Bagi pasien yang menjalani operasi implan ortopedi, infeksi bakteri dan respons imun yang disebabkan oleh infeksi selalu menjadi risiko yang mengancam jiwa.Bahan biologis konvensional rentan terhadap kontaminasi biologis, yang menyebabkan bakteri menyerang area luka dan menyebabkan infeksi pasca operasi.Oleh karena itu, terdapat kebutuhan mendesak untuk mengembangkan lapisan anti-infeksi dan pelepasan kekebalan untuk implan ortopedi.Di sini, kami telah mengembangkan teknologi modifikasi permukaan canggih untuk implan ortopedi yang disebut Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), yang terinspirasi oleh permukaan halus kantong tanaman kantong semar.LOIS memiliki daya tolak cairan yang tahan lama dan kuat terhadap berbagai cairan dan zat biologis (termasuk sel, protein, kalsium, dan bakteri).Selain itu, kami memastikan ketahanan mekanis terhadap goresan dan kekuatan fiksasi dengan mensimulasikan kerusakan yang tidak dapat dihindari selama operasi in vitro.Model fraktur femur inflamasi sumsum tulang kelinci digunakan untuk mempelajari secara menyeluruh kemampuan penskalaan anti-biologis dan anti-infeksi LOIS.Kami membayangkan LOIS, yang memiliki sifat anti-biofouling dan ketahanan mekanis, merupakan langkah maju dalam bedah ortopedi bebas infeksi.
Saat ini, karena penuaan secara keseluruhan, jumlah pasien yang menderita penyakit ortopedi (seperti patah tulang pada lansia, penyakit sendi degeneratif, dan osteoporosis) telah meningkat pesat (1, 2).Oleh karena itu, institusi medis sangat mementingkan bedah ortopedi, termasuk implan ortopedi berupa sekrup, pelat, paku, dan sendi buatan (3, 4).Namun, implan ortopedi tradisional dilaporkan rentan terhadap adhesi bakteri dan pembentukan biofilm, yang dapat menyebabkan infeksi lokasi bedah (SSI) setelah operasi (5, 6).Setelah biofilm terbentuk pada permukaan implan ortopedi, pengangkatan biofilm menjadi sangat sulit bahkan dengan penggunaan antibiotik dosis besar.Oleh karena itu, biasanya menyebabkan infeksi parah pasca operasi (7, 8).Karena permasalahan di atas, pengobatan terhadap implan yang terinfeksi harus mencakup operasi ulang, termasuk pengangkatan seluruh implan dan jaringan di sekitarnya;oleh karena itu, pasien akan menderita sakit parah dan beberapa risiko (9, 10).
Untuk mengatasi beberapa masalah ini, implan ortopedi yang mengelusi obat telah dikembangkan untuk mencegah infeksi dengan menghilangkan bakteri yang menempel pada permukaan (11, 12).Namun, strategi tersebut masih menunjukkan beberapa keterbatasan.Telah dilaporkan bahwa implantasi implan yang mengelusi obat dalam jangka panjang telah menyebabkan kerusakan pada jaringan di sekitarnya dan menyebabkan peradangan, yang dapat menyebabkan nekrosis (13, 14).Selain itu, pelarut organik yang mungkin ada setelah proses pembuatan implan ortopedi yang mengelusi obat, yang dilarang keras oleh Badan Pengawas Obat dan Makanan AS, memerlukan langkah pemurnian tambahan untuk memenuhi standarnya (15).Implan yang mengelusi obat merupakan tantangan dalam pelepasan obat yang terkontrol, dan karena obatnya yang terbatas, penerapan obat dalam jangka panjang tidak mungkin dilakukan (16).
Strategi umum lainnya adalah melapisi implan dengan polimer antifouling untuk mencegah bahan biologis dan bakteri menempel pada permukaan (17).Misalnya, polimer zwitterionik telah menarik perhatian karena sifat non-perekatnya ketika bersentuhan dengan protein plasma, sel, dan bakteri.Namun, ia memiliki beberapa keterbatasan terkait stabilitas jangka panjang dan ketahanan mekanis, yang menghambat penerapan praktisnya pada implan ortopedi, terutama karena gesekan mekanis selama prosedur bedah (18, 19).Selain itu, karena biokompatibilitasnya yang tinggi, tidak diperlukannya operasi pengangkatan, dan sifat pembersihan permukaan melalui korosi, implan ortopedi yang terbuat dari bahan yang dapat terbiodegradasi telah digunakan (20, 21).Selama korosi, ikatan kimia antara matriks polimer dipecah dan terlepas dari permukaan, dan bahan yang menempel membersihkan permukaan.Namun, pengotoran anti-biologis dengan pembersihan permukaan efektif dalam waktu singkat.Selain itu, sebagian besar bahan yang dapat diserap termasuk poli(kopolimer asam laktat-asam glikolat) (PLGA), asam polilaktat (PLA) dan paduan berbasis magnesium akan mengalami biodegradasi dan erosi yang tidak merata di dalam tubuh, yang akan berdampak negatif pada stabilitas mekanik.(dua puluh dua).Selain itu, pecahan pelat yang dapat terurai secara hayati menyediakan tempat bagi bakteri untuk menempel, sehingga meningkatkan kemungkinan infeksi dalam jangka panjang.Risiko degradasi mekanis dan infeksi membatasi penerapan praktis bedah plastik (23).
Permukaan superhidrofobik (SHP) yang meniru struktur hierarki daun teratai telah menjadi solusi potensial untuk permukaan anti-pengotoran (24, 25).Ketika permukaan SHP direndam dalam cairan, gelembung udara akan terperangkap sehingga membentuk kantong udara dan mencegah adhesi bakteri (26).Namun, penelitian terbaru menunjukkan bahwa permukaan SHP memiliki kelemahan terkait ketahanan mekanis dan stabilitas jangka panjang, sehingga menghambat penerapannya pada implan medis.Selain itu, kantong udara akan larut dan kehilangan sifat anti-foulingnya, sehingga mengakibatkan adhesi bakteri lebih luas karena luas permukaan permukaan SHP yang besar (27, 28).Baru-baru ini, Aizenberg dan rekannya memperkenalkan metode inovatif pelapisan permukaan anti-biofouling dengan mengembangkan permukaan halus yang terinspirasi oleh tanaman kantong semar Nepenthes (29, 30).Permukaan halus menunjukkan stabilitas jangka panjang dalam kondisi hidrolik, sangat anti cair terhadap cairan biologis, dan memiliki sifat dapat memperbaiki sendiri.Namun, belum ada metode untuk mengaplikasikan pelapis pada implan medis yang berbentuk kompleks, juga tidak terbukti mendukung proses penyembuhan jaringan yang rusak setelah implantasi.
Di sini, kami memperkenalkan permukaan implan ortopedi berpelumas (LOIS), permukaan implan ortopedi berstruktur mikro/nano dan dikombinasikan erat dengan lapisan pelumas tipis untuk mencegahnya dikaitkan dengan operasi plastik Infeksi bakteri, seperti fiksasi fraktur.Karena struktur tingkat mikro/nano yang difungsikan fluor dengan kuat mengikat pelumas pada struktur, LOIS yang dikembangkan dapat sepenuhnya menolak adhesi berbagai cairan dan mempertahankan kinerja anti-pengotoran untuk waktu yang lama.Pelapis LOIS dapat diaplikasikan pada bahan dengan berbagai bentuk yang ditujukan untuk sintesis tulang.Sifat anti-biofouling yang sangat baik dari LOIS terhadap bakteri biofilm [Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus (MRSA) yang resisten terhadap metisilin] dan zat biologis (sel, protein, dan kalsium) telah dikonfirmasi secara in vitro.Tingkat adhesi adhesi ekstensif ke substrat kurang dari 1%.Selain itu, bahkan setelah terjadi tekanan mekanis seperti goresan permukaan, penyembuhan otomatis yang disebabkan oleh pelumas yang berpenetrasi membantu mempertahankan sifat anti-pengotorannya.Hasil uji ketahanan mekanik menunjukkan bahwa meskipun dilakukan modifikasi struktur dan kimia, kekuatan total tidak akan berkurang secara signifikan.Selain itu, percobaan in vitro yang mensimulasikan tekanan mekanis di lingkungan pembedahan dilakukan untuk membuktikan bahwa LOIS dapat menahan berbagai tekanan mekanis yang terjadi selama operasi plastik.Terakhir, kami menggunakan model fraktur femur in vivo berbasis kelinci, yang membuktikan bahwa LOIS memiliki sifat antibakteri dan biokompatibilitas yang unggul.Hasil radiologi dan histologis menegaskan bahwa perilaku pelumas yang stabil dan sifat anti-biofouling dalam waktu 4 minggu setelah implantasi dapat mencapai kinerja anti-infeksi dan pelepasan kekebalan yang efektif tanpa menunda proses penyembuhan tulang.
Gambar 1A menunjukkan diagram skema LOIS yang dikembangkan, yang ditanamkan dengan struktur skala mikro/nano pada model patah tulang paha kelinci untuk memastikan sifat anti-biologis dan anti-infeksi yang sangat baik.Metode biomimetik dilakukan untuk mensimulasikan permukaan tanaman pot air, dan untuk mencegah biofouling dengan memasukkan lapisan pelumas ke dalam struktur mikro/nano permukaan.Permukaan yang disuntik pelumas dapat meminimalkan kontak antara zat biologis dan permukaan.Oleh karena itu, karena pembentukan ikatan kimia yang stabil di permukaan, ia memiliki kinerja antifouling yang sangat baik dan stabilitas jangka panjang.Hasilnya, sifat anti-biofouling pada permukaan pelumas memungkinkan berbagai aplikasi praktis dalam penelitian biomedis.Namun, penelitian ekstensif tentang bagaimana permukaan khusus ini berinteraksi di dalam tubuh belum selesai.Dengan membandingkan LOIS dengan substrat telanjang secara in vitro menggunakan bakteri albumin dan biofilm, sifat non-perekat LOIS dapat dikonfirmasi (Gambar 1B).Selain itu, dengan menggulung tetesan air pada substrat miring dan substrat LOIS (Gambar S1 dan Film S1), kinerja kontaminasi biologis dapat ditunjukkan.Seperti yang ditunjukkan pada gambar mikroskop fluoresensi, substrat terbuka yang diinkubasi dalam suspensi protein dan bakteri menunjukkan sejumlah besar bahan biologis yang menempel pada permukaan.Namun, karena sifat anti-biofoulingnya yang sangat baik, LOIS hampir tidak menunjukkan fluoresensi apa pun.Untuk memastikan sifat anti-biofouling dan anti-infeksi, LOIS diaplikasikan pada permukaan implan ortopedi untuk sintesis tulang (pelat dan sekrup) dan ditempatkan pada model fraktur kelinci.Sebelum implantasi, implan ortopedi telanjang dan LOIS diinkubasi dalam suspensi bakteri selama 12 jam.Pra-inkubasi memastikan bahwa biofilm terbentuk pada permukaan implan yang terbuka untuk perbandingan.Gambar 1C menunjukkan foto lokasi fraktur 4 minggu setelah implantasi.Di sebelah kiri, kelinci dengan implan ortopedi telanjang menunjukkan tingkat peradangan yang parah akibat pembentukan biofilm pada permukaan implan.Hasil sebaliknya diamati pada kelinci yang diimplantasi LOIS, yaitu jaringan di sekitar LOIS tidak menunjukkan tanda-tanda infeksi maupun tanda-tanda peradangan.Selain itu, gambar optik di sebelah kiri menunjukkan lokasi pembedahan kelinci dengan implan terbuka, menunjukkan bahwa tidak ditemukan banyak perekat pada permukaan implan terbuka pada permukaan LOIS.Hal ini menunjukkan bahwa LOIS memiliki stabilitas jangka panjang dan memiliki kemampuan untuk mempertahankan sifat anti-biologis fouling dan anti-adhesi.
(A) Diagram skema LOIS dan implantasinya pada model fraktur femur kelinci.(B) Gambar mikroskop fluoresensi protein dan biofilm bakteri pada permukaan telanjang dan substrat LOIS.4 minggu setelah implantasi, (C) gambar foto lokasi fraktur dan (D) gambar sinar-X (disorot dengan persegi panjang merah).Gambar milik: Kyomin Chae, Universitas Yonsei.
Kelinci yang disterilkan dan diberi implan negatif menunjukkan proses penyembuhan tulang yang normal tanpa tanda-tanda peradangan atau infeksi.Di sisi lain, implan SHP yang diinkubasi sebelumnya dalam suspensi bakteri menunjukkan peradangan terkait infeksi pada jaringan di sekitarnya.Hal ini dapat dikaitkan dengan ketidakmampuannya menghambat adhesi bakteri dalam waktu lama (Gambar S2).Untuk membuktikan bahwa LOIS tidak mempengaruhi proses penyembuhan, namun menghambat kemungkinan infeksi terkait implantasi, gambar sinar-X dari matriks positif yang terpapar dan LOIS di lokasi fraktur dibandingkan (Gambar 1D).Gambar X-ray dari implan positif menunjukkan garis osteolisis yang persisten, menunjukkan bahwa tulang belum sembuh total.Hal ini menunjukkan bahwa proses pemulihan tulang mungkin sangat tertunda karena peradangan terkait infeksi.Sebaliknya, hal ini menunjukkan bahwa kelinci yang diimplantasikan dengan LOIS telah sembuh dan tidak menunjukkan lokasi patah tulang yang jelas.
Untuk mengembangkan implan medis dengan stabilitas dan fungsionalitas jangka panjang (termasuk ketahanan terhadap biofouling), banyak upaya telah dilakukan.Namun, keberadaan berbagai zat biologis dan dinamika adhesi jaringan membatasi pengembangan metode yang dapat diandalkan secara klinis.Untuk mengatasi kekurangan ini, kami telah mengembangkan struktur berlapis mikro/nano dan permukaan yang dimodifikasi secara kimia, yang dioptimalkan karena gaya kapiler tinggi dan afinitas kimia untuk menjaga pelumas paling halus semaksimal mungkin.Gambar 2A menunjukkan keseluruhan proses pembuatan LOIS.Pertama, siapkan substrat baja tahan karat (SS) 304 kelas medis.Kedua, struktur mikro/nano dibentuk pada substrat SS melalui etsa kimia menggunakan larutan asam fluorida (HF).Untuk mengembalikan ketahanan korosi SS, larutan asam nitrat (HNO3) (31) digunakan untuk memproses substrat yang tergores.Pasifasi meningkatkan ketahanan korosi pada substrat SS dan secara signifikan memperlambat proses korosi yang dapat mengurangi kinerja LOIS secara keseluruhan.Kemudian, dengan membentuk lapisan tunggal rakitan sendiri (SAM) dengan 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane (POTS), permukaannya dimodifikasi secara kimia untuk meningkatkan interaksi kimia antara permukaan dan Afinitas pelumas halus.Modifikasi permukaan secara signifikan mengurangi energi permukaan dari permukaan terstruktur skala mikro/nano yang dibuat, yang setara dengan energi permukaan pelumas halus.Hal ini memungkinkan pelumas menjadi basah seluruhnya, sehingga membentuk lapisan pelumas yang stabil di permukaan.Permukaan yang dimodifikasi menunjukkan peningkatan hidrofobisitas.Hasilnya menunjukkan bahwa pelumas licin menunjukkan perilaku stabil pada LOIS karena afinitas kimia yang tinggi dan gaya kapiler yang disebabkan oleh struktur mikro/nano (32, 33).Perubahan optik pada permukaan SS setelah modifikasi permukaan dan injeksi pelumas dipelajari.Struktur lapisan mikro/nano yang terbentuk pada permukaan dapat menyebabkan perubahan visual dan menggelapkan permukaan.Fenomena ini disebabkan oleh peningkatan efek hamburan cahaya pada permukaan kasar, yang meningkatkan refleksi difus yang disebabkan oleh mekanisme perangkap cahaya (34).Selain itu, setelah pelumas diinjeksikan, LOIS menjadi lebih gelap.Lapisan pelumas menyebabkan lebih sedikit cahaya yang dipantulkan dari media, sehingga menggelapkan LOIS.Untuk mengoptimalkan struktur mikro/struktur nano agar menunjukkan sudut geser (SA) terkecil untuk mencapai kinerja anti-biofouling, pemindaian mikroskop elektron (SEM) dan pasangan atom digunakan untuk melakukan waktu etsa HF yang berbeda (0, 3)., 15 dan 60 menit) Force Microscope (AFM) (Gambar 2B).Gambar SEM dan AFM menunjukkan bahwa setelah waktu pengetsaan yang singkat (pengetasan 3 menit), substrat telanjang telah membentuk kekasaran skala nano yang tidak merata.Kekasaran permukaan berubah seiring waktu pengetsaan (Gambar S3).Kurva variasi waktu menunjukkan bahwa kekasaran permukaan terus meningkat dan mencapai puncaknya pada waktu pengetsaan 15 menit, kemudian hanya terjadi sedikit penurunan nilai kekasaran pada waktu pengetsaan 30 menit.Pada titik ini, kekasaran tingkat nano terhapus, sedangkan kekasaran tingkat mikro berkembang pesat, membuat perubahan kekasaran lebih stabil.Setelah etsa selama lebih dari 30 menit, peningkatan kekasaran lebih lanjut diamati, yang dijelaskan secara rinci sebagai berikut: SS terdiri dari baja, dicampur dengan unsur-unsur termasuk besi, kromium, nikel, molibdenum dan banyak unsur lainnya.Di antara unsur-unsur tersebut, besi, kromium, dan molibdenum berperan penting dalam membentuk kekasaran skala mikron/nano pada SS dengan etsa HF.Pada tahap awal korosi, besi dan kromium terutama terkorosi karena molibdenum memiliki ketahanan korosi yang lebih tinggi dibandingkan molibdenum.Saat proses etsa berlangsung, larutan etsa mencapai kejenuhan lokal, membentuk fluorida dan oksida yang disebabkan oleh etsa.Fluorida dan oksida mengendap dan akhirnya mengendap kembali di permukaan, membentuk kekasaran permukaan dalam kisaran mikron/nano (31).Kekasaran tingkat mikro/nano ini memainkan peran penting dalam sifat penyembuhan diri LOIS.Permukaan skala ganda menghasilkan efek sinergis, meningkatkan kekuatan kapiler secara signifikan.Fenomena ini memungkinkan pelumas menembus permukaan secara stabil dan berkontribusi terhadap sifat penyembuhan diri (35).Terbentuknya kekasaran tergantung pada waktu pengetsaan.Pengetsaan dalam waktu kurang dari 10 menit, permukaannya hanya mengandung kekasaran berskala nano, yang tidak cukup untuk menampung cukup pelumas sehingga memiliki ketahanan terhadap biofouling (36).Sebaliknya, jika waktu etsa melebihi 30 menit, kekasaran skala nano yang terbentuk dari pengendapan kembali besi dan kromium akan hilang, dan hanya kekasaran skala mikro yang tersisa akibat molibdenum.Permukaan yang tergores berlebihan tidak memiliki kekasaran skala nano dan kehilangan efek sinergis dari kekasaran dua tahap, yang berdampak negatif terhadap karakteristik penyembuhan diri LOIS.Pengukuran SA dilakukan pada substrat dengan waktu etsa berbeda untuk membuktikan kinerja anti-fouling.Berbagai jenis cairan dipilih berdasarkan viskositas dan energi permukaan, termasuk air deionisasi (DI), darah, etilen glikol (EG), etanol (EtOH) dan heksadekana (HD) (Gambar S4).Pola etsa yang bervariasi terhadap waktu menunjukkan bahwa untuk berbagai cairan dengan energi permukaan dan viskositas yang berbeda, SA LOIS setelah etsa 15 menit adalah yang paling rendah.Oleh karena itu, LOIS dioptimalkan untuk mengetsa selama 15 menit untuk membentuk kekasaran skala mikron dan nano, yang cocok untuk menjaga daya tahan pelumas secara efektif dan sifat anti-fouling yang sangat baik.
(A) Diagram skema proses pembuatan LOIS empat langkah.Inset menunjukkan SAM terbentuk pada substrat.(B) Gambar SEM dan AFM, digunakan untuk mengoptimalkan struktur mikro/nano substrat pada waktu etsa yang berbeda.Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) spektrum (C) Cr2p dan (D) F1s setelah pasivasi permukaan dan pelapisan SAM.au, satuan sembarang.(E) Gambar representatif tetesan air pada substrat telanjang, tergores, SHP dan LOIS.(F) Pengukuran sudut kontak (CA) dan SA zat cair dengan tegangan permukaan berbeda pada SHP dan LOIS.Data dinyatakan sebagai mean ± SD.
Kemudian, untuk memastikan perubahan sifat kimia permukaan, spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) digunakan untuk mempelajari perubahan komposisi kimia permukaan substrat setelah setiap pelapisan permukaan.Gambar 2C menunjukkan hasil pengukuran XPS pada permukaan yang tergores HF dan permukaan yang diberi perlakuan HNO 3.Dua puncak utama pada 587,3 dan 577,7 eV dapat dikaitkan dengan ikatan Cr-O yang ada pada lapisan kromium oksida, yang merupakan perbedaan utama dari permukaan tergores HF.Hal ini terutama disebabkan oleh konsumsi besi dan kromium fluorida di permukaan oleh HNO3.Pengetsaan berbasis HNO3 memungkinkan kromium membentuk lapisan oksida pasif pada permukaan, yang membuat SS yang tergores kembali tahan terhadap korosi.Pada Gambar 2D, spektrum XPS diperoleh untuk mengonfirmasi bahwa silan berbasis fluorokarbon terbentuk di permukaan setelah lapisan SAM, yang memiliki daya tolak cairan yang sangat tinggi bahkan untuk EG, darah, dan EtOH.Pelapisan SAM diselesaikan dengan mereaksikan gugus fungsi silan dengan gugus hidroksil yang dibentuk oleh perlakuan plasma.Hasilnya, terjadi peningkatan signifikan pada puncak CF2 dan CF3.Energi pengikatan antara 286 dan 296 eV menunjukkan bahwa modifikasi kimia telah berhasil diselesaikan oleh lapisan SAM.SHP menunjukkan puncak CF2 (290,1 ​​eV) dan CF3 (293,3 eV) yang relatif besar, yang disebabkan oleh silan berbasis fluorokarbon yang terbentuk di permukaan.Gambar 2E menunjukkan gambar optik representatif dari pengukuran sudut kontak (CA) untuk berbagai kelompok air deionisasi yang bersentuhan dengan telanjang, tergores, SHP, dan LOIS.Gambar-gambar ini menunjukkan bahwa permukaan yang tergores menjadi hidrofilik karena struktur mikro/nano yang dibentuk oleh etsa kimia sehingga air deionisasi terserap ke dalam struktur.Namun, jika substrat dilapisi dengan SAM, substrat tersebut menunjukkan daya tolak air yang kuat, sehingga terbentuk SHP permukaan dan bidang kontak antara air dan permukaan menjadi kecil.Terakhir, penurunan CA diamati pada LOIS, yang dapat dikaitkan dengan penetrasi pelumas ke dalam struktur mikro, sehingga meningkatkan area kontak.Untuk membuktikan bahwa permukaan memiliki kemampuan menolak cairan dan sifat non-perekat yang sangat baik, LOIS dibandingkan dengan substrat SHP dengan mengukur CA dan SA menggunakan berbagai cairan (Gambar 2F).Berbagai jenis cairan dipilih berdasarkan viskositas dan energi permukaan, termasuk air deionisasi, darah, EG, EtOH, dan HD (Gambar S4).Hasil pengukuran CA menunjukkan bahwa ketika CA cenderung ke HD, maka nilai reduksi CA, dimana CA mempunyai energi permukaan paling rendah.Selain itu, LOIS CA secara keseluruhan rendah.Namun, pengukuran SA menunjukkan fenomena yang sangat berbeda.Kecuali air terionisasi, semua cairan menempel pada substrat SHP tanpa terlepas.Sebaliknya, LOIS menunjukkan SA yang sangat rendah, dimana ketika semua cairan dimiringkan dengan sudut lebih rendah dari 10° hingga 15°, semua cairan akan menggelinding.Hal ini menunjukkan bahwa sifat non-adhesif permukaan LOIS lebih baik dibandingkan permukaan SHP.Selain itu, pelapis LOIS juga diaplikasikan pada berbagai jenis material, antara lain titanium (Ti), polifenilsulfon (PPSU), polioksimetilen (POM), polieter eter keton (PEEK) dan polimer bioabsorbable (PLGA), yang merupakan bahan ortopedi yang dapat ditanamkan (Gambar S5)).Gambar berurutan dari tetesan pada bahan yang diolah dengan LOIS menunjukkan bahwa sifat anti-biofouling LOIS adalah sama pada semua substrat.Selain itu, hasil pengukuran CA dan SA menunjukkan bahwa sifat non-perekat LOIS dapat diterapkan pada material lain.
Untuk memastikan sifat anti-fouling LOIS, berbagai jenis substrat (termasuk telanjang, tergores, SHP dan LOIS) diinkubasi dengan Pseudomonas aeruginosa dan MRSA.Kedua bakteri ini dipilih sebagai bakteri yang mewakili rumah sakit, yang dapat menyebabkan pembentukan biofilm, yang menyebabkan SSI (37).Gambar 3 (A dan B) menunjukkan gambar mikroskop fluoresensi dan hasil pengukuran colony forming unit (CFU) dari substrat yang diinkubasi dalam suspensi bakteri masing-masing untuk jangka pendek (12 jam) dan jangka panjang (72 jam).Dalam waktu singkat, bakteri akan membentuk kelompok dan bertambah besar, menutupi dirinya dengan zat mirip lendir dan mencegah pembuangannya.Namun pada masa inkubasi 72 jam, bakteri akan matang dan mudah menyebar sehingga membentuk lebih banyak koloni atau cluster.Oleh karena itu, dapat dianggap bahwa inkubasi 72 jam merupakan jangka panjang dan merupakan waktu inkubasi yang tepat untuk membentuk biofilm yang kuat di permukaan (38).Dalam waktu singkat, permukaan yang tergores dan permukaan SHP menunjukkan adhesi bakteri, yang berkurang sekitar 25% hingga 50% dibandingkan dengan substrat kosong.Namun, karena kinerja dan stabilitas anti-biofouling yang sangat baik, LOIS tidak menunjukkan adhesi biofilm bakteri dalam jangka pendek dan panjang.Diagram skematik (Gambar 3C) menjelaskan penjelasan mekanisme anti-biological fouling pada larutan etsa, SHP dan LOIS.Asumsinya adalah substrat yang tergores dengan sifat hidrofilik akan memiliki luas permukaan lebih besar dibandingkan substrat telanjang.Oleh karena itu, adhesi bakteri akan lebih banyak terjadi pada substrat yang tergores.Namun, dibandingkan dengan substrat telanjang, substrat yang tergores memiliki lebih sedikit biofilm yang terbentuk di permukaan.Hal ini karena molekul air berikatan kuat pada permukaan hidrofilik dan bertindak sebagai pelumas air, sehingga mengganggu adhesi bakteri dalam jangka pendek (39).Namun lapisan molekul air sangat tipis dan larut dalam suspensi bakteri.Oleh karena itu, lapisan molekul air menghilang dalam waktu lama, menyebabkan adhesi dan perkembangbiakan bakteri secara ekstensif.Untuk SHP, karena sifatnya yang tidak membasahi dalam jangka pendek, adhesi bakteri terhambat.Berkurangnya adhesi bakteri dapat disebabkan oleh kantong udara yang terperangkap dalam struktur berlapis dan energi permukaan yang lebih rendah, sehingga meminimalkan kontak antara suspensi bakteri dan permukaan.Namun, adhesi bakteri yang luas diamati pada SHP karena SHP kehilangan sifat anti-pengotorannya dalam waktu yang lama.Hal ini terutama disebabkan oleh hilangnya kantong udara akibat tekanan hidrostatik dan larutnya udara dalam air.Hal ini terutama disebabkan oleh hilangnya kantong udara akibat pelarutan dan struktur berlapis yang memberikan luas permukaan lebih besar untuk adhesi (27, 40).Berbeda dengan kedua substrat ini yang mempunyai pengaruh penting terhadap stabilitas jangka panjang, pelumas pelumas yang terkandung dalam LOIS disuntikkan ke dalam struktur mikro/nano dan tidak akan hilang bahkan dalam jangka panjang.Pelumas yang diisi dengan struktur mikro/nano sangat stabil dan tertarik kuat ke permukaan karena afinitas kimianya yang tinggi, sehingga mencegah adhesi bakteri dalam waktu lama.Gambar S6 menunjukkan gambar mikroskop confocal refleksi dari substrat yang diberi pelumas yang direndam dalam larutan buffer fosfat (PBS).Gambar kontinu menunjukkan bahwa bahkan setelah 120 jam pengocokan ringan (120 rpm), lapisan pelumas pada LOIS tetap tidak berubah, yang menunjukkan stabilitas jangka panjang dalam kondisi aliran.Hal ini disebabkan adanya afinitas kimia yang tinggi antara lapisan SAM berbahan dasar fluor dan pelumas berbahan dasar perfluorokarbon, sehingga dapat terbentuk lapisan pelumas yang stabil.Oleh karena itu, kinerja anti-fouling tetap terjaga.Selain itu, substrat diuji terhadap protein representatif (albumin dan fibrinogen), yang terdapat dalam plasma, sel yang berkaitan erat dengan fungsi kekebalan (makrofag dan fibroblas), dan yang terkait dengan pembentukan tulang.Kandungan kalsiumnya sangat tinggi.(Gambar 3D, 1 dan 2, dan Gambar S7) (41, 42).Selain itu, gambar mikroskop fluoresensi uji adhesi fibrinogen, albumin dan kalsium menunjukkan karakteristik adhesi yang berbeda dari setiap kelompok substrat (Gambar S8).Selama pembentukan tulang, lapisan tulang dan kalsium yang baru terbentuk mungkin mengelilingi implan ortopedi, yang tidak hanya mempersulit pengangkatan, namun juga dapat menyebabkan cedera yang tidak terduga pada pasien selama proses pengangkatan.Oleh karena itu, rendahnya tingkat deposit kalsium pada pelat tulang dan sekrup bermanfaat untuk bedah ortopedi yang memerlukan pelepasan implan.Berdasarkan kuantifikasi area yang ditempel berdasarkan intensitas fluoresensi dan jumlah sel, kami memastikan bahwa LOIS menunjukkan sifat anti-biofouling yang sangat baik untuk semua zat biologis dibandingkan dengan substrat lainnya.Berdasarkan hasil percobaan in vitro, LOIS pengotoran antibiologis dapat diterapkan pada implan ortopedi, yang tidak hanya menghambat infeksi yang disebabkan oleh bakteri biofilm, tetapi juga mengurangi peradangan yang disebabkan oleh sistem kekebalan aktif tubuh.
(A) Gambar mikroskop fluoresensi masing-masing kelompok (telanjang, tergores, SHP dan LOIS) diinkubasi dalam suspensi Pseudomonas aeruginosa dan MRSA selama 12 dan 72 jam.(B) Jumlah CFU yang melekat pada Pseudomonas aeruginosa dan MRSA pada permukaan masing-masing kelompok.(C) Diagram skema mekanisme pengotoran anti-biologis etsa jangka pendek dan jangka panjang, SHP dan LOIS.(D) (1) Jumlah fibroblas yang menempel pada setiap substrat dan gambar mikroskop fluoresensi sel yang menempel pada telanjang dan LOIS.(2) Uji adhesi protein terkait imun, albumin dan kalsium yang terlibat dalam proses penyembuhan tulang (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 dan ****P<0,0001).tidak, tidak penting.
Dalam kasus tekanan terkonsentrasi yang tidak dapat dihindari, ketahanan mekanis selalu menjadi tantangan utama dalam penerapan lapisan antifouling.Metode gel anti-limbah tradisional didasarkan pada polimer dengan kelarutan dan kerapuhan dalam air yang rendah.Oleh karena itu, mereka biasanya rentan terhadap tekanan mekanis dalam aplikasi biomedis.Oleh karena itu, lapisan antifouling yang tahan lama secara mekanis tetap menjadi tantangan untuk aplikasi seperti implan ortopedi (43, 44).Gambar 4A(1) menunjukkan dua jenis tekanan utama yang diterapkan pada implan ortopedi, termasuk goresan (tegangan geser) dan kompresi dengan gambar optik dari implan rusak yang dihasilkan oleh forsep.Misalnya, ketika sekrup dikencangkan dengan obeng, atau ketika ahli bedah memegang erat pelat tulang dengan pinset dan memberikan gaya tekan, pelat tulang plastik akan rusak dan tergores pada skala makro dan mikro/nano (Gambar 4A, 2) .Untuk menguji apakah LOIS yang diproduksi dapat menahan kerusakan ini selama operasi plastik, nanoindentation dilakukan untuk membandingkan kekerasan substrat telanjang dan LOIS pada skala mikro/nano untuk mempelajari sifat mekanik struktur mikro/nano. Dampak (Gambar 4B).Diagram skematik menunjukkan perbedaan perilaku deformasi LOIS karena adanya struktur mikro/nano.Kurva gaya-perpindahan digambar berdasarkan hasil nanoindentasi (Gambar 4C).Gambar biru mewakili substrat kosong, yang hanya menunjukkan sedikit deformasi, seperti terlihat pada kedalaman lekukan maksimum 0,26 μm.Di sisi lain, peningkatan bertahap dalam gaya indentasi nano dan perpindahan yang diamati pada LOIS (kurva merah) mungkin menunjukkan tanda-tanda penurunan sifat mekanik, menghasilkan kedalaman nanoindentasi sebesar 1,61μm.Hal ini karena struktur mikro/nano yang terdapat pada LOIS memberikan ruang gerak yang lebih dalam pada ujung nanoindenter, sehingga deformasinya lebih besar dibandingkan dengan substrat telanjang.Konsta-Gdoutos dkk.(45) percaya bahwa karena adanya struktur nano, nanoindentasi dan kekasaran mikro/nano menyebabkan kurva nanoindentasi tidak beraturan.Area yang diarsir menunjukkan kurva deformasi tidak beraturan yang disebabkan oleh struktur nano, sedangkan area yang tidak diarsir disebabkan oleh struktur mikro.Deformasi ini dapat merusak struktur mikro/struktur nano pelumas penahan dan berdampak negatif terhadap kinerja anti-foulingnya.Untuk mempelajari dampak kerusakan pada LOIS, kerusakan yang tak terhindarkan pada struktur mikro/nano direplikasi di dalam tubuh selama operasi plastik.Dengan menggunakan tes adhesi darah dan protein, stabilitas sifat anti-biofouling LOIS setelah in vitro dapat ditentukan (Gambar 4D).Serangkaian gambar optik menunjukkan kerusakan yang terjadi di dekat lubang masing-masing media.Tes adhesi darah dilakukan untuk menunjukkan efek kerusakan mekanis pada lapisan anti-biofouling (Gambar 4E).Seperti SHP, sifat anti-kotoran hilang karena kerusakan, dan LOIS menunjukkan sifat anti-kotor yang sangat baik dengan menolak darah.Hal ini karena, karena energi permukaan digerakkan oleh aksi kapiler yang menutupi area yang rusak, aliran pelumas berstruktur mikro mengembalikan sifat anti-fouling (35).Tren yang sama diamati pada uji adhesi protein menggunakan albumin.Di area yang rusak, adhesi protein pada permukaan SHP diamati secara luas, dan dengan mengukur cakupan areanya, dapat diukur sebagai setengah dari tingkat adhesi substrat telanjang.Di sisi lain, LOIS mempertahankan sifat anti-biofoulingnya tanpa menyebabkan adhesi (Gambar 4, F dan G).Selain itu, permukaan sekrup sering mengalami tekanan mekanis yang kuat, seperti pengeboran, sehingga kami mempelajari kemampuan lapisan LOIS untuk tetap utuh pada sekrup secara in vitro.Gambar 4H menunjukkan gambar optik dari berbagai sekrup, termasuk telanjang, SHP dan LOIS.Kotak merah mewakili area target di mana tekanan mekanis yang kuat terjadi selama implantasi tulang.Mirip dengan uji adhesi protein pada pelat, mikroskop fluoresensi digunakan untuk menggambarkan adhesi protein dan mengukur area cakupan untuk membuktikan integritas lapisan LOIS, bahkan di bawah tekanan mekanis yang kuat (Gambar 4, I dan J).Sekrup yang diberi perlakuan LOIS menunjukkan kinerja anti-pengotoran yang sangat baik, dan hampir tidak ada protein yang menempel pada permukaan.Di sisi lain, adhesi protein diamati pada sekrup telanjang dan sekrup SHP, di mana cakupan area sekrup SHP adalah sepertiga dari cakupan area sekrup telanjang.Selain itu, implan ortopedi yang digunakan untuk fiksasi harus kuat secara mekanis untuk menahan tekanan yang diberikan pada lokasi fraktur, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 4K.Oleh karena itu, dilakukan uji lentur untuk mengetahui pengaruh modifikasi kimia terhadap sifat mekanik.Selain itu, hal ini dilakukan untuk menjaga tegangan tetap dari implan.Terapkan gaya mekanis vertikal hingga implan terlipat sepenuhnya dan diperoleh kurva tegangan-regangan (Gambar 4L, 1).Dua sifat termasuk modulus Young dan kekuatan lentur dibandingkan antara substrat telanjang dan LOIS sebagai indikator kekuatan mekaniknya (Gambar 4L, 2 dan 3).Modulus Young menunjukkan kemampuan suatu material untuk menahan perubahan mekanis.Modulus Young masing-masing substrat adalah 41,48±1,01 dan 40,06±0,96 GPa;perbedaan yang diamati adalah sekitar 3,4%.Selain itu, dilaporkan bahwa kekuatan lentur yang menentukan ketangguhan material adalah 102,34±1,51 GPa untuk substrat telanjang dan 96,99±0,86 GPa untuk SHP.Substrat telanjang kira-kira 5,3% lebih tinggi.Sedikit penurunan sifat mekanik mungkin disebabkan oleh efek takik.Dalam efek takik, kekasaran mikro/nano dapat bertindak sebagai serangkaian takik, yang menyebabkan konsentrasi tegangan lokal dan mempengaruhi sifat mekanik implan (46).Namun, berdasarkan fakta bahwa kekakuan tulang kortikal manusia dilaporkan antara 7,4 dan 31,6 GPa, dan modulus LOIS yang diukur melebihi modulus tulang kortikal manusia (47), LOIS cukup untuk mendukung fraktur dan keseluruhannya. sifat mekanik minimal dipengaruhi oleh modifikasi permukaan.
(A) Diagram skematik (1) tekanan mekanis yang diterapkan pada implan ortopedi selama operasi, dan (2) gambar optik dari implan ortopedi yang rusak.(B) Diagram skema pengukuran sifat nano-mekanis dengan nanoindentation dan LOIS pada permukaan telanjang.(C) Kurva perpindahan gaya nanoindentasi pada permukaan telanjang dan LOIS.(D) Setelah percobaan in vitro, simulasikan gambar optik dari berbagai jenis pelat ortopedi (area yang rusak disorot dengan persegi panjang merah) untuk mensimulasikan tekanan mekanis yang disebabkan selama operasi.(E) Uji adhesi darah dan (F) uji adhesi protein pada kelompok pelat ortopedi yang rusak.(G) Ukur cakupan area protein yang menempel pada pelat.(H) Gambar optik dari berbagai jenis sekrup ortopedi setelah percobaan in vitro.(I) Uji adhesi protein untuk mempelajari integritas lapisan yang berbeda.(J) Ukur cakupan area protein yang menempel pada sekrup.(K) Pergerakan kelinci dimaksudkan untuk menimbulkan tegangan tetap pada tulang yang patah.(L) (1) Hasil uji tekukan dan gambar optik sebelum dan sesudah tekukan.Perbedaan (2) modulus Young dan (3) kekuatan lentur antara implan telanjang dan SHP.Data dinyatakan sebagai rata-rata ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 dan ****P<0,0001).Gambar milik: Kyomin Chae, Universitas Yonsei.
Dalam situasi klinis, sebagian besar kontak bakteri dengan bahan biologis dan lokasi luka berasal dari biofilm yang matang (48).Oleh karena itu, Pusat Pengendalian dan Pencegahan Penyakit AS memperkirakan bahwa 65% dari seluruh infeksi pada manusia berhubungan dengan biofilm (49).Dalam hal ini, perlu disediakan desain eksperimental in vivo yang memberikan pembentukan biofilm yang konsisten pada permukaan implan.Oleh karena itu, kami mengembangkan model fraktur femur kelinci di mana implan ortopedi diinkubasi terlebih dahulu dalam suspensi bakteri dan kemudian ditanamkan pada femur kelinci untuk mempelajari sifat anti-fouling LOIS in vivo.Karena tiga fakta penting berikut ini, infeksi bakteri disebabkan oleh pra-kultur, bukan melalui suntikan langsung suspensi bakteri: (i) Sistem kekebalan kelinci secara alami lebih kuat dibandingkan manusia;oleh karena itu, injeksi suspensi bakteri dan bakteri planktonik dimungkinkan. Tidak berpengaruh pada pembentukan biofilm.(Ii) Bakteri planktonik lebih rentan terhadap antibiotik, dan antibiotik biasanya digunakan setelah operasi;akhirnya, (iii) suspensi bakteri planktonik dapat diencerkan oleh cairan tubuh hewan (50).Dengan melakukan pra-kultur implan dalam suspensi bakteri sebelum implantasi, kita dapat mempelajari secara menyeluruh dampak berbahaya dari infeksi bakteri dan reaksi benda asing (FBR) pada proses penyembuhan tulang.Kelinci dikorbankan 4 minggu setelah implantasi, karena osseointegrasi yang penting untuk proses penyembuhan tulang akan selesai dalam waktu 4 minggu.Kemudian, implan dikeluarkan dari kelinci untuk penelitian hilir.Gambar 5A menunjukkan mekanisme proliferasi bakteri.Implan ortopedi yang terinfeksi dimasukkan ke dalam tubuh.Sebagai hasil dari pra-inkubasi dalam suspensi bakteri, enam dari enam kelinci yang ditanam dengan implan telanjang terinfeksi, sementara tidak ada kelinci yang ditanam dengan implan yang diberi perlakuan LOIS yang terinfeksi.Infeksi bakteri berlangsung dalam tiga tahap, termasuk pertumbuhan, pematangan dan penyebaran (51).Pertama, bakteri yang menempel berkembang biak dan tumbuh di permukaan, kemudian bakteri tersebut membentuk biofilm ketika mereka mengeluarkan polimer ekstraseluler (EPS), amiloid, dan DNA ekstraseluler.Biofilm tidak hanya mengganggu penetrasi antibiotik, namun juga mendorong akumulasi enzim pengurai antibiotik (seperti β-laktamase) (52).Akhirnya, biofilm menyebarkan bakteri dewasa ke jaringan sekitarnya.Oleh karena itu, terjadilah infeksi.Selain itu, ketika ada benda asing yang masuk ke dalam tubuh, infeksi yang dapat menimbulkan respon imun yang kuat dapat menyebabkan peradangan parah, nyeri, dan penurunan imunitas.Gambar 5B memberikan gambaran umum tentang FBR yang disebabkan oleh pemasangan implan ortopedi, bukan respon imun yang disebabkan oleh infeksi bakteri.Sistem kekebalan mengenali implan yang dimasukkan sebagai benda asing, dan kemudian menyebabkan sel dan jaringan bereaksi untuk membungkus benda asing tersebut (53).Pada masa awal FBR, matriks suplai terbentuk pada permukaan implan ortopedi, yang mengakibatkan adsorpsi fibrinogen.Fibrinogen yang teradsorpsi kemudian membentuk jaringan fibrin yang sangat padat, yang mendorong perlekatan leukosit (54).Setelah jaringan fibrin terbentuk, akan terjadi peradangan akut akibat infiltrasi neutrofil.Pada langkah ini, berbagai sitokin seperti tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) dan IL-β dilepaskan, dan monosit mulai menyusup ke tempat implantasi dan berdiferensiasi menjadi sel raksasa.Fag (41, 55, 56).Menurunkan FBR selalu menjadi tantangan karena FBR yang berlebihan dapat menyebabkan peradangan akut dan kronis yang dapat mengakibatkan komplikasi yang fatal.Untuk menilai dampak infeksi bakteri pada jaringan di sekitar implan telanjang dan LOIS, digunakan pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) dan Masson trichrome (MT).Untuk kelinci yang diimplantasi dengan substrat kosong, infeksi bakteri parah berkembang, dan slide jaringan H&E dengan jelas menunjukkan abses dan nekrosis yang disebabkan oleh peradangan.Di sisi lain, LOIS permukaan anti-biofouling yang sangat kuat menghambat adhesi bakteri, sehingga tidak menunjukkan tanda-tanda infeksi dan mengurangi peradangan (Gambar 5C).Hasil pewarnaan MT menunjukkan kecenderungan yang sama.Namun, pewarnaan MT juga menunjukkan edema pada kelinci yang diimplantasikan dengan LOIS, yang menunjukkan bahwa pemulihan akan segera terjadi (Gambar 5D).Untuk mengetahui derajat respon imun, dilakukan pewarnaan imunohistokimia (IHC) dengan menggunakan sitokin TNF-α dan IL-6 yang berhubungan dengan respon imun.Implan negatif telanjang yang tidak terkena bakteri dibandingkan dengan LOIS yang terkena bakteri tetapi tidak terinfeksi untuk mempelajari proses penyembuhan tanpa adanya infeksi bakteri.Gambar 5E menunjukkan gambar optik slide IHC yang mengekspresikan TNF-α.Area berwarna coklat mewakili respon imun, menunjukkan bahwa respon imun pada LOIS sedikit berkurang.Selain itu, ekspresi IL-6 pada LOIS secara signifikan lebih kecil dibandingkan ekspresi negatif pada steril telanjang (Gambar 5F).Ekspresi sitokin diukur dengan mengukur area pewarnaan antibodi yang sesuai dengan sitokin (Gambar 5G).Dibandingkan dengan kelinci yang diberi implan negatif, tingkat ekspresi kelinci yang diberi implan LOIS lebih rendah, sehingga menunjukkan perbedaan yang berarti.Penurunan ekspresi sitokin menunjukkan bahwa sifat anti-fouling LOIS yang stabil dan jangka panjang tidak hanya terkait dengan penghambatan infeksi bakteri, tetapi juga dengan penurunan FBR, yang diinduksi oleh makrofag yang menempel pada substrat (53, 57, 58).Oleh karena itu, berkurangnya respon imun karena sifat penghindaran imun dari LOIS dapat mengatasi efek samping setelah implantasi, seperti respon imun yang berlebihan setelah operasi plastik.
(A) Diagram skema mekanisme pembentukan dan penyebaran biofilm pada permukaan implan ortopedi yang terinfeksi.eDNA, DNA ekstraseluler.(B) Diagram skema respon imun setelah pemasangan implan ortopedi.(C) Pewarnaan H&E dan (D) Pewarnaan MT pada jaringan sekitar implan ortopedi dengan bare positif dan LOIS.IHC sitokin terkait imun (E) TNF-α dan (F) IL-6 adalah gambar bernoda dari kelinci telanjang-negatif dan kelinci yang diimplantasi LOIS.(G) Kuantifikasi ekspresi sitokin berdasarkan pengukuran cakupan area (** P <0,01).
Biokompatibilitas LOIS dan pengaruhnya terhadap proses penyembuhan tulang diperiksa secara in vivo menggunakan pencitraan diagnostik [x-ray dan micro-computed tomography (CT)] dan IHC osteoklas.Gambar 6A menunjukkan proses penyembuhan tulang yang melibatkan tiga tahap berbeda: peradangan, perbaikan, dan remodeling.Saat terjadi patah tulang, sel inflamasi dan fibroblas akan menembus ke dalam tulang yang patah dan mulai tumbuh ke dalam jaringan pembuluh darah.Selama fase perbaikan, pertumbuhan jaringan pembuluh darah ke dalam menyebar di dekat lokasi fraktur.Jaringan pembuluh darah menyediakan nutrisi untuk pembentukan tulang baru yang disebut kalus.Tahap akhir dari proses penyembuhan tulang adalah tahap remodeling, dimana ukuran kalus dikurangi menjadi ukuran tulang normal dengan bantuan peningkatan kadar osteoklas yang teraktivasi (59).Rekonstruksi tiga dimensi (3D) pada lokasi fraktur dilakukan dengan menggunakan mikro-CT scan untuk mengamati perbedaan tingkat pembentukan kalus pada masing-masing kelompok.Amati penampang tulang paha untuk mengamati ketebalan kalus yang mengelilingi tulang yang retak (Gambar 6, B dan C).Sinar-X juga digunakan untuk memeriksa lokasi fraktur semua kelompok setiap minggu untuk mengamati proses regenerasi tulang yang berbeda pada setiap kelompok (Gambar S9).Kalus dan tulang dewasa masing-masing ditampilkan dalam warna biru/hijau dan gading.Sebagian besar jaringan lunak disaring dengan ambang batas yang telah ditentukan.Nude positif dan SHP mengkonfirmasi pembentukan sejumlah kecil kalus di sekitar lokasi fraktur.Di sisi lain, bagian negatif LOIS yang terbuka dan lokasi fraktur dikelilingi oleh kalus yang tebal.Gambar mikro-CT menunjukkan bahwa pembentukan kalus terhambat oleh infeksi bakteri dan peradangan terkait infeksi.Hal ini karena sistem kekebalan tubuh memprioritaskan penyembuhan luka septik yang disebabkan oleh peradangan terkait infeksi, dibandingkan pemulihan tulang (60).Pewarnaan IHC dan Tartrate-resisten Acid Phosphatase (TRAP) dilakukan untuk mengamati aktivitas osteoklas dan resorpsi tulang (Gambar 6D) (61).Hanya beberapa osteoklas teraktivasi berwarna ungu yang ditemukan pada hasil positif telanjang dan SHP.Di sisi lain, banyak osteoklas yang teraktivasi diamati di dekat tulang LOIS yang positif dan matang.Fenomena ini menunjukkan bahwa dengan adanya osteoklas, kalus di sekitar lokasi fraktur sedang mengalami proses remodeling yang hebat (62).Volume tulang dan area ekspresi osteoklas kalus diukur untuk membandingkan tingkat pembentukan kalus di sekitar lokasi fraktur pada semua kelompok, sehingga dapat mengukur hasil mikro-CT scan dan IHC (Gambar 6E, 1 dan 2).Seperti yang diharapkan, hasil negatif telanjang dan pembentukan kalus pada LOIS secara signifikan lebih tinggi dibandingkan kelompok lainnya, yang menunjukkan bahwa terjadi remodeling tulang yang positif (63).Gambar S10 menunjukkan gambar optik lokasi pembedahan, hasil pewarnaan MT dari jaringan yang dikumpulkan di dekat sekrup, dan hasil pewarnaan TRAP yang menyoroti antarmuka tulang sekrup.Pada substrat telanjang, terlihat pembentukan kalus dan fibrosis yang kuat, sedangkan implan yang diberi perlakuan LOIS menunjukkan permukaan yang relatif tidak melekat.Demikian pula, dibandingkan dengan negatif telanjang, fibrosis yang lebih rendah diamati pada kelinci yang diimplantasi dengan LOIS, seperti yang ditunjukkan oleh panah putih.Selain itu, edema yang kuat (panah biru) dapat dikaitkan dengan sifat penghindaran kekebalan LOIS, sehingga mengurangi peradangan parah.Permukaan antilengket di sekitar implan dan berkurangnya fibrosis menunjukkan bahwa proses pelepasan lebih mudah, yang biasanya menyebabkan patah tulang atau peradangan lainnya.Proses penyembuhan tulang setelah pelepasan sekrup dievaluasi berdasarkan aktivitas osteoklas pada antarmuka tulang sekrup.Baik tulang telanjang maupun antarmuka implan LOIS menyerap jumlah osteoklas yang serupa untuk penyembuhan tulang lebih lanjut, yang menunjukkan bahwa lapisan LOIS tidak memiliki efek negatif pada penyembuhan tulang atau respons imun.Untuk memastikan bahwa modifikasi permukaan yang dilakukan pada LOIS tidak mengganggu proses penyembuhan tulang, pemeriksaan X-ray digunakan untuk membandingkan penyembuhan tulang kelinci dengan paparan ion negatif dan implantasi LOIS selama 6 minggu (Gambar 6F).Hasilnya menunjukkan bahwa dibandingkan dengan kelompok telanjang positif yang tidak terinfeksi, LOIS menunjukkan tingkat penyembuhan tulang yang sama, dan tidak ada tanda-tanda patah tulang yang jelas (garis osteolisis berkelanjutan) pada kedua kelompok.
(A) Diagram skema proses penyembuhan tulang setelah patah tulang.(B) Perbedaan derajat pembentukan kalus tiap kelompok permukaan dan (C) gambaran penampang lokasi rekahan.(D) Pewarnaan TRAP untuk memvisualisasikan aktivitas osteoklas dan resorpsi tulang.Berdasarkan aktivitas TRAP, pembentukan kalus eksternal tulang kortikal dianalisis secara kuantitatif dengan (E) (1) mikro-CT dan (2) aktivitas osteoklas.(F) 6 minggu setelah implantasi, gambar rontgen tulang yang retak diekspos negatif (disorot dengan persegi panjang putus-putus merah) dan LOIS (disorot dengan persegi panjang putus-putus biru).Analisis statistik dilakukan dengan analisis varian satu arah (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Singkatnya, LOIS menyediakan strategi infeksi antibakteri jenis baru dan lapisan pelepasan kekebalan untuk implan ortopedi.Implan ortopedi konvensional dengan fungsi SHP menunjukkan sifat anti-biofouling jangka pendek, namun tidak dapat mempertahankan sifat tersebut untuk waktu yang lama.Superhidrofobisitas substrat memerangkap gelembung udara antara bakteri dan substrat, sehingga membentuk kantong udara, sehingga mencegah infeksi bakteri.Namun, karena adanya difusi udara, kantong-kantong udara ini mudah dikeluarkan.Di sisi lain, LOIS telah membuktikan kemampuannya dalam mencegah infeksi terkait biofilm.Oleh karena itu, karena sifat anti-penolakan dari lapisan pelumas yang disuntikkan ke permukaan struktur mikro/nano berlapis, peradangan terkait infeksi dapat dicegah.Berbagai metode karakterisasi termasuk pengukuran SEM, AFM, XPS dan CA digunakan untuk mengoptimalkan kondisi manufaktur LOIS.Selain itu, LOIS juga dapat diterapkan pada berbagai bahan biologi yang biasa digunakan pada peralatan fiksasi ortopedi, seperti PLGA, Ti, PE, POM dan PPSU.Kemudian, LOIS diuji secara in vitro untuk membuktikan sifat anti-biofoulingnya terhadap bakteri dan zat biologis terkait respon imun.Hasilnya menunjukkan bahwa implan ini mempunyai efek antibakteri dan anti-biofouling yang sangat baik dibandingkan dengan implan telanjang.Selain itu, LOIS menunjukkan kekuatan mekanik bahkan setelah menerapkan tekanan mekanis, yang tidak dapat dihindari dalam operasi plastik.Karena sifat penyembuhan diri pelumas pada permukaan struktur mikro/nano, LOIS berhasil mempertahankan sifat anti-pengotoran biologisnya.Untuk mempelajari biokompatibilitas dan sifat antibakteri LOIS secara in vivo, LOIS ditanamkan ke tulang paha kelinci selama 4 minggu.Tidak ada infeksi bakteri yang diamati pada kelinci yang diimplantasikan dengan LOIS.Selain itu, penggunaan IHC menunjukkan penurunan tingkat respon imun lokal, yang menunjukkan bahwa LOIS tidak menghambat proses penyembuhan tulang.LOIS menunjukkan sifat antibakteri dan penghindaran kekebalan yang sangat baik, dan telah terbukti efektif mencegah pembentukan biofilm sebelum dan selama operasi ortopedi, terutama untuk sintesis tulang.Dengan menggunakan model fraktur femur inflamasi sumsum tulang kelinci, pengaruh infeksi terkait biofilm pada proses penyembuhan tulang yang disebabkan oleh implan pra-inkubasi dipelajari secara mendalam.Sebagai penelitian di masa depan, model in vivo baru diperlukan untuk mempelajari kemungkinan infeksi setelah implantasi guna memahami sepenuhnya dan mencegah infeksi terkait biofilm selama keseluruhan proses penyembuhan.Selain itu, osteoinduksi masih merupakan tantangan yang belum terselesaikan dalam integrasi dengan LOIS.Penelitian lebih lanjut diperlukan untuk menggabungkan adhesi selektif sel osteoinduktif atau pengobatan regeneratif dengan LOIS untuk mengatasi tantangan tersebut.Secara keseluruhan, LOIS mewakili lapisan implan ortopedi yang menjanjikan dengan kekuatan mekanis dan sifat anti-biofouling yang sangat baik, yang dapat mengurangi SSI dan efek samping kekebalan tubuh.
Cuci substrat 304 SS 15mm x 15mm x 1mm (Dong Kang M-Tech Co., Korea) dalam aseton, EtOH, dan air DI selama 15 menit untuk menghilangkan kontaminan.Untuk membentuk struktur tingkat mikro/nano di permukaan, substrat yang telah dibersihkan direndam dalam larutan HF 48% hingga 51% (DUKSAN Corp., Korea Selatan) pada suhu 50°C.Waktu etsa bervariasi dari 0 hingga 60 menit.Kemudian, substrat yang tergores dibersihkan dengan air deionisasi dan ditempatkan dalam larutan HNO3 65% (Korea DUKSAN Corp.) pada suhu 50°C selama 30 menit untuk membentuk lapisan pasivasi kromium oksida di permukaan.Setelah pasivasi, substrat dicuci dengan air deionisasi dan dikeringkan untuk mendapatkan substrat dengan struktur berlapis.Selanjutnya substrat dipaparkan dengan plasma oksigen (100 W, 3 menit), dan segera direndam dalam larutan POTS 8,88 mM (Sigma-Aldrich, Germany) dalam toluena pada suhu kamar selama 12 jam.Kemudian substrat yang dilapisi POTS dibersihkan dengan EtOH, dan dianil pada suhu 150°C selama 2 jam hingga diperoleh POTS SAM yang padat.Setelah pelapisan SAM, lapisan pelumas dibentuk pada substrat dengan mengaplikasikan pelumas perfluoropolyether (Krytox 101; DuPont, USA) dengan volume pemuatan 20 μm/cm 2. Sebelum digunakan, saring pelumas melalui filter 0,2 mikron.Hilangkan kelebihan pelumas dengan memiringkannya pada sudut 45° selama 15 menit.Prosedur pembuatan yang sama digunakan untuk implan ortopedi yang terbuat dari 304 SS (pelat pengunci dan sekrup pengunci kortikal; Dong Kang M-Tech Co., Korea).Semua implan ortopedi dirancang agar sesuai dengan geometri tulang paha kelinci.
Morfologi permukaan substrat dan implan ortopedi diperiksa dengan SEM emisi lapangan (Inspect F50, FEI, USA) dan AFM (XE-100, Park Systems, Korea Selatan).Kekasaran permukaan (Ra, Rq) diukur dengan mengalikan luas 20 μm dengan 20 μm (n=4).Sistem XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Jepang) yang dilengkapi dengan sumber sinar-X Al Kα dengan ukuran titik 100μm2 digunakan untuk menganalisis komposisi kimia permukaan.Sistem pengukuran CA yang dilengkapi dengan kamera pengambilan gambar dinamis (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Korea Selatan) digunakan untuk mengukur CA dan SA cair.Untuk setiap pengukuran, 6 hingga 10 μl tetesan (air deionisasi, darah kuda, EG, etanol 30%, dan HD) ditempatkan pada permukaan untuk mengukur CA.Ketika sudut kemiringan media meningkat dengan kecepatan 2°/s (n = 4), SA diukur saat tetesan jatuh.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] dan MRSA (ATCC 25923) dibeli dari ATCC (Manassas, Virginia, USA), dan kultur stok dipertahankan pada suhu -80°C.Sebelum digunakan, kultur beku diinkubasi dalam kaldu kedelai yang dicairkan dengan trypsin (Komed, Korea) pada suhu 37°C selama 18 jam dan kemudian dipindahkan dua kali untuk mengaktifkannya.Setelah inkubasi, kultur disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4°C dan dicuci dua kali dengan larutan PBS (pH 7,3).Kultur yang disentrifugasi kemudian disubkultur pada pelat agar darah (BAP).MRSA dan Pseudomonas aeruginosa disiapkan semalaman dan dikultur dalam kaldu Luria-Bertani.Konsentrasi Pseudomonas aeruginosa dan MRSA dalam inokulum ditentukan secara kuantitatif oleh CFU suspensi dalam pengenceran serial pada agar.Kemudian, sesuaikan konsentrasi bakteri menjadi 0,5 standar McFarland atau setara dengan 108 CFU/ml.Kemudian encerkan suspensi bakteri kerja 100 kali menjadi 106 CFU/ml.Untuk menguji sifat adhesi antibakteri, substrat disterilkan pada suhu 121°C selama 15 menit sebelum digunakan.Substrat kemudian dipindahkan ke 25 ml suspensi bakteri dan diinkubasi pada suhu 37°C dengan pengocokan kuat (200 rpm) selama 12 dan 72 jam.Setelah inkubasi, setiap substrat dikeluarkan dari inkubator dan dicuci 3 kali dengan PBS untuk menghilangkan bakteri yang mengambang di permukaan.Untuk mengamati biofilm pada substrat, biofilm difiksasi dengan metanol dan diwarnai dengan 1 ml krimidin oranye selama 2 menit.Kemudian mikroskop fluoresensi (BX51TR, Olympus, Jepang) digunakan untuk mengambil gambar biofilm yang diwarnai.Untuk mengukur biofilm pada substrat, sel-sel yang menempel dipisahkan dari substrat dengan metode bead pusaran, yang dianggap sebagai metode yang paling cocok untuk menghilangkan bakteri yang menempel (n = 4).Dengan menggunakan tang steril, keluarkan substrat dari media pertumbuhan dan ketuk pelat sumur untuk menghilangkan kelebihan cairan.Sel-sel yang melekat secara longgar dihilangkan dengan mencuci dua kali dengan PBS steril.Setiap substrat kemudian dipindahkan ke tabung reaksi steril yang berisi 9 ml protein ept saline (PSW) 0,1% dan 2 g 20 hingga 25 manik-manik kaca steril (diameter 0,4 hingga 0,5 mm).Kemudian divorteks selama 3 menit untuk melepaskan sel dari sampel.Setelah divorteks, suspensi diencerkan secara seri 10 kali lipat dengan 0,1% PSW, dan kemudian 0,1 ml setiap pengenceran diinokulasi pada BAP.Setelah 24 jam inkubasi pada suhu 37°C, CFU dihitung secara manual.
Untuk sel, fibroblas tikus NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) dan makrofag tikus RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC) digunakan.Gunakan media Eagle yang dimodifikasi Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) untuk membiakkan fibroblas tikus dan suplemen dengan 10% serum anak sapi (S103-01, Welgene) dan 1% penisilin-streptomisin (PS; LS202-02, Welgene (Welgene ). Gunakan DMEM untuk membiakkan makrofag tikus, ditambah dengan 10% serum janin sapi (S001-01, Welgene) dan 1% PS. Tempatkan substrat dalam pelat kultur sel enam lubang, dan inokulasi sel pada 105 sel/cm2. Sel diinkubasi semalaman pada suhu 37°C dan 5% CO2. Untuk pewarnaan sel, sel difiksasi dengan paraformaldehyde 4% selama 20 menit dan ditempatkan dalam Inkubasi Triton X 0,5% selama 5 menit dalam -100 pada suhu 37°C selama 30 menit. Setelah proses inkubasi, gunakan media fiksasi VECTASHIELD 4′,6-diamino-2-phenylindole (H -1200, Vector Laboratories, UK) (n = 4 per sel). , fluorescein, fluorescein isothiocyanate-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Jerman) dan plasma manusia Fibrinogen terkonjugasi Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, USA) dilarutkan dalam PBS (10 mM, pH 7,4).Konsentrasi albumin dan fibrinogen masing-masing adalah 1 dan 150 μg/ml.Setelah substrat Sebelum direndam dalam larutan protein, bilas dengan PBS untuk merehidrasi permukaan.Kemudian rendam semua substrat dalam piring enam lubang yang berisi larutan protein dan inkubasi pada suhu 37°C selama 30 dan 90 menit.Setelah inkubasi, substrat kemudian dikeluarkan dari larutan protein, dicuci perlahan dengan PBS sebanyak 3 kali, dan difiksasi dengan paraformaldehyde 4% (n = 4 untuk setiap protein).Untuk kalsium, natrium klorida (0,21 M) dan kalium fosfat (3,77 mM) ) dilarutkan dalam air deionisasi.PH larutan diatur menjadi 2,0 dengan menambahkan larutan hidroklorida (1M).Kemudian kalsium klorida (5,62 mM) dilarutkan dalam larutan.Dengan menambahkan 1M tris(hidroksimetil)-amino Metana menyesuaikan pH larutan menjadi 7,4.Rendam semua substrat dalam pelat enam lubang yang diisi dengan larutan kalsium fosfat 1,5× dan keluarkan dari larutan setelah 30 menit.Untuk pewarnaan, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Campur dengan 100 ml air deionisasi.Kemudian, gunakan amonium hidroksida 10% untuk mengatur pH menjadi 4. Warnai substrat dengan larutan Alizarin Red selama 5 menit, lalu kibaskan sisa pewarna dan noda.Setelah proses pengocokan, keluarkan media.Bahan didehidrasi, kemudian direndam dalam aseton selama 5 menit, kemudian direndam dalam larutan aseton-xilena (1:1) selama 5 menit, dan terakhir dicuci dengan xilena (n = 4).Mikroskop fluoresensi (Axio Imager) dengan lensa objektif ×10 dan ×20 digunakan..A2m, Zeiss, Jerman) gambar semua media.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) digunakan untuk mengukur data adhesi zat biologis pada setiap kelompok dari empat area pencitraan yang berbeda.Ubah semua gambar menjadi gambar biner dengan ambang batas tetap untuk perbandingan media.
Mikroskop confocal Zeiss LSM 700 digunakan untuk memantau stabilitas lapisan pelumas di PBS dalam mode refleksi.Sampel kaca berlapis SAM berbasis fluor dengan lapisan pelumas yang disuntikkan direndam dalam larutan PBS, dan diuji menggunakan pengocok orbital (SHO-1D; Daihan Scientific, Korea Selatan) dalam kondisi pengocokan ringan (120 rpm).Kemudian ambil sampel dan pantau hilangnya pelumas dengan mengukur hilangnya cahaya yang dipantulkan.Untuk memperoleh gambar fluoresensi dalam mode refleksi, sampel disinari laser 633 nm kemudian dikumpulkan, karena cahaya akan dipantulkan kembali dari sampel.Sampel diukur pada interval waktu 0, 30, 60, dan 120 jam.
Untuk menentukan pengaruh proses modifikasi permukaan pada sifat nanomekanis implan ortopedi, nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) yang dilengkapi dengan ujung berlian Berkovich berbentuk piramida tiga sisi digunakan untuk mengukur nanoindenedione.Beban puncaknya adalah 10 mN dan luasnya 100μmx 100μm.Untuk semua pengukuran, waktu bongkar muat adalah 10 detik, dan waktu penahanan di bawah beban indentasi puncak adalah 2 detik.Lakukan pengukuran dari lima lokasi berbeda dan ambil rata-ratanya.Untuk mengevaluasi kinerja kekuatan mekanik di bawah beban, uji tekuk tiga titik melintang dilakukan menggunakan mesin uji universal (Instron 5966, Instron, USA).Substrat dikompresi dengan kecepatan konstan 10 N/s dengan peningkatan beban.Program perangkat lunak Bluehill Universal (n = 3) digunakan untuk menghitung modulus lentur dan tegangan tekan maksimum.
Untuk mensimulasikan proses operasi dan kerusakan mekanis terkait yang disebabkan selama operasi, proses operasi dilakukan secara in vitro.Tulang paha dikumpulkan dari kelinci putih Selandia Baru yang dieksekusi.Tulang paha dibersihkan dan difiksasi dalam paraformaldehyde 4% selama 1 minggu.Seperti yang dijelaskan dalam metode percobaan pada hewan, tulang paha tetap dioperasikan melalui pembedahan.Setelah operasi, implan ortopedi direndam dalam darah (darah kuda, KISAN, Korea) selama 10 detik untuk memastikan apakah terjadi perlengketan darah setelah cedera mekanis diterapkan (n = 3).
Sebanyak 24 kelinci putih Selandia Baru jantan (berat 3,0 hingga 3,5kg, usia rata-rata 6 bulan) dibagi secara acak menjadi empat kelompok: telanjang negatif, positif telanjang, SHP dan LOIS.Semua prosedur yang melibatkan hewan dilakukan sesuai dengan standar etika Komite Perawatan dan Penggunaan Hewan Institusional (disetujui IACUC, KOREA-2017-0159).Implan ortopedi terdiri dari pelat pengunci dengan lima lubang (panjang 41 mm, lebar 7 mm dan tebal 2 mm) dan sekrup pengunci kortikal (panjang 12 mm, diameter 2,7 mm) untuk fiksasi fraktur.Kecuali pelat dan sekrup yang digunakan pada kelompok bare-negatif, semua pelat dan sekrup diinkubasi dalam suspensi MRSA (106 CFU/ml) selama 12 jam.Kelompok negatif telanjang (n=6) diobati dengan implan permukaan telanjang tanpa paparan suspensi bakteri, sebagai kontrol negatif terhadap infeksi.Kelompok positif telanjang (n = 6) diobati dengan implan permukaan terbuka yang terkena bakteri sebagai kontrol positif terhadap infeksi.Kelompok SHP (n = 6) diobati dengan implan SHP yang terpapar bakteri.Terakhir, kelompok LOIS diobati dengan implan LOIS yang terpajan bakteri (n = 6).Semua hewan dipelihara di dalam kandang, dan banyak makanan serta air disediakan.Sebelum dilakukan operasi, kelinci dipuasakan selama 12 jam.Hewan-hewan dibius dengan injeksi xylazine intramuskular (5mg/kg) dan injeksi paclitaxel intravena (3mg/kg) untuk induksi.Setelah itu, berikan 2% isofluran dan 50% hingga 70% oksigen medis (laju aliran 2 L/menit) melalui sistem pernapasan untuk mempertahankan anestesi.Ini ditanamkan melalui pendekatan langsung ke tulang paha lateral.Setelah pencabutan bulu dan desinfeksi kulit dengan povidone-iodine, dibuat sayatan sepanjang sekitar 6 cm di bagian luar tulang paha tengah kiri.Dengan membuka celah antara otot-otot yang menutupi tulang paha, tulang paha akan terbuka sepenuhnya.Tempatkan pelat di depan poros femoralis dan kencangkan dengan empat sekrup.Setelah fiksasi, gunakan mata gergaji (tebal 1 mm) untuk membuat retakan buatan di area antara lubang kedua dan lubang keempat.Di akhir operasi, luka dicuci dengan larutan garam dan ditutup dengan jahitan.Setiap kelinci disuntik secara subkutan dengan enrofloxacin (5 mg/kg) yang diencerkan sepertiganya dalam larutan garam.Sinar-X tulang paha pasca operasi diambil pada semua hewan (0, 7, 14, 21, 28, dan 42 hari) untuk memastikan osteotomi tulang.Setelah anestesi mendalam, semua hewan dibunuh dengan KCl intravena (2 mmol/kg) pada hari 28 dan 42.Setelah eksekusi, tulang paha dipindai dengan mikro-CT untuk mengamati dan membandingkan proses penyembuhan tulang dan pembentukan tulang baru antara keempat kelompok.
Setelah eksekusi, jaringan lunak yang bersentuhan langsung dengan implan ortopedi dikumpulkan.Jaringan difiksasi dalam formalin buffer netral 10% semalaman dan kemudian didehidrasi dalam EtOH.Jaringan dehidrasi tertanam dalam parafin dan dibelah pada ketebalan 40 μm menggunakan mikrotom (400CS; EXAKT, Jerman).Untuk memvisualisasikan infeksi, dilakukan pewarnaan H&E dan pewarnaan MT.Untuk memeriksa respons inang, jaringan yang dipotong diinkubasi dengan antibodi primer anti-TNF-α kelinci (AB6671, Abcam, USA) dan kelinci anti-IL-6 (AB6672; Abcam, USA), dan kemudian diobati dengan lobak pedas.Oksidase.Terapkan sistem pewarnaan avidin-biotin complex (ABC) pada bagian sesuai dengan instruksi pabrik.Agar tampak sebagai produk reaksi coklat, digunakan 3,3-diaminobenzidine di seluruh bagian.Pemindai slide digital (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hongaria) digunakan untuk memvisualisasikan semua irisan, dan setidaknya empat substrat di setiap kelompok dianalisis dengan perangkat lunak ImageJ.
Gambar sinar-X diambil pada semua hewan setelah operasi dan setiap minggu untuk memantau penyembuhan patah tulang (n=6 per kelompok).Setelah eksekusi, mikro-CT resolusi tinggi digunakan untuk menghitung pembentukan kalus di sekitar tulang paha setelah penyembuhan.Femur yang diperoleh dibersihkan, difiksasi dalam paraformaldehyde 4% selama 3 hari, dan didehidrasi dalam etanol 75%.Tulang yang mengalami dehidrasi kemudian dipindai dengan menggunakan mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgia) untuk menghasilkan gambar voxel 3D (2240×2240 piksel) dari sampel tulang.Gunakan filter Al 1,0 mm untuk mengurangi gangguan sinyal dan menerapkan resolusi tinggi ke semua pemindaian (E = 133 kVp, I = 60 μA, waktu integrasi = 500 ms).Perangkat lunak Nrecon (versi 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgia) digunakan untuk menghasilkan volume 3D dari sampel yang dipindai dari proyeksi lateral 2D yang diperoleh.Untuk analisis, gambar rekonstruksi 3D dibagi menjadi kubus berukuran 10mm×10mm×10mm sesuai dengan lokasi rekahan.Hitung kalus di luar tulang kortikal.Perangkat lunak DataViewer (versi 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgia) digunakan untuk mengarahkan ulang volume tulang yang dipindai secara digital, dan perangkat lunak CT-Analyzer (versi 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgia) digunakan untuk analisis.Koefisien penyerapan sinar-X relatif pada tulang dewasa dan kalus dibedakan berdasarkan kepadatannya, dan kemudian volume kalus diukur (n = 4).Untuk memastikan bahwa biokompatibilitas LOIS tidak menunda proses penyembuhan tulang, analisis sinar-X dan mikro-CT tambahan dilakukan pada dua kelinci: kelompok negatif-telanjang dan kelompok LOIS.Kedua kelompok dieksekusi pada minggu ke-6.
Tulang paha hewan kurban dikumpulkan dan difiksasi dalam paraformaldehyde 4% selama 3 hari.Implan ortopedi kemudian dikeluarkan dengan hati-hati dari tulang paha.Tulang paha didekalsifikasi selama 21 hari dengan menggunakan 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Kemudian tulang paha yang telah mengalami dekalsifikasi direndam dalam EtOH hingga mengalami dehidrasi.Tulang paha yang mengalami dehidrasi dihilangkan dalam xilena dan ditanam dalam parafin.Kemudian sampel diiris dengan mikrotom putar otomatis (Leica RM2255, Leica Biosystems, Jerman) dengan ketebalan 3 μm.Untuk pewarnaan TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Jerman), sampel yang telah dipotong dideparafinisasi, direhidrasi dan diinkubasi dalam reagen TRAP pada suhu 37°C selama 1 jam.Gambar diperoleh dengan menggunakan pemindai slide (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hongaria) dan diukur dengan mengukur cakupan area area yang diwarnai.Dalam setiap percobaan, setidaknya empat substrat di setiap kelompok dianalisis dengan perangkat lunak ImageJ.
Analisis signifikansi statistik dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Uji-t tidak berpasangan dan analisis varian satu arah (ANOVA) digunakan untuk menguji perbedaan antara kelompok evaluasi.Tingkat signifikansinya ditunjukkan pada gambar sebagai berikut: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 dan ****P<0,0001;NS, tidak ada perbedaan yang signifikan.
Untuk materi tambahan artikel ini, silakan lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Ini adalah artikel akses terbuka yang didistribusikan di bawah ketentuan Lisensi Atribusi-Non-Komersial Creative Commons, yang mengizinkan penggunaan, distribusi, dan reproduksi dalam media apa pun, selama penggunaannya bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah bahwa aslinya pekerjaan sudah benar.Referensi.
Catatan: Kami hanya meminta Anda untuk memberikan alamat email sehingga orang yang Anda rekomendasikan ke halaman tersebut mengetahui bahwa Anda ingin mereka melihat email tersebut dan bahwa email tersebut bukan spam.Kami tidak akan menangkap alamat email apa pun.
Pertanyaan ini digunakan untuk menguji apakah Anda pengunjung manusia dan untuk mencegah pengiriman spam otomatis.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Lapisan antibakteri dan pelepasan kekebalan pada implan ortopedi dapat mengurangi infeksi dan respons imun yang disebabkan oleh infeksi.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Lapisan antibakteri dan pelepasan kekebalan pada implan ortopedi dapat mengurangi infeksi dan respons imun yang disebabkan oleh infeksi.
©2021 Asosiasi Amerika untuk Kemajuan Ilmu Pengetahuan.seluruh hak cipta.AAAS adalah mitra dari HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER.ScienceAdvanced ISSN 2375-2548.