За пацијенте који су подвргнути операцији ортопедских имплантата, бактеријске инфекције и имуни одговори изазвани инфекцијом су увек били опасни по живот.Конвенционални биолошки материјали су подложни биолошкој контаминацији, што доводи до инвазије бактерија на повређено подручје и изазивања постоперативне инфекције.Због тога постоји хитна потреба за развојем анти-инфекцијских и заштитних премаза за ортопедске имплантате.Овде смо развили напредну технологију модификације површине за ортопедске имплантате под називом Лубрицатед Ортхопедиц Имплант Сурфаце (ЛОИС), која је инспирисана глатком површином врчева за биљке.ЛОИС има дуготрајну и јаку репелентност течности на разне течности и биолошке супстанце (укључујући ћелије, протеине, калцијум и бактерије).Поред тога, потврдили смо механичку отпорност на огреботине и силу причвршћивања симулирајући неизбежна оштећења током ин витро операције.Модел инфламаторног прелома бутне кости кунића је коришћен за темељно проучавање антибиолошке способности ЛОИС-а за скалирање и антиинфекцију.Замишљамо да је ЛОИС, који има својства против биообраштања и механичку издржљивост, корак напред у ортопедској хирургији без инфекција.
Данас, услед свеукупног старења, број пацијената који болују од ортопедских болести (као што су преломи старијих особа, дегенеративна обољења зглобова, остеопороза) је веома порастао (1, 2).Због тога медицинске установе придају велики значај ортопедској хирургији, укључујући ортопедске имплантате шрафова, плоча, ексера и вештачких зглобова (3, 4).Међутим, пријављено је да су традиционални ортопедски имплантати подложни бактеријској адхезији и формирању биофилма, што може изазвати инфекцију хируршког места (ССИ) након операције (5, 6).Када се биофилм формира на површини ортопедског имплантата, уклањање биофилма постаје изузетно тешко чак и уз употребу великих доза антибиотика.Стога обично доводи до тешких постоперативних инфекција (7, 8).Због наведених проблема, лечење инфицираних имплантата треба да обухвати поновну операцију, укључујући уклањање свих имплантата и околних ткива;стога ће пацијент трпети јак бол и неке ризике (9, 10).
Да би се решили неки од ових проблема, развијени су ортопедски имплантати који елуирају лекове да би спречили инфекцију елиминацијом бактерија причвршћених за површину (11, 12).Међутим, стратегија и даље показује неколико ограничења.Пријављено је да је дуготрајна имплантација имплантата који елуирају лек изазвала оштећење околних ткива и изазвала упалу, што може довести до некрозе (13, 14).Поред тога, органски растварачи који могу постојати након процеса производње ортопедских имплантата који елуирају лекове, а који су строго забрањени од стране америчке Управе за храну и лекове, захтевају додатне кораке пречишћавања да би се испунили њени стандарди (15).Имплантати који елуирају лек представљају изазов за контролисано ослобађање лекова, а због њиховог ограниченог пуњења леком, дуготрајна примена лека није изводљива (16).
Друга уобичајена стратегија је облагање имплантата полимером против обрастања како би се спречило приањање биолошких материја и бактерија на површину (17).На пример, цвитерјонски полимери су привукли пажњу због својих нелепљивих својстава када су у контакту са протеинима плазме, ћелијама и бактеријама.Међутим, има одређена ограничења везана за дугорочну стабилност и механичку издржљивост, која отежавају његову практичну примену у ортопедским имплантатима, посебно због механичког стругања током хируршких захвата (18, 19).Поред тога, због високе биокомпатибилности, недостатка потребе за операцијом уклањања и својстава површинског чишћења кроз корозију, коришћени су ортопедски имплантати од биоразградивих материјала (20, 21).Током корозије, хемијске везе између полимерне матрице се разбијају и одвајају од површине, а адхеренти чисте површину.Међутим, антибиолошко онечишћење површинским чишћењем је ефикасно у кратком временском периоду.Поред тога, већина материјала који се апсорбују, укључујући кополимер поли(млечне киселине и гликолне киселине) (ПЛГА), полимлечне киселине (ПЛА) и легуре на бази магнезијума, биће подвргнути неуједначеној биодеградацији и ерозији у телу, што ће негативно утицати на механичку стабилност.(двадесет два).Поред тога, биоразградиви фрагменти плоче обезбеђују место за причвршћивање бактерија, што повећава шансу за инфекцију на дужи рок.Овај ризик од механичке деградације и инфекције ограничава практичну примену пластичне хирургије (23).
Суперхидрофобне (СХП) површине које опонашају хијерархијску структуру листова лотоса постале су потенцијално решење за површине против обрастања (24, 25).Када је површина СХП-а уроњена у течност, мехурићи ваздуха ће бити заробљени, стварајући тако ваздушне џепове и спречавајући приањање бактерија (26).Међутим, недавне студије су показале да СХП површина има недостатке везане за механичку издржљивост и дуготрајну стабилност, што отежава њену примену у медицинским имплантатима.Штавише, ваздушни џепови ће се растворити и изгубити својства против обраштања, што ће довести до ширег приањања бактерија због велике површине површине СХП (27, 28).Недавно су Аизенберг и његове колеге представили иновативну методу површинског премаза против биообраштања развијањем глатке површине инспирисане биљком Непентхес (29, 30).Глатка површина показује дугорочну стабилност у хидрауличним условима, изузетно је течна отпорна на биолошке течности и има својства самопоправљања.Међутим, не постоји ни метода за наношење премаза на медицински имплантат сложеног облика, нити је доказано да подржава процес зарастања оштећеног ткива након имплантације.
Овде представљамо подмазану ортопедску површину имплантата (ЛОИС), микро/нано структурирану ортопедску површину имплантата и чврсто комбиновану са танким слојем мазива како бисмо спречили да буде повезана са пластичном хирургијом. Бактеријске инфекције, као што је фиксација прелома.Пошто структура на микро/нано нивоу функционализована флуором чврсто фиксира мазиво на структуру, развијени ЛОИС може у потпуности да одбије адхезију различитих течности и задржи перформансе против обрастања дуго времена.ЛОИС премази се могу применити на материјале различитих облика намењених за синтезу костију.Одлична својства ЛОИС против биообраштања против бактерија биофилма [Псеудомонас аеругиноса и Стапхилоцоццус ауреус (МРСА) отпорна на метицилин] и биолошких супстанци (ћелије, протеини и калцијум) потврђена су ин витро.Стопа адхезије екстензивне адхезије на подлогу је мања од 1%.Поред тога, чак и након механичког напрезања као што је површинско гребање, самозарастање изазвано продирањем мазива помаже у одржавању његових својстава против обраштања.Резултати испитивања механичке издржљивости показују да чак и након структурне и хемијске модификације, укупна чврстоћа неће бити значајно смањена.Поред тога, спроведен је ин витро експеримент који симулира механички стрес у хируршком окружењу како би се доказало да ЛОИС може да издржи различите механичке напрезања до којих долази током пластичне хирургије.Коначно, користили смо ин виво модел прелома бутне кости заснован на зечевима, који је доказао да ЛОИС има супериорна антибактеријска својства и биокомпатибилност.Радиолошки и хистолошки резултати су потврдили да стабилно понашање мазива и својства против биообраштања у року од 4 недеље након имплантације могу постићи ефикасну анти-инфекцију и учинак имунолошког бекства без одлагања процеса зарастања кости.
Слика 1А приказује шематски дијаграм развијеног ЛОИС-а, који је имплантиран са микро/нано структурама у модел прелома фемура зеца како би се потврдила његова одлична анти-биолошка својства обрастања и анти-инфекција.Биомиметички метод се спроводи да би се симулирала површина биљке у посуди за воду и да би се спречило биообраштање уградњом слоја мазива унутар микро/нано структуре површине.Површина убризгана мазивом може да минимизира контакт између биолошких супстанци и површине.Због тога, због формирања стабилних хемијских веза на површини, има одличне перформансе против обраштања и дугорочну стабилност.Као резултат, својства површине за подмазивање против биообраштања омогућавају различите практичне примене у биомедицинским истраживањима.Међутим, опсежна истраживања о томе како ова посебна површина интерагује у телу још нису завршена.Упоређивањем ЛОИС-а са голим супстратима ин витро коришћењем албумина и биофилмских бактерија, може се потврдити нелепљивост ЛОИС-а (слика 1Б).Поред тога, откотрљањем капљица воде на нагнутој голој подлози и ЛОИС супстрату (слика С1 и филм С1), може се демонстрирати учинак биолошке контаминације.Као што је приказано на слици флуоресцентног микроскопа, изложени супстрат инкубиран у суспензији протеина и бактерија показао је велику количину биолошког материјала који је приањао на површину.Међутим, због својих одличних својстава против биообраштања, ЛОИС једва да показује било какву флуоресценцију.Да би се потврдила његова анти-биофоулинг и антиинфекциона својства, ЛОИС је примењен на површину ортопедских имплантата за синтезу костију (плоче и шрафови) и постављен у модел фрактуре зеца.Пре имплантације, голи ортопедски имплантат и ЛОИС су инкубирани у бактеријској суспензији 12 сати.Претходна инкубација осигурава да се на површини изложеног имплантата формира биофилм ради поређења.Слика 1Ц приказује фотографију места прелома 4 недеље након имплантације.На левој страни, зец са голим ортопедским имплантом показао је јак ниво упале услед формирања биофилма на површини имплантата.Супротан резултат је примећен код зечева са имплантираним ЛОИС-ом, односно околна ткива ЛОИС-а нису показивала ни знаке инфекције ни знаке упале.Поред тога, оптичка слика са леве стране указује на хируршко место зеца са изложеним имплантом, што указује да на површини ЛОИС-а није пронађено више лепкова присутних на површини изложеног имплантата.Ово показује да ЛОИС има дугорочну стабилност и да има способност да одржи своја својства против биолошког зарастања и против адхезије.
(А) Шематски дијаграм ЛОИС-а и његова имплантација у модел прелома бутне кости зеца.(Б) Флуоресцентна микроскопска слика протеина и бактеријског биофилма на голој површини и ЛОИС супстрату.4 недеље након имплантације, (Ц) фотографска слика места прелома и (Д) рендгенска слика (истакнута црвеним правоугаоником).Слика љубазношћу: Киомин Цхае, Ионсеи Университи.
Стерилизовани, изложени негативно имплантирани зечеви су показали нормалан процес зарастања костију без икаквих знакова упале или инфекције.С друге стране, СХП имплантати претходно инкубирани у бактеријској суспензији показују запаљење повезано са инфекцијом на околним ткивима.Ово се може приписати његовој неспособности да инхибира адхезију бактерија на дуже време (слика С2).Да би се доказало да ЛОИС не утиче на процес зарастања, али инхибира могуће инфекције повезане са имплантацијом, упоређене су рендгенске слике експонираног позитивног матрикса и ЛОИС на месту прелома (Слика 1Д).Рендгенски снимак голог позитивног имплантата показао је упорне линије остеолизе, што указује да кост није потпуно зарасла.Ово сугерише да процес опоравка кости може бити знатно одложен због упале повезане са инфекцијом.Напротив, показало је да су зечеви имплантирани са ЛОИС-ом зарасли и да нису показали никакво очигледно место прелома.
Да би се развили медицински имплантати са дуготрајном стабилношћу и функционалношћу (укључујући отпорност на биообраштање), уложено је много напора.Међутим, присуство различитих биолошких супстанци и динамика адхезије ткива ограничава развој њихових клинички поузданих метода.Да бисмо превазишли ове недостатке, развили смо микро/нано слојевиту структуру и хемијски модификовану површину, која је оптимизована због велике капиларне силе и хемијског афинитета да задржи најглаткије мазиво у највећој мери.Слика 2А приказује укупан процес производње ЛОИС-а.Прво припремите подлогу од медицинског нерђајућег челика (СС) 304.Друго, микро/нано структура се формира на СС супстрату хемијским јеткањем помоћу раствора флуороводоничне киселине (ХФ).Да би се повратила отпорност на корозију СС, за обраду урезане подлоге користи се раствор азотне киселине (ХНО3) (31).Пасивација повећава отпорност на корозију СС подлоге и значајно успорава процес корозије што може смањити укупне перформансе ЛОИС-а.Затим, формирањем само-састављеног монослоја (САМ) са 1Х, 1Х, 2Х, 2Х-перфлуороктилтриетоксисиланом (ПОТС), површина се хемијски модификује да би се побољшала хемијска интеракција између површине и глатког мазива Аффинити.Модификација површине значајно смањује површинску енергију произведене микро/нано структуриране површине, која одговара површинској енергији глатког мазива.Ово омогућава да се мазиво потпуно навлажи, чиме се формира стабилан слој мазива на површини.Модификована површина показује повећану хидрофобност.Резултати показују да клизаво мазиво показује стабилно понашање на ЛОИС-у због високог хемијског афинитета и капиларне силе узроковане микро/нано структуром (32, 33).Проучаване су оптичке промене на површини СС након модификације површине и убризгавања мазива.Микро/нано слојевита структура формирана на површини може изазвати визуелне промене и потамнити површину.Овај феномен се приписује појачаном ефекту расипања светлости на храпавој површини, што повећава дифузну рефлексију изазвану механизмом за хватање светлости (34).Поред тога, након убризгавања мазива, ЛОИС постаје тамнији.Слој за подмазивање узрокује да се мање светлости рефлектује од подлоге, чиме се потамњује ЛОИС.Да би се оптимизовала микроструктура/наноструктура да би се показао најмањи угао клизања (СА) да би се постигле перформансе против биообраштања, коришћена је скенирајућа електронска микроскопија (СЕМ) и атомски парови за извођење различитих времена ХФ нагризања (0, 3)., 15 и 60 минута) Форце Мицросцопе (АФМ) (слика 2Б).СЕМ и АФМ слике показују да је након кратког времена јеткања (3 минута јеткања), гола подлога формирала неуједначену храпавост нано-скале.Храпавост површине се мења са временом нагризања (слика С3).Временски променљива крива показује да храпавост површине наставља да расте и достиже врхунац на 15 минута јеткања, а затим се примећује само благи пад вредности храпавости на 30 минута јеткања.У овом тренутку, храпавост нано нивоа је урезана, док се храпавост на микро нивоу снажно развија, чинећи промену храпавости стабилнијом.Након гравирања дуже од 30 минута, примећује се даље повећање храпавости, што је детаљно објашњено на следећи начин: СС се састоји од челика, легираног елементима укључујући гвожђе, хром, никл, молибден и многе друге елементе.Међу овим елементима, гвожђе, хром и молибден играју важну улогу у формирању храпавости микрона/нано скале на СС-у ХФ јеткањем.У раним фазама корозије, гвожђе и хром су углавном кородирани јер молибден има већу отпорност на корозију од молибдена.Како гравирање напредује, раствор за јеткање достиже локалну презасићеност, формирајући флуориде и оксиде изазване јеткањем.Флуорид и оксид се таложе и на крају поново таложе на површини, формирајући храпавост површине у микрон/нано опсегу (31).Ова храпавост на микро/нано нивоу игра важну улогу у својствима самоизлечења ЛОИС-а.Двострука површина производи синергистички ефекат, значајно повећавајући капиларну силу.Овај феномен омогућава мазиву да стабилно продре у површину и доприноси својствима самоизлечења (35).Формирање храпавости зависи од времена нагризања.За мање од 10 минута јеткања, површина садржи само храпавост на нано-скали, што није довољно да задржи довољно мазива да би имала отпорност на биообраштање (36).С друге стране, ако време нагризања прелази 30 минута, храпавост нано-скале настала поновним таложењем гвожђа и хрома ће нестати, а само храпавост на микро скали ће остати због молибдена.Превише нагризаној површини недостаје храпавост нано-скале и губи синергистички ефекат двостепене храпавости, што негативно утиче на карактеристике самозарастања ЛОИС-а.СА мерења су обављена на подлогама са различитим временима јеткања да би се доказале перформансе против зарастања.Различите врсте течности су одабране на основу вискозитета и површинске енергије, укључујући дејонизовану (ДИ) воду, крв, етилен гликол (ЕГ), етанол (ЕтОХ) и хексадекан (ХД) (Слика С4).Временски променљив образац јеткања показује да је за различите течности са различитим површинским енергијама и вискозитетима, СА ЛОИС након 15 минута јеткања најнижи.Због тога је ЛОИС оптимизован за нагризање у трајању од 15 минута да би се формирала храпавост микрона и нано-скале, што је погодно за ефикасно одржавање трајности мазива и одличних својстава против обрастања.
(А) Шематски дијаграм процеса производње ЛОИС-а у четири корака.Уметак приказује САМ формиран на подлози.(Б) СЕМ и АФМ слике, које се користе за оптимизацију микро/нано структуре супстрата под различитим временима јеткања.Спектри рендгенске фотоелектронске спектроскопије (КСПС) (Ц) Цр2п и (Д) Ф1с након површинске пасивације и САМ превлаке.ау, произвољна јединица.(Е) Репрезентативне слике капљица воде на голим, угравираним, СХП и ЛОИС подлогама.(Ф) Мерење контактног угла (ЦА) и СА течности са различитим површинским напонима на СХП и ЛОИС.Подаци су изражени као средња вредност ± СД.
Затим, да би се потврдила промена хемијских својстава површине, коришћена је рендгенска фотоелектронска спектроскопија (КСПС) за проучавање промене хемијског састава површине супстрата након сваког површинског премаза.Слика 2Ц приказује резултате КСПС мерења ХФ урезане површине и површине третиране ХНО 3 .Два главна пика на 587,3 и 577,7 еВ могу се приписати Цр-О вези која постоји у слоју хром-оксида, што је главна разлика у односу на ХФ урезану површину.Ово је углавном због потрошње гвожђа и хром-флуорида на површини од стране ХНО3.Јеткање на бази ХНО3 омогућава хрому да формира пасивизирајући слој оксида на површини, што чини угравирани СС поново отпорним на корозију.На слици 2Д, КСПС спектри су добијени како би се потврдило да је силан на бази флуороугљеника формиран на површини након САМ премаза, који има изузетно високу репелентност течности чак и за ЕГ, крв и ЕтОХ.САМ превлака је завршена реакцијом силанских функционалних група са хидроксил групама које настају третманом плазмом.Као резултат тога, примећено је значајно повећање ЦФ2 и ЦФ3 пикова.Енергија везивања између 286 и 296 еВ указује да је хемијска модификација успешно завршена од стране САМ премаза.СХП показује релативно велике ЦФ2 (290,1 еВ) и ЦФ3 (293,3 еВ) пикове, који су узроковани силаном на бази флуороугљеника који се формира на површини.Слика 2Е приказује репрезентативне оптичке слике мерења контактног угла (ЦА) за различите групе дејонизоване воде у контакту са голим, угравираним, СХП и ЛОИС.Ове слике показују да урезана површина постаје хидрофилна због микро/нано структуре формиране хемијским јеткањем тако да се дејонизована вода апсорбује у структуру.Међутим, када је подлога премазана САМ-ом, подлога показује јаку водоодбојност, тако да се формира површински СХП и површина контакта између воде и површине је мала.Коначно, у ЛОИС-у је примећено смањење ЦА, што се може приписати продирању мазива у микроструктуру, чиме се повећава контактна површина.Да би се доказало да површина има одличну репелентност течности и нелепљива својства, ЛОИС је упоређен са СХП подлогом мерењем ЦА и СА коришћењем различитих течности (слика 2Ф).Различите врсте течности су одабране на основу вискозитета и површинске енергије, укључујући дејонизовану воду, крв, ЕГ, ЕтОХ и ХД (слика С4).Резултати мерења ЦА показују да када ЦА тежи ка ХД, вредност редукције ЦА, где ЦА има најмању површинску енергију.Поред тога, ЛОИС укупног ЦА је низак.Међутим, мерење СА показује сасвим другачији феномен.Осим јонизоване воде, све течности пријањају на СХП подлогу без склизања.С друге стране, ЛОИС показује веома низак СА, где када се сва течност нагне под углом мањим од 10° до 15°, сва течност ће се откотрљати.Ово јасно показује да је нелепљивост ЛОИС-а боља од оне СХП површине.Поред тога, ЛОИС премази се такође примењују на различите врсте материјала, укључујући титанијум (Ти), полифенилсулфон (ППСУ), полиоксиметилен (ПОМ), полиетар етар кетон (ПЕЕК) и биоапсорбујуће полимере (ПЛГА). Они су имплантабилни ортопедски материјали (Слика С5)).Узастопне слике капљица на материјалу третираном ЛОИС-ом показују да су својства ЛОИС-а против биообрастања иста на свим подлогама.Поред тога, резултати мерења ЦА и СА показују да се нелепљива својства ЛОИС-а могу применити на друге материјале.
Да би се потврдила својства ЛОИС-а против обрастања, различите врсте супстрата (укључујући голе, урезане, СХП и ЛОИС) су инкубиране са Псеудомонас аеругиноса и МРСА.Ове две бактерије су одабране као репрезентативне болничке бактерије, које могу довести до стварања биофилма, што доводи до ССИ (37).Слика 3 (А и Б) приказује слике флуоресцентног микроскопа и резултате мерења јединице за формирање колоније (ЦФУ) супстрата инкубираних у бактеријској суспензији краткорочно (12 сати) и дуготрајно (72 сата), респективно.У кратком временском периоду, бактерије ће формирати кластере и расти у величини, покривајући се супстанцама налик слузи и спречавајући њихово уклањање.Међутим, током 72-часовне инкубације, бактерије ће сазрети и лако ће се распршити да би формирале више колонија или кластера.Стога се може сматрати да је 72-часовна инкубација дуготрајна и да је одговарајуће време инкубације за формирање снажног биофилма на површини (38).У кратком временском периоду, урезана површина и површина СХП-а су испољиле бактеријску адхезију, која је смањена за око 25% до 50% у поређењу са голом подлогом.Међутим, због својих одличних перформанси и стабилности против биообраштања, ЛОИС није показао адхезију бактеријског биофилма краткорочно и дугорочно.Шематски дијаграм (Слика 3Ц) описује објашњење антибиолошког механизма зарастања раствора за нагризање, СХП и ЛОИС.Претпоставка је да ће урезани супстрат са хидрофилним својствима имати већу површину од голе подлоге.Због тога ће доћи до већег пријањања бактерија на угравирану подлогу.Међутим, у поређењу са голом подлогом, урезани супстрат има значајно мање формираног биофилма на површини.То је зато што се молекули воде чврсто везују за хидрофилну површину и делују као мазиво за воду, ометајући тако краткорочно пријањање бактерија (39).Међутим, слој молекула воде је веома танак и растворљив у бактеријским суспензијама.Стога, молекуларни слој воде нестаје дуго времена, што доводи до екстензивне бактеријске адхезије и пролиферације.За СХП, због својих краткорочних својстава која не влаже, бактеријска адхезија је инхибирана.Смањена бактеријска адхезија се може приписати ваздушним џеповима заробљеним у слојевитој структури и нижој површинској енергији, чиме се минимизира контакт између бактеријске суспензије и површине.Међутим, у СХП-у је примећена екстензивна бактеријска адхезија јер је дуго изгубила својства против обраштања.Ово је углавном због нестанка ваздушних џепова услед хидростатичког притиска и растварања ваздуха у води.Ово је углавном због нестанка ваздушних џепова услед растварања и слојевите структуре која обезбеђује већу површину за адхезију (27, 40).За разлику од ова два супстрата који имају важан утицај на дугорочну стабилност, мазиво које се налази у ЛОИС-у се убризгава у микро/нано структуру и неће нестати чак ни на дужи рок.Лубриканти пуњени микро/нано структурама су веома стабилни и снажно привлаче површину због високог хемијског афинитета, чиме спречавају приањање бактерија на дуже време.Слика С6 приказује слику рефлексивног конфокалног микроскопа супстрата натопљеног лубрикантом уроњеног у физиолошки раствор пуферован фосфатом (ПБС).Непрекидне слике показују да чак и након 120 сати лаганог подрхтавања (120 о/мин), слој мазива на ЛОИС-у остаје непромењен, што указује на дугорочну стабилност у условима протока.Ово је због високог хемијског афинитета између САМ премаза на бази флуора и мазива на бази перфлуороугљеника, тако да се може формирати стабилан слој мазива.Због тога се одржава учинак против обраштања.Поред тога, супстрат је тестиран на репрезентативне протеине (албумин и фибриноген), који се налазе у плазми, ћелије које су уско повезане са имунолошком функцијом (макрофаги и фибробласти) и оне повезане са формирањем костију.Садржај калцијума је веома висок.(Слика 3Д, 1 и 2 и слика С7) (41, 42).Поред тога, слике флуоресцентног микроскопа теста адхезије за фибриноген, албумин и калцијум показале су различите карактеристике адхезије сваке групе супстрата (Слика С8).Током формирања костију, новоформирани слојеви кости и калцијума могу окружити ортопедски имплантат, што не само да отежава уклањање, већ може проузроковати и неочекивану штету пацијенту током процеса уклањања.Због тога је низак ниво наслага калцијума на коштаним плочама и шрафовима користан за ортопедску хирургију која захтева уклањање имплантата.На основу квантификације везаног подручја на основу интензитета флуоресценције и броја ћелија, потврдили смо да ЛОИС показује одлична својства против биообраштања за све биолошке супстанце у поређењу са другим супстратима.Према резултатима ин витро експеримената, ЛОИС против биолошког зарастања може се применити на ортопедске имплантате, који не само да може инхибирати инфекције узроковане бактеријама биофилма, већ и смањити упалу изазвану активним имунолошким системом тела.
(А) Слике флуоресцентног микроскопа сваке групе (голе, урезане, СХП и ЛОИС) инкубиране у суспензијама Псеудомонас аеругиноса и МРСА током 12 и 72 сата.(Б) Број адхерентних ЦФУ Псеудомонас аеругиноса и МРСА на површини сваке групе.(Ц) Шематски дијаграм антибиолошког механизма зарастања краткорочног и дуготрајног јеткања, СХП и ЛОИС.(Д) (1) Број фибробласта прилепљених на сваки супстрат и слике ћелија са флуоресцентног микроскопа прилепљене на голи и ЛОИС.(2) Тест адхезије протеина повезаних са имунитетом, албумина и калцијума укључених у процес зарастања костију (* П <0,05, ** П <0,01, *** П <0,001 и **** П <0,0001).нс, није важно.
У случају неизбежних концентрисаних напона, механичка издржљивост је одувек била главни изазов за примену премаза против обрастања.Традиционалне методе гела против канализације засноване су на полимерима са ниском растворљивошћу у води и крхкости.Због тога су обично подложни механичком стресу у биомедицинским применама.Стога, механички издржљиви премази против обрастања остају изазов за примене као што су ортопедски имплантати (43, 44).Слика 4А(1) приказује две главне врсте напрезања примењених на ортопедске имплантате, укључујући гребање (напрезање смицања) и компресију са оптичком сликом оштећеног импланта коју стварају пинцете.На пример, када се шраф затегне шрафцигером, или када хирург чврсто држи коштану плочу пинцетом и примени силу притиска, пластична коштана плоча ће се оштетити и изгребати и на макро и на микро/нано скали (слика 4А, 2) .Да би се тестирало да ли произведени ЛОИС може да издржи ова оштећења током пластичне хирургије, извршена је наноиндентација како би се упоредила тврдоћа голе подлоге и ЛОИС на микро/нано скали како би се проучавала механичка својства микро/нано структуре Удар (слика 4Б).Шематски дијаграм показује различито деформационо понашање ЛОИС-а због присуства микро/нано структура.На основу резултата наноиндентације нацртана је крива сила-померање (слика 4Ц).Плава слика представља голу подлогу, која показује само благу деформацију, што се види по максималној дубини удубљења од 0,26 μм.С друге стране, постепено повећање силе наноиндентације и померања уочено у ЛОИС (црвена крива) може показати знаке смањених механичких својстава, што резултира дубином наноиндентације од 1,61 μм.То је зато што микро/нано структура присутна у ЛОИС-у обезбеђује дубљи простор за напредовање врха наноиндентера, тако да је његова деформација већа од деформације голе подлоге.Конста-Гдоутос и др.(45) сматра да због присуства наноструктура, наноиндентација и микро/нано храпавост доводе до неправилних наноиндентационих кривуља.Осенчена површина одговара кривој неправилне деформације која се приписује наноструктури, док се неосенчена област приписује микроструктури.Ова деформација може оштетити микроструктуру/наноструктуру мазива за држање и негативно утицати на његов учинак против обрастања.У циљу проучавања утицаја оштећења на ЛОИС, неизбежно оштећење микро/нано структура је реплицирано у телу током пластичне хирургије.Коришћењем тестова адхезије крви и протеина може се утврдити стабилност анти-биофаулинг својстава ЛОИС-а након ин витро (слика 4Д).Серија оптичких слика показује оштећења која су настала у близини рупа на свакој подлози.Урађен је тест адхезије крви да би се демонстрирао ефекат механичког оштећења на премаз против биообрастања (Слика 4Е).Као и СХП, својства против обраштања се губе услед оштећења, а ЛОИС показује одлична својства против обраштања одбијањем крви.То је зато што, пошто се површинска енергија покреће капиларним деловањем које покрива оштећено подручје, проток у микроструктурираном мазиву враћа својства против обрастања (35).Исти тренд је примећен у тесту адхезије протеина коришћењем албумина.У оштећеном подручју се широко примећује адхезија протеина на површини СХП-а, а мерењем покривености површине може се квантификовати као половина нивоа адхезије голе подлоге.С друге стране, ЛОИС је задржао своја својства против биообраштања без изазивања адхезије (Слика 4, Ф и Г).Поред тога, површина завртња је често изложена јаком механичком напрезању, као што је бушење, па смо проучавали способност ЛОИС премаза да остане нетакнут на завртњу ин витро.Слика 4Х приказује оптичке слике различитих вијака, укључујући голе, СХП и ЛОИС.Црвени правоугаоник представља циљно подручје где се јавља јак механички стрес током имплантације кости.Слично тесту протеинске адхезије плоче, флуоресцентни микроскоп се користи за снимање адхезије протеина и мерење површине покривености како би се доказао интегритет ЛОИС премаза, чак и под јаким механичким стресом (Слика 4, И и Ј).Шрафови третирани ЛОИС-ом показују одличне перформансе против обраштања и скоро да нема протеина на површини.Са друге стране, примећена је адхезија протеина код голих шрафова и СХП вијака, где је површина СХП вијака била једна трећина површине голих вијака.Поред тога, ортопедски имплантат који се користи за фиксацију мора бити механички јак да издржи напрезање примењено на место прелома, као што је приказано на слици 4К.Због тога је извршено испитивање савијања да би се утврдио утицај хемијске модификације на механичка својства.Поред тога, ово се ради да би се одржао фиксни стрес од имплантата.Примените вертикалну механичку силу док се имплантат потпуно не савије и док се не добије крива напон-деформација (Слика 4Л, 1).Две особине, укључујући Иоунгов модул и чврстоћу на савијање, упоређене су између голих и ЛОИС подлога као индикатора њихове механичке чврстоће (Слика 4Л, 2 и 3).Јангов модул указује на способност материјала да издржи механичке промене.Јангов модул сваке подлоге је 41,48±1,01 и 40,06±0,96 ГПа, респективно;уочена разлика је око 3,4%.Поред тога, наводи се да је чврстоћа на савијање, која одређује жилавост материјала, 102,34±1,51 ГПа за голу подлогу и 96,99±0,86 ГПа за СХП.Гола подлога је приближно 5,3% већа.Благо смањење механичких својстава може бити узроковано ефектом зареза.У ефекту зареза, микро/нано храпавост може деловати као скуп зареза, што доводи до локалне концентрације напона и утиче на механичка својства имплантата (46).Међутим, на основу чињенице да се тврди да је крутост људске кортикалне кости између 7,4 и 31,6 ГПа, а измерени ЛОИС модул превазилази модул људске кортикалне кости (47), ЛОИС је довољан да подржи прелом и његов укупни. на механичка својства минимално утиче модификација површине.
(А) Шематски дијаграм (1) механичког напрезања примењеног на ортопедски имплантат током операције и (2) оптичке слике оштећеног ортопедског имплантата.(Б) Шематски дијаграм мерења наномеханичких својстава наноиндентацијом и ЛОИС-ом на голој површини.(Ц) Наноиндентациона крива сила-померања голе површине и ЛОИС.(Д) Након ин витро експеримената, симулирајте оптичке слике различитих типова ортопедских плоча (оштећено подручје је истакнуто црвеним правоугаоником) да бисте симулирали механички стрес изазван током операције.(Е) Тест адхезије крви и (Ф) тест адхезије протеина оштећене групе ортопедских плоча.(Г) Измерите површину покривености протеина који се држи плоче.(Х) Оптичке слике различитих типова ортопедских вијака након ин витро експеримента.(И) Тест адхезије протеина за проучавање интегритета различитих премаза.(Ј) Измерите површину покривености протеина који се придржава завртња.(К) Кретање зеца има за циљ да створи фиксни стрес на сломљеној кости.(Л) (1) Резултати теста савијања и оптичке слике пре и после савијања.Разлика у (2) Иоунговом модулу и (3) чврстоћи на савијање између голог имплантата и СХП.Подаци су изражени као средња вредност ± СД (*П<0,05, **П<0,01, ***П<0,001 и ****П<0,0001).Слика љубазношћу: Киомин Цхае, Ионсеи Университи.
У клиничким ситуацијама, већина контакта бактерија са биолошким материјалима и местима ране долази из зрелих, зрелих биофилма (48).Према томе, амерички центри за контролу и превенцију болести процењују да је 65% свих инфекција људи повезано са биофилмом (49).У овом случају, неопходно је обезбедити ин виво експериментални дизајн који обезбеђује конзистентно формирање биофилма на површини имплантата.Због тога смо развили модел прелома бутне кости зеца у коме су ортопедски имплантати претходно инкубирани у бактеријској суспензији, а затим имплантирани у фемур зеца да би се проучавала својства ЛОИС-а против обрастања ин виво.Због следеће три важне чињенице, бактеријске инфекције се индукују пре-културом, а не директним убризгавањем бактеријских суспензија: (и) Имуни систем зечева је природно јачи него код људи;стога је могуће убризгавање бактеријских суспензија и планктонских бактерија. Нема утицаја на формирање биофилма.(Ии) Планктонске бактерије су подложније антибиотицима, а антибиотици се обично користе након операције;коначно, (иии) суспензија планктонских бактерија може бити разблажена телесним течностима животиње (50).Пре-култивисањем имплантата у бактеријској суспензији пре имплантације, можемо темељно проучити штетне ефекте бактеријске инфекције и реакције страног тела (ФБР) на процес зарастања кости.Зечеви су жртвовани 4 недеље након имплантације, јер ће осеоинтеграција неопходна за процес зарастања костију бити завршена у року од 4 недеље.Затим су имплантати уклоњени са зечева за низводне студије.Слика 5А приказује механизам пролиферације бактерија.Инфицирани ортопедски имплантат се уноси у тело.Као резултат пре-инкубације у бактеријској суспензији, шест од шест зечева имплантираних голих имплантата је заражено, док ниједан од зечева имплантираних имплантата третираних ЛОИС-ом није инфициран.Бактеријске инфекције се одвијају у три корака, укључујући раст, сазревање и дисперзију (51).Прво, закачене бактерије се размножавају и расту на површини, а затим бактерије формирају биофилм када излучују екстрацелуларни полимер (ЕПС), амилоид и екстрацелуларну ДНК.Биофилм не само да омета продирање антибиотика, већ и подстиче акумулацију ензима који разграђују антибиотике (као што је β-лактамаза) (52).Коначно, биофилм шири зреле бактерије у околна ткива.Због тога долази до инфекције.Поред тога, када страно тело уђе у тело, инфекција која може изазвати јак имуни одговор може изазвати тешку упалу, бол и смањење имунитета.Слика 5Б даје преглед ФБР-а узрокованог уметањем ортопедског имплантата, а не имунолошког одговора изазваног бактеријском инфекцијом.Имуни систем препознаје уметнути имплантат као страно тело, а затим изазива реакције ћелија и ткива да инкапсулирају страно тело (53).У раним данима ФБР-а, на површини ортопедских имплантата формирала се матрица снабдевања, што је резултирало адсорпцијом фибриногена.Адсорбовани фибриноген затим формира високо густу фибринску мрежу, која промовише везивање леукоцита (54).Када се фибринска мрежа формира, долази до акутне упале услед инфилтрације неутрофила.У овом кораку се ослобађају различити цитокини као што су фактор некрозе тумора-α (ТНФ-α), интерлеукин-4 (ИЛ-4) и ИЛ-β, а моноцити почињу да се инфилтрирају на место имплантације и диференцирају у џиновске ћелије.Фаг (41, 55, 56).Смањење ФБР је одувек представљало изазов јер прекомерни ФБР може изазвати акутну и хроничну упалу, што може довести до фаталних компликација.Да би се проценио утицај бактеријских инфекција на ткива која окружују голи имплантат и ЛОИС, коришћено је бојење хематоксилином и еозином (Х&Е) и Массон трихром (МТ).За зечеве са имплантираним голим супстратима, тешке бактеријске инфекције су напредовале, а дијапозитиви ткива Х&Е јасно су показали апсцесе и некрозе узроковане упалом.С друге стране, изузетно јака површина против биообраштања ЛОИС инхибира адхезију бактерија, тако да не показује знаке инфекције и смањује упалу (слика 5Ц).Резултати МТ бојења показали су исти тренд.Међутим, МТ бојење је такође показало едем код зечева са имплантираним ЛОИС-ом, што указује да ће ускоро доћи до опоравка (Слика 5Д).У циљу проучавања степена имуног одговора, извршено је имунохистохемијско (ИХЦ) бојење коришћењем цитокина ТНФ-α и ИЛ-6 који се односе на имуни одговор.Голи негативни имплантат који није био изложен бактеријама упоређен је са ЛОИС-ом који је био изложен бактеријама, али није инфициран да би се проучавао процес зарастања у одсуству бактеријске инфекције.Слика 5Е приказује оптичку слику ИХЦ слајда који експримира ТНФ-α.Смеђа област представља имуни одговор, што указује да је имуни одговор у ЛОИС-у благо смањен.Поред тога, експресија ИЛ-6 у ЛОИС-у била је значајно мања од негативне експресије стерилних голих (Слика 5Ф).Експресија цитокина је квантификована мерењем површине бојења антитела која одговара цитокину (Слика 5Г).У поређењу са зечевима изложеним негативним имплантатима, нивои експресије зечева имплантираних са ЛОИС су били нижи, показујући значајну разлику.Смањење експресије цитокина указује на то да дугорочна, стабилна својства ЛОИС-а против обрастања нису повезана само са инхибицијом бактеријских инфекција, већ и са смањењем ФБР-а, који је изазван макрофагима који се држе супстрата (53, 57, 58).Стога, смањени имуни одговор због својстава ЛОИС-а за избегавање имунитета може да реши нежељене ефекте након имплантације, као што је прекомерни имуни одговор након пластичне операције.
(А) Шематски дијаграм механизма формирања и ширења биофилма на површини инфицираног ортопедског имплантата.еДНК, екстрацелуларна ДНК.(Б) Шематски дијаграм имуног одговора након уметања ортопедског имплантата.(Ц) Х&Е бојење и (Д) МТ бојење околних ткива ортопедских имплантата са голим позитивним и ЛОИС.ИХЦ имуно-сродних цитокина (Е) ТНФ-α и (Ф) ИЛ-6 су обојене слике голих негативних и ЛОИС имплантираних зечева.(Г) Квантификација експресије цитокина мерењем покривености површине (** П <0,01).
Биокомпатибилност ЛОИС-а и његов утицај на процес зарастања костију испитани су ин виво коришћењем дијагностичког снимања [рендгенски снимак и микро-компјутерска томографија (ЦТ)] и остеокластни ИХЦ.Слика 6А приказује процес зарастања кости који укључује три различите фазе: упалу, поправку и ремоделирање.Када дође до прелома, инфламаторне ћелије и фибробласти ће продрети у сломљену кост и почети да расту у васкуларно ткиво.Током фазе поправке, урастање васкуларног ткива се шири у близини места прелома.Васкуларно ткиво обезбеђује хранљиве материје за формирање нове кости, која се назива калус.Завршна фаза процеса зарастања кости је фаза ремоделирања, у којој се величина калуса смањује на величину нормалне кости уз помоћ повећања нивоа активираних остеокласта (59).Тродимензионална (3Д) реконструкција места прелома је изведена коришћењем микро-ЦТ скенирања да би се уочиле разлике у нивоу формирања калуса у свакој групи.Посматрајте попречни пресек бутне кости да бисте уочили дебљину калуса који окружује сломљену кост (Слика 6, Б и Ц).Рендгенски зраци су такође коришћени за испитивање места прелома свих група сваке недеље да би се посматрали различити процеси регенерације костију у свакој групи (слика С9).Калус и зреле кости су приказане у плавој/зеленој и слоновачи, респективно.Већина меких ткива се филтрира са унапред подешеним прагом.Нуде позитивни и СХП потврдили су формирање мале количине калуса око места прелома.С друге стране, изложени негатив ЛОИС-а и место прелома су окружени дебелим калусом.Микро-ЦТ слике су показале да је формирање калуса ометано бактеријском инфекцијом и упалом повезаним са инфекцијом.То је зато што имуни систем даје предност зацељивању септичких повреда узрокованих упалом повезаним са инфекцијом, а не опоравку костију (60).ИХЦ и бојење киселом фосфатазом отпорном на тартрат (ТРАП) обављено је да би се посматрала активност остеокласта и ресорпција кости (слика 6Д) (61).Само неколико активираних остеокласта обојених љубичастом бојом пронађено је у голим позитивима и СХП.С друге стране, многи активирани остеокласти су примећени у близини голих позитивних и зрелих костију ЛОИС-а.Овај феномен указује на то да у присуству остеокласта, калус око места прелома пролази кроз насилни процес ремоделирања (62).Измерени су волумен кости и експресиона површина остеокласта калуса да би се упоредио ниво формирања калуса око места прелома у свим групама, како би се квантификовали микро-ЦТ скенирање и резултати ИХЦ (Слика 6Е, 1 и 2).Као што се и очекивало, голи негативи и формирање калуса у ЛОИС-у били су значајно већи него у другим групама, што указује да је дошло до позитивног ремоделирања кости (63).Слика С10 приказује оптичку слику хируршког места, резултат МТ бојења ткива сакупљеног у близини завртња, и резултат бојења ТРАП који наглашава интерфејс завој-кост.У голој подлози примећено је снажно формирање калуса и фиброзе, док је имплантат третиран ЛОИС-ом показао релативно нелепљиву површину.Слично, у поређењу са голим негативима, нижа фиброза је примећена код зечева са имплантираним ЛОИС-ом, као што је назначено белим стрелицама.Поред тога, чврст едем (плава стрелица) се може приписати особинама ЛОИС-а за избегавање имунитета, чиме се смањује тешка упала.Нелепљива површина око имплантата и смањена фиброза сугеришу да је процес уклањања лакши, што обично резултира другим преломима или упалом.Процес зарастања кости након уклањања завртња је процењен на основу активности остеокласта на интерфејсу завртње-кост.И гола кост и интерфејс ЛОИС имплантата апсорбовали су сличне нивое остеокласта за даље зарастање костију, што указује да ЛОИС премаз нема негативан утицај на зарастање кости или имуни одговор.Да би се потврдило да модификација површине извршена на ЛОИС-у не омета процес зарастања костију, рендгенски преглед је коришћен да се упореди зарастање костију зечева са изложеним негативним јонима и 6 недеља имплантације ЛОИС-а (Слика 6Ф).Резултати су показали да је у поређењу са неинфицираном голопозитивном групом, ЛОИС показао исти степен зарастања костију, и да није било очигледних знакова прелома (континуирана линија остеолизе) у обе групе.
(А) Шематски дијаграм процеса зарастања костију након прелома.(Б) Разлика у степену формирања калуса сваке површинске групе и (Ц) слика попречног пресека места прелома.(Д) ТРАП бојење за визуелизацију активности остеокласта и ресорпције костију.На основу ТРАП активности, формирање спољашњег калуса кортикалне кости је квантитативно анализирано помоћу (Е) (1) микро-ЦТ и (2) активности остеокласта.(Ф) 6 недеља након имплантације, рендгенски снимци сломљене кости изложеног негатива (истакнут црвеним испрекиданим правоугаоником) и ЛОИС (наглашен плавим испрекиданим правоугаоником).Статистичка анализа је извршена једносмерном анализом варијансе (АНОВА).* П <0,05.** П <0,01.
Укратко, ЛОИС пружа нову врсту стратегије антибактеријске инфекције и превлаке за бијег имунитета за ортопедске имплантате.Конвенционални ортопедски имплантати са СХП функционализацијом показују краткорочна својства против биообраштања, али не могу задржати своја својства дуго времена.Суперхидрофобност супстрата задржава ваздушне мехуриће између бактерија и супстрата, стварајући тако ваздушне џепове, чиме се спречава бактеријска инфекција.Међутим, због дифузије ваздуха, ови ваздушни џепови се лако уклањају.С друге стране, ЛОИС је добро доказао своју способност да спречи инфекције повезане са биофилмом.Због тога, због својстава против одбацивања слоја мазива убризганог у слојевиту површину микро/нано структуре, може се спречити упала повезана са инфекцијом.Различите методе карактеризације укључујући СЕМ, АФМ, КСПС и ЦА мерења се користе за оптимизацију услова производње ЛОИС-а.Поред тога, ЛОИС се такође може применити на различите биолошке материјале који се обично користе у ортопедској опреми за фиксирање, као што су ПЛГА, Ти, ПЕ, ПОМ и ППСУ.Затим је ЛОИС тестиран ин витро да би се доказала његова својства против биообраштања против бактерија и биолошких супстанци повезаних са имунолошким одговором.Резултати показују да има одличне антибактеријске и анти-биофоулинг ефекте у поређењу са голим имплантом.Поред тога, ЛОИС показује механичку чврстоћу чак и након примене механичког напрезања, што је неизбежно у пластичној хирургији.Због својстава самоизлечења мазива на површини микро/нано структуре, ЛОИС је успешно задржао своја антибиолошка својства загађивања.Да би се проучавала биокомпатибилност и антибактеријска својства ЛОИС-а ин виво, ЛОИС је имплантиран у фемур зеца током 4 недеље.Није примећена бактеријска инфекција код зечева имплантираних ЛОИС-ом.Поред тога, употреба ИХЦ-а је показала смањен ниво локалног имунолошког одговора, што указује да ЛОИС не инхибира процес зарастања костију.ЛОИС показује одлична антибактеријска својства и својства избегавања имуног система, и доказано је да ефикасно спречава стварање биофилма пре и током ортопедске хирургије, посебно за синтезу костију.Користећи модел инфламаторног прелома феморалне кости зеца, дубоко је проучаван ефекат инфекција повезаних са биофилмом на процес зарастања костију изазван претходно инкубираним имплантатима.Као будућа студија, потребан је нови модел ин виво за проучавање могућих инфекција након имплантације како би се у потпуности разумеле и спречиле инфекције повезане са биофилмом током читавог процеса зарастања.Поред тога, остеоиндукција је још увек нерешен изазов у ​​интеграцији са ЛОИС-ом.Потребна су даља истраживања како би се комбиновала селективна адхезија остеоиндуктивних ћелија или регенеративна медицина са ЛОИС-ом како би се превазишао изазов.Све у свему, ЛОИС представља обећавајући ортопедски премаз за имплантате са механичком робусношћу и одличним својствима против биообраштања, што може смањити ССИ и нежељене ефекте имуног система.
Оперите подлогу од 15 мм к 15 мм к 1 мм 304 СС (Донг Канг М-Тецх Цо., Кореја) у ацетону, ЕтОХ и ДИ води 15 минута да бисте уклонили загађиваче.Да би се формирала структура на микро/нано нивоу на површини, очишћена подлога се урања у 48% до 51% ХФ раствор (ДУКСАН Цорп., Јужна Кореја) на 50°Ц.Време нагризања варира од 0 до 60 минута.Затим је урезана подлога очишћена дејонизованом водом и стављена у раствор 65% ХНО3 (Кореа ДУКСАН Цорп.) на 50°Ц у трајању од 30 минута да би се формирао слој за пасивизацију хром-оксида на површини.Након пасивизације, супстрат се опере дејонизованом водом и осуши да би се добио супстрат слојевите структуре.Затим је супстрат изложен кисеоничкој плазми (100 В, 3 минута) и одмах уроњен у раствор 8,88 мМ ПОТС (Сигма-Алдрицх, Немачка) у толуену на собној температури током 12 сати.Затим је супстрат обложен ПОТС-ом очишћен са ЕтОХ и жарен на 150°Ц током 2 сата да би се добио густи ПОТС САМ.Након САМ премаза, на подлогу је формиран слој мазива наношењем перфлуорополиетарског мазива (Криток 101; ДуПонт, САД) са запремином оптерећења од 20 μм/цм 2. Пре употребе, мазиво филтрирати кроз филтер од 0,2 микрона.Уклоните вишак мазива нагињањем под углом од 45° током 15 минута.Исти производни поступак је коришћен за ортопедске имплантате од 304 СС (плоча за закључавање и кортикални вијак за закључавање; Донг Канг М-Тецх Цо., Кореја).Сви ортопедски имплантати су дизајнирани да одговарају геометрији бутне кости зеца.
Морфологија површине супстрата и ортопедских имплантата испитана је теренским емисионим СЕМ (Инспецт Ф50, ФЕИ, УСА) и АФМ (КСЕ-100, Парк Системс, Јужна Кореја).Храпавост површине (Ра, Рк) се мери множењем површине од 20 μм са 20 μм (н=4).За анализу хемијског састава површине коришћен је КСПС (ПХИ 5000 ВерсаПробе, УЛВАЦ ПХИ, Јапан) систем опремљен Ал Кα рендгенским извором са величином тачке од 100 μм2.За мерење течног ЦА и СА коришћен је мерни систем ЦА опремљен камером за динамичко снимање слике (СмартДроп, ФЕМТОБИОМЕД, Јужна Кореја).За свако мерење, 6 до 10 μл капљица (дејонизована вода, коњска крв, ЕГ, 30% етанол и ХД) се ставља на површину за мерење ЦА.Када се угао нагиба подлоге повећава брзином од 2°/с (н = 4), СА се мери када капљица падне.
Псеудомонас аеругиноса [Америцан Типе Цултуре Цоллецтион (АТЦЦ) 27853] и МРСА (АТЦЦ 25923) су купљени од АТЦЦ (Манассас, Виргиниа, УСА), а основна култура је одржавана на -80°Ц.Пре употребе, смрзнута култура је инкубирана у сојином бујону одмрзнутом трипсином (Комед, Кореја) на 37°Ц током 18 сати, а затим два пута пребачена да би се активирала.После инкубације, култура је центрифугирана на 10.000 рпм током 10 минута на 4°Ц и испрана два пута раствором ПБС (пХ 7,3).Центрифугирана култура је затим субкултурисана на плочицама са крвним агаром (БАП).МРСА и Псеудомонас аеругиноса су припремљени преко ноћи и култивисани у Луриа-Бертани бујону.Концентрација Псеудомонас аеругиноса и МРСА у инокулуму је квантитативно одређена ЦФУ суспензије у серијским разблажењима на агару.Затим подесите концентрацију бактерија на 0,5 МцФарланд стандарда, што је еквивалентно 108 ЦФУ/мл.Затим разблажите радну бактеријску суспензију 100 пута до 106 ЦФУ/мл.Да би се тестирала својства антибактеријске адхезије, супстрат је стерилисан на 121°Ц 15 минута пре употребе.Супстрат је затим пребачен у 25 мл бактеријске суспензије и инкубиран на 37°Ц уз снажно мућкање (200 рпм) током 12 и 72 сата.Након инкубације, сваки супстрат је уклоњен из инкубатора и испран 3 пута са ПБС-ом да би се уклониле све плутајуће бактерије на површини.Да би се посматрао биофилм на супстрату, биофилм је фиксиран метанолом и обојен са 1 мл кримидин наранџе 2 минута.Затим је коришћен флуоресцентни микроскоп (БКС51ТР, Олимп, Јапан) за снимање слика обојеног биофилма.Да би се квантификовао биофилм на супстрату, причвршћене ћелије су одвојене од супстрата методом вортек-а, за коју се сматрало да је најпогоднија метода за уклањање везаних бактерија (н = 4).Користећи стерилне пинцете, уклоните супстрат из медијума за раст и куцните у плочу бунара да бисте уклонили вишак течности.Лабаво везане ћелије су уклоњене испирањем два пута стерилним ПБС.Сваки супстрат је затим пребачен у стерилну епрувету која садржи 9 мл 0,1% протеин епт физиолошког раствора (ПСВ) и 2 г 20 до 25 стерилних стаклених перли (0,4 до 0,5 мм у пречнику).Затим је мешано 3 минута да се ћелије одвоје од узорка.Након вртложног мешања, суспензија је серијски разблажена 10 пута са 0,1% ПСВ, а затим је 0,1 мл сваког разблажења инокулисано на БАП.После 24 сата инкубације на 37°Ц, ЦФУ је пребројан ручно.
За ћелије су коришћени мишји фибробласти НИХ/3Т3 (ЦРЛ-1658; амерички АТЦЦ) и мишји макрофаги РАВ 264.7 (ТИБ-71; амерички АТЦЦ).Користите Дулбеццо-ов модификовани Еагле медијум (ДМЕМ; ЛМ001-05, Велгене, Кореја) за култивацију фибробласта миша и допуну са 10% телећег серума (С103-01, Велгене) и 1% пеницилин-стрептомицина (ПС; ЛС202-02, В Велгене). Користите ДМЕМ за култивацију мишјих макрофага, са додатком 10% феталног говеђег серума (С001-01, Велгене) и 1% ПС ставите супстрат у плочу за ћелијску културу са шест јажица, и инокулирајте ћелије на 105 ћелија/цм2. Ћелије су инкубиране преко ноћи на 37°Ц и 5% ЦО2. За бојење ћелија, ћелије су фиксиране са 4% параформалдехидом у трајању од 20 минута и стављене у 0,5% Тритон Кс инкубирајуће 5 минута у -100°Ц на 37°Ц током 30 минута Након процеса инкубације, користите супстрат са 4′,6-диамино-2-фенилиндолом (Х -1200, Вецтор Лабораториес, УК) ВЕЦТАСХИЕЛД фиксациони медијум (н = 4 по ћелији). , флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцијанат-албумин (А9771, Сигма-Алдрицх, Немачка) и људска плазма Алека Флуор 488-коњуговани фибриноген (Ф13191, Инвитроген, САД) је растворен у ПБС (10 мМ, пХ 7).Концентрације албумина и фибриногена биле су 1 и 150 μг/мл, респективно.После супстрата Пре потапања у раствор протеина, исперите их ПБС-ом да бисте рехидрирали површину.Затим потопите све супстрате у плочу са шест јажица која садржи раствор протеина и инкубирајте на 37°Ц 30 и 90 минута.После инкубације, супстрат је затим уклоњен из раствора протеина, нежно испран ПБС-ом 3 пута и фиксиран са 4% параформалдехида (н = 4 за сваки протеин).За калцијум, натријум хлорид (0,21 М) и калијум фосфат (3,77 мМ) су растворени у дејонизованој води.пХ раствора је подешен на 2,0 додавањем раствора хидрохлорида (1М).Затим је калцијум хлорид (5,62 мМ) растворен у раствору.Додавањем 1М трис(хидроксиметил)-амино Метан подешава пХ раствора на 7,4.Потопите све супстрате у плочу са шест бунарчића напуњену 1,5× раствором калцијум фосфата и уклоните из раствора након 30 минута.За бојење, 2 г Ализарин Ред С (ЦИ 58005) помешати са 100 мл дејонизоване воде.Затим употребите 10% амонијум хидроксида да подесите пХ на 4. Обојите супстрат раствором Ализарин Ред 5 минута, а затим отресите вишак боје и обришите.Након протресања, уклоните подлогу.Материјал се дехидрира, затим потопи у ацетон 5 минута, затим урони у раствор ацетон-ксилола (1:1) током 5 минута и на крају опере ксиленом (н = 4).Користи се флуоресцентни микроскоп (Акио Имагер) са објективима ×10 и ×20..А2м, Зеисс, Немачка) приказује све подлоге.ИмагеЈ/ФИЈИ (хттпс://имагеј.них.гов/иј/) је коришћен за квантификацију података о адхезији биолошких супстанци на свакој групи од четири различите области снимања.Претворите све слике у бинарне слике са фиксним праговима за поређење подлоге.
Конфокални микроскоп Зеисс ЛСМ 700 је коришћен за праћење стабилности слоја мазива у ПБС у режиму рефлексије.Узорак стакла на бази флуора обложеног САМ-ом са убризганим слојем за подмазивање потопљен је у раствор ПБС и тестиран коришћењем орбиталног шејкера ​​(СХО-1Д; Даихан Сциентифиц, Јужна Кореја) под благим условима тресања (120 о/мин).Затим узмите узорак и пратите губитак мазива мерењем губитка рефлектоване светлости.За добијање флуоресцентних слика у режиму рефлексије, узорак се излаже ласеру од 633 нм, а затим сакупља, јер ће се светлост рефлектовати назад од узорка.Узорци су мерени у временским интервалима од 0, 30, 60 и 120 сати.
Да би се утврдио утицај процеса модификације површине на наномеханичка својства ортопедских имплантата, за мерење наноиндендиона коришћен је наноиндентер (ТИ 950 ТрибоИндентер, Хиситрон, УСА) опремљен тространим Берковицх дијамантским врхом у облику пирамиде.Максимално оптерећење је 10 мН, а површина је 100 μмк 100 μм.За сва мерења, време пуњења и истовара је 10 с, а време држања под вршним оптерећењем удубљења је 2 с.Извршите мерења са пет различитих локација и узмите просек.Да би се процениле перформансе механичке чврстоће под оптерећењем, извршено је попречно испитивање савијања у три тачке коришћењем универзалне машине за испитивање (Инстрон 5966, Инстрон, САД).Подлога се сабија константном брзином од 10 Н/с са повећаним оптерећењем.За израчунавање модула савијања и максималног тлачног напона коришћен је софтверски програм Блуехилл Универсал (н = 3).
Да би се симулирао процес операције и повезана механичка оштећења настала током операције, процес операције је изведен ин витро.Бутне кости су сакупљене од погубљених новозеландских белих зечева.Фемур је очишћен и фиксиран у 4% параформалдехиду током 1 недеље.Као што је описано у методи експеримента на животињама, фиксна бутна кост је хируршки оперисана.Након операције, ортопедски имплантат је уроњен у крв (коњска крв, КИСАН, Кореја) на 10 с да би се потврдило да ли је дошло до адхезије крви након примењене механичке повреде (н = 3).
Укупно 24 мужјака новозеландских белих зечева (тежине 3,0 до 3,5 кг, просечне старости 6 месеци) су насумично подељени у четири групе: голо-негативни, голи позитивни, СХП и ЛОИС.Све процедуре које укључују животиње спроведене су у складу са етичким стандардима Институционалне комисије за негу и употребу животиња (одобрено од стране ИАЦУЦ, КОРЕА-2017-0159).Ортопедски имплантат се састоји од плоче за закључавање са пет рупа (дужине 41 мм, ширине 7 мм и дебљине 2 мм) и кортикалних вијака за закључавање (дужине 12 мм, пречника 2,7 мм) за фиксацију прелома.Осим оних плоча и шрафова који су коришћени у голо-негативној групи, све плоче и шрафови су инкубирани у МРСА суспензији (106 ЦФУ/мл) током 12 сати.Група голо-негативна (н=6) третирана је имплантатима голе површине без излагања бактеријској суспензији, као негативна контрола за инфекцију.Гола позитивна група (н = 6) третирана је имплантатом голе површине изложеним бактеријама као позитивна контрола инфекције.СХП група (н = 6) лечена је СХП имплантатима изложеним бактеријама.Коначно, ЛОИС група је лечена ЛОИС имплантатима изложеним бактеријама (н = 6).Све животиње се држе у кавезу, а обезбеђено је доста хране и воде.Пре операције, зечеви су гладни 12 сати.Животиње су анестезиране интрамускуларном ињекцијом ксилазина (5 мг/кг) и интравенском ињекцијом паклитаксела (3 мг/кг) за индукцију.Након тога, испоручите 2% изофлурана и 50% до 70% медицинског кисеоника (брзина протока 2 Л/мин) кроз респираторни систем да бисте одржали анестезију.Имплантира се директним приступом бочној бутној кости.Након уклањања длачица и дезинфекције коже повидон-јодом, направљен је рез дужине око 6 цм на спољашњој страни леве средње бутне кости.Отварањем јаза између мишића који покривају бутну кост, бутна кост је потпуно изложена.Поставите плочу испред бутне кости и причврстите је са четири завртња.Након фиксирања, користите лист тестере (дебљине 1 мм) да вештачки направите прелом у области између друге и четврте рупе.На крају операције, рана је испрана физиолошким раствором и затворена шавовима.Сваком зецу је субкутано убризган енрофлоксацин (5 мг/кг) разблажен до једне трећине у физиолошком раствору.Постоперативни рендгенски снимци бутне кости рађени су код свих животиња (0, 7, 14, 21, 28 и 42 дана) да би се потврдила остеотомија кости.После дубоке анестезије, све животиње су убијене интравенским КЦл (2 ммол/кг) 28 и 42 дана.Након извршења, бутна кост је скенирана микро-ЦТ-ом да би се посматрао и упоредио процес зарастања костију и формирање нове кости између четири групе.
Након извршења, сакупљена су мека ткива која су била у директном контакту са ортопедским имплантатима.Ткиво је фиксирано у 10% неутралном пуферисаном формалину преко ноћи, а затим дехидрирано у ЕтОХ.Дехидрирано ткиво је уграђено у парафин и пресечено на дебљину од 40 μм помоћу микротома (400ЦС; ЕКСАКТ, Немачка).Да би се визуелизовала инфекција, обављено је Х&Е бојење и МТ бојење.Да би се проверио одговор домаћина, исечено ткиво је инкубирано са примарним антителом зеца против ТНФ-α (АБ6671, Абцам, САД) и зечјим анти-ИЛ-6 (АБ6672; Абцам, САД), а затим третирано хреном.Оксидаза.Нанесите авидин-биотин комплекс (АБЦ) систем бојења на секције према упутствима произвођача.Да би се појавио као браон производ реакције, у свим деловима је коришћен 3,3-диаминобензидин.Дигитални скенер слајдова (Паннорамиц 250 Фласх ИИИ, 3ДХИСТЕЦХ, Мађарска) коришћен је за визуелизацију свих резова, а најмање четири супстрата у свакој групи анализирана су софтвером ИмагеЈ.
Рендгенски снимци су направљени код свих животиња након операције и сваке недеље да би се пратило зарастање прелома (н=6 по групи).Након извршења, микро-ЦТ високе резолуције је коришћен за израчунавање формирања калуса око бутне кости након зарастања.Добијена бутна кост је очишћена, фиксирана у 4% параформалдехиду 3 дана и дехидрирана у 75% етанолу.Дехидриране кости су затим скениране коришћењем микро-ЦТ-а (СкиСцан 1173, Брооке Мицро-ЦТ, Канди, Белгија) да би се генерисале 3Д вокселне слике (2240 ​​× 2240 пиксела) узорка кости.Користите Ал филтер од 1,0 мм да смањите шум сигнала и примените високу резолуцију на сва скенирања (Е = 133 кВп, И = 60 μА, време интеграције = 500 мс).Софтвер Нрецон (верзија 1.6.9.8, Брукер мицроЦТ, Контицх, Белгија) је коришћен за генерисање 3Д запремине скенираног узорка из добијене 2Д бочне пројекције.За анализу, 3Д реконструисана слика је подељена на 10мм×10мм×10мм коцке према месту прелома.Израчунајте калус изван кортикалне кости.За дигитално преусмеравање скенираног волумена кости коришћен је софтвер ДатаВиевер (верзија 1.5.1.2; Брукер мицроЦТ, Контицх, Белгија), а за анализу је коришћен софтвер ЦТ-Анализер (верзија 1.14.4.1; Брукер мицроЦТ, Контицх, Белгија).Релативни коефицијенти апсорпције рендгенских зрака у зрелој кости и калусу се разликују по њиховој густини, а затим се квантификује запремина калуса (н = 4).Да би се потврдило да биокомпатибилност ЛОИС-а не одлаже процес зарастања костију, урађене су додатне рендгенске и микро-ЦТ анализе код два зеца: голонегативне и ЛОИС групе.Обе групе су погубљене у 6. недељи.
Бутне кости жртвованих животиња су сакупљене и фиксиране у 4% параформалдехиду током 3 дана.Ортопедски имплантат се затим пажљиво уклања из бутне кости.Фемур је декалцификован 21 дан коришћењем 0,5 М ЕДТА (ЕЦ-900, Натионал Диагностицс Цорпоратион).Затим је декалцификована бутна кост потопљена у ЕтОХ да би се дехидрирала.Дехидрирана бутна кост је уклоњена у ксилену и уграђена у парафин.Затим је узорак исечен аутоматским ротационим микротомом (Леица РМ2255, Леица Биосистемс, Немачка) дебљине 3 μм.За ТРАП бојење (Ф6760, Сигма-Алдрицх, Немачка), пресечени узорци су депарафинизовани, рехидрирани и инкубирани у ТРАП реагенсу на 37°Ц током 1 сата.Слике су добијене помоћу скенера слајдова (Паннорамиц 250 Фласх ИИИ, 3ДХИСТЕЦХ, Мађарска) и квантификоване мерењем површине покривености обојене површине.У сваком експерименту, најмање четири супстрата у свакој групи анализирана су софтвером ИмагеЈ.
Анализа статистичке значајности је извршена коришћењем ГрапхПад Присм (ГрапхПад Софтваре Инц., САД).Неупарени т-тест и једносмерна анализа варијансе (АНОВА) коришћени су за тестирање разлика између евалуационих група.Ниво значајности је приказан на слици на следећи начин: *П<0,05, **П<0,01, ***П<0,001 и ****П<0,0001;НС, нема значајне разлике.
За додатне материјале за овај чланак, погледајте хттп://адванцес.сциенцемаг.орг/цги/цонтент/фулл/6/44/еабб0025/ДЦ1
Ово је чланак отвореног приступа који се дистрибуира под условима Цреативе Цоммонс Аттрибутион-Некомерцијалне лиценце, која дозвољава употребу, дистрибуцију и репродукцију у било ком медију, све док употреба није за комерцијалну добит и премиса је да оригинал рад је исправан.Референца.
Напомена: Од вас тражимо само адресу е-поште како би особа коју препоручите страници знала да желите да види е-пошту и да она није непожељна.Нећемо ухватити ниједну адресу е-поште.
Ово питање се користи за тестирање да ли сте човек и за спречавање аутоматског слања нежељене поште.
Цхое Киунг Мин, Ох Иоунг Јанг, Парк Јун Јоон, Лее Јин Хиук, Ким Хиун Цхеол, Лее Киунг Моон, Лее Цханг Киу, Лее Иеон Таек, Лее Сун-уцк, Јеонг Моруи
Антибактеријски и имуни премази ортопедских имплантата могу смањити инфекције и имуни одговор узрокован инфекцијама.
Цхое Киунг Мин, Ох Иоунг Јанг, Парк Јун Јоон, Лее Јин Хиук, Ким Хиун Цхеол, Лее Киунг Моон, Лее Цханг Киу, Лее Иеон Таек, Лее Сун-уцк, Јеонг Моруи
Антибактеријски и имуни премази ортопедских имплантата могу смањити инфекције и имуни одговор узрокован инфекцијама.
©2021 Америчко удружење за унапређење науке.Сва права задржана.АААС је партнер ХИНАРИ, АГОРА, ОАРЕ, ЦХОРУС, ЦЛОЦКСС, ЦроссРеф и ЦОУНТЕР.СциенцеАдванцес ИССН 2375-2548.