Für Patienten, die sich einer orthopädischen Implantation unterziehen, waren bakterielle Infektionen und infektionsbedingte Immunreaktionen schon immer lebensbedrohliche Risiken.Herkömmliche biologische Materialien sind anfällig für biologische Kontaminationen, die dazu führen, dass Bakterien in den verletzten Bereich eindringen und eine postoperative Infektion verursachen.Daher besteht ein dringender Bedarf an der Entwicklung von Antiinfektions- und Immunschutzbeschichtungen für orthopädische Implantate.Hier haben wir eine fortschrittliche Oberflächenmodifikationstechnologie für orthopädische Implantate namens Lubricated Orthopaedic Implant Surface (LOIS) entwickelt, die von der glatten Oberfläche von Kannenpflanzenkannen inspiriert ist.LOIS verfügt über eine lang anhaltende und starke Flüssigkeitsabweisung gegenüber einer Vielzahl von Flüssigkeiten und biologischen Substanzen (einschließlich Zellen, Proteinen, Kalzium und Bakterien).Darüber hinaus haben wir die mechanische Beständigkeit gegen Kratzer und Befestigungskräfte bestätigt, indem wir die unvermeidlichen Schäden während der In-vitro-Operation simuliert haben.Das Modell einer entzündlichen Oberschenkelfraktur im Kaninchenknochenmark wurde verwendet, um die antibiologische Skalierungs- und Antiinfektionsfähigkeit von LOIS gründlich zu untersuchen.Wir gehen davon aus, dass LOIS, das über Anti-Biofouling-Eigenschaften und mechanische Haltbarkeit verfügt, einen Fortschritt in der infektionsfreien orthopädischen Chirurgie darstellt.
Heutzutage ist aufgrund der allgemeinen Alterung die Zahl der Patienten, die an orthopädischen Erkrankungen (z. B. Frakturen im Alter, degenerativen Gelenkerkrankungen und Osteoporose) leiden, stark gestiegen (1, 2).Daher legen medizinische Einrichtungen großen Wert auf orthopädische Chirurgie, einschließlich orthopädischer Implantate aus Schrauben, Platten, Nägeln und künstlichen Gelenken (3, 4).Es wurde jedoch berichtet, dass herkömmliche orthopädische Implantate anfällig für bakterielle Adhäsion und Biofilmbildung sind, was nach der Operation zu einer Infektion der Operationsstelle (SSI) führen kann (5, 6).Sobald sich der Biofilm auf der Oberfläche des orthopädischen Implantats gebildet hat, wird die Entfernung des Biofilms selbst bei Verwendung hoher Antibiotikadosen äußerst schwierig.Daher kommt es in der Regel zu schweren postoperativen Infektionen (7, 8).Aufgrund der oben genannten Probleme sollte die Behandlung infizierter Implantate eine erneute Operation umfassen, einschließlich der Entfernung aller Implantate und des umgebenden Gewebes;Daher wird der Patient unter starken Schmerzen und einigen Risiken leiden (9, 10).
Um einige dieser Probleme zu lösen, wurden medikamentenfreisetzende orthopädische Implantate entwickelt, die Infektionen vorbeugen, indem sie an der Oberfläche anhaftende Bakterien eliminieren (11, 12).Allerdings weist die Strategie noch einige Einschränkungen auf.Es wurde berichtet, dass die Langzeitimplantation von medikamentenfreisetzenden Implantaten zu Schäden am umliegenden Gewebe und zu Entzündungen geführt hat, die zu Nekrose führen können (13, 14).Darüber hinaus erfordern die organischen Lösungsmittel, die nach dem Herstellungsprozess von medikamentenfreisetzenden orthopädischen Implantaten entstehen können und die von der US-amerikanischen Food and Drug Administration strengstens verboten sind, zusätzliche Reinigungsschritte, um deren Standards zu erfüllen (15).Medikamentenfreisetzende Implantate stellen eine Herausforderung für die kontrollierte Freisetzung von Medikamenten dar und aufgrund ihrer begrenzten Wirkstoffbeladung ist eine langfristige Anwendung des Medikaments nicht möglich (16).
Eine weitere gängige Strategie besteht darin, das Implantat mit einem Antifouling-Polymer zu beschichten, um zu verhindern, dass biologische Stoffe und Bakterien an der Oberfläche haften (17).Beispielsweise haben zwitterionische Polymere aufgrund ihrer nichtadhäsiven Eigenschaften bei Kontakt mit Plasmaproteinen, Zellen und Bakterien Aufmerksamkeit erregt.Es weist jedoch einige Einschränkungen in Bezug auf Langzeitstabilität und mechanische Haltbarkeit auf, die seine praktische Anwendung bei orthopädischen Implantaten behindern, insbesondere aufgrund der mechanischen Abschürfung bei chirurgischen Eingriffen (18, 19).Darüber hinaus wurden orthopädische Implantate aus biologisch abbaubaren Materialien verwendet, da sie eine hohe Biokompatibilität aufweisen, keine chirurgische Entfernung erforderlich sind und die Oberfläche durch Korrosion reinigen (20, 21).Bei der Korrosion werden die chemischen Bindungen zwischen der Polymermatrix aufgebrochen und von der Oberfläche gelöst, und die Anhaftungen reinigen die Oberfläche.Eine antibiologische Verschmutzung durch Oberflächenreinigung ist jedoch schon nach kurzer Zeit wirksam.Darüber hinaus unterliegen die meisten absorbierbaren Materialien, einschließlich Polymilchsäure-Glykolsäure-Copolymer (PLGA), Polymilchsäure (PLA) und Magnesiumlegierungen, im Körper einem ungleichmäßigen biologischen Abbau und Erosion, was sich negativ auf die mechanische Stabilität auswirkt.(zweiundzwanzig).Darüber hinaus bieten die biologisch abbaubaren Plattenfragmente einen Nährboden für Bakterien, was auf lange Sicht das Infektionsrisiko erhöht.Dieses Risiko mechanischer Zersetzung und Infektion schränkt die praktische Anwendung der plastischen Chirurgie ein (23).
Superhydrophobe (SHP) Oberflächen, die die hierarchische Struktur von Lotusblättern nachahmen, sind zu einer möglichen Lösung für Antifouling-Oberflächen geworden (24, 25).Wenn die SHP-Oberfläche in Flüssigkeit eingetaucht wird, werden Luftblasen eingeschlossen, wodurch Lufteinschlüsse entstehen und die Anhaftung von Bakterien verhindert wird (26).Neuere Studien haben jedoch gezeigt, dass die SHP-Oberfläche Nachteile hinsichtlich der mechanischen Haltbarkeit und Langzeitstabilität aufweist, was einer Anwendung in medizinischen Implantaten entgegensteht.Darüber hinaus lösen sich die Lufteinschlüsse auf und verlieren ihre Antifouling-Eigenschaften, was aufgrund der großen Oberfläche der SHP-Oberfläche zu einer größeren Bakterienanhaftung führt (27, 28).Kürzlich stellten Aizenberg und Kollegen eine innovative Methode zur Anti-Biofouling-Oberflächenbeschichtung vor, indem sie eine glatte Oberfläche entwickelten, die von der Kannenpflanze Nepenthes inspiriert war (29, 30).Die glatte Oberfläche zeigt unter hydraulischen Bedingungen eine Langzeitstabilität, ist gegenüber biologischen Flüssigkeiten äußerst flüssigkeitsabweisend und verfügt über selbstreparierende Eigenschaften.Allerdings gibt es weder eine Methode, eine Beschichtung auf ein komplex geformtes medizinisches Implantat aufzubringen, noch ist nachgewiesen, dass sie den Heilungsprozess von geschädigtem Gewebe nach der Implantation unterstützt.
Hier stellen wir eine geschmierte orthopädische Implantatoberfläche (LOIS) vor, eine mikro-/nanostrukturierte orthopädische Implantatoberfläche, die fest mit einer dünnen Gleitmittelschicht verbunden ist, um zu verhindern, dass sie mit bakteriellen Infektionen wie der Frakturfixierung bei plastischen Operationen in Verbindung gebracht wird.Da die fluorfunktionalisierte Mikro-/Nanostruktur das Schmiermittel fest auf der Struktur fixiert, kann das entwickelte LOIS das Anhaften verschiedener Flüssigkeiten vollständig abwehren und die Antifouling-Leistung über einen langen Zeitraum aufrechterhalten.LOIS-Beschichtungen können auf Materialien unterschiedlicher Form aufgetragen werden, die für die Knochensynthese bestimmt sind.Die hervorragenden Anti-Biofouling-Eigenschaften von LOIS gegen Biofilmbakterien [Pseudomonas aeruginosa und Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA)] und biologische Substanzen (Zellen, Proteine ​​und Kalzium) wurden in vitro bestätigt.Der Adhäsionsgrad der großflächigen Haftung auf dem Untergrund beträgt weniger als 1 %.Darüber hinaus trägt die durch das eindringende Schmiermittel verursachte Selbstheilung dazu bei, dass die Antifouling-Eigenschaften auch nach Auftreten mechanischer Belastungen wie Oberflächenkratzern erhalten bleiben.Die Ergebnisse des mechanischen Haltbarkeitstests zeigen, dass die Gesamtfestigkeit auch nach struktureller und chemischer Modifikation nicht wesentlich verringert wird.Darüber hinaus wurde ein In-vitro-Experiment durchgeführt, das die mechanische Belastung im chirurgischen Umfeld simuliert, um zu beweisen, dass LOIS verschiedenen mechanischen Belastungen standhalten kann, die während der plastischen Chirurgie auftreten.Schließlich verwendeten wir ein Kaninchen-basiertes In-vivo-Femurfrakturmodell, das bewies, dass LOIS über überlegene antibakterielle Eigenschaften und Biokompatibilität verfügt.Radiologische und histologische Ergebnisse bestätigten, dass ein stabiles Gleitverhalten und Anti-Biofouling-Eigenschaften innerhalb von 4 Wochen nach der Implantation eine wirksame Anti-Infektions- und Immun-Escape-Leistung erzielen können, ohne den Knochenheilungsprozess zu verzögern.
Abbildung 1A zeigt ein schematisches Diagramm des entwickelten LOIS, dem Mikro-/Nanostrukturen im Oberschenkelfrakturmodell des Kaninchens implantiert werden, um seine hervorragenden antibiologischen Fouling- und Antiinfektionseigenschaften zu bestätigen.Mit einer biomimetischen Methode wird die Oberfläche einer Wassertopfpflanze simuliert und Biofouling durch den Einbau einer Gleitmittelschicht in die Mikro-/Nanostruktur der Oberfläche verhindert.Durch die mit Gleitmittel injizierte Oberfläche kann der Kontakt zwischen biologischen Substanzen und der Oberfläche minimiert werden.Aufgrund der Bildung stabiler chemischer Bindungen auf der Oberfläche weist es daher eine hervorragende Antifouling-Leistung und Langzeitstabilität auf.Dadurch ermöglichen die Anti-Biofouling-Eigenschaften der Gleitoberfläche verschiedene praktische Anwendungen in der biomedizinischen Forschung.Umfangreiche Untersuchungen zum Zusammenspiel dieser speziellen Oberfläche im Körper sind jedoch noch nicht abgeschlossen.Durch den Vergleich von LOIS mit nackten Substraten in vitro unter Verwendung von Albumin- und Biofilmbakterien kann die Nichthaftfähigkeit von LOIS bestätigt werden (Abbildung 1B).Darüber hinaus kann durch das Abrollen der Wassertropfen auf dem geneigten nackten Substrat und dem LOIS-Substrat (Abbildung S1 und Film S1) die biologische Kontaminationsleistung demonstriert werden.Wie im Bild des Fluoreszenzmikroskops gezeigt, zeigte das freigelegte Substrat, das in einer Suspension aus Proteinen und Bakterien inkubiert wurde, eine große Menge an biologischem Material, das an der Oberfläche haftete.Aufgrund seiner hervorragenden Anti-Biofouling-Eigenschaften zeigt LOIS jedoch kaum Fluoreszenz.Um seine Anti-Biofouling- und Anti-Infektions-Eigenschaften zu bestätigen, wurde LOIS auf die Oberfläche orthopädischer Implantate zur Knochensynthese (Platten und Schrauben) aufgetragen und in einem Kaninchen-Frakturmodell platziert.Vor der Implantation wurden das nackte orthopädische Implantat und LOIS 12 Stunden lang in einer Bakteriensuspension inkubiert.Durch die Vorinkubation wird sichergestellt, dass sich zum Vergleich ein Biofilm auf der Oberfläche des freigelegten Implantats bildet.Abbildung 1C zeigt ein Foto der Frakturstelle 4 Wochen nach der Implantation.Links zeigte ein Kaninchen mit einem nackten orthopädischen Implantat eine schwere Entzündung aufgrund der Bildung eines Biofilms auf der Oberfläche des Implantats.Das gegenteilige Ergebnis wurde bei Kaninchen beobachtet, denen LOIS implantiert worden war, d. h. das umgebende Gewebe von LOIS zeigte weder Anzeichen einer Infektion noch Anzeichen einer Entzündung.Darüber hinaus zeigt das optische Bild auf der linken Seite die Operationsstelle des Kaninchens mit dem freigelegten Implantat, was darauf hinweist, dass auf der Oberfläche des LOIS keine mehrfachen Klebstoffe gefunden wurden, die auf der Oberfläche des freigelegten Implantats vorhanden waren.Dies zeigt, dass LOIS langfristig stabil ist und seine antibiologischen Fouling- und Antihafteigenschaften beibehalten kann.
(A) Schematische Darstellung von LOIS und seiner Implantation in einem Kaninchen-Femurfrakturmodell.(B) Fluoreszenzmikroskopisches Bild von Protein- und Bakterienbiofilm auf blanker Oberfläche und LOIS-Substrat.4 Wochen nach der Implantation, (C) ein fotografisches Bild der Frakturstelle und (D) ein Röntgenbild (hervorgehoben durch ein rotes Rechteck).Bild mit freundlicher Genehmigung: Kyomin Chae, Yonsei University.
Die sterilisierten, exponierten, negativ implantierten Kaninchen zeigten einen normalen Knochenheilungsprozess ohne Anzeichen einer Entzündung oder Infektion.Andererseits zeigen SHP-Implantate, die in einer Bakteriensuspension vorinkubiert wurden, infektionsbedingte Entzündungen im umliegenden Gewebe.Dies kann darauf zurückgeführt werden, dass es die Bakterienadhäsion nicht über einen langen Zeitraum hemmen kann (Abbildung S2).Um zu beweisen, dass LOIS den Heilungsprozess nicht beeinflusst, aber mögliche Infektionen im Zusammenhang mit der Implantation hemmt, wurden Röntgenbilder der freigelegten positiven Matrix und LOIS an der Frakturstelle verglichen (Abbildung 1D).Das Röntgenbild des blanken positiven Implantats zeigte anhaltende Osteolyselinien, was darauf hindeutet, dass der Knochen nicht vollständig verheilt war.Dies deutet darauf hin, dass der Knochenwiederherstellungsprozess aufgrund einer infektionsbedingten Entzündung möglicherweise stark verzögert ist.Im Gegenteil zeigte sich, dass die mit LOIS implantierten Kaninchen geheilt waren und keine offensichtliche Bruchstelle aufwiesen.
Um medizinische Implantate mit langfristiger Stabilität und Funktionalität (einschließlich Resistenz gegen Biofouling) zu entwickeln, wurden viele Anstrengungen unternommen.Das Vorhandensein verschiedener biologischer Substanzen und die Dynamik der Gewebeadhäsion schränken jedoch die Entwicklung klinisch zuverlässiger Methoden ein.Um diese Mängel zu überwinden, haben wir eine Mikro-/Nanoschichtstruktur und eine chemisch modifizierte Oberfläche entwickelt, die aufgrund der hohen Kapillarkraft und chemischen Affinität optimiert ist, um ein möglichst glattes Schmiermittel zu erhalten.Abbildung 2A zeigt den gesamten Herstellungsprozess von LOIS.Bereiten Sie zunächst ein Substrat aus medizinischem Edelstahl (SS) 304 vor.Zweitens wird die Mikro-/Nanostruktur auf dem SS-Substrat durch chemisches Ätzen unter Verwendung einer Flusssäurelösung (HF) gebildet.Um die Korrosionsbeständigkeit von Edelstahl wiederherzustellen, wird eine Salpetersäurelösung (HNO3) (31) zur Bearbeitung des geätzten Substrats verwendet.Die Passivierung erhöht die Korrosionsbeständigkeit des SS-Substrats und verlangsamt den Korrosionsprozess erheblich, was die Gesamtleistung von LOIS beeinträchtigen kann.Anschließend wird die Oberfläche durch Bildung einer selbstorganisierten Monoschicht (SAM) mit 1H, 1H, 2H, 2H-Perfluoroctyltriethoxysilan (POTS) chemisch modifiziert, um die chemische Wechselwirkung zwischen der Oberfläche und der glatten Schmierstoffaffinität zu verbessern.Durch die Oberflächenmodifikation wird die Oberflächenenergie der hergestellten mikro-/nanoskaligen strukturierten Oberfläche erheblich reduziert, was der Oberflächenenergie des glatten Schmiermittels entspricht.Dadurch kann der Schmierstoff vollständig benetzt werden und es entsteht eine stabile Schmierstoffschicht auf der Oberfläche.Die modifizierte Oberfläche weist eine erhöhte Hydrophobie auf.Die Ergebnisse zeigen, dass das Gleitmittel aufgrund der hohen chemischen Affinität und Kapillarkraft, die durch die Mikro-/Nanostruktur verursacht werden, ein stabiles Verhalten auf LOIS zeigt (32, 33).Die optischen Veränderungen auf der Oberfläche von Edelstahl nach Oberflächenmodifikation und Schmiermittelinjektion wurden untersucht.Die auf der Oberfläche gebildete Mikro-/Nanoschichtstruktur kann zu optischen Veränderungen führen und die Oberfläche verdunkeln.Dieses Phänomen wird auf den verstärkten Lichtstreueffekt auf der rauen Oberfläche zurückgeführt, der die durch den Lichteinfangmechanismus verursachte diffuse Reflexion erhöht (34).Darüber hinaus wird der LOIS nach dem Einspritzen des Gleitmittels dunkler.Durch die Gleitschicht wird weniger Licht vom Substrat reflektiert, wodurch das LOIS abgedunkelt wird.Um die Mikrostruktur/Nanostruktur so zu optimieren, dass sie den kleinsten Gleitwinkel (SA) aufweist, um eine Anti-Biofouling-Leistung zu erzielen, wurden Rasterelektronenmikroskopie (REM) und Atompaare verwendet, um unterschiedliche HF-Ätzzeiten (0, 3) durchzuführen., 15 und 60 Minuten) Kraftmikroskop (AFM) (Abbildung 2B).SEM- und AFM-Bilder zeigen, dass sich auf dem blanken Substrat nach kurzer Ätzzeit (3 Minuten Ätzzeit) eine ungleichmäßige Rauheit im Nanomaßstab gebildet hat.Die Oberflächenrauheit ändert sich mit der Ätzzeit (Abbildung S3).Die zeitveränderliche Kurve zeigt, dass die Oberflächenrauheit weiter zunimmt und nach 15 Minuten Ätzen einen Höhepunkt erreicht. Anschließend ist nach 30 Minuten Ätzen nur noch eine leichte Abnahme des Rauheitswerts zu beobachten.An diesem Punkt wird die Rauheit auf Nanoebene weggeätzt, während sich die Rauheit auf Mikroebene kräftig entwickelt, wodurch die Rauheitsänderung stabiler wird.Nach einer Ätzdauer von mehr als 30 Minuten ist ein weiterer Anstieg der Rauheit zu beobachten, der im Einzelnen wie folgt erklärt wird: SS besteht aus Stahl, legiert mit Elementen wie Eisen, Chrom, Nickel, Molybdän und vielen anderen Elementen.Unter diesen Elementen spielen Eisen, Chrom und Molybdän eine wichtige Rolle bei der Bildung einer Rauheit im Mikro-/Nanobereich auf dem Edelstahl durch HF-Ätzen.In den frühen Stadien der Korrosion werden hauptsächlich Eisen und Chrom korrodiert, da Molybdän eine höhere Korrosionsbeständigkeit aufweist als Molybdän.Mit fortschreitendem Ätzvorgang kommt es zu einer lokalen Übersättigung der Ätzlösung, wodurch sich durch den Ätzvorgang Fluoride und Oxide bilden.Fluorid und Oxid fallen aus und lagern sich schließlich wieder auf der Oberfläche ab, wodurch eine Oberflächenrauheit im Mikrometer-/Nanobereich entsteht (31).Diese Rauheit im Mikro-/Nanobereich spielt eine wichtige Rolle für die Selbstheilungseigenschaften von LOIS.Die Doppelskalenoberfläche erzeugt einen synergistischen Effekt und erhöht die Kapillarkraft erheblich.Dieses Phänomen ermöglicht ein stabiles Eindringen des Schmiermittels in die Oberfläche und trägt zu den Selbstheilungseigenschaften bei (35).Die Rauheitsbildung hängt von der Ätzzeit ab.Nach einer 10-minütigen Ätzung weist die Oberfläche nur eine Rauheit im Nanomaßstab auf, die nicht ausreicht, um genügend Schmiermittel aufzunehmen, um eine Biofouling-Beständigkeit zu erreichen (36).Wenn andererseits die Ätzzeit 30 Minuten überschreitet, verschwindet die nanoskalige Rauheit, die durch die erneute Abscheidung von Eisen und Chrom entsteht, und es bleibt nur die mikroskalige Rauheit aufgrund von Molybdän zurück.Der überätzten Oberfläche fehlt die Rauheit im Nanomaßstab und sie verliert den synergistischen Effekt der zweistufigen Rauheit, was sich negativ auf die Selbstheilungseigenschaften von LOIS auswirkt.SA-Messungen wurden an Substraten mit unterschiedlichen Ätzzeiten durchgeführt, um die Antifouling-Leistung nachzuweisen.Basierend auf Viskosität und Oberflächenenergie wurden verschiedene Arten von Flüssigkeiten ausgewählt, darunter entionisiertes (DI) Wasser, Blut, Ethylenglykol (EG), Ethanol (EtOH) und Hexadecan (HD) (Abbildung S4).Das zeitlich variierende Ätzmuster zeigt, dass für verschiedene Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Oberflächenenergien und Viskositäten die SA von LOIS nach 15 Minuten Ätzen am niedrigsten ist.Daher ist LOIS so optimiert, dass es 15 Minuten lang ätzt, um eine Rauheit im Mikro- und Nanobereich zu erzeugen, die geeignet ist, die Haltbarkeit des Schmiermittels und hervorragende Antifouling-Eigenschaften wirksam aufrechtzuerhalten.
(A) Schematische Darstellung des vierstufigen Herstellungsprozesses von LOIS.Der Einschub zeigt die auf dem Substrat gebildete SAM.(B) SEM- und AFM-Bilder, die zur Optimierung der Mikro-/Nanostruktur des Substrats unter verschiedenen Ätzzeiten verwendet werden.Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS)-Spektren von (C) Cr2p und (D) F1s nach Oberflächenpassivierung und SAM-Beschichtung.au, beliebige Einheit.(E) Repräsentative Bilder von Wassertropfen auf blanken, geätzten, SHP- und LOIS-Substraten.(F) Der Kontaktwinkel (CA) und die SA-Messung von Flüssigkeiten mit unterschiedlichen Oberflächenspannungen auf SHP und LOIS.Die Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt.
Anschließend wurde zur Bestätigung der Veränderung der chemischen Eigenschaften der Oberfläche die Veränderung der chemischen Zusammensetzung der Substratoberfläche nach jeder Oberflächenbeschichtung mithilfe der Röntgenphotoelektronenspektroskopie (XPS) untersucht.Abbildung 2C zeigt die XPS-Messergebnisse der HF-geätzten Oberfläche und der mit HNO 3 behandelten Oberfläche.Die beiden Hauptpeaks bei 587,3 und 577,7 eV können auf die in der Chromoxidschicht vorhandene Cr-O-Bindung zurückgeführt werden, die den Hauptunterschied zur HF-geätzten Oberfläche darstellt.Dies ist vor allem auf den Verbrauch von Eisen- und Chromfluorid an der Oberfläche durch HNO3 zurückzuführen.Durch das Ätzen auf HNO3-Basis bildet Chrom eine passivierende Oxidschicht auf der Oberfläche, die das geätzte Edelstahl wieder korrosionsbeständig macht.In Abbildung 2D wurden XPS-Spektren aufgenommen, um zu bestätigen, dass sich nach der SAM-Beschichtung auf der Oberfläche fluorkohlenstoffbasiertes Silan gebildet hat, das selbst gegenüber EG, Blut und EtOH eine extrem hohe Flüssigkeitsabweisung aufweist.Die SAM-Beschichtung wird durch die Reaktion funktioneller Silangruppen mit durch Plasmabehandlung gebildeten Hydroxylgruppen vervollständigt.Infolgedessen wurde ein deutlicher Anstieg der CF2- und CF3-Peaks beobachtet.Die Bindungsenergie zwischen 286 und 296 eV zeigt an, dass die chemische Modifikation durch die SAM-Beschichtung erfolgreich abgeschlossen wurde.SHP zeigt relativ große CF2- (290,1 eV) und CF3-Peaks (293,3 eV), die durch das auf der Oberfläche gebildete fluorkohlenstoffbasierte Silan verursacht werden.Abbildung 2E zeigt repräsentative optische Bilder von Kontaktwinkelmessungen (CA) für verschiedene Gruppen von entionisiertem Wasser in Kontakt mit blankem, geätztem, SHP und LOIS.Diese Bilder zeigen, dass die geätzte Oberfläche aufgrund der durch chemisches Ätzen gebildeten Mikro-/Nanostruktur hydrophil wird, sodass entionisiertes Wasser in die Struktur absorbiert wird.Wenn das Substrat jedoch mit SAM beschichtet ist, zeigt das Substrat eine starke wasserabweisende Wirkung, sodass ein Oberflächen-SHP gebildet wird und die Kontaktfläche zwischen Wasser und der Oberfläche klein ist.Schließlich wurde bei LOIS eine Abnahme der CA beobachtet, die auf das Eindringen von Schmiermittel in die Mikrostruktur und dadurch eine Vergrößerung der Kontaktfläche zurückzuführen ist.Um zu beweisen, dass die Oberfläche hervorragende flüssigkeitsabweisende und nicht klebende Eigenschaften aufweist, wurde das LOIS mit dem SHP-Substrat verglichen, indem CA und SA unter Verwendung verschiedener Flüssigkeiten gemessen wurden (Abbildung 2F).Basierend auf Viskosität und Oberflächenenergie wurden verschiedene Arten von Flüssigkeiten ausgewählt, darunter entionisiertes Wasser, Blut, EG, EtOH und HD (Abbildung S4).CA-Messergebnisse zeigen, dass, wenn CA zu HD tendiert, der Reduktionswert von CA ansteigt, wobei CA die niedrigste Oberflächenenergie aufweist.Darüber hinaus ist der LOIS der gesamten CA niedrig.Die SA-Messung zeigt jedoch ein völlig anderes Phänomen.Bis auf das ionisierte Wasser haften alle Flüssigkeiten am SHP-Substrat, ohne abzurutschen.Andererseits zeigt LOIS eine sehr niedrige SA, bei der die gesamte Flüssigkeit abperlt, wenn sie in einem Winkel von weniger als 10° bis 15° geneigt wird.Dies zeigt deutlich, dass die Nichthaftfähigkeit der LOIS-Oberfläche besser ist als die der SHP-Oberfläche.Darüber hinaus werden LOIS-Beschichtungen auch auf verschiedene Arten von Materialien aufgebracht, darunter Titan (Ti), Polyphenylsulfon (PPSU), Polyoxymethylen (POM), Polyetheretherketon (PEEK) und bioabsorbierbare Polymere (PLGA). Dabei handelt es sich um implantierbare orthopädische Materialien (Abbildung S5)).Die aufeinanderfolgenden Bilder der Tröpfchen auf dem mit LOIS behandelten Material zeigen, dass die Anti-Biofouling-Eigenschaften von LOIS auf allen Substraten gleich sind.Darüber hinaus zeigen die Messergebnisse von CA und SA, dass die nichtklebenden Eigenschaften von LOIS auf andere Materialien übertragen werden können.
Um die Antifouling-Eigenschaften von LOIS zu bestätigen, wurden verschiedene Arten von Substraten (einschließlich blanker, geätzter, SHP und LOIS) mit Pseudomonas aeruginosa und MRSA inkubiert.Diese beiden Bakterien wurden als repräsentative Krankenhausbakterien ausgewählt, die zur Bildung von Biofilmen und damit zu SSI führen können (37).Abbildung 3 (A und B) zeigt die Fluoreszenzmikroskopbilder und die Messergebnisse der koloniebildenden Einheit (CFU) der in der Bakteriensuspension kurzzeitig (12 Stunden) bzw. langfristig (72 Stunden) inkubierten Substrate.Innerhalb kurzer Zeit bilden sich Bakterienhaufen und wachsen an Größe, wobei sie sich mit schleimähnlichen Substanzen bedecken und ihre Entfernung verhindern.Während der 72-stündigen Inkubation reifen die Bakterien jedoch heran und können sich leicht verteilen, um weitere Kolonien oder Cluster zu bilden.Daher kann davon ausgegangen werden, dass eine 72-stündige Inkubation langfristig und die geeignete Inkubationszeit ist, um einen starken Biofilm auf der Oberfläche zu bilden (38).In kurzer Zeit zeigten die geätzte Oberfläche und die Oberfläche des SHP eine bakterielle Adhäsion, die im Vergleich zum blanken Substrat um etwa 25 bis 50 % reduziert war.Aufgrund seiner hervorragenden Anti-Biofouling-Leistung und Stabilität zeigte LOIS jedoch weder kurz- noch langfristig eine Anhaftung von bakteriellem Biofilm.Das schematische Diagramm (Abbildung 3C) beschreibt die Erklärung des antibiologischen Fouling-Mechanismus der Ätzlösung, SHP und LOIS.Es wird davon ausgegangen, dass das geätzte Substrat mit hydrophilen Eigenschaften eine größere Oberfläche aufweist als das blanke Substrat.Daher kommt es zu einer stärkeren Anhaftung von Bakterien auf dem geätzten Substrat.Im Vergleich zum bloßen Substrat weist das geätzte Substrat jedoch deutlich weniger Biofilmbildung auf der Oberfläche auf.Denn Wassermoleküle binden sich fest an die hydrophile Oberfläche und wirken als Gleitmittel für Wasser, wodurch sie kurzfristig die Adhäsion von Bakterien beeinträchtigen (39).Allerdings ist die Schicht aus Wassermolekülen in Bakteriensuspensionen sehr dünn und löslich.Daher verschwindet die Wassermolekularschicht für lange Zeit, was zu einer starken Anhaftung und Vermehrung von Bakterien führt.Bei SHP wird aufgrund seiner kurzzeitigen, nicht benetzenden Eigenschaften die Bakterienadhäsion gehemmt.Die verringerte Bakterienadhäsion kann auf in der Schichtstruktur eingeschlossene Lufteinschlüsse und eine geringere Oberflächenenergie zurückgeführt werden, wodurch der Kontakt zwischen der Bakteriensuspension und der Oberfläche minimiert wird.Bei SHP wurde jedoch eine starke Bakterienanhaftung beobachtet, da es seine Antifouling-Eigenschaften für lange Zeit verlor.Dies ist hauptsächlich auf das Verschwinden von Lufteinschlüssen aufgrund des hydrostatischen Drucks und der Auflösung von Luft im Wasser zurückzuführen.Dies ist hauptsächlich auf das Verschwinden von Lufteinschlüssen aufgrund der Auflösung und die Schichtstruktur zurückzuführen, die eine größere Oberfläche für die Haftung bietet (27, 40).Im Gegensatz zu diesen beiden Substraten, die einen wichtigen Einfluss auf die Langzeitstabilität haben, wird der in LOIS enthaltene Schmierstoff in die Mikro-/Nanostruktur injiziert und verschwindet auch langfristig nicht.Mit Mikro-/Nanostrukturen gefüllte Schmierstoffe sind sehr stabil und werden aufgrund ihrer hohen chemischen Affinität stark von der Oberfläche angezogen und verhindern so die Anhaftung von Bakterien für lange Zeit.Abbildung S6 zeigt ein konfokales Reflexionsmikroskopbild eines mit Gleitmittel infundierten Substrats, das in phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) getaucht ist.Kontinuierliche Bilder zeigen, dass die Schmiermittelschicht auf dem LOIS auch nach 120 Stunden leichtem Schütteln (120 U/min) unverändert bleibt, was auf eine langfristige Stabilität unter Strömungsbedingungen hinweist.Dies liegt an der hohen chemischen Affinität zwischen der fluorbasierten SAM-Beschichtung und dem perfluorkohlenstoffbasierten Schmierstoff, sodass eine stabile Schmierstoffschicht gebildet werden kann.Daher bleibt die Antifouling-Leistung erhalten.Darüber hinaus wurde das Substrat gegen repräsentative Proteine ​​(Albumin und Fibrinogen) getestet, die im Plasma, in Zellen, die eng mit der Immunfunktion verbunden sind (Makrophagen und Fibroblasten), und solchen, die mit der Knochenbildung zusammenhängen, vorkommen.Der Gehalt an Kalzium ist sehr hoch.(Abbildung 3D, 1 und 2 und Abbildung S7) (41, 42).Darüber hinaus zeigten die Fluoreszenzmikroskopbilder des Adhäsionstests für Fibrinogen, Albumin und Calcium unterschiedliche Adhäsionseigenschaften jeder Substratgruppe (Abbildung S8).Während der Knochenbildung können neu gebildete Knochen- und Kalziumschichten das orthopädische Implantat umgeben, was nicht nur die Entfernung erschwert, sondern auch zu unerwarteten Schäden beim Patienten während des Entfernungsprozesses führen kann.Daher sind geringe Kalziumablagerungen auf Knochenplatten und Schrauben für orthopädische Eingriffe, bei denen eine Implantatentfernung erforderlich ist, von Vorteil.Basierend auf der Quantifizierung der anhaftenden Fläche anhand der Fluoreszenzintensität und der Zellzahl haben wir bestätigt, dass LOIS im Vergleich zu anderen Substraten hervorragende Anti-Biofouling-Eigenschaften für alle biologischen Substanzen aufweist.Den Ergebnissen von In-vitro-Experimenten zufolge kann das antibiologische Fouling LOIS auf orthopädische Implantate angewendet werden, das nicht nur durch Biofilmbakterien verursachte Infektionen hemmen, sondern auch durch das aktive Immunsystem des Körpers verursachte Entzündungen reduzieren kann.
(A) Fluoreszenzmikroskopische Bilder jeder Gruppe (nackt, geätzt, SHP und LOIS), inkubiert in Pseudomonas aeruginosa- und MRSA-Suspensionen für 12 und 72 Stunden.(B) Die Anzahl der anhaftenden KBE von Pseudomonas aeruginosa und MRSA auf der Oberfläche jeder Gruppe.(C) Schematische Darstellung des antibiologischen Fouling-Mechanismus von Kurzzeit- und Langzeitätzung, SHP und LOIS.(D) (1) Die Anzahl der an jedem Substrat anhaftenden Fibroblasten und Fluoreszenzmikroskopbilder der an der nackten und LOIS anhaftenden Zellen.(2) Adhäsionstest von immunbezogenen Proteinen, Albumin und Kalzium, die am Knochenheilungsprozess beteiligt sind (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 und **** P <0,0001).ns, nicht wichtig.
Bei unvermeidbaren punktuellen Belastungen ist die mechanische Belastbarkeit seit jeher die größte Herausforderung bei der Anwendung von Antifouling-Beschichtungen.Herkömmliche Anti-Abwasser-Gel-Methoden basieren auf Polymeren mit geringer Wasserlöslichkeit und Zerbrechlichkeit.Daher sind sie in biomedizinischen Anwendungen meist anfällig für mechanische Belastungen.Daher bleiben mechanisch beständige Antifouling-Beschichtungen eine Herausforderung für Anwendungen wie orthopädische Implantate (43, 44).Abbildung 4A(1) zeigt die beiden Hauptarten der auf orthopädische Implantate ausgeübten Belastung, einschließlich Kratzen (Scherbelastung) und Kompression, anhand des optischen Bildes des beschädigten Implantats, das von der Pinzette erzeugt wird.Wenn die Schraube beispielsweise mit einem Schraubenzieher festgezogen wird oder wenn der Chirurg die Knochenplatte mit einer Pinzette festhält und Druckkraft ausübt, wird die Kunststoffknochenplatte sowohl im Makro- als auch im Mikro-/Nanomaßstab beschädigt und zerkratzt (Abbildung 4A, 2) .Um zu testen, ob das hergestellte LOIS diesen Schäden während der plastischen Chirurgie standhalten kann, wurde eine Nanoindentation durchgeführt, um die Härte des nackten Substrats und des LOIS auf der Mikro-/Nanoskala zu vergleichen und die mechanischen Eigenschaften der Mikro-/Nanostruktur Impact zu untersuchen (Abbildung 4B).Das schematische Diagramm zeigt das unterschiedliche Verformungsverhalten von LOIS aufgrund des Vorhandenseins von Mikro-/Nanostrukturen.Basierend auf den Ergebnissen der Nanoindentation wurde eine Kraft-Weg-Kurve erstellt (Abbildung 4C).Das blaue Bild stellt das blanke Substrat dar, das nur leichte Verformungen aufweist, erkennbar an der maximalen Einkerbungstiefe von 0,26 μm.Andererseits kann der in LOIS beobachtete allmähliche Anstieg der Nanoindentationskraft und -verschiebung (rote Kurve) Anzeichen für verringerte mechanische Eigenschaften zeigen, was zu einer Nanoindentationstiefe von 1,61 μm führt.Dies liegt daran, dass die im LOIS vorhandene Mikro-/Nanostruktur einen tieferen Vorschubraum für die Spitze des Nanoindenters bietet, sodass seine Verformung größer ist als die des bloßen Substrats.Konsta-Gdoutos et al.(45) geht davon aus, dass Nanoindentation und Mikro-/Nanorauheit aufgrund des Vorhandenseins von Nanostrukturen zu unregelmäßigen Nanoindentationskurven führen.Der schattierte Bereich entspricht der unregelmäßigen Verformungskurve, die der Nanostruktur zugeschrieben wird, während der nicht schattierte Bereich der Mikrostruktur zugeschrieben wird.Diese Verformung kann die Mikrostruktur/Nanostruktur des Halteschmiermittels beschädigen und dessen Antifouling-Leistung negativ beeinflussen.Um die Auswirkungen von Schäden auf LOIS zu untersuchen, wurden unvermeidliche Schäden an Mikro-/Nanostrukturen im Körper während plastischer Chirurgie nachgebildet.Mithilfe von Blut- und Proteinadhäsionstests kann die Stabilität der Anti-Biofouling-Eigenschaften von LOIS nach In-vitro-Tests bestimmt werden (Abbildung 4D).Eine Reihe optischer Bilder zeigt die Schäden, die in der Nähe der Löcher jedes Substrats aufgetreten sind.Um die Auswirkungen mechanischer Schäden auf die Anti-Biofouling-Beschichtung zu demonstrieren, wurde ein Blutadhäsionstest durchgeführt (Abbildung 4E).Wie bei SHP gehen die Antifouling-Eigenschaften durch Beschädigung verloren, und LOIS weist hervorragende Antifouling-Eigenschaften auf, indem es Blut abweist.Dies liegt daran, dass die Oberflächenenergie durch die Kapillarwirkung, die den beschädigten Bereich bedeckt, angetrieben wird und der Fluss im mikrostrukturierten Schmierstoff die Antifouling-Eigenschaften wiederherstellt (35).Der gleiche Trend wurde beim Proteinadhäsionstest mit Albumin beobachtet.Im beschädigten Bereich ist die Adhäsion von Proteinen auf der Oberfläche von SHP weit verbreitet und kann durch Messung der Flächenabdeckung als die Hälfte des Adhäsionsgrads des bloßen Substrats quantifiziert werden.Andererseits behielt LOIS seine Anti-Biofouling-Eigenschaften bei, ohne dass es zu Adhäsionen kam (Abbildung 4, F und G).Darüber hinaus ist die Oberfläche der Schraube häufig starken mechanischen Belastungen ausgesetzt, beispielsweise beim Bohren. Daher haben wir in vitro die Fähigkeit der LOIS-Beschichtung untersucht, auf der Schraube intakt zu bleiben.Abbildung 4H zeigt optische Bilder verschiedener Schrauben, einschließlich blanker, SHP- und LOIS-Schrauben.Das rote Rechteck stellt den Zielbereich dar, in dem bei der Knochenimplantation starke mechanische Belastungen auftreten.Ähnlich wie beim Proteinadhäsionstest der Platte wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet, um die Proteinadhäsion abzubilden und die Abdeckungsfläche zu messen, um die Integrität der LOIS-Beschichtung auch unter starker mechanischer Belastung nachzuweisen (Abbildung 4, I und J).Die LOIS-behandelten Schnecken weisen eine hervorragende Antifouling-Leistung auf und nahezu kein Protein haftet an der Oberfläche.Andererseits wurde Proteinadhäsion bei blanken Schrauben und SHP-Schrauben beobachtet, wobei die Flächenabdeckung von SHP-Schrauben ein Drittel derjenigen von blanken Schrauben betrug.Darüber hinaus muss das zur Fixierung verwendete orthopädische Implantat mechanisch stark sein, um der auf die Frakturstelle ausgeübten Belastung standzuhalten, wie in Abbildung 4K dargestellt.Daher wurde ein Biegetest durchgeführt, um die Auswirkung der chemischen Modifikation auf die mechanischen Eigenschaften zu bestimmen.Darüber hinaus dient dies dazu, die feste Spannung des Implantats aufrechtzuerhalten.Wenden Sie vertikale mechanische Kraft an, bis das Implantat vollständig gefaltet ist und eine Spannungs-Dehnungs-Kurve erhalten wird (Abbildung 4L, 1).Zwei Eigenschaften, einschließlich Elastizitätsmodul und Biegefestigkeit, wurden zwischen blanken und LOIS-Substraten als Indikatoren ihrer mechanischen Festigkeit verglichen (Abbildung 4L, 2 und 3).Der Elastizitätsmodul gibt die Fähigkeit eines Materials an, mechanischen Veränderungen standzuhalten.Der Elastizitätsmodul jedes Substrats beträgt 41,48 ± 1,01 bzw. 40,06 ± 0,96 GPa;der beobachtete Unterschied beträgt etwa 3,4 %.Darüber hinaus wird berichtet, dass die Biegefestigkeit, die die Zähigkeit des Materials bestimmt, 102,34 ± 1,51 GPa für das blanke Substrat und 96,99 ± 0,86 GPa für SHP beträgt.Der blanke Untergrund liegt ca. 5,3 % höher.Die leichte Verschlechterung der mechanischen Eigenschaften kann auf die Kerbwirkung zurückzuführen sein.Beim Kerbeffekt kann die Mikro-/Nanorauheit wie eine Reihe von Kerben wirken, was zu einer lokalen Spannungskonzentration führt und die mechanischen Eigenschaften des Implantats beeinträchtigt (46).Basierend auf der Tatsache, dass die Steifheit des menschlichen Kortikalisknochens Berichten zufolge zwischen 7,4 und 31,6 GPa liegt und der gemessene LOIS-Modul den des menschlichen Kortikalisknochens übersteigt (47), reicht der LOIS aus, um die Fraktur und ihre Gesamtstabilität zu unterstützen Die mechanischen Eigenschaften werden durch die Oberflächenmodifikation nur minimal beeinflusst.
(A) Schematische Darstellung (1) der mechanischen Beanspruchung des orthopädischen Implantats während der Operation und (2) des optischen Bildes des beschädigten orthopädischen Implantats.(B) Schematische Darstellung der Messung nanomechanischer Eigenschaften durch Nanoindentation und LOIS auf der blanken Oberfläche.(C) Nanoindentations-Kraft-Verschiebungskurve der blanken Oberfläche und LOIS.(D) Simulieren Sie nach In-vitro-Experimenten die optischen Bilder verschiedener Arten orthopädischer Platten (der beschädigte Bereich wird mit einem roten Rechteck hervorgehoben), um die während der Operation verursachte mechanische Belastung zu simulieren.(E) Blutadhäsionstest und (F) Proteinadhäsionstest der beschädigten orthopädischen Plattengruppe.(G) Messen Sie die Flächendeckung des an der Platte haftenden Proteins.(H) Optische Bilder verschiedener Arten orthopädischer Schrauben nach dem In-vitro-Experiment.(I) Proteinadhäsionstest zur Untersuchung der Integrität verschiedener Beschichtungen.(J) Messen Sie die Flächenabdeckung des an der Schraube haftenden Proteins.(K) Die Bewegung des Kaninchens soll eine feste Belastung auf den gebrochenen Knochen erzeugen.(L) (1) Biegetestergebnisse und optische Bilder vor und nach dem Biegen.Der Unterschied im (2) Elastizitätsmodul und (3) Biegefestigkeit zwischen nacktem Implantat und SHP.Die Daten werden als Mittelwert ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 und ****P<0,0001) ausgedrückt.Bild mit freundlicher Genehmigung: Kyomin Chae, Yonsei University.
In klinischen Situationen erfolgt der meiste bakterielle Kontakt mit biologischen Materialien und Wundstellen über ausgereifte Biofilme (48).Daher schätzen die US-amerikanischen Zentren für die Kontrolle und Prävention von Krankheiten, dass 65 % aller menschlichen Infektionen mit Biofilmen zusammenhängen (49).In diesem Fall ist es notwendig, ein In-vivo-Versuchsdesign bereitzustellen, das eine konsistente Biofilmbildung auf der Oberfläche des Implantats gewährleistet.Daher haben wir ein Kaninchen-Femurfrakturmodell entwickelt, bei dem orthopädische Implantate in einer Bakteriensuspension vorinkubiert und dann in Kaninchen-Femuren implantiert wurden, um die Antifouling-Eigenschaften von LOIS in vivo zu untersuchen.Aufgrund der folgenden drei wichtigen Tatsachen werden bakterielle Infektionen eher durch Vorkultur als durch direkte Injektion von Bakteriensuspensionen induziert: (i) Das Immunsystem von Kaninchen ist von Natur aus stärker als das von Menschen;Daher ist die Injektion von Bakteriensuspensionen und Planktonbakterien möglich. Es hat keinen Einfluss auf die Bildung von Biofilmen.(Ii) Planktonbakterien sind anfälliger für Antibiotika, und Antibiotika werden normalerweise nach einer Operation eingesetzt;schließlich (iii) die Planktonbakteriensuspension kann durch die Körperflüssigkeiten des Tieres verdünnt werden (50).Indem wir das Implantat vor der Implantation in einer Bakteriensuspension vorkultivieren, können wir die schädlichen Auswirkungen bakterieller Infektionen und Fremdkörperreaktionen (FBR) auf den Knochenheilungsprozess gründlich untersuchen.Die Kaninchen wurden 4 Wochen nach der Implantation getötet, da die für den Knochenheilungsprozess notwendige Osseointegration innerhalb von 4 Wochen abgeschlossen sein wird.Anschließend wurden den Kaninchen die Implantate für weiterführende Studien entnommen.Abbildung 5A zeigt den Proliferationsmechanismus von Bakterien.Das infizierte orthopädische Implantat wird in den Körper eingeführt.Als Ergebnis der Vorinkubation in Bakteriensuspension wurden sechs der sechs Kaninchen, denen nackte Implantate implantiert wurden, infiziert, während keines der Kaninchen, denen LOIS-behandelte Implantate implantiert wurden, infiziert wurde.Bakterielle Infektionen verlaufen in drei Schritten: Wachstum, Reifung und Ausbreitung (51).Zuerst vermehren sich die anhaftenden Bakterien und wachsen auf der Oberfläche. Anschließend bilden die Bakterien einen Biofilm, indem sie extrazelluläres Polymer (EPS), Amyloid und extrazelluläre DNA ausscheiden.Biofilm behindert nicht nur das Eindringen von Antibiotika, sondern fördert auch die Anreicherung antibiotikaabbauender Enzyme (wie β-Lactamase) (52).Schließlich verteilt der Biofilm die reifen Bakterien in das umliegende Gewebe.Daher kommt es zu einer Infektion.Wenn außerdem ein Fremdkörper in den Körper eindringt, kann eine Infektion, die eine starke Immunantwort hervorrufen kann, schwere Entzündungen, Schmerzen und eine verminderte Immunität verursachen.Abbildung 5B bietet einen Überblick über die FBR, die durch das Einsetzen eines orthopädischen Implantats verursacht wird, und nicht über die Immunantwort, die durch eine bakterielle Infektion verursacht wird.Das Immunsystem erkennt das eingesetzte Implantat als Fremdkörper und veranlasst dann eine Reaktion der Zellen und Gewebe, um den Fremdkörper einzukapseln (53).In den Anfängen der FBR bildete sich auf der Oberfläche orthopädischer Implantate eine Versorgungsmatrix, die zur Adsorption von Fibrinogen führte.Das adsorbierte Fibrinogen bildet dann ein hochdichtes Fibrinnetzwerk, das die Anlagerung von Leukozyten fördert (54).Sobald das Fibrinnetzwerk gebildet ist, kommt es aufgrund der Infiltration von Neutrophilen zu einer akuten Entzündung.In diesem Schritt werden verschiedene Zytokine wie Tumornekrosefaktor-α (TNF-α), Interleukin-4 (IL-4) und IL-β freigesetzt und Monozyten beginnen, die Implantationsstelle zu infiltrieren und sich zu Riesenzellen zu differenzieren.Phagen (41, 55, 56).Die Reduzierung des FBR war schon immer eine Herausforderung, da ein übermäßiger FBR zu akuten und chronischen Entzündungen führen kann, die zu tödlichen Komplikationen führen können.Um die Auswirkungen bakterieller Infektionen in den Geweben rund um das nackte Implantat und LOIS zu beurteilen, wurden Hämatoxylin- und Eosin- (H&E) und Masson-Trichrom-Färbungen (MT) verwendet.Bei Kaninchen, denen nackte Substrate implantiert wurden, schritten schwere bakterielle Infektionen fort, und H&E-Gewebeschnitte zeigten deutlich Abszesse und Nekrosen, die durch Entzündungen verursacht wurden.Andererseits hemmt die extrem starke Anti-Biofouling-Oberfläche LOIS die Bakterienanhaftung, sodass keine Anzeichen einer Infektion auftreten und Entzündungen reduziert werden (Abbildung 5C).Die Ergebnisse der MT-Färbung zeigten den gleichen Trend.Die MT-Färbung zeigte jedoch auch Ödeme bei Kaninchen, denen LOIS implantiert worden war, was darauf hindeutet, dass eine Genesung bevorsteht (Abbildung 5D).Um den Grad der Immunantwort zu untersuchen, wurde eine immunhistochemische (IHC) Färbung mit den Zytokinen TNF-α und IL-6 durchgeführt, die mit der Immunantwort in Zusammenhang stehen.Ein nacktes negatives Implantat, das keinen Bakterien ausgesetzt war, wurde mit einem LOIS verglichen, das Bakterien ausgesetzt, aber nicht infiziert war, um den Heilungsprozess ohne bakterielle Infektion zu untersuchen.Abbildung 5E zeigt ein optisches Bild eines IHC-Objektträgers, der TNF-α exprimiert.Der braune Bereich stellt die Immunantwort dar, was darauf hinweist, dass die Immunantwort bei LOIS leicht reduziert ist.Darüber hinaus war die Expression von IL-6 in LOIS deutlich geringer als die negative Expression von sterilem nacktem (Abbildung 5F).Die Expression von Zytokin wurde durch Messung des Bereichs der Antikörperfärbung quantifiziert, der dem Zytokin entspricht (Abbildung 5G).Im Vergleich zu den Kaninchen, die den negativen Implantaten ausgesetzt waren, waren die Expressionsniveaus der mit LOIS implantierten Kaninchen niedriger, was einen signifikanten Unterschied zeigt.Die Abnahme der Zytokinexpression weist darauf hin, dass die langfristigen, stabilen Antifouling-Eigenschaften von LOIS nicht nur mit der Hemmung bakterieller Infektionen zusammenhängen, sondern auch mit der Abnahme von FBR, die durch am Substrat haftende Makrophagen induziert wird (53, 57, 58).Daher kann die verringerte Immunantwort aufgrund der Immunevasionseigenschaften von LOIS die Nebenwirkungen nach der Implantation, wie beispielsweise eine übermäßige Immunantwort nach einer plastischen Operation, beheben.
(A) Ein schematisches Diagramm des Mechanismus der Biofilmbildung und -ausbreitung auf der Oberfläche eines infizierten orthopädischen Implantats.eDNA, extrazelluläre DNA.(B) Schematische Darstellung der Immunantwort nach dem Einsetzen eines orthopädischen Implantats.(C) H&E-Färbung und (D) MT-Färbung des umgebenden Gewebes orthopädischer Implantate mit bloßem Positiv und LOIS.IHC der immunbezogenen Zytokine (E) TNF-α und (F) IL-6 sind gefärbte Bilder von nackt-negativen und LOIS-implantierten Kaninchen.(G) Quantifizierung der Zytokinexpression durch Flächendeckungsmessung (** P <0,01).
Die Biokompatibilität von LOIS und seine Auswirkung auf den Knochenheilungsprozess wurden in vivo mithilfe diagnostischer Bildgebung [Röntgen und Mikrocomputertomographie (CT)] und Osteoklasten-IHC untersucht.Abbildung 6A zeigt den Knochenheilungsprozess in drei verschiedenen Phasen: Entzündung, Reparatur und Umbau.Wenn es zu einer Fraktur kommt, dringen Entzündungszellen und Fibroblasten in den gebrochenen Knochen ein und beginnen, in das Gefäßgewebe hineinzuwachsen.Während der Reparaturphase breitet sich das Einwachsen von Gefäßgewebe in der Nähe der Frakturstelle aus.Gefäßgewebe liefert Nährstoffe für die Bildung von neuem Knochen, der als Kallus bezeichnet wird.Die letzte Phase des Knochenheilungsprozesses ist die Remodellierungsphase, in der die Größe des Kallus mithilfe einer Erhöhung der Anzahl aktivierter Osteoklasten auf die Größe normaler Knochen reduziert wird (59).Mithilfe von Mikro-CT-Scans wurde eine dreidimensionale (3D) Rekonstruktion der Frakturstelle durchgeführt, um die Unterschiede im Grad der Kallusbildung in jeder Gruppe zu beobachten.Beobachten Sie den Querschnitt des Femurs, um die Dicke des Kallus rund um den gebrochenen Knochen zu erkennen (Abbildung 6, B und C).Außerdem wurden die Frakturstellen aller Gruppen jede Woche mit Röntgenstrahlen untersucht, um die unterschiedlichen Knochenregenerationsprozesse in jeder Gruppe zu beobachten (Abbildung S9).Kallus und reife Knochen werden in Blau/Grün bzw. Elfenbein dargestellt.Die meisten Weichgewebe werden mit einem voreingestellten Schwellenwert herausgefiltert.Nackt positiv und SHP bestätigten die Bildung einer kleinen Menge Kallus um die Frakturstelle.Andererseits sind das freigelegte Negativ von LOIS und die Frakturstelle von dickem Kallus umgeben.Mikro-CT-Bilder zeigten, dass die Kallusbildung durch bakterielle Infektionen und infektionsbedingte Entzündungen behindert wurde.Dies liegt daran, dass das Immunsystem der Heilung septischer Verletzungen, die durch infektionsbedingte Entzündungen verursacht werden, Vorrang vor der Knochenwiederherstellung einräumt (60).Es wurden IHC- und TRAP-Färbungen (Tartrat-resistente saure Phosphatase) durchgeführt, um die Osteoklastenaktivität und die Knochenresorption zu beobachten (Abbildung 6D) (61).In Nacktpositiven und SHP wurden nur wenige aktivierte, violett gefärbte Osteoklasten gefunden.Andererseits wurden viele aktivierte Osteoklasten in der Nähe der nackten positiven und reifen Knochen von LOIS beobachtet.Dieses Phänomen weist darauf hin, dass bei Vorhandensein von Osteoklasten der Kallus um die Frakturstelle einen heftigen Umbauprozess durchläuft (62).Das Knochenvolumen und die Osteoklastenexpressionsfläche des Kallus wurden gemessen, um den Grad der Kallusbildung um die Frakturstelle in allen Gruppen zu vergleichen und so den Mikro-CT-Scan und die IHC-Ergebnisse zu quantifizieren (Abbildung 6E, 1 und 2).Wie erwartet waren die nackten Negative und die Kallusbildung bei LOIS signifikant höher als in den anderen Gruppen, was darauf hindeutet, dass ein positiver Knochenumbau stattgefunden hat (63).Abbildung S10 zeigt das optische Bild der Operationsstelle, das MT-Färbeergebnis des in der Nähe der Schraube gesammelten Gewebes und das TRAP-Färbeergebnis, das die Schnittstelle zwischen Schraube und Knochen hervorhebt.Im blanken Substrat wurde eine starke Kallus- und Fibrosebildung beobachtet, während das mit LOIS behandelte Implantat eine relativ nicht haftende Oberfläche aufwies.In ähnlicher Weise wurde im Vergleich zu nackten Negativen bei Kaninchen, denen LOIS implantiert wurde, eine geringere Fibrose beobachtet, wie durch die weißen Pfeile angezeigt.Darüber hinaus kann das feste Ödem (blauer Pfeil) auf die Immunevasionseigenschaften von LOIS zurückgeführt werden, wodurch schwere Entzündungen reduziert werden.Die antihaftbeschichtete Oberfläche rund um das Implantat und die verringerte Fibrose lassen darauf schließen, dass der Entfernungsprozess einfacher ist, was in der Regel zu weiteren Frakturen oder Entzündungen führt.Der Knochenheilungsprozess nach der Schraubenentfernung wurde anhand der Osteoklastenaktivität an der Schnittstelle zwischen Schraube und Knochen bewertet.Sowohl der bloße Knochen als auch die LOIS-Implantatschnittstelle absorbierten ähnliche Mengen an Osteoklasten, um die Knochenheilung zu fördern, was darauf hindeutet, dass die LOIS-Beschichtung keinen negativen Einfluss auf die Knochenheilung oder die Immunantwort hat.Um zu bestätigen, dass die am LOIS durchgeführte Oberflächenmodifikation den Knochenheilungsprozess nicht beeinträchtigt, wurde eine Röntgenuntersuchung verwendet, um die Knochenheilung der Kaninchen mit exponierten negativen Ionen und 6 Wochen LOIS-Implantation zu vergleichen (Abbildung 6F).Die Ergebnisse zeigten, dass LOIS im Vergleich zur nicht infizierten nackten positiven Gruppe den gleichen Grad der Knochenheilung aufwies und es in beiden Gruppen keine offensichtlichen Anzeichen einer Fraktur (kontinuierliche Osteolyselinie) gab.
(A) Schematische Darstellung des Knochenheilungsprozesses nach einer Fraktur.(B) Der Unterschied im Grad der Kallusbildung jeder Oberflächengruppe und (C) das Querschnittsbild der Frakturstelle.(D) TRAP-Färbung zur Visualisierung der Osteoklastenaktivität und Knochenresorption.Basierend auf der TRAP-Aktivität wurde die Bildung von äußerem Kallus des kortikalen Knochens quantitativ durch (E) (1) Mikro-CT und (2) Osteoklastenaktivität analysiert.(F) 6 Wochen nach der Implantation, Röntgenbilder des gebrochenen Knochens des freigelegten Negativs (hervorgehoben durch das rot gestrichelte Rechteck) und LOIS (hervorgehoben durch das blau gestrichelte Rechteck).Die statistische Analyse wurde mittels einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt.* P <0,05.** P <0,01.
Kurz gesagt, LOIS bietet eine neue Art von antibakterieller Infektionsstrategie und Immun-Escape-Beschichtung für orthopädische Implantate.Herkömmliche orthopädische Implantate mit SHP-Funktionalisierung weisen kurzfristige Anti-Biofouling-Eigenschaften auf, können diese Eigenschaften jedoch nicht über einen langen Zeitraum beibehalten.Durch die Superhydrophobie des Substrats werden Luftblasen zwischen den Bakterien und dem Substrat eingeschlossen, wodurch Lufteinschlüsse entstehen und so eine bakterielle Infektion verhindert wird.Aufgrund der Luftdiffusion können diese Lufteinschlüsse jedoch leicht entfernt werden.Andererseits hat LOIS seine Fähigkeit, biofilmbedingte Infektionen zu verhindern, gut bewiesen.Aufgrund der Anti-Abstoßungseigenschaften der in die geschichtete Mikro-/Nanostrukturoberfläche injizierten Gleitmittelschicht können infektionsbedingte Entzündungen verhindert werden.Zur Optimierung der LOIS-Herstellungsbedingungen werden verschiedene Charakterisierungsmethoden eingesetzt, darunter SEM-, AFM-, XPS- und CA-Messungen.Darüber hinaus kann LOIS auch auf verschiedene biologische Materialien angewendet werden, die üblicherweise in orthopädischen Fixierungsgeräten verwendet werden, wie z. B. PLGA, Ti, PE, POM und PPSU.Anschließend wurde LOIS in vitro getestet, um seine Anti-Biofouling-Eigenschaften gegen Bakterien und biologische Substanzen im Zusammenhang mit der Immunantwort nachzuweisen.Die Ergebnisse zeigen, dass es im Vergleich zum bloßen Implantat eine hervorragende antibakterielle und antibiofoulingartige Wirkung hat.Darüber hinaus zeigt LOIS auch nach mechanischer Beanspruchung, die in der plastischen Chirurgie unvermeidbar ist, mechanische Festigkeit.Aufgrund der selbstheilenden Eigenschaften des Schmiermittels auf der Oberfläche der Mikro-/Nanostruktur konnte LOIS seine antibiologischen Fouling-Eigenschaften erfolgreich aufrechterhalten.Um die Biokompatibilität und antibakteriellen Eigenschaften von LOIS in vivo zu untersuchen, wurde LOIS für 4 Wochen in den Oberschenkelknochen von Kaninchen implantiert.Bei Kaninchen, denen LOIS implantiert wurde, wurde keine bakterielle Infektion beobachtet.Darüber hinaus zeigte die Verwendung von IHC eine verringerte lokale Immunantwort, was darauf hindeutet, dass LOIS den Knochenheilungsprozess nicht hemmt.LOIS weist hervorragende antibakterielle und immunverhindernde Eigenschaften auf und verhindert nachweislich wirksam die Bildung von Biofilmen vor und während orthopädischer Eingriffe, insbesondere bei der Knochensynthese.Anhand eines Modells für entzündliche Femurfrakturen im Knochenmark eines Kaninchens wurde die Auswirkung biofilmbedingter Infektionen auf den Knochenheilungsprozess, der durch vorinkubierte Implantate ausgelöst wird, eingehend untersucht.Als zukünftige Studie wird ein neues In-vivo-Modell benötigt, um mögliche Infektionen nach der Implantation zu untersuchen und biofilmbedingte Infektionen während des gesamten Heilungsprozesses vollständig zu verstehen und zu verhindern.Darüber hinaus stellt die Osteoinduktion bei der Integration mit LOIS immer noch eine ungelöste Herausforderung dar.Weitere Forschung ist erforderlich, um die selektive Adhäsion osteoinduktiver Zellen oder regenerative Medizin mit LOIS zu kombinieren und diese Herausforderung zu meistern.Insgesamt stellt LOIS eine vielversprechende orthopädische Implantatbeschichtung mit mechanischer Robustheit und hervorragenden Anti-Biofouling-Eigenschaften dar, die SSI und immunologische Nebenwirkungen reduzieren kann.
Waschen Sie das 15 mm x 15 mm x 1 mm große 304 SS-Substrat (Dong Kang M-Tech Co., Korea) 15 Minuten lang in Aceton, EtOH und entionisiertem Wasser, um Verunreinigungen zu entfernen.Um eine Struktur auf Mikro-/Nanoebene auf der Oberfläche zu bilden, wird das gereinigte Substrat in eine 48 % bis 51 %ige HF-Lösung (DUKSAN Corp., Südkorea) bei 50 °C getaucht.Die Ätzzeit variiert zwischen 0 und 60 Minuten.Anschließend wurde das geätzte Substrat mit entionisiertem Wasser gereinigt und 30 Minuten lang in eine 65 %ige HNO3-Lösung (Korea DUKSAN Corp.) bei 50 °C gelegt, um eine Chromoxid-Passivierungsschicht auf der Oberfläche zu bilden.Nach der Passivierung wird das Substrat mit entionisiertem Wasser gewaschen und getrocknet, um ein Substrat mit Schichtstruktur zu erhalten.Als nächstes wurde das Substrat einem Sauerstoffplasma (100 W, 3 Minuten) ausgesetzt und sofort 12 Stunden lang bei Raumtemperatur in eine Lösung von 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Deutschland) in Toluol eingetaucht.Anschließend wurde das mit POTS beschichtete Substrat mit EtOH gereinigt und 2 Stunden lang bei 150 °C getempert, um eine dichte POTS-SAM zu erhalten.Nach der SAM-Beschichtung wurde eine Schmiermittelschicht auf dem Substrat gebildet, indem ein Perfluorpolyether-Schmiermittel (Krytox 101; DuPont, USA) mit einem Beladungsvolumen von 20 μm/cm 2 aufgetragen wurde. Filtern Sie das Schmiermittel vor der Verwendung durch einen 0,2-Mikron-Filter.Überschüssiges Schmiermittel durch 15-minütiges Kippen im 45°-Winkel entfernen.Das gleiche Herstellungsverfahren wurde für orthopädische Implantate aus 304 SS (Verriegelungsplatte und kortikale Verriegelungsschraube; Dong Kang M-Tech Co., Korea) angewendet.Alle orthopädischen Implantate sind so konzipiert, dass sie sich der Geometrie des Kaninchenfemurs anpassen.
Die Oberflächenmorphologie des Substrats und der orthopädischen Implantate wurde mittels Feldemissions-REM (Inspect F50, FEI, USA) und AFM (XE-100, Park Systems, Südkorea) untersucht.Die Oberflächenrauheit (Ra, Rq) wird durch Multiplikation der Fläche von 20 μm mit 20 μm (n=4) gemessen.Zur Analyse der chemischen Zusammensetzung der Oberfläche wurde ein XPS-System (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japan) verwendet, das mit einer Al Kα-Röntgenquelle mit einer Punktgröße von 100 μm2 ausgestattet war.Zur Messung von flüssigem CA und SA wurde ein CA-Messsystem verwendet, das mit einer dynamischen Bilderfassungskamera (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Südkorea) ausgestattet war.Für jede Messung werden 6 bis 10 μl Tröpfchen (deionisiertes Wasser, Pferdeblut, EG, 30 % Ethanol und HD) auf die Oberfläche gegeben, um CA zu messen.Wenn der Neigungswinkel des Substrats mit einer Geschwindigkeit von 2°/s (n = 4) zunimmt, wird die SA beim Fallen des Tropfens gemessen.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] und MRSA (ATCC 25923) wurden von ATCC (Manassas, Virginia, USA) gekauft und die Stammkultur wurde bei –80 °C gehalten.Vor der Verwendung wurde die gefrorene Kultur 18 Stunden lang in mit Trypsin aufgetauter Sojabohnenbrühe (Komed, Korea) bei 37 °C inkubiert und dann zur Aktivierung zweimal übertragen.Nach der Inkubation wurde die Kultur 10 Minuten lang bei 4 °C mit 10.000 U/min zentrifugiert und zweimal mit einer PBS-Lösung (pH 7,3) gewaschen.Die zentrifugierte Kultur wird dann auf Blutagarplatten (BAP) subkultiviert.MRSA und Pseudomonas aeruginosa wurden über Nacht hergestellt und in Luria-Bertani-Brühe kultiviert.Die Konzentration von Pseudomonas aeruginosa und MRSA im Inokulum wurde quantitativ anhand der KBE der Suspension in Reihenverdünnungen auf Agar bestimmt.Stellen Sie dann die Bakterienkonzentration auf 0,5 McFarland-Standard ein, was 108 KBE/ml entspricht.Anschließend die Arbeitsbakteriensuspension 100-fach auf 106 KBE/ml verdünnen.Um die antibakteriellen Hafteigenschaften zu testen, wurde das Substrat vor der Verwendung 15 Minuten lang bei 121 °C sterilisiert.Das Substrat wurde dann in 25 ml Bakteriensuspension überführt und bei 37 °C unter kräftigem Schütteln (200 U/min) 12 und 72 Stunden lang inkubiert.Nach der Inkubation wurde jedes Substrat aus dem Inkubator genommen und dreimal mit PBS gewaschen, um alle auf der Oberfläche schwimmenden Bakterien zu entfernen.Um den Biofilm auf dem Substrat zu beobachten, wurde der Biofilm mit Methanol fixiert und 2 Minuten lang mit 1 ml Crimidinorange angefärbt.Dann wurde ein Fluoreszenzmikroskop (BX51TR, Olympus, Japan) verwendet, um Bilder des gefärbten Biofilms aufzunehmen.Um den Biofilm auf dem Substrat zu quantifizieren, wurden die anhaftenden Zellen vom Substrat durch die Bead-Vortex-Methode getrennt, die als die am besten geeignete Methode zur Entfernung anhaftender Bakterien angesehen wurde (n = 4).Entfernen Sie das Substrat mit einer sterilen Pinzette aus dem Wachstumsmedium und klopfen Sie auf die Wellplatte, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen.Lose anhaftende Zellen wurden durch zweimaliges Waschen mit sterilem PBS entfernt.Jedes Substrat wurde dann in ein steriles Reagenzglas überführt, das 9 ml 0,1 % Protein-Ept-Salzlösung (PSW) und 2 g 20 bis 25 sterile Glasperlen (0,4 bis 0,5 mm Durchmesser) enthielt.Anschließend wurde 3 Minuten lang gevortext, um die Zellen von der Probe zu lösen.Nach dem Vortexen wurde die Suspension seriell 10-fach mit 0,1 % PSW verdünnt und dann wurden 0,1 ml jeder Verdünnung auf BAP beimpft.Nach 24 Stunden Inkubation bei 37 °C wurde die KBE manuell gezählt.
Für die Zellen wurden Mausfibroblasten NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) und Mausmakrophagen RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC) verwendet.Verwenden Sie Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea), um Mausfibroblasten zu kultivieren und mit 10 % Kälberserum (S103-01, Welgene) und 1 % Penicillin-Streptomycin (PS; LS202-02, Welgene (Welgene) zu ergänzen ) Verwenden Sie DMEM, um Mausmakrophagen zu kultivieren, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (S001-01, Welgene) und 1 % PS. Legen Sie das Substrat in eine Zellkulturplatte mit sechs Vertiefungen und inokulieren Sie die Zellen mit 105 Zellen/cm2. Die Zellen wurden über Nacht bei 37 °C und 5 % CO2 inkubiert. Zur Zellfärbung wurden die Zellen 20 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert und 5 Minuten lang in 50 nM Tetramethylrhodamin inkubiert Bei 37°C für 30 Minuten das Substrat mit 4′,6-Diamino-2-phenylindol (H-1200, Vector Laboratories, UK) Fixierungsmedium (n = 4 pro Zelle) verwenden , Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat-Albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Deutschland) und menschliches Plasma. Das mit Alexa Fluor 488 konjugierte Fibrinogen (F13191, Invitrogen, USA) wurde in PBS (10 mM, pH 7,4) gelöst.Die Konzentrationen von Albumin und Fibrinogen betrugen 1 bzw. 150 µg/ml.Nachdem Sie das Substrat in die Proteinlösung eingetaucht haben, spülen Sie es mit PBS ab, um die Oberfläche zu rehydrieren.Tauchen Sie dann alle Substrate in eine Platte mit sechs Vertiefungen, die die Proteinlösung enthält, und inkubieren Sie sie 30 und 90 Minuten lang bei 37 °C.Nach der Inkubation wurde das Substrat dann aus der Proteinlösung entfernt, dreimal vorsichtig mit PBS gewaschen und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert (n = 4 für jedes Protein).Für Calcium wurden Natriumchlorid (0,21 M) und Kaliumphosphat (3,77 mM) in entionisiertem Wasser gelöst.Der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von Hydrochloridlösung (1 M) auf 2,0 eingestellt.Dann wurde Calciumchlorid (5,62 mM) in der Lösung gelöst.Durch Zugabe von 1M Tris(hydroxymethyl)aminomethan wird der pH-Wert der Lösung auf 7,4 eingestellt.Tauchen Sie alle Substrate in eine Platte mit sechs Vertiefungen, die mit 1,5-facher Calciumphosphatlösung gefüllt ist, und nehmen Sie sie nach 30 Minuten aus der Lösung.Zum Färben werden 2 g Alizarinrot S (CI 58005) mit 100 ml entionisiertem Wasser gemischt.Verwenden Sie dann 10 % Ammoniumhydroxid, um den pH-Wert auf 4 einzustellen. Färben Sie das Substrat 5 Minuten lang mit Alizarinrot-Lösung, schütteln Sie dann den überschüssigen Farbstoff ab und tupfen Sie es ab.Nach dem Rüttelvorgang den Untergrund entfernen.Das Material wird dehydriert, dann 5 Minuten lang in Aceton getaucht, dann 5 Minuten lang in eine Aceton-Xylol-Lösung (1:1) getaucht und schließlich mit Xylol (n = 4) gewaschen.Es wird ein Fluoreszenzmikroskop (Axio Imager) mit Objektiven ×10 und ×20 verwendet..A2m, Zeiss, Deutschland) bildet alle Substrate ab.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) wurde verwendet, um die Adhäsionsdaten biologischer Substanzen auf jeder Gruppe von vier verschiedenen Bildgebungsbereichen zu quantifizieren.Konvertieren Sie alle Bilder zum Substratvergleich in Binärbilder mit festen Schwellenwerten.
Ein konfokales Zeiss LSM 700-Mikroskop wurde verwendet, um die Stabilität der Schmiermittelschicht im PBS im Reflexionsmodus zu überwachen.Die fluorbasierte SAM-beschichtete Glasprobe mit einer eingespritzten Gleitschicht wurde in eine PBS-Lösung getaucht und mit einem Orbitalschüttler (SHO-1D; Daihan Scientific, Südkorea) unter milden Schüttelbedingungen (120 U/min) getestet.Nehmen Sie dann die Probe und überwachen Sie den Schmierstoffverlust, indem Sie den Verlust an reflektiertem Licht messen.Um Fluoreszenzbilder im Reflexionsmodus aufzunehmen, wird die Probe einem 633-nm-Laser ausgesetzt und dann gesammelt, da das Licht von der Probe zurückreflektiert wird.Die Proben wurden in Zeitintervallen von 0, 30, 60 und 120 Stunden gemessen.
Um den Einfluss des Oberflächenmodifizierungsprozesses auf die nanomechanischen Eigenschaften orthopädischer Implantate zu bestimmen, wurde ein Nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) mit einer dreiseitigen, pyramidenförmigen Berkovich-Diamantspitze zur Messung von Nanoindendion verwendet.Die Spitzenlast beträgt 10 mN und die Fläche beträgt 100μm x 100μm.Bei allen Messungen beträgt die Be- und Entladezeit 10 s, die Haltezeit unter Spitzenbelastung 2 s.Nehmen Sie Messungen an fünf verschiedenen Orten vor und ermitteln Sie den Durchschnitt.Um die mechanische Festigkeit unter Last zu bewerten, wurde ein transversaler Dreipunkt-Biegetest mit einer Universalprüfmaschine (Instron 5966, Instron, USA) durchgeführt.Bei erhöhter Belastung wird das Substrat mit einer konstanten Geschwindigkeit von 10 N/s komprimiert.Zur Berechnung des Biegemoduls und der maximalen Druckspannung wurde das Softwareprogramm Bluehill Universal (n = 3) verwendet.
Um den Operationsprozess und die damit verbundenen mechanischen Schäden während der Operation zu simulieren, wurde der Operationsprozess in vitro durchgeführt.Die Oberschenkelknochen wurden von den hingerichteten weißen Neuseeland-Kaninchen gesammelt.Der Femur wurde gereinigt und eine Woche lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert.Wie im Tierversuch beschrieben, wurde der fixierte Femur operativ operiert.Nach der Operation wurde das orthopädische Implantat 10 Sekunden lang in Blut (Pferdeblut, KISAN, Korea) getaucht, um zu bestätigen, ob nach der mechanischen Verletzung Blutanhaftungen auftraten (n = 3).
Insgesamt 24 männliche weiße Neuseeland-Kaninchen (Gewicht 3,0 bis 3,5 kg, Durchschnittsalter 6 Monate) wurden zufällig in vier Gruppen eingeteilt: nackt negativ, nackt positiv, SHP und LOIS.Alle Verfahren mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit den ethischen Standards des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC genehmigt, KOREA-2017-0159) durchgeführt.Das orthopädische Implantat besteht aus einer Verriegelungsplatte mit fünf Löchern (Länge 41 mm, Breite 7 mm und Dicke 2 mm) und kortikalen Verriegelungsschrauben (Länge 12 mm, Durchmesser 2,7 mm) zur Frakturfixierung.Mit Ausnahme der Platten und Schrauben, die in der rein negativen Gruppe verwendet wurden, wurden alle Platten und Schrauben 12 Stunden lang in MRSA-Suspension (106 KBE/ml) inkubiert.Die nackt-negative Gruppe (n=6) wurde mit Implantaten mit nackter Oberfläche behandelt, ohne einer Bakteriensuspension ausgesetzt zu sein, als Negativkontrolle für Infektionen.Die nackte positive Gruppe (n = 6) wurde mit einem Implantat mit bloßer Oberfläche behandelt, das Bakterien ausgesetzt war, als positive Kontrolle für eine Infektion.Die SHP-Gruppe (n = 6) wurde mit bakteriell exponierten SHP-Implantaten behandelt.Schließlich wurde die LOIS-Gruppe mit bakterienexponierten LOIS-Implantaten behandelt (n = 6).Alle Tiere werden in einem Käfig gehalten und es wird für viel Futter und Wasser gesorgt.Vor der Operation wurden die Kaninchen 12 Stunden lang nüchtern gehalten.Zur Einleitung wurden die Tiere durch intramuskuläre Injektion von Xylazin (5 mg/kg) und intravenöse Injektion von Paclitaxel (3 mg/kg) anästhesiert.Anschließend verabreichen Sie 2 % Isofluran und 50 % bis 70 % medizinischen Sauerstoff (Durchflussrate 2 l/min) durch das Atmungssystem, um die Anästhesie aufrechtzuerhalten.Die Implantation erfolgt über einen direkten Zugang zum lateralen Femur.Nach Haarentfernung und Povidon-Jod-Desinfektion der Haut wurde an der Außenseite des linken mittleren Femurs ein etwa 6 cm langer Schnitt angelegt.Durch Öffnen der Lücke zwischen den Muskeln, die den Oberschenkelknochen bedecken, wird der Oberschenkelknochen vollständig freigelegt.Platzieren Sie die Platte vor dem Femurschaft und befestigen Sie sie mit vier Schrauben.Nach der Fixierung wird mit einem Sägeblatt (1 mm dick) im Bereich zwischen dem zweiten Loch und dem vierten Loch künstlich ein Bruch erzeugt.Am Ende der Operation wurde die Wunde mit Kochsalzlösung gewaschen und mit Nähten verschlossen.Jedem Kaninchen wurde Enrofloxacin (5 mg/kg), zu einem Drittel verdünnt in Kochsalzlösung, subkutan injiziert.Bei allen Tieren wurden postoperative Röntgenaufnahmen des Femurs angefertigt (0, 7, 14, 21, 28 und 42 Tage), um die Osteotomie des Knochens zu bestätigen.Nach tiefer Anästhesie wurden alle Tiere am 28. und 42. Tag durch intravenöse KCl (2 mmol/kg) getötet.Nach der Hinrichtung wurde der Femur mittels Mikro-CT gescannt, um den Knochenheilungsprozess und die Knochenneubildung zwischen den vier Gruppen zu beobachten und zu vergleichen.
Nach der Durchführung wurden die Weichteile gesammelt, die in direktem Kontakt mit den orthopädischen Implantaten standen.Das Gewebe wurde über Nacht in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert und dann in EtOH dehydriert.Das dehydrierte Gewebe wurde in Paraffin eingebettet und mit einem Mikrotom (400CS; EXAKT, Deutschland) in einer Dicke von 40 μm geschnitten.Um die Infektion sichtbar zu machen, wurden H&E-Färbung und MT-Färbung durchgeführt.Um die Wirtsreaktion zu überprüfen, wurde das geschnittene Gewebe mit Kaninchen-Anti-TNF-α-Primärantikörper (AB6671, Abcam, USA) und Kaninchen-Anti-IL-6 (AB6672; Abcam, USA) inkubiert und dann mit Meerrettich behandelt.Oxidase.Tragen Sie das Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Färbesystem gemäß den Anweisungen des Herstellers auf die Abschnitte auf.Um als braunes Reaktionsprodukt zu erscheinen, wurde in allen Teilen 3,3-Diaminobenzidin verwendet.Zur Visualisierung aller Schnitte wurde ein digitaler Objektträgerscanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungarn) verwendet, und mindestens vier Substrate in jeder Gruppe wurden mit der ImageJ-Software analysiert.
Bei allen Tieren wurden nach der Operation und jede Woche Röntgenbilder angefertigt, um die Frakturheilung zu überwachen (n=6 pro Gruppe).Nach der Durchführung wurde ein hochauflösendes Mikro-CT verwendet, um die Kallusbildung um den Femur nach der Heilung zu berechnen.Der erhaltene Femur wurde gereinigt, 3 Tage lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert und in 75 % Ethanol dehydriert.Die dehydrierten Knochen wurden dann mithilfe von Mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgien) gescannt, um 3D-Voxelbilder (2240 ​​× 2240 Pixel) der Knochenprobe zu erstellen.Verwenden Sie einen 1,0-mm-Al-Filter, um Signalrauschen zu reduzieren und eine hohe Auflösung auf alle Scans anzuwenden (E = 133 kVp, I = 60 μA, Integrationszeit = 500 ms).Mit der Nrecon-Software (Version 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgien) wurde aus der erfassten 2D-Lateralprojektion ein 3D-Volumen der gescannten Probe generiert.Zur Analyse wird das 3D-rekonstruierte Bild entsprechend der Frakturstelle in 10 mm × 10 mm × 10 mm große Würfel unterteilt.Berechnen Sie den Kallus außerhalb der Kortikalis.Die Software DataViewer (Version 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgien) wurde verwendet, um das gescannte Knochenvolumen digital umzuleiten, und die Software CT-Analyzer (Version 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgien) wurde zur Analyse verwendet.Die relativen Röntgenabsorptionskoeffizienten in reifem Knochen und Kallus werden anhand ihrer Dichte unterschieden und anschließend das Kallusvolumen quantifiziert (n = 4).Um zu bestätigen, dass die Biokompatibilität von LOIS den Knochenheilungsprozess nicht verzögert, wurden zusätzliche Röntgen- und Mikro-CT-Analysen bei zwei Kaninchen durchgeführt: der nackt-negativen Gruppe und der LOIS-Gruppe.Beide Gruppen wurden in der 6. Woche hingerichtet.
Die Oberschenkelknochen der getöteten Tiere wurden gesammelt und 3 Tage lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert.Anschließend wird das orthopädische Implantat vorsichtig aus dem Femur entfernt.Der Femur wurde 21 Tage lang mit 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation) entkalkt.Anschließend wurde der entkalkte Femur in EtOH getaucht, um ihn zu dehydrieren.Der dehydrierte Femur wurde in Xylol entnommen und in Paraffin eingebettet.Anschließend wurde die Probe mit einem automatischen Rotationsmikrotom (Leica RM2255, Leica Biosystems, Deutschland) in eine Dicke von 3 μm geschnitten.Für die TRAP-Färbung (F6760, Sigma-Aldrich, Deutschland) wurden die geschnittenen Proben entparaffiniert, rehydratisiert und 1 Stunde lang bei 37 °C in TRAP-Reagenz inkubiert.Die Bilder wurden mit einem Diascanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungarn) aufgenommen und durch Messung der Flächenabdeckung des gefärbten Bereichs quantifiziert.In jedem Experiment wurden mindestens vier Substrate in jeder Gruppe mit der ImageJ-Software analysiert.
Die statistische Signifikanzanalyse wurde mit GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA) durchgeführt.Um die Unterschiede zwischen den Bewertungsgruppen zu testen, wurden ein ungepaarter T-Test und eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) verwendet.Das Signifikanzniveau wird in der Abbildung wie folgt angegeben: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 und ****P<0,0001;NS, kein signifikanter Unterschied.
Ergänzende Materialien zu diesem Artikel finden Sie unter http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
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Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Die antibakteriellen und Immun-Escape-Beschichtungen orthopädischer Implantate können Infektionen und durch Infektionen verursachte Immunreaktionen reduzieren.
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