geëtste substraat te bewerken.Passivering verbetert de corrosieweerstand van het SS-substraat en vertraagt ​​aanzienlijk het corrosieproces dat de algehele prestaties van LOIS kan verminderen.Vervolgens wordt het oppervlak, door een zelf-assemblerende monolaag (SAM) te vormen met 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyltriethoxysilaan (POTS), chemisch gemodificeerd om de chemische interactie tussen het oppervlak en de affiniteit van het gladde smeermiddel te verbeteren.De oppervlaktemodificatie vermindert de oppervlakte-energie van het gefabriceerde gestructureerde oppervlak op micro-/nanoschaal aanzienlijk, wat overeenkomt met de oppervlakte-energie van het gladde smeermiddel.Hierdoor kan het smeermiddel volledig worden bevochtigd, waardoor een stabiele smeermiddellaag op het oppervlak ontstaat.Het gemodificeerde oppervlak vertoont verbeterde hydrofobiciteit.De resultaten laten zien dat het gladde smeermiddel stabiel gedrag vertoont op LOIS vanwege de hoge chemische affiniteit en capillaire kracht veroorzaakt door de micro/nanostructuur (32, 33).De optische veranderingen op het oppervlak van SS na oppervlaktemodificatie en injectie van smeermiddel werden bestudeerd.De micro-/nanolaagstructuur die op het oppervlak wordt gevormd, kan visuele veranderingen veroorzaken en het oppervlak donkerder maken.Dit fenomeen wordt toegeschreven aan het verbeterde lichtverstrooiende effect op het ruwe oppervlak, waardoor de diffuse reflectie veroorzaakt door het lichtvangmechanisme (34) toeneemt.Bovendien wordt de LOIS donkerder nadat het smeermiddel is geïnjecteerd.De smeerlaag zorgt ervoor dat er minder licht door het substraat wordt gereflecteerd, waardoor de LOIS donkerder wordt.Om de microstructuur/nanostructuur te optimaliseren om de kleinste glijhoek (SA) weer te geven om anti-biofouling-prestaties te bereiken, werden scanning-elektronenmicroscopie (SEM) en atomaire paren gebruikt om verschillende HF-etstijden uit te voeren (0, 3)., 15 en 60 minuten) Force Microscoop (AFM) (Figuur 2B).SEM- en AFM-beelden laten zien dat na een korte etstijd (3 minuten etsen) het kale substraat een ongelijkmatige ruwheid op nanoschaal heeft gevormd.De oppervlakteruwheid verandert met de etstijd (Figuur S3).De tijdsvariërende curve laat zien dat de oppervlakteruwheid blijft toenemen en een piek bereikt na 15 minuten etsen, en dat vervolgens na 30 minuten etsen slechts een lichte afname van de ruwheidswaarde wordt waargenomen.Op dit punt wordt de ruwheid op nanoniveau weggeëtst, terwijl de ruwheid op microniveau zich krachtig ontwikkelt, waardoor de ruwheidsverandering stabieler wordt.Na ruim 30 minuten etsen wordt een verdere toename van de ruwheid waargenomen, die als volgt in detail wordt uitgelegd: SS is samengesteld uit staal, gelegeerd met elementen als ijzer, chroom, nikkel, molybdeen en vele andere elementen.Van deze elementen spelen ijzer, chroom en molybdeen een belangrijke rol bij het vormen van ruwheid op micron-/nanoschaal op de SS door HF-etsen.In de vroege stadia van corrosie worden ijzer en chroom voornamelijk gecorrodeerd omdat molybdeen een hogere corrosieweerstand heeft dan molybdeen.Naarmate het etsen vordert, bereikt de etsoplossing een lokale oververzadiging, waardoor fluoriden en oxiden worden gevormd die door het etsen worden veroorzaakt.Fluoride en oxide slaan neer en zetten zich uiteindelijk opnieuw af op het oppervlak, waardoor een oppervlakteruwheid in het micron/nano-bereik ontstaat (31).Deze ruwheid op micro-/nanoniveau speelt een belangrijke rol in de zelfherstellende eigenschappen van LOIS.Het oppervlak met dubbele schaal produceert een synergetisch effect, waardoor de capillaire kracht aanzienlijk toeneemt.Dit fenomeen zorgt ervoor dat het smeermiddel stabiel in het oppervlak kan doordringen en draagt ​​bij aan de zelfherstellende eigenschappen (35).De vorming van ruwheid is afhankelijk van de etstijd.Na 10 minuten etsen bevat het oppervlak slechts ruwheid op nanoschaal, wat niet genoeg is om voldoende smeermiddel vast te houden om bestand te zijn tegen biofouling (36).Aan de andere kant, als de etstijd langer duurt dan 30 minuten, zal de ruwheid op nanoschaal, gevormd door de herafzetting van ijzer en chroom, verdwijnen, en zal alleen de ruwheid op microschaal overblijven als gevolg van molybdeen.Het overgeëtste oppervlak mist ruwheid op nanoschaal en verliest het synergetische effect van tweetrapsruwheid, wat de zelfherstellende eigenschappen van LOIS negatief beïnvloedt.Er werden SA-metingen uitgevoerd op substraten met verschillende etstijden om de aangroeiwerende werking aan te tonen.Er werden verschillende soorten vloeistoffen geselecteerd op basis van viscositeit en oppervlakte-energie, waaronder gedeïoniseerd (DI) water, bloed, ethyleenglycol (EG), ethanol (EtOH) en hexadecaan (HD) (Figuur S4).Het tijdsvariërende etspatroon laat zien dat voor verschillende vloeistoffen met verschillende oppervlakte-energieën en viscositeiten de SA van LOIS na 15 minuten etsen het laagst is.Daarom is LOIS geoptimaliseerd om gedurende 15 minuten te etsen om ruwheid op micron- en nanoschaal te vormen, wat geschikt is voor het effectief behouden van de duurzaamheid van het smeermiddel en uitstekende aangroeiwerende eigenschappen.
(A) Schematisch diagram van het vierstapsproductieproces van LOIS.De inzet toont de SAM die op het substraat is gevormd.(B) SEM- en AFM-afbeeldingen, gebruikt om de micro/nanostructuur van het substraat onder verschillende etstijden te optimaliseren.Röntgenfoto-elektronenspectroscopie (XPS) spectra van (C) Cr2p en (D) F1s na oppervlaktepassivering en SAM-coating.au, willekeurige eenheid.(E) Representatieve afbeeldingen van waterdruppels op kale, geëtste, SHP- en LOIS-substraten.(F) De contacthoek (CA) en SA-meting van vloeistoffen met verschillende oppervlaktespanningen op SHP en LOIS.Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD.
Om de verandering in de chemische eigenschappen van het oppervlak te bevestigen, werd vervolgens röntgenfoto-elektronenspectroscopie (XPS) gebruikt om de verandering in de chemische samenstelling van het substraatoppervlak na elke oppervlaktecoating te bestuderen.Figuur 2C toont de XPS-meetresultaten van het met HF geëtste oppervlak en het met HNO3 behandelde oppervlak.De twee belangrijkste pieken bij 587,3 en 577,7 eV kunnen worden toegeschreven aan de Cr-O-binding die bestaat in de chroomoxidelaag, wat het belangrijkste verschil is met het met HF geëtste oppervlak.Dit komt vooral door het verbruik van ijzer en chroomfluoride aan het oppervlak door HNO3.Door het op HNO3 gebaseerde etsen kan chroom een ​​passiverende oxidelaag op het oppervlak vormen, waardoor het geëtste RVS weer bestand is tegen corrosie.In Figuur 2D werden XPS-spectra verkregen om te bevestigen dat op fluorkoolstof gebaseerd silaan werd gevormd op het oppervlak na de SAM-coating, die een extreem hoge vloeistofafstotendheid heeft, zelfs voor EG, bloed en EtOH.De SAM-coating wordt voltooid door functionele silaangroepen te laten reageren met hydroxylgroepen gevormd door plasmabehandeling.Als resultaat werd een significante toename van CF2- en CF3-pieken waargenomen.De bindingsenergie tussen 286 en 296 eV geeft aan dat de chemische modificatie met succes is voltooid door de SAM-coating.SHP vertoont relatief grote CF2 (290,1 eV) en CF3 (293,3 eV) pieken, die worden veroorzaakt door het op het oppervlak gevormde silaan op basis van fluorkoolstof.Figuur 2E toont representatieve optische beelden van contacthoekmetingen (CA) voor verschillende groepen gedeïoniseerd water in contact met kaal, geëtst, SHP en LOIS.Deze beelden laten zien dat het geëtste oppervlak hydrofiel wordt door de micro/nanostructuur gevormd door chemisch etsen, zodat gedeïoniseerd water in de structuur wordt geabsorbeerd.Wanneer het substraat echter wordt gecoat met SAM, vertoont het substraat een sterke waterafstotendheid, waardoor een oppervlakte-SHP wordt gevormd en het contactoppervlak tussen water en het oppervlak klein is.Ten slotte werd een afname van CA waargenomen in LOIS, wat kan worden toegeschreven aan de penetratie van smeermiddel in de microstructuur, waardoor het contactoppervlak groter wordt.Om te bewijzen dat het oppervlak uitstekende vloeistofafstotende en niet-klevende eigenschappen heeft, werd de LOIS vergeleken met het SHP-substraat door CA en SA te meten met behulp van verschillende vloeistoffen (Figuur 2F).Er werden verschillende soorten vloeistoffen geselecteerd op basis van viscositeit en oppervlakte-energie, waaronder gedeïoniseerd water, bloed, EG, EtOH en HD (Figuur S4).CA-meetresultaten laten zien dat wanneer CA neigt naar HD, de reductiewaarde van CA, waarbij CA de laagste oppervlakte-energie heeft.Bovendien is de LOIS van de totale CA laag.De SA-meting laat echter een heel ander fenomeen zien.Met uitzondering van het geïoniseerde water hechten alle vloeistoffen zich aan het SHP-substraat zonder eraf te glijden.Aan de andere kant laat LOIS een zeer lage SA zien, waarbij wanneer alle vloeistof wordt gekanteld onder een hoek kleiner dan 10° tot 15°, alle vloeistof eraf zal rollen.Dit toont sterk aan dat de niet-adhesie van LOIS beter is dan die van SHP-oppervlak.Daarnaast worden LOIS-coatings ook toegepast op verschillende soorten materialen, waaronder titanium (Ti), polyfenylsulfon (PPSU), polyoxymethyleen (POM), polyetheretherketon (PEEK) en bioabsorbeerbare polymeren (PLGA). Het zijn implanteerbare orthopedische materialen (figuur S5)).De opeenvolgende beelden van de druppels op het met LOIS behandelde materiaal laten zien dat de anti-biofouling-eigenschappen van LOIS op alle substraten hetzelfde zijn.Bovendien laten de meetresultaten van CA en SA zien dat de niet-klevende eigenschappen van LOIS op andere materialen kunnen worden toegepast.
Om de aangroeiwerende eigenschappen van LOIS te bevestigen, werden verschillende soorten substraten (waaronder kaal, geëtst, SHP en LOIS) geïncubeerd met Pseudomonas aeruginosa en MRSA.Deze twee bacteriën zijn geselecteerd als representatieve ziekenhuisbacteriën, wat kan leiden tot de vorming van biofilms, wat kan leiden tot POWI’s (37).Figuur 3 (A en B) toont de fluorescentiemicroscoopbeelden en de meetresultaten van de kolonievormende eenheid (CFU) van de substraten die respectievelijk op korte termijn (12 uur) en lange termijn (72 uur) in de bacteriesuspensie zijn geïncubeerd.In korte tijd zullen bacteriën clusters vormen en in omvang toenemen, zichzelf bedekken met slijmachtige stoffen en de verwijdering ervan verhinderen.Tijdens de 72 uur durende incubatie zullen de bacteriën echter volwassen worden en gemakkelijk verspreid worden om meer kolonies of clusters te vormen.Daarom kan worden aangenomen dat een incubatieperiode van 72 uur langdurig is en de juiste incubatietijd is om een ​​sterke biofilm op het oppervlak te vormen (38).In korte tijd vertoonden het geëtste oppervlak en het oppervlak van de SHP bacteriële adhesie, die met ongeveer 25% tot 50% was verminderd in vergelijking met het kale substraat.Vanwege de uitstekende anti-biofoulingprestaties en stabiliteit vertoonde LOIS echter geen adhesie van bacteriële biofilms op de korte en lange termijn.Het schematische diagram (Figuur 3C) beschrijft de uitleg van het antibiologische vervuilingsmechanisme van de etsoplossing, SHP en LOIS.De aanname is dat het geëtste substraat met hydrofiele eigenschappen een groter oppervlak zal hebben dan het kale substraat.Daarom zal er meer bacteriële adhesie optreden op het geëtste substraat.Vergeleken met het kale substraat heeft het geëtste substraat echter aanzienlijk minder biofilm gevormd op het oppervlak.Dit komt omdat watermoleculen zich stevig aan het hydrofiele oppervlak binden en als smeermiddel voor water werken, waardoor de hechting van bacteriën op korte termijn wordt verstoord (39).De laag watermoleculen is echter erg dun en oplosbaar in bacteriële suspensies.Daarom verdwijnt de watermoleculaire laag voor een lange tijd, wat leidt tot uitgebreide bacteriële adhesie en proliferatie.Bij SHP wordt de bacteriële adhesie geremd vanwege de niet-bevochtigende eigenschappen op korte termijn.De verminderde bacteriële adhesie kan worden toegeschreven aan luchtzakken die in de gelaagde structuur zijn opgesloten en een lagere oppervlakte-energie, waardoor het contact tussen de bacteriële suspensie en het oppervlak wordt geminimaliseerd.Er werd echter een uitgebreide bacteriële adhesie waargenomen in SHP omdat het zijn aangroeiwerende eigenschappen lange tijd verloor.Dit komt voornamelijk door het verdwijnen van luchtzakken als gevolg van hydrostatische druk en het oplossen van lucht in water.Dit komt voornamelijk door het verdwijnen van luchtzakken als gevolg van het oplossen en de gelaagde structuur die zorgt voor een groter oppervlak voor hechting (27, 40).In tegenstelling tot deze twee substraten, die een belangrijk effect hebben op de stabiliteit op lange termijn, wordt het smeermiddel in LOIS in de micro/nano-structuur geïnjecteerd en zal zelfs op de lange termijn niet verdwijnen.Smeermiddelen gevuld met micro-/nanostructuren zijn zeer stabiel en worden door hun hoge chemische affiniteit sterk door het oppervlak aangetrokken, waardoor bacteriële hechting langdurig wordt voorkomen.Figuur S6 toont een confocaal reflectiemicroscoopbeeld van een met smeermiddel doordrenkt substraat ondergedompeld in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).Continue beelden laten zien dat zelfs na 120 uur licht schudden (120 rpm) de smeermiddellaag op de LOIS onveranderd blijft, wat wijst op langdurige stabiliteit onder stromingsomstandigheden.Dit komt door de hoge chemische affiniteit tussen de op fluor gebaseerde SAM-coating en het op perfluorkoolstof gebaseerde smeermiddel, waardoor een stabiele smeermiddellaag kan worden gevormd.Daarom blijven de aangroeiwerende eigenschappen behouden.Bovendien werd het substraat getest tegen representatieve eiwitten (albumine en fibrinogeen), die zich in plasma bevinden, cellen die nauw verwant zijn aan de immuunfunctie (macrofagen en fibroblasten) en eiwitten die verband houden met botvorming.Het calciumgehalte is zeer hoog.(Figuur 3D, 1 en 2, en Figuur S7) (41, 42).Bovendien vertoonden de fluorescentiemicroscoopbeelden van de adhesietest voor fibrinogeen, albumine en calcium verschillende adhesiekarakteristieken van elke substraatgroep (Figuur S8).Tijdens de botvorming kunnen nieuw gevormde bot- en calciumlagen het orthopedische implantaat omringen, wat niet alleen de verwijdering bemoeilijkt, maar ook onverwachte schade aan de patiënt kan veroorzaken tijdens het verwijderingsproces.Daarom zijn lage niveaus van calciumafzettingen op botplaten en schroeven gunstig voor orthopedische chirurgie waarbij implantaatverwijdering vereist is.Op basis van de kwantificering van het aangehechte gebied op basis van de fluorescentie-intensiteit en het aantal cellen hebben we bevestigd dat LOIS uitstekende anti-biofouling-eigenschappen vertoont voor alle biologische stoffen in vergelijking met andere substraten.Volgens de resultaten van in vitro-experimenten kan de antibiologische vervuiling LOIS worden toegepast op orthopedische implantaten, die niet alleen infecties kunnen remmen die worden veroorzaakt door biofilmbacteriën, maar ook ontstekingen kunnen verminderen die worden veroorzaakt door het actieve immuunsysteem van het lichaam.
(A) Fluorescentiemicroscoopbeelden van elke groep (naakt, geëtst, SHP en LOIS) geïncubeerd in Pseudomonas aeruginosa en MRSA-suspensies gedurende 12 en 72 uur.(B) Het aantal aanhangende CFU van Pseudomonas aeruginosa en MRSA op het oppervlak van elke groep.(C) Schematisch diagram van het antibiologische vervuilingsmechanisme van etsen op korte en lange termijn, SHP en LOIS.(D) (1) Het aantal fibroblasten dat aan elk substraat is gehecht en fluorescentiemicroscoopbeelden van de cellen die aan de kale en LOIS zijn gehecht.(2) Adhesietest van immuungerelateerde eiwitten, albumine en calcium die betrokken zijn bij het botgenezingsproces (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 en **** P <0,0001).ns, niet belangrijk.
Bij onvermijdelijke geconcentreerde spanningen is mechanische duurzaamheid altijd de belangrijkste uitdaging geweest bij het aanbrengen van aangroeiwerende coatings.Traditionele anti-rioleringsgelmethoden zijn gebaseerd op polymeren met een lage wateroplosbaarheid en kwetsbaarheid.Daarom zijn ze meestal gevoelig voor mechanische belasting in biomedische toepassingen.Daarom blijven mechanisch duurzame aangroeiwerende coatings een uitdaging voor toepassingen zoals orthopedische implantaten (43, 44).Figuur 4A(1) toont de twee belangrijkste soorten spanning die worden uitgeoefend op orthopedische implantaten, waaronder krassen (schuifspanning) en compressie met het optische beeld van het beschadigde implantaat geproduceerd door de forceps.Wanneer de schroef bijvoorbeeld wordt vastgedraaid met een schroevendraaier, of wanneer de chirurg de botplaat stevig vasthoudt met een pincet en drukkracht uitoefent, wordt de plastic botplaat beschadigd en bekrast op zowel de macro- als de micro/nano-schaal (Figuur 4A, 2) .Om te testen of de vervaardigde LOIS deze schade tijdens plastische chirurgie kan weerstaan, werd nano-indentatie uitgevoerd om de hardheid van het kale substraat en de LOIS op micro/nano-schaal te vergelijken om de mechanische eigenschappen van de micro/nano-structuur Impact te bestuderen (figuur 4B).Het schematische diagram toont het verschillende vervormingsgedrag van LOIS als gevolg van de aanwezigheid van micro-/nanostructuren.Er werd een kracht-verplaatsingscurve getekend op basis van de resultaten van nano-indentatie (Figuur 4C).De blauwe afbeelding vertegenwoordigt het kale substraat, dat slechts een lichte vervorming vertoont, zoals blijkt uit de maximale inkepingsdiepte van 0,26 μm.Aan de andere kant kan de geleidelijke toename van de nano-indentatiekracht en verplaatsing waargenomen in LOIS (rode curve) tekenen vertonen van verminderde mechanische eigenschappen, resulterend in een nano-indentatiediepte van 1,61 μm.Dit komt omdat de micro-/nanostructuur die aanwezig is in de LOIS een diepere voortbewegingsruimte biedt voor de punt van de nano-indenter, zodat de vervorming ervan groter is dan die van het kale substraat.Konsta-Gdoutos et al.(45) is van mening dat door de aanwezigheid van nanostructuren nano-indentatie en micro/nano-ruwheid leiden tot onregelmatige nano-indentatiecurven.Het gearceerde gebied komt overeen met de onregelmatige vervormingscurve die wordt toegeschreven aan de nanostructuur, terwijl het niet-gearceerde gebied wordt toegeschreven aan de microstructuur.Deze vervorming kan de microstructuur/nanostructuur van het smeermiddel beschadigen en de aangroeiwerende werking negatief beïnvloeden.Om de impact van schade op LOIS te bestuderen, werd tijdens plastische chirurgie onvermijdelijke schade aan micro-/nanostructuren in het lichaam gerepliceerd.Door gebruik te maken van bloed- en eiwitadhesietests kan de stabiliteit van de anti-biofouling-eigenschappen van LOIS na in vitro worden bepaald (Figuur 4D).Een reeks optische beelden toont de schade die is opgetreden nabij de gaten van elk substraat.Er werd een bloedadhesietest uitgevoerd om het effect van mechanische schade op de anti-biofouling-coating aan te tonen (Figuur 4E).Net als SHP gaan de aangroeiwerende eigenschappen verloren als gevolg van beschadiging, en LOIS vertoont uitstekende aangroeiwerende eigenschappen door bloed af te stoten.Dit komt omdat, omdat de oppervlakte-energie wordt aangedreven door de capillaire werking die het beschadigde gebied bedekt, de stroming in het microgestructureerde smeermiddel de aangroeiwerende eigenschappen herstelt (35).Dezelfde trend werd waargenomen bij de eiwitadhesietest met albumine.In het beschadigde gebied wordt de hechting van eiwit op het oppervlak van SHP algemeen waargenomen, en door de oppervlaktedekking te meten, kan deze worden gekwantificeerd als de helft van het hechtingsniveau van het kale substraat.Aan de andere kant behield LOIS zijn anti-biofouling-eigenschappen zonder adhesie te veroorzaken (Figuur 4, F en G).Bovendien wordt het oppervlak van de schroef vaak onderworpen aan sterke mechanische spanningen, zoals boren. Daarom hebben we in vitro het vermogen van de LOIS-coating om op de schroef intact te blijven bestudeerd.Figuur 4H toont optische afbeeldingen van verschillende schroeven, waaronder kale, SHP en LOIS.De rode rechthoek vertegenwoordigt het doelgebied waar sterke mechanische spanning optreedt tijdens botimplantatie.Net als bij de eiwithechtingstest van de plaat wordt een fluorescentiemicroscoop gebruikt om de eiwithechting in beeld te brengen en het dekkingsgebied te meten om de integriteit van de LOIS-coating te bewijzen, zelfs onder sterke mechanische belasting (Figuur 4, I en J).De met LOIS behandelde schroeven vertonen uitstekende aangroeiwerende eigenschappen en er hecht vrijwel geen eiwit aan het oppervlak.Aan de andere kant werd eiwithechting waargenomen bij kale schroeven en SHP-schroeven, waarbij de oppervlaktedekking van SHP-schroeven een derde was van die van kale schroeven.Bovendien moet het orthopedische implantaat dat voor de fixatie wordt gebruikt mechanisch sterk zijn om de spanning te weerstaan ​​die op de fractuurplaats wordt uitgeoefend, zoals weergegeven in figuur 4K.Daarom werd een buigtest uitgevoerd om het effect van chemische modificatie op de mechanische eigenschappen te bepalen.Bovendien wordt dit gedaan om de vaste spanning van het implantaat te behouden.Oefen verticale mechanische kracht uit totdat het implantaat volledig is gevouwen en een spanning-rekcurve wordt verkregen (Figuur 4L, 1).Twee eigenschappen, waaronder Young's modulus en buigsterkte, werden vergeleken tussen kale en LOIS-substraten als indicatoren voor hun mechanische sterkte (Figuur 4L, 2 en 3).De Young-modulus geeft het vermogen van een materiaal aan om mechanische veranderingen te weerstaan.De Young-modulus van elk substraat is respectievelijk 41,48 ± 1,01 en 40,06 ± 0,96 GPa;het waargenomen verschil bedraagt ​​ongeveer 3,4%.Bovendien wordt gerapporteerd dat de buigsterkte, die de taaiheid van het materiaal bepaalt, 102,34 ± 1,51 GPa bedraagt ​​voor het kale substraat en 96,99 ± 0,86 GPa voor SHP.Het kale substraat ligt circa 5,3% hoger.De lichte afname van de mechanische eigenschappen kan worden veroorzaakt door het kerfeffect.Bij het kerfeffect kan de micro/nano-ruwheid fungeren als een reeks inkepingen, wat leidt tot lokale spanningsconcentratie en de mechanische eigenschappen van het implantaat beïnvloedt (46).Gebaseerd op het feit dat de stijfheid van menselijk corticaal bot naar verluidt tussen 7,4 en 31,6 GPa ligt, en de gemeten LOIS-modulus groter is dan die van menselijk corticaal bot (47), is de LOIS voldoende om de fractuur en de algehele breuk te ondersteunen. mechanische eigenschappen worden minimaal beïnvloed door oppervlaktemodificatie.
(A) Schematisch diagram van (1) de mechanische spanning die tijdens de operatie op het orthopedische implantaat wordt uitgeoefend, en (2) het optische beeld van het beschadigde orthopedische implantaat.(B) Schematisch diagram van het meten van nanomechanische eigenschappen door nano-indentatie en LOIS op het kale oppervlak.(C) Nano-indentatiekracht-verplaatsingscurve van kaal oppervlak en LOIS.(D) Simuleer na in vitro-experimenten de optische beelden van verschillende soorten orthopedische platen (het beschadigde gebied wordt gemarkeerd met een rode rechthoek) om de mechanische spanning te simuleren die tijdens de operatie wordt veroorzaakt.(E) Bloedadhesietest en (F) eiwitadhesietest van de beschadigde orthopedische plaatgroep.(G) Meet de oppervlaktedekking van het eiwit dat aan de plaat kleeft.(H) Optische beelden van verschillende soorten orthopedische schroeven na het in vitro-experiment.(I) Eiwithechtingstest om de integriteit van verschillende coatings te bestuderen.(J) Meet de oppervlaktedekking van het eiwit dat aan de schroef kleeft.(K) De beweging van het konijn is bedoeld om een ​​vaste spanning op het gebroken bot te genereren.(L) (1) Buigtestresultaten en optische beelden voor en na het buigen.Het verschil in (2) Young's modulus en (3) buigsterkte tussen kaal implantaat en SHP.Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en ****P<0,0001).Met dank aan: Kyomin Chae, Yonsei Universiteit.
In klinische situaties is het meeste bacteriële contact met biologische materialen en wondplaatsen afkomstig van volwassen, volwassen biofilms (48).Daarom schatten de Amerikaanse Centers for Disease Control and Prevention dat 65% van alle menselijke infecties verband houdt met biofilms (49).In dit geval is het noodzakelijk om een ​​in vivo experimenteel ontwerp te bieden dat zorgt voor consistente biofilmvorming op het oppervlak van het implantaat.Daarom hebben we een femurfractuurmodel bij konijnen ontwikkeld, waarbij orthopedische implantaten vooraf werden geïncubeerd in een bacteriële suspensie en vervolgens in de dijbenen van konijnen werden geïmplanteerd om de aangroeiwerende eigenschappen van LOIS in vivo te bestuderen.Vanwege de volgende drie belangrijke feiten worden bacteriële infecties veroorzaakt door voorkweek in plaats van door directe injectie van bacteriële suspensies: (i) Het immuunsysteem van konijnen is van nature sterker dan dat van mensen;daarom is injectie van bacteriële suspensies en planktonbacteriën mogelijk. Het heeft geen effect op de vorming van biofilms.(Ii) Planktonische bacteriën zijn gevoeliger voor antibiotica, en antibiotica worden meestal na een operatie gebruikt;ten slotte (iii) kan de planktonbacteriënsuspensie worden verdund met de lichaamsvloeistoffen van het dier (50).Door het implantaat vóór implantatie voor te kweken in een bacteriële suspensie, kunnen we de schadelijke effecten van bacteriële infecties en vreemd lichaamreacties (FBR) op het botgenezingsproces grondig bestuderen.De konijnen werden 4 weken na implantatie opgeofferd, omdat de osseo-integratie die essentieel is voor het botgenezingsproces binnen 4 weken voltooid zal zijn.Vervolgens werden de implantaten uit de konijnen verwijderd voor vervolgstudies.Figuur 5A toont het proliferatiemechanisme van bacteriën.Het geïnfecteerde orthopedische implantaat wordt in het lichaam ingebracht.Als resultaat van pre-incubatie in bacteriële suspensie werden zes van de zes konijnen bij wie naakte implantaten waren geïmplanteerd, geïnfecteerd, terwijl geen van de konijnen bij wie met LOIS behandelde implantaten waren geïmplanteerd, geïnfecteerd was.Bacteriële infecties verlopen in drie stappen, waaronder groei, rijping en verspreiding (51).Eerst reproduceren en groeien de aangehechte bacteriën op het oppervlak, en vervolgens vormen de bacteriën een biofilm wanneer ze extracellulair polymeer (EPS), amyloïde en extracellulair DNA uitscheiden.Biofilm interfereert niet alleen met de penetratie van antibiotica, maar bevordert ook de accumulatie van antibiotica-afbrekende enzymen (zoals β-lactamase) (52).Ten slotte verspreidt de biofilm de volwassen bacteriën naar de omliggende weefsels.Daarom vindt er infectie plaats.Wanneer een vreemd lichaam het lichaam binnendringt, kan een infectie die een sterke immuunreactie kan veroorzaken bovendien ernstige ontstekingen, pijn en verminderde immuniteit veroorzaken.Figuur 5B geeft een overzicht van de FBR veroorzaakt door het inbrengen van een orthopedisch implantaat, in plaats van de immuunrespons veroorzaakt door een bacteriële infectie.Het immuunsysteem herkent het ingebrachte implantaat als een vreemd lichaam en zorgt er vervolgens voor dat de cellen en weefsels reageren om het vreemde lichaam in te kapselen (53).In de begindagen van FBR werd een voedingsmatrix gevormd op het oppervlak van orthopedische implantaten, wat resulteerde in de adsorptie van fibrinogeen.Het geadsorbeerde fibrinogeen vormt vervolgens een zeer dicht fibrinenetwerk, dat de aanhechting van leukocyten bevordert (54).Zodra het fibrinenetwerk is gevormd, zal er een acute ontsteking optreden als gevolg van de infiltratie van neutrofielen.In deze stap wordt een verscheidenheid aan cytokinen vrijgegeven, zoals tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine-4 (IL-4) en IL-β, en beginnen monocyten de implantatieplaats te infiltreren en te differentiëren tot gigantische cellen.Faag (41, 55, 56).Het terugdringen van FBR is altijd een uitdaging geweest, omdat overmatige FBR acute en chronische ontstekingen kan veroorzaken, wat tot fatale complicaties kan leiden.Om de impact van bacteriële infecties in de weefsels rond het kale implantaat en LOIS te beoordelen, werden hematoxyline- en eosine (H&E) en Masson trichrome (MT) kleuring gebruikt.Bij konijnen bij wie kale substraten waren geïmplanteerd, namen ernstige bacteriële infecties toe, en H&E-weefselglaasjes vertoonden duidelijk abcessen en necrose veroorzaakt door ontstekingen.Aan de andere kant remt het extreem sterke anti-biofouling-oppervlak LOIS de bacteriële adhesie, zodat het geen tekenen van infectie vertoont en de ontsteking vermindert (Figuur 5C).De resultaten van MT-kleuring vertoonden dezelfde trend.MT-kleuring toonde echter ook oedeem aan bij konijnen waarbij LOIS was geïmplanteerd, wat aangeeft dat herstel op het punt staat op te treden (Figuur 5D).Om de mate van de immuunrespons te bestuderen, werd immunohistochemische (IHC) kleuring uitgevoerd met behulp van cytokines TNF-a en IL-6 gerelateerd aan de immuunrespons.Een naakt negatief implantaat dat niet aan bacteriën was blootgesteld, werd vergeleken met een LOIS dat aan bacteriën was blootgesteld maar niet was geïnfecteerd om het genezingsproces te bestuderen in afwezigheid van een bacteriële infectie.Figuur 5E toont een optisch beeld van een IHC-glaasje dat TNF-a tot expressie brengt.Het bruine gebied vertegenwoordigt de immuunrespons, wat aangeeft dat de immuunrespons in LOIS enigszins verminderd is.Bovendien was de expressie van IL-6 in LOIS aanzienlijk minder dan de negatieve expressie van steriel naakt (Figuur 5F).De expressie van cytokine werd gekwantificeerd door het meten van het gebied van antilichaamkleuring dat overeenkomt met het cytokine (Figuur 5G).Vergeleken met de konijnen die waren blootgesteld aan de negatieve implantaten, waren de expressieniveaus van de konijnen waarbij LOIS was geïmplanteerd lager, wat een betekenisvol verschil laat zien.De afname van de cytokine-expressie geeft aan dat de langdurige, stabiele aangroeiwerende eigenschappen van LOIS niet alleen verband houden met de remming van bacteriële infecties, maar ook met de afname van FBR, die wordt geïnduceerd door macrofagen die zich aan het substraat hechten (53, 57, 58).Daarom kan de verminderde immuunrespons als gevolg van de immuunontwijkende eigenschappen van LOIS de bijwerkingen na implantatie oplossen, zoals een overmatige immuunrespons na plastische chirurgie.
(A) Een schematisch diagram van het mechanisme van biofilmvorming en verspreiding op het oppervlak van een geïnfecteerd orthopedisch implantaat.eDNA, extracellulair DNA.(B) Schematisch diagram van de immuunrespons na het inbrengen van orthopedische implantaten.(C) H&E-kleuring en (D) MT-kleuring van de omliggende weefsels van orthopedische implantaten met kaal positief en LOIS.IHC van immuungerelateerde cytokinen (E) TNF-α en (F) IL-6 zijn gekleurde beelden van naakt-negatieve en LOIS-geïmplanteerde konijnen.(G) Kwantificering van cytokine-expressie door meting van de oppervlaktedekking (** P <0,01).
De biocompatibiliteit van LOIS en het effect ervan op het botgenezingsproces werden in vivo onderzocht met behulp van diagnostische beeldvorming [röntgenstraling en micro-computertomografie (CT)] en osteoclast IHC.Figuur 6A toont het botgenezingsproces dat drie verschillende stadia omvat: ontsteking, reparatie en hermodellering.Wanneer er een breuk optreedt, zullen ontstekingscellen en fibroblasten het gebroken bot binnendringen en in het vaatweefsel beginnen te groeien.Tijdens de herstelfase verspreidt de ingroei van vaatweefsel zich nabij de fractuurplaats.Vaatweefsel levert voedingsstoffen voor de vorming van nieuw bot, dat callus wordt genoemd.De laatste fase van het botgenezingsproces is de remodelleringsfase, waarin de grootte van de callus wordt teruggebracht tot de grootte van normaal bot met behulp van een toename van het niveau van geactiveerde osteoclasten (59).Driedimensionale (3D) reconstructie van de fractuurlocatie werd uitgevoerd met behulp van micro-CT-scans om de verschillen in het niveau van callusvorming in elke groep waar te nemen.Bekijk de dwarsdoorsnede van het dijbeen om de dikte van de callus rond het gebroken bot te observeren (Figuur 6, B en C).Er werden ook röntgenfoto's gebruikt om wekelijks de breukplaatsen van alle groepen te onderzoeken om de verschillende botregeneratieprocessen in elke groep te observeren (Figuur S9).Eelt en volwassen botten worden respectievelijk weergegeven in blauw/groen en ivoor.De meeste zachte weefsels worden eruit gefilterd met een vooraf ingestelde drempel.Naakt positief en SHP bevestigden de vorming van een kleine hoeveelheid callus rond de fractuurplaats.Aan de andere kant zijn het blootgestelde negatief van LOIS en de fractuurplaats omgeven door dik callus.Micro-CT-beelden lieten zien dat de vorming van callus werd gehinderd door bacteriële infecties en infectiegerelateerde ontstekingen.Dit komt omdat het immuunsysteem prioriteit geeft aan de genezing van septische verwondingen veroorzaakt door infectiegerelateerde ontstekingen, in plaats van aan botherstel (60).IHC en tartraat-resistente zure fosfatase (TRAP) kleuring werden uitgevoerd om osteoclastactiviteit en botresorptie waar te nemen (Figuur 6D) (61).Er werden slechts enkele geactiveerde, paars gekleurde osteoclasten gevonden in naakte positieven en SHP.Aan de andere kant werden veel geactiveerde osteoclasten waargenomen nabij de naakte positieve en volwassen botten van LOIS.Dit fenomeen geeft aan dat in de aanwezigheid van osteoclasten de callus rond de fractuurplaats een gewelddadig hermodelleringsproces ondergaat (62).Het botvolume en het osteoclastexpressiegebied van de callus werden gemeten om het niveau van callusvorming rond de fractuurplaats in alle groepen te vergelijken, om zo de micro-CT-scan en IHC-resultaten te kwantificeren (Figuur 6E, 1 en 2).Zoals verwacht waren de naakte negatieven en callusvorming bij LOIS significant hoger dan bij de andere groepen, wat aangeeft dat er positieve botremodellering plaatsvond (63).Figuur S10 toont het optische beeld van de operatieplaats, het MT-kleuringsresultaat van het weefsel dat nabij de schroef is verzameld, en het TRAP-kleuringsresultaat waarbij het grensvlak tussen de schroef en het bot wordt benadrukt.In het kale substraat werd sterke callus- en fibrosevorming waargenomen, terwijl het met LOIS behandelde implantaat een relatief niet-gehecht oppervlak vertoonde.Op vergelijkbare wijze werd, vergeleken met naakte negatieven, een lagere fibrose waargenomen bij konijnen bij wie LOIS was geïmplanteerd, zoals aangegeven door de witte pijlen.Bovendien kan het stevige oedeem (blauwe pijl) worden toegeschreven aan de immuunontwijkende eigenschappen van LOIS, waardoor ernstige ontstekingen worden verminderd.Het niet-klevende oppervlak rond het implantaat en de verminderde fibrose suggereren dat het verwijderingsproces gemakkelijker is, wat meestal resulteert in andere fracturen of ontstekingen.Het botgenezingsproces na het verwijderen van de schroef werd geëvalueerd aan de hand van de osteoclastactiviteit op het grensvlak van de schroef en het bot.Zowel het kale bot als het LOIS-implantaatinterface absorbeerden vergelijkbare hoeveelheden osteoclasten om de botgenezing te bevorderen, wat erop wijst dat de LOIS-coating geen negatief effect heeft op de botgenezing of de immuunrespons.Om te bevestigen dat de oppervlaktemodificatie uitgevoerd op de LOIS het botgenezingsproces niet verstoort, werd röntgenonderzoek gebruikt om de botgenezing van de konijnen te vergelijken met blootgestelde negatieve ionen en 6 weken LOIS-implantatie (Figuur 6F).De resultaten toonden aan dat LOIS in vergelijking met de niet-geïnfecteerde naaktpositieve groep dezelfde mate van botgenezing vertoonde en dat er in beide groepen geen duidelijke tekenen van fractuur waren (continue osteolyselijn).
(A) Schematisch diagram van het botgenezingsproces na een fractuur.(B) Het verschil in de mate van callusvorming van elke oppervlaktegroep en (C) het dwarsdoorsnedebeeld van de breukplaats.(D) TRAP-kleuring om osteoclastactiviteit en botresorptie te visualiseren.Op basis van TRAP-activiteit werd de vorming van externe callus van corticaal bot kwantitatief geanalyseerd door (E) (1) micro-CT en (2) osteoclastactiviteit.(F) 6 weken na implantatie, röntgenfoto's van het gebroken bot van het blootgestelde negatief (gemarkeerd door de rood gestippelde rechthoek) en LOIS (gemarkeerd door de blauw gestippelde rechthoek).Statistische analyse werd uitgevoerd door middel van eenwegsvariantieanalyse (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Kortom, LOIS biedt een nieuw type antibacteriële infectiestrategie en een immuun-ontsnappingscoating voor orthopedische implantaten.Conventionele orthopedische implantaten met SHP-functionalisatie vertonen anti-biofouling-eigenschappen op korte termijn, maar kunnen hun eigenschappen niet lang behouden.De superhydrofobiciteit van het substraat vangt luchtbellen op tussen de bacteriën en het substraat, waardoor luchtzakken worden gevormd, waardoor bacteriële infectie wordt voorkomen.Door de diffusie van lucht kunnen deze luchtzakken echter gemakkelijk worden verwijderd.Aan de andere kant heeft LOIS goed bewezen dat het biofilmgerelateerde infecties kan voorkomen.Vanwege de anti-afstotingseigenschappen van de smeermiddellaag die in het gelaagde micro-/nanostructuuroppervlak wordt geïnjecteerd, kan infectiegerelateerde ontsteking worden voorkomen.Er worden verschillende karakteriseringsmethoden gebruikt, waaronder SEM-, AFM-, XPS- en CA-metingen om de LOIS-productieomstandigheden te optimaliseren.Daarnaast kan LOIS ook worden toegepast op verschillende biologische materialen die veel worden gebruikt in orthopedische fixatieapparatuur, zoals PLGA, Ti, PE, POM en PPSU.Vervolgens werd LOIS in vitro getest om de anti-biofouling-eigenschappen tegen bacteriën en biologische stoffen die verband houden met de immuunrespons te bewijzen.De resultaten laten zien dat het uitstekende antibacteriële en anti-biofouling-effecten heeft in vergelijking met het kale implantaat.Bovendien vertoont LOIS mechanische sterkte, zelfs na het uitoefenen van mechanische belasting, wat onvermijdelijk is bij plastische chirurgie.Dankzij de zelfherstellende eigenschappen van het smeermiddel op het oppervlak van de micro/nanostructuur heeft LOIS met succes zijn antibiologische vervuilingseigenschappen behouden.Om de biocompatibiliteit en antibacteriële eigenschappen van LOIS in vivo te bestuderen, werd LOIS gedurende 4 weken in het dijbeen van een konijn geïmplanteerd.Er werd geen bacteriële infectie waargenomen bij konijnen bij wie LOIS was geïmplanteerd.Bovendien toonde het gebruik van IHC een verlaagd niveau van lokale immuunrespons aan, wat aangeeft dat LOIS het botgenezingsproces niet remt.LOIS vertoont uitstekende antibacteriële en immuunontwijkende eigenschappen en het is bewezen dat het effectief de vorming van biofilm voorkomt vóór en tijdens orthopedische chirurgie, vooral voor botsynthese.Door gebruik te maken van een inflammatoir femurfractuurmodel van konijnenbeenmerg werd het effect van biofilm-gerelateerde infecties op het botgenezingsproces geïnduceerd door voorgeïncubeerde implantaten diepgaand bestudeerd.Als toekomstig onderzoek is een nieuw in vivo model nodig om mogelijke infecties na implantatie te bestuderen om biofilmgerelateerde infecties tijdens het gehele genezingsproces volledig te begrijpen en te voorkomen.Bovendien is osteo-inductie nog steeds een onopgelost probleem bij de integratie met LOIS.Verder onderzoek is nodig om de selectieve adhesie van osteo-inductieve cellen of regeneratieve geneeskunde te combineren met LOIS om de uitdaging te overwinnen.Over het geheel genomen vertegenwoordigt LOIS een veelbelovende orthopedische implantaatcoating met mechanische robuustheid en uitstekende anti-biofouling-eigenschappen, die POWI's en immuunbijwerkingen kunnen verminderen.
Was het 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS-substraat (Dong Kang M-Tech Co., Korea) gedurende 15 minuten in aceton, EtOH en DI-water om verontreinigingen te verwijderen.Om een ​​structuur op micro-/nanoniveau op het oppervlak te vormen, wordt het gereinigde substraat ondergedompeld in een 48% tot 51% HF-oplossing (DUKSAN Corp., Zuid-Korea) bij 50°C.De etstijd varieert van 0 tot 60 minuten.Vervolgens werd het geëtste substraat gereinigd met gedeïoniseerd water en gedurende 30 minuten bij 50°C in een 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) oplossing geplaatst om een ​​chroomoxidepassiveringslaag op het oppervlak te vormen.Na passivering wordt het substraat gewassen met gedeïoniseerd water en gedroogd om een ​​substraat met een gelaagde structuur te verkrijgen.Vervolgens werd het substraat blootgesteld aan zuurstofplasma (100 W, 3 minuten) en onmiddellijk bij kamertemperatuur gedurende 12 uur ondergedompeld in een oplossing van 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Duitsland) in tolueen.Vervolgens werd het met POTS gecoate substraat gereinigd met EtOH en gedurende 2 uur uitgegloeid bij 150°C om een ​​dichte POTS SAM te verkrijgen.Na SAM-coating werd een smeermiddellaag op het substraat gevormd door het aanbrengen van een perfluorpolyether-smeermiddel (Krytox 101; DuPont, VS) met een laadvolume van 20 μm/cm2. Filtreer het smeermiddel vóór gebruik door een filter van 0,2 micron.Verwijder overtollig smeermiddel door het gedurende 15 minuten in een hoek van 45° te kantelen.Dezelfde fabricageprocedure werd gebruikt voor orthopedische implantaten gemaakt van 304 SS (borgplaat en corticale borgschroef; Dong Kang M-Tech Co., Korea).Alle orthopedische implantaten zijn ontworpen om te passen bij de geometrie van het konijnendijbeen.
De oppervlaktemorfologie van het substraat en orthopedische implantaten werd geïnspecteerd door veldemissie SEM (Inspect F50, FEI, VS) en AFM (XE-100, Park Systems, Zuid-Korea).De oppervlakteruwheid (Ra, Rq) wordt gemeten door de oppervlakte van 20 μm te vermenigvuldigen met 20 μm (n=4).Een XPS-systeem (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japan) uitgerust met een Al Ka-röntgenbron met een vlekgrootte van 100 μm2 werd gebruikt om de chemische samenstelling van het oppervlak te analyseren.Een CA-meetsysteem uitgerust met een dynamische camera voor beeldopname (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Zuid-Korea) werd gebruikt om vloeibare CA en SA te meten.Voor elke meting wordt 6 tot 10 μl druppels (gedeïoniseerd water, paardenbloed, EG, 30% ethanol en HD) op het oppervlak geplaatst om CA te meten.Wanneer de hellingshoek van het substraat toeneemt met een snelheid van 2°/s (n = 4), wordt de SA gemeten wanneer de druppel valt.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] en MRSA (ATCC 25923) werden gekocht bij ATCC (Manassas, Virginia, VS) en de voorraadcultuur werd op -80°C gehouden.Vóór gebruik werd de bevroren cultuur gedurende 18 uur bij 37°C geïncubeerd in met trypsine ontdooide sojabonenbouillon (Komed, Korea) en vervolgens tweemaal overgebracht om deze te activeren.Na incubatie werd de kweek gedurende 10 minuten bij 4°C bij 10.000 rpm gecentrifugeerd en tweemaal gewassen met een PBS-oplossing (pH 7,3).De gecentrifugeerde cultuur wordt vervolgens verder gekweekt op bloedagarplaten (BAP).MRSA en Pseudomonas aeruginosa werden overnacht bereid en gekweekt in Luria-Bertani-bouillon.De concentratie van Pseudomonas aeruginosa en MRSA in het inoculum werd kwantitatief bepaald door de CFU van de suspensie in seriële verdunningen op agar.Pas vervolgens de bacterieconcentratie aan op 0,5 McFarland-standaard, wat overeenkomt met 108 CFU/ml.Verdun vervolgens de werkende bacteriesuspensie 100 keer tot 106 CFU/ml.Om de antibacteriële hechtingseigenschappen te testen, werd het substraat vóór gebruik gedurende 15 minuten bij 121°C gesteriliseerd.Het substraat werd vervolgens overgebracht naar 25 ml bacteriesuspensie en gedurende 12 en 72 uur bij 37°C onder krachtig schudden (200 rpm) geïncubeerd.Na incubatie werd elk substraat uit de incubator verwijderd en driemaal gewassen met PBS om eventuele drijvende bacteriën op het oppervlak te verwijderen.Om de biofilm op het substraat waar te nemen, werd de biofilm gefixeerd met methanol en gedurende 2 minuten gekleurd met 1 ml crimidine-oranje.Vervolgens werd een fluorescentiemicroscoop (BX51TR, Olympus, Japan) gebruikt om foto's te maken van de gekleurde biofilm.Om de biofilm op het substraat te kwantificeren, werden de aangehechte cellen van het substraat gescheiden door de bead vortex-methode, die werd beschouwd als de meest geschikte methode om aangehechte bacteriën te verwijderen (n = 4).Verwijder met behulp van een steriele pincet het substraat uit het groeimedium en tik op de putplaat om overtollige vloeistof te verwijderen.Losjes gehechte cellen werden verwijderd door tweemaal te wassen met steriele PBS.Elk substraat werd vervolgens overgebracht naar een steriele reageerbuis die 9 ml 0,1% eiwit-ept-zoutoplossing (PSW) en 2 g 20 tot 25 steriele glaskralen (0,4 tot 0,5 mm in diameter) bevatte.Vervolgens werd het gedurende 3 minuten gewerveld om de cellen van het monster los te maken.Na vortexen werd de suspensie serieel 10-voudig verdund met 0,1% PSW, en vervolgens werd 0,1 ml van elke verdunning geënt op BAP.Na 24 uur incubatie bij 37°C werd de CFU handmatig geteld.
Voor de cellen werden muizenfibroblasten NIH/3T3 (CRL-1658; Amerikaanse ATCC) en muizenmacrofagen RAW 264.7 (TIB-71; Amerikaanse ATCC) gebruikt.Gebruik Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) om fibroblasten van muizen te kweken en aan te vullen met 10% kalfsserum (S103-01, Welgene) en 1% penicilline-streptomycine (PS; LS202-02, Welgene (Welgene Gebruik DMEM om muismacrofagen te kweken, aangevuld met 10% foetaal runderserum (S001-01, Welgene) en 1% PS. Plaats het substraat in een celkweekplaat met zes putjes en inoculeer de cellen met 105 cellen/cm2. De cellen werden overnacht bij 37°C en 5% CO2 geïncubeerd, de cellen werden gedurende 20 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gedurende 5 minuten in 0,5% Triton X geplaatst. Dompel het substraat onder in 50 nM tetramethylrhodamine bij 37°C gedurende 30 minuten. Gebruik na het incubatieproces het substraat met 4′,6-diamino-2-fenylindool (H -1200, Vector Laboratories, VK) VECTASHIELD-fixatiemedium (n = 4 per cel). , fluoresceïne, fluoresceïne-isothiocyanaat-albumine (A9771, Sigma-Aldrich, Duitsland) en menselijk plasma. Het Alexa Fluor 488-geconjugeerde fibrinogeen (F13191, Invitrogen, VS) werd opgelost in PBS (10 mM, pH 7,4).De concentraties albumine en fibrinogeen waren respectievelijk 1 en 150 μg/ml.Na het substraat Voordat u het in de eiwitoplossing dompelt, spoelt u het af met PBS om het oppervlak te rehydrateren.Dompel vervolgens alle substraten onder in een plaat met zes putjes die de eiwitoplossing bevat en incubeer bij 37°C gedurende 30 en 90 minuten.Na incubatie werd het substraat vervolgens uit de eiwitoplossing verwijderd, driemaal voorzichtig gewassen met PBS en gefixeerd met 4% paraformaldehyde (n = 4 voor elk eiwit).Voor calcium werden natriumchloride (0,21 M) en kaliumfosfaat (3,77 mM) opgelost in gedeïoniseerd water.De pH van de oplossing werd op 2,0 gebracht door toevoeging van een hydrochlorideoplossing (1M).Vervolgens werd calciumchloride (5,62 mM) in de oplossing opgelost.Door het toevoegen van 1M tris(hydroxymethyl)aminomethaan wordt de pH van de oplossing op 7,4 gebracht.Dompel alle substraten onder in een plaat met zes putjes gevuld met 1,5 x calciumfosfaatoplossing en verwijder ze na 30 minuten uit de oplossing.Voor kleuring: 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Mengen met 100 ml gedeïoniseerd water.Gebruik vervolgens 10% ammoniumhydroxide om de pH op 4 te brengen. Verf het substraat gedurende 5 minuten met Alizarin Red-oplossing, schud vervolgens de overtollige kleurstof af en dep het af.Na het schudproces verwijdert u het substraat.Het materiaal wordt gedehydrateerd, vervolgens gedurende 5 minuten ondergedompeld in aceton, vervolgens gedurende 5 minuten ondergedompeld in een aceton-xyleen (1:1) oplossing en tenslotte gewassen met xyleen (n = 4).Er wordt gebruik gemaakt van een fluorescentiemicroscoop (Axio Imager) met objectieflenzen van ×10 en ×20..A2m, Zeiss, Duitsland) belicht alle substraten.ImageJ/FIJI (//imagej.nih.gov/ij/) werd gebruikt om de adhesiegegevens van biologische stoffen op elke groep van vier verschillende beeldgebieden te kwantificeren.Converteer alle afbeeldingen naar binaire afbeeldingen met vaste drempels voor substraatvergelijking.
Een Zeiss LSM 700 confocale microscoop werd gebruikt om de stabiliteit van de smeermiddellaag in de PBS in reflectiemodus te controleren.Het op fluor gebaseerde SAM-gecoate glasmonster met een geïnjecteerde smeerlaag werd ondergedompeld in een PBS-oplossing en getest met behulp van een orbitale schudder (SHO-1D; Daihan Scientific, Zuid-Korea) onder milde schudomstandigheden (120 rpm).Neem vervolgens het monster en controleer het verlies aan smeermiddel door het verlies aan gereflecteerd licht te meten.Om fluorescentiebeelden in reflectiemodus te verkrijgen, wordt het monster blootgesteld aan een laser van 633 nm en vervolgens verzameld, omdat het licht door het monster wordt teruggekaatst.De monsters werden gemeten met tijdsintervallen van 0, 30, 60 en 120 uur.
Om de invloed van het oppervlaktemodificatieproces op de nanomechanische eigenschappen van orthopedische implantaten te bepalen, werd een nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, VS) uitgerust met een driezijdige piramidevormige Berkovich-diamantentip gebruikt om nanoindeendion te meten.De piekbelasting is 10 mN en het oppervlak is 100 μmx 100 μm.Voor alle metingen bedraagt ​​de laad- en lostijd 10 s, en de verblijftijd onder piekbelasting 2 s.Voer metingen uit op vijf verschillende locaties en neem het gemiddelde.Om de mechanische sterkteprestaties onder belasting te evalueren, werd een dwarse driepuntsbuigtest uitgevoerd met behulp van een universele testmachine (Instron 5966, Instron, VS).Het substraat wordt samengedrukt met een constante snelheid van 10 N/s bij verhoogde belasting.Het softwareprogramma Bluehill Universal (n = 3) werd gebruikt om de buigmodulus en de maximale drukspanning te berekenen.
Om het operatieproces en de daarmee samenhangende mechanische schade veroorzaakt tijdens de operatie te simuleren, werd het operatieproces in vitro uitgevoerd.De dijbenen werden verzameld van de geëxecuteerde witte konijnen uit Nieuw-Zeeland.Het dijbeen werd gereinigd en gedurende 1 week gefixeerd in 4% paraformaldehyde.Zoals beschreven in de dierproefmethode werd het vaste dijbeen operatief geopereerd.Na de operatie werd het orthopedische implantaat gedurende 10 seconden ondergedompeld in bloed (paardenbloed, KISAN, Korea) om te bevestigen of er bloedadhesies optraden nadat het mechanische letsel was aangebracht (n = 3).
In totaal werden 24 mannelijke witte Nieuw-Zeelandse konijnen (gewicht 3,0 tot 3,5 kg, gemiddelde leeftijd 6 maanden) willekeurig verdeeld in vier groepen: naakt negatief, naakt positief, SHP en LOIS.Alle procedures waarbij dieren betrokken waren, werden uitgevoerd in overeenstemming met de ethische normen van het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC goedgekeurd, KOREA-2017-0159).Het orthopedische implantaat bestaat uit een borgplaat met vijf gaten (lengte 41 mm, breedte 7 mm en dikte 2 mm) en corticale borgschroeven (lengte 12 mm, diameter 2,7 mm) voor fractuurfixatie.Met uitzondering van de platen en schroeven die in de kaal-negatieve groep werden gebruikt, werden alle platen en schroeven gedurende 12 uur in MRSA-suspensie (106 CFU/ml) geïncubeerd.De naakt-negatieve groep (n=6) werd behandeld met naakte oppervlakte-implantaten zonder blootstelling aan bacteriële suspensie, als negatieve controle op infectie.De kale positieve groep (n = 6) werd behandeld met een implantaat met een bloot oppervlak blootgesteld aan bacteriën als positieve controle op infectie.De SHP-groep (n = 6) werd behandeld met bacterieel blootgestelde SHP-implantaten.Ten slotte werd de LOIS-groep behandeld met aan bacteriën blootgestelde LOIS-implantaten (n = 6).Alle dieren worden in een kooi gehouden en er wordt gezorgd voor veel voedsel en water.Vóór de operatie lieten de konijnen 12 uur vasten.De dieren werden verdoofd door intramusculaire injectie van xylazine (5 mg/kg) en intraveneuze injectie van paclitaxel (3 mg/kg) voor inductie.Lever daarna 2% isofluraan en 50% tot 70% medische zuurstof (stroomsnelheid 2 l/min) via het ademhalingssysteem om de anesthesie te behouden.Het wordt geïmplanteerd via een directe benadering van het laterale femur.Na ontharing en desinfectie van de huid met povidonjood werd een incisie van ongeveer 6 cm lang gemaakt aan de buitenkant van het linker middendijbeen.Door de opening tussen de spieren die het dijbeen bedekken te openen, wordt het dijbeen volledig blootgelegd.Plaats de plaat voor de femurschacht en bevestig deze met vier schroeven.Gebruik na de fixatie een zaagblad (1 mm dik) om kunstmatig een breuk te creëren in het gebied tussen het tweede gat en het vierde gat.Aan het einde van de operatie werd de wond gewassen met een zoutoplossing en gesloten met hechtingen.Elk konijn werd subcutaan geïnjecteerd met enrofloxacine (5 mg/kg), voor een derde verdund in zoutoplossing.Bij alle dieren werden postoperatieve röntgenfoto's van het dijbeen gemaakt (0, 7, 14, 21, 28 en 42 dagen) om de osteotomie van het bot te bevestigen.Na diepe anesthesie werden alle dieren gedood door intraveneuze KCl (2 mmol/kg) op 28 en 42 dagen.Na de uitvoering werd het dijbeen gescand met micro-CT om het botgenezingsproces en de nieuwe botvorming tussen de vier groepen te observeren en te vergelijken.
Na de uitvoering werden de zachte weefsels verzameld die in direct contact stonden met de orthopedische implantaten.Het weefsel werd overnacht gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline en vervolgens gedehydrateerd in EtOH.Het gedehydrateerde weefsel werd ingebed in paraffine en in plakjes gesneden met een dikte van 40 μm met behulp van een microtoom (400CS; EXAKT, Duitsland).Om de infectie zichtbaar te maken, werden H&E-kleuring en MT-kleuring uitgevoerd.Om de respons van de gastheer te controleren, werd het uitgesneden weefsel geïncubeerd met primair antilichaam anti-TNF-a van konijn (AB6671, Abcam, VS) en anti-IL-6 van konijn (AB6672; Abcam, VS) en vervolgens behandeld met mierikswortel.Oxidase.Breng het kleuringssysteem avidine-biotinecomplex (ABC) aan op de secties volgens de instructies van de fabrikant.Om te verschijnen als een bruin reactieproduct werd in alle delen 3,3-diaminobenzidine gebruikt.Een digitale diascanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hongarije) werd gebruikt om alle plakjes te visualiseren, en ten minste vier substraten in elke groep werden geanalyseerd met ImageJ-software.
Er werden bij alle dieren na de operatie en elke week röntgenfoto's gemaakt om de genezing van de fracturen te volgen (n=6 per groep).Na de uitvoering werd micro-CT met hoge resolutie gebruikt om de vorming van callus rond het dijbeen na genezing te berekenen.Het verkregen dijbeen werd gereinigd, gedurende 3 dagen gefixeerd in 4% paraformaldehyde en gedehydrateerd in 75% ethanol.De gedehydrateerde botten werden vervolgens gescand met behulp van micro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, België) om 3D-voxelbeelden (2240 ​​x 2240 pixels) van het botmonster te genereren.Gebruik een Al-filter van 1,0 mm om signaalruis te verminderen en hoge resolutie toe te passen op alle scans (E = 133 kVp, I = 60 μA, integratietijd = 500 ms).Nrecon-software (versie 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, België) werd gebruikt om een ​​3D-volume van het gescande monster te genereren uit de verkregen 2D laterale projectie.Voor analyse wordt het 3D-gereconstrueerde beeld verdeeld in kubussen van 10 mm x 10 mm x 10 mm, afhankelijk van de breukplaats.Bereken de callus buiten het corticale bot.DataViewer (versie 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, België) software werd gebruikt om het gescande botvolume digitaal om te leiden, en CT-Analyzer (versie 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, België) software werd gebruikt voor analyse.De relatieve röntgenabsorptiecoëfficiënten in volwassen bot en callus onderscheiden zich door hun dichtheid, en vervolgens wordt het callusvolume gekwantificeerd (n = 4).Om te bevestigen dat de biocompatibiliteit van LOIS het botgenezingsproces niet vertraagt, werden aanvullende röntgen- en micro-CT-analyses uitgevoerd bij twee konijnen: de naakt-negatieve en LOIS-groepen.Beide groepen werden in de zesde week geëxecuteerd.
De dijbenen van geofferde dieren werden verzameld en gedurende 3 dagen gefixeerd in 4% paraformaldehyde.Vervolgens wordt het orthopedische implantaat voorzichtig uit het dijbeen verwijderd.Het dijbeen werd gedurende 21 dagen ontkalkt met behulp van 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Vervolgens werd het ontkalkte dijbeen ondergedompeld in EtOH om het uitgedroogd te maken.Het gedehydrateerde dijbeen werd verwijderd in xyleen en ingebed in paraffine.Vervolgens werd het monster in plakjes gesneden met een automatische roterende microtoom (Leica RM2255, Leica Biosystems, Duitsland) met een dikte van 3 μm.Voor TRAP-kleuring (F6760, Sigma-Aldrich, Duitsland) werden de in secties verdeelde monsters van paraffine ontdaan, gerehydrateerd en gedurende 1 uur bij 37°C in TRAP-reagens geïncubeerd.Beelden werden verkregen met behulp van een diascanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hongarije) en gekwantificeerd door de dekking van het bevlekte gebied te meten.In elk experiment werden ten minste vier substraten in elke groep geanalyseerd met ImageJ-software.
Statistische significantieanalyse werd uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., VS).Ongepaarde t-test en eenwegsvariantieanalyse (ANOVA) werden gebruikt om de verschillen tussen de evaluatiegroepen te testen.Het significantieniveau wordt in de figuur als volgt aangegeven: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 en ****P<0,0001;NS, geen significant verschil.
Voor aanvullende materialen bij dit artikel, zie http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Dit is een open access-artikel dat wordt verspreid onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, die het gebruik, de distributie en de reproductie op elk medium toestaat, zolang het gebruik niet voor commercieel gewin is en het uitgangspunt is dat het origineel werk klopt.Referentie.
Opmerking: we vragen u alleen om een ​​e-mailadres op te geven, zodat de persoon die u aanbeveelt op de pagina weet dat u wilt dat hij of zij de e-mail ziet en dat de e-mail geen spam is.Wij zullen geen e-mailadressen vastleggen.
Deze vraag wordt gebruikt om te testen of u een menselijke bezoeker bent en om automatische spam-inzendingen te voorkomen.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
De antibacteriële en immuun-ontsnappingscoatings van orthopedische implantaten kunnen infecties en immuunreacties veroorzaakt door infecties verminderen.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
De antibacteriële en immuun-ontsnappingscoatings van orthopedische implantaten kunnen infecties en immuunreacties veroorzaakt door infecties verminderen.
©2021 Amerikaanse Vereniging voor de Bevordering van de Wetenschap.alle rechten voorbehouden.AAAS is partner van HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef en COUNTER.Wetenschapsvooruitgang ISSN 2375-2548.