For pasienter som gjennomgår ortopedisk implantatkirurgi, har bakterielle infeksjoner og infeksjonsindusert immunrespons alltid vært livstruende risiko.Konvensjonelle biologiske materialer er mottakelige for biologisk forurensning, noe som får bakterier til å invadere det skadde området og forårsake postoperativ infeksjon.Derfor er det et presserende behov for å utvikle anti-infeksjon og immune escape belegg for ortopediske implantater.Her har vi utviklet en avansert overflatemodifikasjonsteknologi for ortopediske implantater kalt Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), som er inspirert av den glatte overflaten til pitcher-plantekrukker.LOIS har langvarig og sterk væskeavstøtende motstand mot en rekke væsker og biologiske stoffer (inkludert celler, proteiner, kalsium og bakterier).I tillegg bekreftet vi den mekaniske holdbarheten mot riper og fikseringskraft ved å simulere den uunngåelige skaden under in vitro-operasjonen.Modellen for inflammatorisk lårbensfraktur fra kaninbenmarg ble brukt til å studere den anti-biologiske skaleringen og anti-infeksjonsevnen til LOIS grundig.Vi ser for oss at LOIS, som har anti-biobegroingsegenskaper og mekanisk holdbarhet, er et fremskritt innen infeksjonsfri ortopedisk kirurgi.
I dag, på grunn av generell aldring, har antallet pasienter som lider av ortopediske sykdommer (som eldre brudd, degenerative leddsykdommer og osteoporose) økt kraftig (1, 2).Medisinske institusjoner legger derfor stor vekt på ortopedisk kirurgi, inkludert ortopediske implantater av skruer, plater, spiker og kunstige ledd (3, 4).Tradisjonelle ortopediske implantater har imidlertid blitt rapportert å være mottakelige for bakteriell adhesjon og biofilmdannelse, noe som kan forårsake infeksjon på operasjonsstedet (SSI) etter kirurgi (5, 6).Når først biofilmen er dannet på overflaten av det ortopediske implantatet, blir fjerningen av biofilmen ekstremt vanskelig selv ved bruk av store doser antibiotika.Derfor fører det vanligvis til alvorlige postoperative infeksjoner (7, 8).På grunn av problemene ovenfor, bør behandlingen av infiserte implantater omfatte reoperasjon, inkludert fjerning av alle implantater og omkringliggende vev;derfor vil pasienten lide av sterke smerter og noen risikoer (9, 10).
For å løse noen av disse problemene er det utviklet medikament-eluerende ortopediske implantater for å forhindre infeksjon ved å eliminere bakterier festet til overflaten (11, 12).Strategien viser imidlertid fortsatt flere begrensninger.Det er rapportert at langtidsimplantasjon av medikamentavgivende implantater har forårsaket skade på omkringliggende vev og forårsaket betennelse, som kan føre til nekrose (13, 14).I tillegg krever de organiske løsningsmidlene som kan eksistere etter produksjonsprosessen av medikamentavgivende ortopediske implantater, som er strengt forbudt av US Food and Drug Administration, ytterligere rensetrinn for å oppfylle standardene (15).Medikamenteluerende implantater er utfordrende for kontrollert frigjøring av medikamenter, og på grunn av deres begrensede medikamentbelastning er langtidsbruk av legemidlet ikke mulig (16).
En annen vanlig strategi er å belegge implantatet med en bunnstoff-polymer for å forhindre at biologisk materiale og bakterier fester seg til overflaten (17).For eksempel har zwitterioniske polymerer tiltrukket seg oppmerksomhet på grunn av deres ikke-klebende egenskaper når de er i kontakt med plasmaproteiner, celler og bakterier.Den har imidlertid noen begrensninger knyttet til langsiktig stabilitet og mekanisk holdbarhet, som hindrer dens praktiske anvendelse i ortopediske implantater, spesielt på grunn av mekanisk skraping under kirurgiske prosedyrer (18, 19).I tillegg, på grunn av sin høye biokompatibilitet, manglende behov for fjerningskirurgi og overflaterensende egenskaper gjennom korrosjon, har ortopediske implantater laget av biologisk nedbrytbare materialer blitt brukt (20, 21).Under korrosjon brytes de kjemiske bindingene mellom polymermatrisen ned og løsnes fra overflaten, og adherentene renser overflaten.Imidlertid er antibiologisk begroing ved overflaterengjøring effektiv på kort tid.I tillegg vil de fleste absorberbare materialer inkludert poly(melkesyre-glykolsyrekopolymer) (PLGA), polymelkesyre (PLA) og magnesiumbaserte legeringer gjennomgå ujevn biologisk nedbrytning og erosjon i kroppen, noe som vil påvirke mekanisk stabilitet negativt.(tjueto).I tillegg gir de biologisk nedbrytbare platefragmentene et sted for bakterier å feste seg, noe som øker sjansen for infeksjon på sikt.Denne risikoen for mekanisk nedbrytning og infeksjon begrenser den praktiske anvendelsen av plastisk kirurgi (23).
Superhydrofobe (SHP) overflater som etterligner den hierarkiske strukturen til lotusblader har blitt en potensiell løsning for begroingshindrende overflater (24, 25).Når SHP-overflaten er nedsenket i væske, vil luftbobler bli fanget, og dermed danne luftlommer og forhindre bakteriell adhesjon (26).Nyere studier har imidlertid vist at SHP-overflaten har ulemper knyttet til mekanisk holdbarhet og langsiktig stabilitet, noe som hindrer bruken i medisinske implantater.Dessuten vil luftlommene løse seg opp og miste sine begroingshindrende egenskaper, noe som resulterer i bredere bakteriell adhesjon på grunn av det store overflatearealet til SHP-overflaten (27, 28).Nylig introduserte Aizenberg og medarbeidere en innovativ metode for anti-biobegroing overflatebelegg ved å utvikle en glatt overflate inspirert av Nepenthes pitcher plant (29, 30).Den glatte overflaten viser langtidsstabilitet under hydrauliske forhold, er ekstremt væskeavvisende for biologiske væsker, og har selvreparerende egenskaper.Imidlertid er det verken en metode for å påføre et belegg på et kompleksformet medisinsk implantat, og det er heller ikke bevist å støtte helingsprosessen av skadet vev etter implantasjon.
Her introduserer vi en smurt ortopedisk implantatoverflate (LOIS), en mikro/nanostrukturert ortopedisk implantatoverflate og tett kombinert med et tynt smørelag for å forhindre at det blir assosiert med plastisk kirurgi Bakterielle infeksjoner, som bruddfiksering.Fordi den fluor-funksjonaliserte mikro/nano-nivå strukturen fester smøremidlet på strukturen, kan den utviklede LOIS fullstendig avvise adhesjonen til ulike væsker og opprettholde anti-fouling ytelse i lang tid.LOIS-belegg kan påføres materialer med forskjellige former beregnet for bensyntese.De utmerkede anti-biobegroingsegenskapene til LOIS mot biofilmbakterier [Pseudomonas aeruginosa og meticillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)] og biologiske stoffer (celler, proteiner og kalsium) er bekreftet in vitro.Adhesjonshastigheten for omfattende vedheft til underlaget er mindre enn 1 %.I tillegg, selv etter mekanisk påkjenning som overflateriper, hjelper selvhelbredelsen forårsaket av det penetrerende smøremiddelet til å opprettholde dets antigroingsegenskaper.De mekaniske holdbarhetstestresultatene viser at selv etter strukturell og kjemisk modifikasjon vil ikke den totale styrken reduseres vesentlig.I tillegg ble det utført et in vitro-eksperiment som simulerer den mekaniske påkjenningen i det kirurgiske miljøet for å bevise at LOIS tåler ulike mekaniske påkjenninger som oppstår under plastisk kirurgi.Til slutt brukte vi en kaninbasert in vivo lårbensbruddmodell, som beviste at LOIS har overlegne antibakterielle egenskaper og biokompatibilitet.Radiologiske og histologiske resultater bekreftet at stabil smøremiddeladferd og anti-biobegroingsegenskaper innen 4 uker etter implantasjon kan oppnå effektiv anti-infeksjon og immunfluktytelse uten å forsinke beinhelingsprosessen.
Figur 1A viser et skjematisk diagram av den utviklede LOIS, som er implantert med strukturer i mikro/nanoskala i lårbensfrakturmodellen for kanin for å bekrefte dens utmerkede anti-biologisk begroing og anti-infeksjonsegenskaper.En biomimetisk metode utføres for å simulere overflaten til en vannpotteplante, og for å forhindre biobegroing ved å inkorporere et smøremiddellag i mikro/nano-strukturen til overflaten.Overflaten injisert med smøremiddel kan minimere kontakten mellom biologiske stoffer og overflaten.Derfor, på grunn av dannelsen av stabile kjemiske bindinger på overflaten, har den utmerket bunnstoff-ytelse og langsiktig stabilitet.Som et resultat tillater de anti-biobegroingsegenskapene til smøreoverflaten ulike praktiske anvendelser i biomedisinsk forskning.Omfattende forskning på hvordan denne spesielle overflaten virker i kroppen er imidlertid ennå ikke fullført.Ved å sammenligne LOIS med nakne underlag in vitro ved bruk av albumin og biofilmbakterier, kan ikke-klebingen til LOIS bekreftes (figur 1B).I tillegg, ved å rulle av vanndråpene på det skråstilte nakne substratet og LOIS-substratet (Figur S1 og Movie S1), kan den biologiske forurensningsytelsen demonstreres.Som vist i fluorescensmikroskopbildet, viste det eksponerte substratet inkubert i en suspensjon av protein og bakterier en stor mengde biologisk materiale som festet seg til overflaten.Men på grunn av sine utmerkede anti-biobegroingsegenskaper, viser LOIS knapt noen fluorescens.For å bekrefte dens anti-biobegroing og anti-infeksjonsegenskaper, ble LOIS påført overflaten av ortopediske implantater for beinsyntese (plater og skruer) og plassert i en kaninfrakturmodell.Før implantasjon ble det nakne ortopediske implantatet og LOIS inkubert i en bakteriesuspensjon i 12 timer.Pre-inkubasjonen sikrer at det dannes en biofilm på overflaten av det eksponerte implantatet for sammenligning.Figur 1C viser et bilde av bruddstedet 4 uker etter implantasjon.Til venstre viste en kanin med et bart ortopedisk implantat et alvorlig nivå av betennelse på grunn av dannelsen av en biofilm på overflaten av implantatet.Det motsatte resultatet ble observert hos kaniner implantert med LOIS, det vil si at det omkringliggende vevet til LOIS verken viste tegn på infeksjon eller tegn på betennelse.I tillegg indikerer det optiske bildet til venstre operasjonsstedet til kaninen med det eksponerte implantatet, noe som indikerer at det ikke ble funnet flere lim på overflaten av det eksponerte implantatet på overflaten av LOIS.Dette viser at LOIS har langsiktig stabilitet og har evnen til å opprettholde sine anti-biologiske begroing og anti-adhesjonsegenskaper.
(A) Skjematisk diagram av LOIS og dets implantasjon i en lårbensfrakturmodell av kanin.(B) Fluorescensmikroskopibilde av protein og bakteriell biofilm på bar overflate og LOIS-substrat.4 uker etter implantasjon, (C) et fotografisk bilde av bruddstedet og (D) et røntgenbilde (uthevet med et rødt rektangel).Bilde med tillatelse: Kyomin Chae, Yonsei University.
De steriliserte, eksponerte negativt implanterte kaninene viste en normal beinhelingsprosess uten tegn til betennelse eller infeksjon.På den annen side viser SHP-implantater pre-inkubert i en bakteriesuspensjon infeksjonsrelatert betennelse i det omkringliggende vevet.Dette kan tilskrives dens manglende evne til å hemme bakteriell adhesjon i lang tid (Figur S2).For å bevise at LOIS ikke påvirker helingsprosessen, men hemmer mulige infeksjoner relatert til implantasjon, ble røntgenbilder av den eksponerte positive matrisen og LOIS på bruddstedet sammenlignet (Figur 1D).Røntgenbildet av det nakne positive implantatet viste vedvarende osteolyselinjer, noe som indikerte at beinet ikke var fullstendig grodd.Dette tyder på at beingjenopprettingsprosessen kan bli sterkt forsinket på grunn av infeksjonsrelatert betennelse.Tvert imot viste den at kaninene implantert med LOIS hadde grodd og ikke viste noe åpenbart bruddsted.
For å utvikle medisinske implantater med langsiktig stabilitet og funksjonalitet (inkludert resistens mot biobegroing) er det gjort mange anstrengelser.Imidlertid begrenser tilstedeværelsen av ulike biologiske stoffer og dynamikken i vevsadhesjon utviklingen av deres klinisk pålitelige metoder.For å overkomme disse manglene har vi utviklet en mikro/nano lagdelt struktur og kjemisk modifisert overflate, som er optimert på grunn av høy kapillærkraft og kjemisk affinitet for å holde det jevneste smøremiddelet i størst grad.Figur 2A viser den totale produksjonsprosessen til LOIS.Forbered først et rustfritt stål (SS) 304-substrat av medisinsk kvalitet.For det andre dannes mikro/nano-strukturen på SS-substratet ved kjemisk etsing ved bruk av flussyre (HF)-løsning.For å gjenopprette korrosjonsmotstanden til SS, brukes en salpetersyre (HNO3)-løsning (31) for å behandle det etsede substratet.Passivering øker korrosjonsmotstanden til SS-substratet og bremser korrosjonsprosessen betydelig som kan redusere den generelle ytelsen til LOIS.Deretter, ved å danne et selvmontert monolag (SAM) med 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyltrietoksysilan (POTS), blir overflaten kjemisk modifisert for å forbedre den kjemiske interaksjonen mellom overflaten og den glatte smøremiddelaffiniteten.Overflatemodifikasjonen reduserer overflateenergien til den strukturerte overflaten i mikro/nanoskala betydelig, som samsvarer med overflateenergien til det glatte smøremiddelet.Dette gjør at smøremidlet blir fullstendig fuktet, og danner dermed et stabilt smøremiddellag på overflaten.Den modifiserte overflaten viser forbedret hydrofobitet.Resultatene viser at det glatte smøremidlet viser stabil oppførsel på LOIS på grunn av den høye kjemiske affiniteten og kapillærkraften forårsaket av mikro/nano-strukturen (32, 33).De optiske endringene på overflaten av SS etter overflatemodifisering og smøremiddelinjeksjon ble studert.Den mikro/nano lagdelte strukturen som dannes på overflaten kan forårsake visuelle endringer og gjøre overflaten mørkere.Dette fenomenet tilskrives den forbedrede lysspredningseffekten på den ru overflaten, som øker den diffuse refleksjonen forårsaket av lysfangemekanismen (34).I tillegg, etter at smøremidlet er injisert, blir LOIS mørkere.Smørelaget fører til at mindre lys reflekteres fra underlaget, og dermed mørkere LOIS.For å optimere mikrostrukturen/nanostrukturen for å vise den minste glidevinkelen (SA) for å oppnå anti-biobegroing ytelse, ble skanneelektronmikroskopi (SEM) og atompar brukt for å utføre forskjellige HF-etsetider (0, 3)., 15 og 60 minutter) Kraftmikroskop (AFM) (Figur 2B).SEM- og AFM-bilder viser at etter kort tid med etsing (3 minutter med etsing), har det nakne underlaget dannet ujevn nanoskala ruhet.Overflatens ruhet endres med etsetiden (Figur S3).Den tidsvarierende kurven viser at overflateruheten fortsetter å øke og når en topp ved 15 minutters etsing, og da observeres kun en liten nedgang i ruhetsverdien ved 30 minutters etsing.På dette tidspunktet blir ruheten på nanonivå etset bort, mens ruheten på mikronivået utvikler seg kraftig, noe som gjør ruhetsendringen mer stabil.Etter etsing i mer enn 30 minutter observeres en ytterligere økning i ruhet, som forklares i detalj som følger: SS er sammensatt av stål, legert med elementer inkludert jern, krom, nikkel, molybden og mange andre elementer.Blant disse elementene spiller jern, krom og molybden en viktig rolle i å danne mikron/nanoskala ruhet på SS ved HF-etsing.I de tidlige stadiene av korrosjon er jern og krom hovedsakelig korrodert fordi molybden har høyere korrosjonsbestandighet enn molybden.Etter hvert som etsingen skrider frem, når etseløsningen lokal overmetning, og danner fluorider og oksider forårsaket av etsing.Fluorid og oksid utfelles og avleires til slutt på overflaten, og danner en overflateruhet i mikron/nano-området (31).Denne mikro/nano-nivå ruheten spiller en viktig rolle i de selvhelbredende egenskapene til LOIS.Overflaten med dobbel skala gir en synergistisk effekt som øker kapillærkraften kraftig.Dette fenomenet lar smøremidlet trenge stabilt inn i overflaten og bidrar til selvhelbredende egenskaper (35).Dannelsen av ruhet avhenger av etsetiden.Under 10 minutter med etsing inneholder overflaten kun ruhet i nanoskala, som ikke er nok til å holde nok smøremiddel til å ha motstand mot biologisk begroing (36).På den annen side, hvis etsetiden overstiger 30 minutter, vil nanoskala ruheten dannet ved gjenavsetning av jern og krom forsvinne, og bare mikroskala ruheten vil forbli på grunn av molybden.Den over-etsede overflaten mangler ruhet i nanoskala og mister den synergistiske effekten av to-trinns ruhet, noe som negativt påvirker de selvhelbredende egenskapene til LOIS.SA-målinger ble utført på underlag med forskjellige etsetider for å bevise bunnhindrende ytelse.Ulike typer væsker ble valgt basert på viskositet og overflateenergi, inkludert avionisert (DI) vann, blod, etylenglykol (EG), etanol (EtOH) og heksadekan (HD) (Figur S4).Det tidsvarierende etsemønsteret viser at for ulike væsker med ulike overflateenergier og viskositeter, er SA for LOIS etter 15 minutters etsing den laveste.Derfor er LOIS optimalisert for å etse i 15 minutter for å danne mikron og nanoskala ruhet, noe som er egnet for effektivt å opprettholde holdbarheten til smøremidlet og utmerkede anti-fouling egenskaper.
(A) Skjematisk diagram av den fire-trinns produksjonsprosessen til LOIS.Innsatsen viser SAM dannet på underlaget.(B) SEM- og AFM-bilder, brukt til å optimalisere mikro/nanostrukturen til underlaget under forskjellige etsetider.Røntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) spektra av (C) Cr2p og (D) F1s etter overflatepassivering og SAM-belegg.au, vilkårlig enhet.(E) Representative bilder av vanndråper på bare, etset, SHP og LOIS underlag.(F) Kontaktvinkelen (CA) og SA-måling av væsker med forskjellige overflatespenninger på SHP og LOIS.Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD.
Deretter, for å bekrefte endringen i overflatens kjemiske egenskaper, ble røntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) brukt for å studere endringen i den kjemiske sammensetningen av underlagsoverflaten etter hvert overflatebelegg.Figur 2C viser XPS-måleresultatene for den HF-etsede overflaten og den HNO 3-behandlede overflaten.De to hovedtoppene ved 587,3 og 577,7 eV kan tilskrives Cr-O-bindingen som eksisterer i kromoksidlaget, som er hovedforskjellen fra den HF-etsede overflaten.Dette skyldes hovedsakelig forbruket av jern og kromfluorid på overflaten av HNO3.Den HNO3-baserte etsingen lar krom danne et passiverende oksidlag på overflaten, noe som gjør den etsede SS-en igjen motstandsdyktig mot korrosjon.I figur 2D ble XPS-spektra oppnådd for å bekrefte at fluorkarbonbasert silan ble dannet på overflaten etter SAM-belegget, som har ekstremt høy væskeavstøtende evne selv for EG, blod og EtOH.SAM-belegget fullføres ved å reagere silanfunksjonelle grupper med hydroksylgrupper dannet ved plasmabehandling.Som et resultat ble det observert en signifikant økning i CF2- og CF3-topper.Bindingsenergien mellom 286 og 296 eV indikerer at den kjemiske modifikasjonen er vellykket fullført av SAM-belegget.SHP viser relativt store CF2 (290,1 eV) og CF3 (293,3 eV) topper, som er forårsaket av den fluorkarbonbaserte silanen dannet på overflaten.Figur 2E viser representative optiske bilder av kontaktvinkelmålinger (CA) for forskjellige grupper av avionisert vann i kontakt med bare, etset, SHP og LOIS.Disse bildene viser at den etsede overflaten blir hydrofil på grunn av mikro/nano-strukturen dannet ved kjemisk etsing slik at avionisert vann absorberes inn i strukturen.Men når substratet er belagt med SAM, viser substratet sterk vannavstøtende evne, slik at det dannes en overflate-SHP og kontaktområdet mellom vann og overflaten er lite.Til slutt ble det observert en reduksjon i CA i LOIS, som kan tilskrives penetrering av smøremiddel inn i mikrostrukturen, og dermed øke kontaktarealet.For å bevise at overflaten har utmerket væskeavstøtende og ikke-klebende egenskaper, ble LOIS sammenlignet med SHP-substratet ved å måle CA og SA ved å bruke forskjellige væsker (Figur 2F).Ulike typer væsker ble valgt basert på viskositet og overflateenergi, inkludert avionisert vann, blod, EG, EtOH og HD (Figur S4).CA-målingsresultater viser at når CA har en tendens til HD, er reduksjonsverdien til CA, der CA har lavest overflateenergi.I tillegg er LOIS for den generelle CA lav.SA-målingen viser imidlertid et helt annet fenomen.Bortsett fra det ioniserte vannet, fester alle væsker seg til SHP-substratet uten å skli av.På den annen side viser LOIS en svært lav SA, der når all væsken vippes i en vinkel lavere enn 10° til 15°, vil all væske rulle av.Dette viser sterkt at ikke-klebingen til LOIS er bedre enn SHP-overflaten.I tillegg påføres LOIS-belegg også på ulike typer materialer, inkludert titan (Ti), polyfenylsulfon (PPSU), polyoksymetylen (POM), polyeter-eterketon (PEEK) og bioabsorberbare polymerer (PLGA), de er implanterbare ortopediske materialer (figur S5)).De sekvensielle bildene av dråpene på materialet behandlet av LOIS viser at antibiobegroingsegenskapene til LOIS er de samme på alle underlag.I tillegg viser måleresultatene til CA og SA at de ikke-klebende egenskapene til LOIS kan brukes på andre materialer.
For å bekrefte de begroingshindrende egenskapene til LOIS, ble ulike typer underlag (inkludert bare, etset, SHP og LOIS) inkubert med Pseudomonas aeruginosa og MRSA.Disse to bakteriene ble valgt ut som representative sykehusbakterier, noe som kan føre til dannelse av biofilmer som fører til SSI (37).Figur 3 (A og B) viser fluorescensmikroskopbildene og måleresultatene for kolonidannende enhet (CFU) av substratene inkubert i bakteriesuspensjonen for henholdsvis kortsiktig (12 timer) og langsiktig (72 timer).I løpet av kort tid vil bakterier danne klynger og vokse i størrelse, dekke seg med slimlignende stoffer og forhindre at de fjernes.I løpet av den 72-timers inkubasjonen vil imidlertid bakteriene modnes og bli lette å spre for å danne flere kolonier eller klynger.Derfor kan det vurderes at 72-timers inkubasjon er langsiktig og er passende inkubasjonstid for å danne en sterk biofilm på overflaten (38).I løpet av kort tid viste den etsede overflaten og overflaten til SHP bakteriell adhesjon, som ble redusert med omtrent 25 % til 50 % sammenlignet med det nakne underlaget.På grunn av sin utmerkede anti-biobegroingsytelse og stabilitet, viste imidlertid ikke LOIS bakteriell biofilmadhesjon på kort og lang sikt.Det skjematiske diagrammet (figur 3C) beskriver forklaringen av den anti-biologiske begroingsmekanismen til etseløsningen, SHP og LOIS.Forutsetningen er at det etsede substratet med hydrofile egenskaper vil ha et større overflateareal enn det nakne substratet.Derfor vil det oppstå mer bakteriell adhesjon på det etsede underlaget.Sammenlignet med det nakne substratet har imidlertid det etsede substratet betydelig mindre biofilm dannet på overflaten.Dette er fordi vannmolekyler binder seg fast til den hydrofile overflaten og fungerer som et smøremiddel for vann, og forstyrrer dermed adhesjonen til bakterier på kort sikt (39).Imidlertid er laget av vannmolekyler veldig tynt og løselig i bakteriesuspensjoner.Derfor forsvinner det vannmolekylære laget i lang tid, noe som fører til omfattende bakteriell adhesjon og spredning.For SHP, på grunn av dens kortsiktige ikke-fuktende egenskaper, hemmes bakteriell adhesjon.Den reduserte bakterielle adhesjonen kan tilskrives luftlommer fanget i den lagdelte strukturen og lavere overflateenergi, og minimerer dermed kontakten mellom bakteriesuspensjonen og overflaten.Imidlertid ble omfattende bakteriell adhesjon observert i SHP fordi den mistet sine begroingshindrende egenskaper i lang tid.Dette skyldes hovedsakelig at luftlommer forsvinner på grunn av hydrostatisk trykk og oppløsning av luft i vann.Dette skyldes hovedsakelig at luftlommer forsvinner på grunn av oppløsning og den lagdelte strukturen som gir større overflateareal for vedheft (27, 40).I motsetning til disse to substratene som har en viktig effekt på langtidsstabiliteten, injiseres smøremiddelet i LOIS inn i mikro/nano-strukturen og vil ikke forsvinne selv på lang sikt.Smøremidler fylt med mikro/nano strukturer er svært stabile og tiltrekkes sterkt av overflaten på grunn av deres høye kjemiske affinitet, og forhindrer dermed bakteriell adhesjon i lang tid.Figur S6 viser et refleksjonskonfokalt mikroskopbilde av et smøremiddel-infundert substrat nedsenket i fosfatbufret saltvann (PBS).Kontinuerlige bilder viser at selv etter 120 timer med lett risting (120 rpm), forblir smøremiddellaget på LOIS uendret, noe som indikerer langtidsstabilitet under strømningsforhold.Dette skyldes den høye kjemiske affiniteten mellom det fluorbaserte SAM-belegget og det perfluorkarbonbaserte smøremidlet, slik at det kan dannes et stabilt smøremiddellag.Derfor opprettholdes den begroingshindrende ytelsen.I tillegg ble substratet testet mot representative proteiner (albumin og fibrinogen), som er i plasma, celler nært relatert til immunfunksjon (makrofager og fibroblaster), og de som er relatert til bendannelse.Innholdet av kalsium er svært høyt.(Figur 3D, 1 og 2, og Figur S7) (41, 42).I tillegg viste fluorescensmikroskopbildene av adhesjonstesten for fibrinogen, albumin og kalsium forskjellige adhesjonsegenskaper for hver substratgruppe (Figur S8).Under bendannelse kan nydannede bein- og kalsiumlag omgi det ortopediske implantatet, noe som ikke bare gjør fjerning vanskelig, men kan også forårsake uventet skade på pasienten under fjerningsprosessen.Derfor er lave nivåer av kalsiumavleiringer på benplater og skruer gunstig for ortopedisk kirurgi som krever implantatfjerning.Basert på kvantifiseringen av det vedlagte området basert på fluorescensintensiteten og celletallet, bekreftet vi at LOIS viser utmerkede anti-biobegroingsegenskaper for alle biologiske stoffer sammenlignet med andre substrater.Ifølge resultatene fra in vitro-eksperimenter kan den anti-biologiske begroingen LOIS påføres ortopediske implantater, som ikke bare kan hemme infeksjoner forårsaket av biofilmbakterier, men også redusere betennelse forårsaket av kroppens aktive immunsystem.
(A) Fluorescensmikroskopbilder av hver gruppe (naken, etset, SHP og LOIS) inkubert i Pseudomonas aeruginosa og MRSA-suspensjoner i 12 og 72 timer.(B) Antall vedhengende CFU av Pseudomonas aeruginosa og MRSA på overflaten av hver gruppe.(C) Skjematisk diagram av den anti-biologiske begroingsmekanismen for kortsiktig og langsiktig etsing, SHP og LOIS.(D) (1) Antall fibroblaster festet til hvert substrat og fluorescensmikroskopbilder av cellene festet til bare og LOIS.(2) Adhesjonstest av immunrelaterte proteiner, albumin og kalsium involvert i beinhelingsprosessen (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 og **** P <0,0001).ns, ikke viktig.
Ved uunngåelige konsentrerte påkjenninger har mekanisk holdbarhet alltid vært hovedutfordringen for påføring av bunnstoff.Tradisjonelle anti-kloakk gelmetoder er basert på polymerer med lav vannløselighet og skjørhet.Derfor er de vanligvis utsatt for mekanisk stress i biomedisinske applikasjoner.Derfor forblir mekanisk holdbare bunnstoffbelegg en utfordring for applikasjoner som ortopediske implantater (43, 44).Figur 4A(1) viser de to hovedtypene av stress som påføres ortopediske implantater, inkludert riper (skjærspenning) og kompresjon med det optiske bildet av det skadede implantatet produsert av tangen.For eksempel, når skruen strammes med en skrutrekker, eller når kirurgen holder beinplaten tett med en pinsett og bruker trykkkraft, vil plastbenplaten bli skadet og ripet opp på både makro- og mikro/nano-skalaen (Figur 4A, 2) .For å teste om den produserte LOIS tåler disse skadene under plastisk kirurgi, ble det utført nanoindentasjon for å sammenligne hardheten til det nakne substratet og LOIS på mikro/nano-skalaen for å studere de mekaniske egenskapene til mikro/nano-strukturen Impact (figur 4B).Det skjematiske diagrammet viser den forskjellige deformasjonsoppførselen til LOIS på grunn av tilstedeværelsen av mikro/nano-strukturer.En kraft-forskyvningskurve ble tegnet basert på resultatene av nanoindentasjon (figur 4C).Det blå bildet representerer det nakne underlaget, som kun viser liten deformasjon, sett av maksimal innrykkdybde på 0,26 μm.På den annen side kan den gradvise økningen i nanoindentasjonskraft og forskyvning observert i LOIS (rød kurve) vise tegn på reduserte mekaniske egenskaper, noe som resulterer i en nanoindentasjonsdybde på 1,61μm.Dette er fordi mikro/nano-strukturen som er tilstede i LOIS gir et dypere fremføringsrom for spissen av nanoindenteren, så dens deformasjon er større enn for det nakne substratet.Konsta-Gdoutos et al.(45) mener at på grunn av tilstedeværelsen av nanostrukturer, fører nanoindentasjon og mikro/nanoruhet til uregelmessige nanoindentasjonskurver.Det skyggelagte området tilsvarer den uregelmessige deformasjonskurven som tilskrives nanostrukturen, mens det ikke-skyggelagte området tilskrives mikrostrukturen.Denne deformasjonen kan skade mikrostrukturen/nanostrukturen til holdesmøremidlet og negativt påvirke dets antibegroingsegenskaper.For å studere virkningen av skade på LOIS, ble uunngåelig skade på mikro/nano-strukturer replikert i kroppen under plastisk kirurgi.Ved å bruke blod- og proteinadhesjonstester, kan stabiliteten til antibiobegroingsegenskapene til LOIS etter in vitro bestemmes (Figur 4D).En serie med optiske bilder viser skaden som oppsto nær hullene på hvert underlag.En blodadhesjonstest ble utført for å demonstrere effekten av mekanisk skade på belegget mot biobegroing (Figur 4E).I likhet med SHP går de begroingshindrende egenskapene tapt på grunn av skade, og LOIS viser utmerkede begroingshindrende egenskaper ved å avvise blod.Dette er fordi, fordi overflateenergien drives av kapillærvirkningen som dekker det skadede området, gjenoppretter strømmen i det mikrostrukturerte smøremiddelet de begroingshindrende egenskapene (35).Den samme trenden ble observert i proteinadhesjonstesten ved bruk av albumin.I det skadede området er adhesjonen av protein på overflaten av SHP mye observert, og ved å måle områdets dekning kan den kvantifiseres som halvparten av adhesjonsnivået til det nakne underlaget.På den annen side opprettholdt LOIS sine anti-biobegroingsegenskaper uten å forårsake vedheft (Figur 4, F og G).I tillegg er overflaten av skruen ofte utsatt for sterk mekanisk påkjenning, som for eksempel boring, så vi studerte evnen til LOIS-belegget til å forbli intakt på skruen in vitro.Figur 4H viser optiske bilder av forskjellige skruer, inkludert bare, SHP og LOIS.Det røde rektangelet representerer målområdet der sterk mekanisk stress oppstår under beinimplantasjon.I likhet med proteinadhesjonstesten til platen, brukes et fluorescensmikroskop for å avbilde proteinadhesjonen og måle dekningsområdet for å bevise integriteten til LOIS-belegget, selv under sterk mekanisk påkjenning (Figur 4, I og J).De LOIS-behandlede skruene viser utmerket anti-fouling ytelse, og nesten ingen protein fester seg til overflaten.På den annen side ble proteinadhesjon observert i bare skruer og SHP-skruer, hvor arealdekningen til SHP-skruer var en tredjedel av den for bare skruer.I tillegg må det ortopediske implantatet som brukes til fiksering være mekanisk sterkt for å tåle belastningen som påføres bruddstedet, som vist i figur 4K.Det ble derfor utført en bøyetest for å bestemme effekten av kjemisk modifikasjon på mekaniske egenskaper.I tillegg gjøres dette for å opprettholde den faste belastningen fra implantatet.Påfør vertikal mekanisk kraft til implantatet er helt foldet og det oppnås en stress-strain-kurve (Figur 4L, 1).To egenskaper inkludert Youngs modul og bøyestyrke ble sammenlignet mellom bare og LOIS-substrater som indikatorer på deres mekaniske styrke (Figur 4L, 2 og 3).Youngs modul indikerer et materiales evne til å motstå mekaniske endringer.Youngs modul for hvert substrat er henholdsvis 41,48±1,01 og 40,06±0,96 GPa;den observerte forskjellen er ca. 3,4 %.I tillegg er det rapportert at bøyestyrken, som bestemmer materialets seighet, er 102,34±1,51 GPa for det nakne underlaget og 96,99±0,86 GPa for SHP.Det nakne underlaget er omtrent 5,3 % høyere.Den svake reduksjonen i mekaniske egenskaper kan være forårsaket av hakkeffekten.I notch-effekten kan mikro/nano-ruheten fungere som et sett med hakk, som fører til lokal spenningskonsentrasjon og påvirker implantatets mekaniske egenskaper (46).Basert på det faktum at stivheten til menneskelig kortikalt bein er rapportert å være mellom 7,4 og 31,6 GPa, og den målte LOIS-modulen overstiger den for menneskelig kortikalt bein (47), er LOIS tilstrekkelig til å støtte bruddet og dets generelle. mekaniske egenskaper påvirkes minimalt av overflatemodifikasjoner.
(A) Skjematisk diagram av (1) den mekaniske belastningen som påføres det ortopediske implantatet under operasjonen, og (2) det optiske bildet av det skadede ortopediske implantatet.(B) Skjematisk diagram av nano-mekaniske egenskaper måling ved nanoindentasjon og LOIS på den nakne overflaten.(C) Nanoindentasjonskraft-forskyvningskurve av bar overflate og LOIS.(D) Etter in vitro-eksperimenter, simuler de optiske bildene av forskjellige typer ortopediske plater (det skadede området er uthevet med et rødt rektangel) for å simulere den mekaniske belastningen forårsaket under operasjonen.(E) Blodadhesjonstest og (F) proteinadhesjonstest av den skadede ortopediske plategruppen.(G) Mål arealdekningen til proteinet som fester seg til platen.(H) Optiske bilder av forskjellige typer ortopediske skruer etter in vitro-eksperimentet.(I) Proteinadhesjonstest for å studere integriteten til forskjellige belegg.(J) Mål arealdekningen til proteinet som fester seg til skruen.(K) Bevegelsen til kaninen er ment å generere en fast belastning på det frakturerte beinet.(L) (1) Bøytestresultater og optiske bilder før og etter bøying.Forskjellen i (2) Youngs modul og (3) bøyestyrke mellom bare implantat og SHP.Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 og ****P<0,0001).Bilde med tillatelse: Kyomin Chae, Yonsei University.
I kliniske situasjoner kommer mest bakteriell kontakt med biologiske materialer og sårsteder fra modne, modne biofilmer (48).Derfor anslår US Centers for Disease Control and Prevention at 65 % av alle menneskelige infeksjoner er relatert til biofilm (49).I dette tilfellet er det nødvendig å gi en in vivo eksperimentell design som gir konsistent biofilmdannelse på overflaten av implantatet.Derfor utviklet vi en lårbensfrakturmodell for kanin der ortopediske implantater ble pre-inkubert i en bakteriesuspensjon og deretter implantert i kanin femur for å studere antifouling-egenskapene til LOIS in vivo.På grunn av følgende tre viktige fakta induseres bakterielle infeksjoner av forkultur i stedet for direkte injeksjon av bakteriesuspensjoner: (i) Immunsystemet til kaniner er naturlig sterkere enn hos mennesker;derfor er injeksjon av bakteriesuspensjoner og planktonbakterier mulig. Det har ingen effekt på dannelsen av biofilm.(Ii) Planktonbakterier er mer mottakelige for antibiotika, og antibiotika brukes vanligvis etter operasjonen;til slutt, (iii) planktonbakteriesuspensjonen kan fortynnes av dyrets kroppsvæsker (50).Ved å pre-dyrke implantatet i en bakteriesuspensjon før implantasjon, kan vi grundig studere de skadelige effektene av bakterieinfeksjon og fremmedlegemereaksjon (FBR) på beinhelingsprosessen.Kaninene ble avlivet 4 uker etter implantasjon, fordi osseointegrasjonen som er avgjørende for beinhelingsprosessen vil bli fullført innen 4 uker.Deretter ble implantatene fjernet fra kaninene for nedstrømsstudier.Figur 5A viser spredningsmekanismen til bakterier.Det infiserte ortopediske implantatet introduseres i kroppen.Som et resultat av pre-inkubasjon i bakteriesuspensjon ble seks av de seks kaninene implantert med nakne implantater infisert, mens ingen av kaninene implantert med LOIS-behandlede implantater var infisert.Bakterielle infeksjoner foregår i tre trinn, inkludert vekst, modning og spredning (51).Først reproduserer og vokser de festede bakteriene på overflaten, og deretter danner bakteriene en biofilm når de skiller ut ekstracellulær polymer (EPS), amyloid og ekstracellulært DNA.Biofilm forstyrrer ikke bare penetrasjonen av antibiotika, men fremmer også akkumulering av antibiotikanedbrytende enzymer (som β-laktamase) (52).Til slutt sprer biofilmen de modne bakteriene inn i det omkringliggende vevet.Derfor oppstår infeksjon.I tillegg, når et fremmedlegeme kommer inn i kroppen, kan en infeksjon som kan forårsake en sterk immunrespons forårsake alvorlig betennelse, smerte og nedsatt immunitet.Figur 5B gir en oversikt over FBR forårsaket av innsetting av et ortopedisk implantat, snarere enn immunresponsen forårsaket av en bakteriell infeksjon.Immunsystemet gjenkjenner det innsatte implantatet som et fremmedlegeme, og får deretter cellene og vevene til å reagere for å kapsle inn fremmedlegemet (53).I de første dagene av FBR ble det dannet en forsyningsmatrise på overflaten av ortopediske implantater, noe som resulterte i adsorpsjon av fibrinogen.Det adsorberte fibrinogenet danner da et svært tett fibrinnettverk, som fremmer bindingen av leukocytter (54).Når fibrinnettverket først er dannet, vil det oppstå akutt betennelse på grunn av infiltrasjon av nøytrofiler.I dette trinnet frigjøres en rekke cytokiner som tumornekrosefaktor-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) og IL-β, og monocytter begynner å infiltrere implantasjonsstedet og differensiere til gigantiske celler.Fag (41, 55, 56).Å redusere FBR har alltid vært en utfordring fordi overdreven FBR kan forårsake akutt og kronisk betennelse, som kan føre til dødelige komplikasjoner.For å vurdere virkningen av bakterielle infeksjoner i vevet rundt det nakne implantatet og LOIS, ble hematoxylin og eosin (H&E) og Masson trichrome (MT) farging brukt.For kaniner implantert med bart underlag, progredierte alvorlige bakterielle infeksjoner, og H&E-vevsglass viste tydelig abscesser og nekrose forårsaket av betennelse.På den annen side hemmer den ekstremt sterke anti-biobegroingsoverflaten LOIS bakteriell adhesjon, så den viser ingen tegn på infeksjon og reduserer betennelse (Figur 5C).Resultatene av MT-farging viste samme trend.Imidlertid viste MT-farging også ødem hos kaniner implantert med LOIS, noe som indikerer at gjenoppretting er i ferd med å skje (figur 5D).For å studere graden av immunrespons ble immunhistokjemisk (IHC) farging utført ved bruk av cytokiner TNF-α og IL-6 relatert til immunrespons.Et nakent negativt implantat som ikke ble utsatt for bakterier ble sammenlignet med et LOIS som ble eksponert for bakterier, men ikke infisert for å studere helingsprosessen i fravær av bakteriell infeksjon.Figur 5E viser et optisk bilde av et IHC-lysbilde som uttrykker TNF-α.Det brune området representerer immunresponsen, noe som indikerer at immunresponsen i LOIS er litt redusert.I tillegg var uttrykket av IL-6 i LOIS signifikant mindre enn det negative uttrykket av steril naken (Figur 5F).Uttrykket av cytokin ble kvantifisert ved å måle området med antistofffarging som tilsvarer cytokinet (figur 5G).Sammenlignet med kaninene som ble utsatt for de negative implantatene, var ekspresjonsnivåene til kaninene implantert med LOIS lavere, noe som viste en meningsfull forskjell.Nedgangen i cytokinekspresjon indikerer at de langsiktige, stabile antibegroingsegenskapene til LOIS ikke bare er relatert til hemming av bakterielle infeksjoner, men også til reduksjonen av FBR, som induseres av makrofager som fester seg til substratet (53, 57, 58).Derfor kan den reduserte immunresponsen på grunn av immununnvikelsesegenskapene til LOIS løse bivirkningene etter implantasjon, for eksempel overdreven immunrespons etter plastisk kirurgi.
(A) Et skjematisk diagram av mekanismen for biofilmdannelse og spredning på overflaten av et infisert ortopedisk implantat.eDNA, ekstracellulært DNA.(B) Skjematisk diagram av immunrespons etter ortopedisk implantatinnsetting.(C) H&E-farging og (D) MT-farging av det omkringliggende vevet til ortopediske implantater med bare positiv og LOIS.IHC av immunrelaterte cytokiner (E) TNF-α og (F) IL-6 er fargede bilder av nakne-negative og LOIS-implanterte kaniner.(G) Kvantifisering av cytokinekspresjon ved områdedekningsmåling (** P <0,01).
Biokompatibiliteten til LOIS og dens effekt på beinhelingsprosessen ble undersøkt in vivo ved bruk av diagnostisk bildebehandling [røntgen- og mikrocomputertomografi (CT)] og osteoklast IHC.Figur 6A viser beinhelingsprosessen som involverer tre forskjellige stadier: betennelse, reparasjon og ombygging.Når et brudd oppstår, vil inflammatoriske celler og fibroblaster trenge inn i det frakturerte beinet og begynne å vokse inn i det vaskulære vevet.Under reparasjonsfasen sprer innveksten av vaskulært vev seg nær bruddstedet.Vaskulært vev gir næringsstoffer for dannelsen av nytt bein, som kalles callus.Det siste stadiet av beinhelingsprosessen er remodelleringsstadiet, hvor størrelsen på callus reduseres til størrelsen på normalt bein ved hjelp av en økning i nivået av aktiverte osteoklaster (59).Tredimensjonal (3D) rekonstruksjon av bruddstedet ble utført ved hjelp av mikro-CT-skanninger for å observere forskjellene i nivået av kallusdannelse i hver gruppe.Observer tverrsnittet av lårbenet for å observere tykkelsen på callus som omgir det frakturerte beinet (Figur 6, B og C).Røntgenstråler ble også brukt til å undersøke bruddstedene til alle grupper hver uke for å observere de forskjellige beinregenereringsprosessene i hver gruppe (Figur S9).Callus og modne bein er vist i henholdsvis blått/grønt og elfenben.De fleste bløtvev filtreres ut med en forhåndsinnstilt terskel.Nakenpositiv og SHP bekreftet dannelsen av en liten mengde kallus rundt bruddstedet.På den annen side er den eksponerte negative av LOIS og bruddstedet omgitt av tykk kallus.Mikro-CT-bilder viste at dannelsen av callus ble hindret av bakteriell infeksjon og infeksjonsrelatert betennelse.Dette er fordi immunsystemet prioriterer helbredelse av septiske skader forårsaket av infeksjonsrelatert betennelse, fremfor beingjenoppretting (60).IHC og Tartrat-resistent syrefosfatase (TRAP) farging ble utført for å observere osteoklastaktivitet og benresorpsjon (Figur 6D) (61).Bare noen få aktiverte osteoklaster farget lilla ble funnet i nakne positiver og SHP.På den annen side ble mange aktiverte osteoklaster observert nær de nakne positive og modne beinene til LOIS.Dette fenomenet indikerer at i nærvær av osteoklaster, gjennomgår kallus rundt bruddstedet en voldsom remodelleringsprosess (62).Benvolumet og osteoklastekspresjonsområdet til kallus ble målt for å sammenligne nivået av kallusdannelse rundt bruddstedet i alle grupper, for å kvantifisere mikro-CT-skanningen og IHC-resultatene (Figur 6E, 1 og 2).Som forventet var de nakne negativene og kallusdannelsen i LOIS signifikant høyere enn i de andre gruppene, noe som indikerer at positiv beinremodellering skjedde (63).Figur S10 viser det optiske bildet av operasjonsstedet, MT-fargeresultatet av vevet som er samlet inn nær skruen, og TRAP-fargingsresultatet som fremhever skrue-bein-grensesnittet.I det bare underlaget ble det observert sterk kallus- og fibrosedannelse, mens det LOIS-behandlede implantatet viste en relativt uheftet overflate.På samme måte, sammenlignet med nakne negativer, ble lavere fibrose observert hos kaniner implantert med LOIS, som indikert av de hvite pilene.I tillegg kan det faste ødemet (blå pil) tilskrives immununnvikelsesegenskapene til LOIS, og reduserer dermed alvorlig betennelse.Den ikke-klebende overflaten rundt implantatet og redusert fibrose tyder på at fjerningsprosessen er lettere, noe som vanligvis resulterer i andre brudd eller betennelse.Benhelingsprosessen etter skrufjerning ble evaluert av osteoklastaktiviteten ved skrue-bengrensesnittet.Både det nakne beinet og LOIS-implantatgrensesnittet absorberte tilsvarende nivåer av osteoklaster for ytterligere beinheling, noe som indikerer at LOIS-belegget ikke har noen negativ effekt på beinheling eller immunrespons.For å bekrefte at overflatemodifikasjonen utført på LOIS ikke forstyrrer beinhelingsprosessen, ble røntgenundersøkelse brukt for å sammenligne beinheling av kaninene med eksponerte negative ioner og 6 uker med LOIS-implantasjon (Figur 6F).Resultatene viste at sammenlignet med den uinfiserte nakenpositive gruppen, viste LOIS samme grad av beinheling, og det var ingen tydelige tegn på brudd (kontinuerlig osteolyselinje) i begge gruppene.
(A) Skjematisk diagram av beinhelingsprosessen etter brudd.(B) Forskjellen i graden av kallusdannelse for hver overflategruppe og (C) tverrsnittsbildet av bruddstedet.(D) TRAP-farging for å visualisere osteoklastaktivitet og benresorpsjon.Basert på TRAP-aktivitet ble dannelsen av ekstern callus av kortikalt bein kvantitativt analysert ved (E) (1) mikro-CT og (2) osteoklastaktivitet.(F) 6 uker etter implantasjon, røntgenbilder av det brutte beinet til det eksponerte negativet (uthevet av det røde stiplede rektangelet) og LOIS (uthevet av det blå stiplede rektangelet).Statistisk analyse ble utført ved enveis variansanalyse (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Kort sagt, LOIS gir en ny type antibakteriell infeksjonsstrategi og immunescape-belegg for ortopediske implantater.Konvensjonelle ortopediske implantater med SHP-funksjonalisering viser kortsiktige anti-biobegroingsegenskaper, men kan ikke opprettholde egenskapene over lang tid.Superhydrofobisiteten til substratet fanger luftbobler mellom bakteriene og substratet, og danner derved luftlommer, og forhindrer dermed bakterieinfeksjon.På grunn av luftdiffusjonen fjernes imidlertid disse luftlommene enkelt.På den annen side har LOIS godt bevist sin evne til å forhindre biofilmrelaterte infeksjoner.Derfor, på grunn av anti-avvisningsegenskapene til smøremiddellaget som injiseres i den lagdelte mikro/nanostrukturoverflaten, kan infeksjonsrelatert betennelse forhindres.Ulike karakteriseringsmetoder inkludert SEM-, AFM-, XPS- og CA-målinger brukes for å optimalisere LOIS-produksjonsforholdene.I tillegg kan LOIS også brukes på ulike biologiske materialer som vanligvis brukes i ortopedisk fikseringsutstyr, som PLGA, Ti, PE, POM og PPSU.Deretter ble LOIS testet in vitro for å bevise dens anti-biobegroingsegenskaper mot bakterier og biologiske stoffer relatert til immunrespons.Resultatene viser at den har utmerkede antibakterielle og anti-biobegroingseffekter sammenlignet med det bare implantatet.I tillegg viser LOIS mekanisk styrke selv etter påføring av mekanisk påkjenning, noe som er uunngåelig ved plastisk kirurgi.På grunn av de selvhelbredende egenskapene til smøremidlet på overflaten av mikro/nano-strukturen, har LOIS opprettholdt sine anti-biologiske begroingsegenskaper.For å studere biokompatibiliteten og antibakterielle egenskapene til LOIS in vivo, ble LOIS implantert i lårbenet fra kanin i 4 uker.Ingen bakteriell infeksjon ble observert hos kaniner implantert med LOIS.I tillegg viste bruk av IHC et redusert nivå av lokal immunrespons, noe som indikerer at LOIS ikke hemmer beinhelingsprosessen.LOIS viser utmerkede antibakterielle og immununnvikende egenskaper, og har vist seg å effektivt forhindre biofilmdannelse før og under ortopedisk kirurgi, spesielt for bensyntese.Ved å bruke en modell for inflammatorisk lårbensfraktur fra kanin, ble effekten av biofilmrelaterte infeksjoner på beinhelingsprosessen indusert av pre-inkuberte implantater grundig studert.Som en fremtidig studie er det nødvendig med en ny in vivo-modell for å studere mulige infeksjoner etter implantasjon for å fullt ut forstå og forhindre biofilmrelaterte infeksjoner under hele helingsprosessen.I tillegg er osteoinduksjon fortsatt en uløst utfordring i integrasjon med LOIS.Ytterligere forskning er nødvendig for å kombinere selektiv adhesjon av osteoinduktive celler eller regenerativ medisin med LOIS for å overvinne utfordringen.Totalt sett representerer LOIS et lovende ortopedisk implantatbelegg med mekanisk robusthet og utmerkede anti-biobegroingsegenskaper, som kan redusere SSI og immunbivirkninger.
Vask 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS-substratet (Dong Kang M-Tech Co., Korea) i aceton, EtOH og DI-vann i 15 minutter for å fjerne forurensninger.For å danne en struktur på mikro/nanonivå på overflaten, senkes det rensede substratet i en 48% til 51% HF-løsning (DUKSAN Corp., Sør-Korea) ved 50°C.Etsetiden varierer fra 0 til 60 minutter.Deretter ble det etsede substratet renset med avionisert vann og plassert i en 65 % HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) løsning ved 50°C i 30 minutter for å danne et kromoksidpassiveringssjikt på overflaten.Etter passivering vaskes substratet med avionisert vann og tørkes for å få et substrat med lagdelt struktur.Deretter ble substratet eksponert for oksygenplasma (100 W, 3 minutter), og umiddelbart nedsenket i en løsning av 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Tyskland) i toluen ved romtemperatur i 12 timer.Deretter ble substratet belagt med POTS renset med EtOH og herdet ved 150°C i 2 timer for å oppnå en tett POTS SAM.Etter SAM-belegging ble det dannet et smøremiddellag på underlaget ved å påføre et perfluorpolyeter-smøremiddel (Krytox 101; DuPont, USA) med et belastningsvolum på 20 μm/cm 2. Før bruk filtreres smøremidlet gjennom et 0,2 mikron filter.Fjern overflødig smøremiddel ved å vippe i en vinkel på 45° i 15 minutter.Den samme produksjonsprosedyren ble brukt for ortopediske implantater laget av 304 SS (låseplate og kortikal låseskrue; Dong Kang M-Tech Co., Korea).Alle ortopediske implantater er designet for å passe geometrien til kanin femur.
Overflatemorfologien til substratet og ortopediske implantater ble inspisert av feltemisjons-SEM (Inspiser F50, FEI, USA) og AFM (XE-100, Park Systems, Sør-Korea).Overflateruheten (Ra, Rq) måles ved å multiplisere arealet på 20 μm med 20 μm (n=4).Et XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japan) system utstyrt med en Al Kα røntgenkilde med en punktstørrelse på 100μm2 ble brukt for å analysere overflatens kjemiske sammensetning.Et CA-målesystem utstyrt med et dynamisk bildefangstkamera (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Sør-Korea) ble brukt til å måle flytende CA og SA.For hver måling plasseres 6 til 10 μl dråper (avionisert vann, hesteblod, EG, 30 % etanol og HD) på overflaten for å måle CA.Når helningsvinkelen til underlaget øker med en hastighet på 2°/s (n = 4), måles SA når dråpen faller.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] og MRSA (ATCC 25923) ble kjøpt fra ATCC (Manassas, Virginia, USA), og stamkulturen ble holdt ved -80°C.Før bruk ble den frosne kulturen inkubert i trypsin-tint soyabuljong (Komed, Korea) ved 37°C i 18 timer og deretter overført to ganger for å aktivere den.Etter inkubering ble kulturen sentrifugert ved 10 000 rpm i 10 minutter ved 4°C og vasket to ganger med en PBS (pH 7,3) løsning.Den sentrifugerte kulturen blir deretter subkulturert på blodagarplater (BAP).MRSA og Pseudomonas aeruginosa ble tilberedt over natten og dyrket i Luria-Bertani-buljong.Konsentrasjonen av Pseudomonas aeruginosa og MRSA i inokulumet ble kvantitativt bestemt av CFU av suspensjonen i seriefortynninger på agar.Juster deretter bakteriekonsentrasjonen til 0,5 McFarland-standard, som tilsvarer 108 CFU/ml.Fortynn deretter den fungerende bakteriesuspensjonen 100 ganger til 106 CFU/ml.For å teste de antibakterielle adhesjonsegenskapene ble substratet sterilisert ved 121°C i 15 minutter før bruk.Substratet ble deretter overført til 25 ml bakteriesuspensjon og inkubert ved 37°C med kraftig risting (200 rpm) i 12 og 72 timer.Etter inkubering ble hvert substrat fjernet fra inkubatoren og vasket 3 ganger med PBS for å fjerne eventuelle flytende bakterier på overflaten.For å observere biofilmen på substratet ble biofilmen fiksert med metanol og farget med 1 ml crimidinoransje i 2 minutter.Deretter ble et fluorescensmikroskop (BX51TR, Olympus, Japan) brukt for å ta bilder av den fargede biofilmen.For å kvantifisere biofilmen på substratet ble de festede cellene separert fra substratet ved hjelp av perlevirvelmetoden, som ble ansett for å være den mest egnede metoden for å fjerne festede bakterier (n = 4).Bruk en steril pinsett, fjern substratet fra vekstmediet og bank på brønnplaten for å fjerne overflødig væske.Løst festede celler ble fjernet ved å vaske to ganger med steril PBS.Hvert substrat ble deretter overført til et sterilt reagensrør inneholdende 9 ml 0,1 % protein ept saltvann (PSW) og 2 g 20 til 25 sterile glasskuler (0,4 til 0,5 mm i diameter).Den ble deretter vortexet i 3 minutter for å løsne cellene fra prøven.Etter vortexing ble suspensjonen seriefortynnet 10 ganger med 0,1 % PSW, og deretter ble 0,1 ml av hver fortynning inokulert på BAP.Etter 24 timers inkubering ved 37°C ble CFU talt manuelt.
For cellene ble musefibroblaster NIH/3T3 (CRL-1658; amerikansk ATCC) og musemakrofager RAW 264.7 (TIB-71; amerikansk ATCC) brukt.Bruk Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) for å dyrke musefibroblaster og suppler med 10 % kalveserum (S103-01, Welgene) og 1 % penicillin-streptomycin (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene) Bruk DMEM til å dyrke musemakrofager, supplert med 10 % føtalt bovint serum (S001-01, Welgene) og 1 % PS. Plasser substratet i en cellekulturplate med seks brønner, og inokuler cellene ved 105 celler/cm2. Cellene ble inkubert over natten ved 37 °C og 5 % CO2. For cellefarging ble cellene fiksert med 4 % paraformaldehyd i 20 minutter og plassert i 0,5 % Triton X Incubate i 5 minutter i -100 nM tetrametylrhodamin ved 37 °C i 30 minutter Etter inkubasjonsprosessen, bruk substratet med 4',6-diamino-2-fenylindol (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD-fikseringsmedium (n = 4 per celle). , fluorescein, fluorescein isotiocyanat-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Tyskland) og human plasma. Alexa Fluor 488-konjugert fibrinogen (F13191, Invitrogen, USA) ble oppløst i PBS (10 mM, pH 7,4).Konsentrasjonene av albumin og fibrinogen var henholdsvis 1 og 150 μg/ml.Etter substratet Før nedsenking i proteinløsningen, skyll dem med PBS for å rehydrere overflaten.Senk deretter alle substratene i en seks-brønns plate som inneholder proteinløsningen og inkuber ved 37°C i 30 og 90 minutter.Etter inkubering ble substratet deretter fjernet fra proteinløsningen, vasket forsiktig med PBS 3 ganger og fiksert med 4 % paraformaldehyd (n = 4 for hvert protein).For kalsium ble natriumklorid (0,21 M) og kaliumfosfat (3,77 mM) løst opp i avionisert vann.Løsningens pH ble justert til 2,0 ved å tilsette hydrokloridløsning (1M).Deretter ble kalsiumklorid (5,62 mM) oppløst i løsningen.Ved å tilsette 1M tris(hydroksymetyl)-amino justerer Metan pH i løsningen til 7,4.Senk alle substrater i en seks-brønns plate fylt med 1,5 x kalsiumfosfatløsning og fjern fra løsningen etter 30 minutter.For farging, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Bland med 100 ml avionisert vann.Bruk deretter 10 % ammoniumhydroksid for å justere pH til 4. Farg substratet med Alizarin Red-løsning i 5 minutter, og rist av overflødig farge og klatt.Etter risteprosessen, fjern substratet.Materialet blir dehydrert, deretter nedsenket i aceton i 5 minutter, deretter nedsenket i en aceton-xylen-løsning (1:1) i 5 minutter, og til slutt vasket med xylen (n = 4).Fluorescensmikroskop (Axio Imager) med ×10 og ×20 objektiver brukes..A2m, Zeiss, Tyskland) avbilder alle underlag.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) ble brukt til å kvantifisere adhesjonsdataene til biologiske stoffer på hver gruppe av fire forskjellige bildeområder.Konverter alle bilder til binære bilder med faste terskler for substratsammenligning.
Et Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop ble brukt for å overvåke stabiliteten til smøremiddellaget i PBS i refleksjonsmodus.Den fluorbaserte SAM-belagte glassprøven med et injisert smørelag ble nedsenket i en PBS-løsning og testet med en orbital shaker (SHO-1D; Daihan Scientific, Sør-Korea) under milde risteforhold (120 rpm).Ta deretter prøven og overvåk tapet av smøremiddel ved å måle tapet av reflektert lys.For å ta fluorescensbilder i refleksjonsmodus, blir prøven eksponert for en 633 nm laser og deretter samlet, fordi lyset vil bli reflektert tilbake fra prøven.Prøvene ble målt med tidsintervaller på 0, 30, 60 og 120 timer.
For å bestemme påvirkningen av overflatemodifikasjonsprosessen på de nanomekaniske egenskapene til ortopediske implantater, ble en nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) utstyrt med en tresidig pyramideformet Berkovich-diamantspiss brukt for å måle nanoindenedion.Topplasten er 10 mN og arealet er 100μmx 100μm.For alle målinger er laste- og lossetiden 10 s, og holdetiden under spissbelastning er 2 s.Ta målinger fra fem forskjellige steder og ta gjennomsnittet.For å evaluere den mekaniske styrkeytelsen under belastning, ble det utført en tverrgående trepunkts bøyetest ved bruk av en universell testmaskin (Instron 5966, Instron, USA).Underlaget komprimeres med en konstant hastighet på 10 N/s med økt belastning.Bluehill Universal-programvaren (n = 3) ble brukt til å beregne bøyemodulen og maksimal trykkspenning.
For å simulere operasjonsprosessen og den relaterte mekaniske skaden forårsaket under operasjonen, ble operasjonsprosessen utført in vitro.Lårbenene ble samlet fra de henrettede hvite kaninene fra New Zealand.Lårbenet ble renset og fiksert i 4 % paraformaldehyd i 1 uke.Som beskrevet i dyreforsøksmetoden ble det fikserte lårbenet kirurgisk operert.Etter operasjonen ble det ortopediske implantatet nedsenket i blod (hesteblod, KISAN, Korea) i 10 s for å bekrefte om blodadhesjoner oppsto etter at den mekaniske skaden ble påført (n = 3).
Totalt 24 hvite New Zealand hannkaniner (vekt 3,0 til 3,5 kg, gjennomsnittsalder 6 måneder) ble tilfeldig delt inn i fire grupper: naken negativ, naken positiv, SHP og LOIS.Alle prosedyrer som involverte dyr ble utført i samsvar med de etiske standardene til Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC-godkjent, KOREA-2017-0159).Det ortopediske implantatet består av en låseplate med fem hull (lengde 41 mm, bredde 7 mm og tykkelse 2 mm) og kortikale låseskruer (lengde 12 mm, diameter 2,7 mm) for bruddfiksering.Bortsett fra de platene og skruene som ble brukt i den bare-negative gruppen, ble alle plater og skruer inkubert i MRSA-suspensjon (106 CFU/ml) i 12 timer.Den nakne-negative gruppen (n=6) ble behandlet med nakne overflateimplantater uten eksponering for bakteriesuspensjon, som en negativ kontroll for infeksjon.Den bare positive gruppen (n = 6) ble behandlet med et bar overflateimplantat eksponert for bakterier som en positiv kontroll for infeksjon.SHP-gruppen (n = 6) ble behandlet med bakterielt eksponerte SHP-implantater.Til slutt ble LOIS-gruppen behandlet med bakterieeksponerte LOIS-implantater (n = 6).Alle dyr holdes i bur, og det blir gitt mye mat og vann.Før operasjonen ble kaninene fastet i 12 timer.Dyrene ble bedøvet ved intramuskulær injeksjon av xylazin (5 mg/kg) og intravenøs injeksjon av paklitaksel (3 mg/kg) for induksjon.Deretter leverer du 2 % isofluran og 50 % til 70 % medisinsk oksygen (strømningshastighet 2 l/min) gjennom luftveiene for å opprettholde anestesi.Det implanteres gjennom en direkte tilnærming til laterale femur.Etter hårfjerning og povidon-jod-desinfeksjon av huden ble det laget et ca. 6 cm langt snitt på utsiden av venstre midtre lårben.Ved å åpne gapet mellom musklene som dekker lårbenet, er lårbenet helt eksponert.Plasser platen foran lårbensskaftet og fest den med fire skruer.Etter fiksering, bruk et sagblad (1 mm tykt) for å kunstig lage et brudd i området mellom det andre hullet og det fjerde hullet.På slutten av operasjonen ble såret vasket med saltvann og lukket med suturer.Hver kanin ble injisert subkutant med enrofloxacin (5 mg/kg) fortynnet en tredjedel i saltvann.Postoperative røntgenbilder av lårbenet ble tatt på alle dyr (0, 7, 14, 21, 28 og 42 dager) for å bekrefte osteotomi av beinet.Etter dyp anestesi ble alle dyrene drept med intravenøs KCl (2 mmol/kg) på 28 og 42 dager.Etter utførelse ble lårbenet skannet med mikro-CT for å observere og sammenligne beinhelingsprosessen og ny beindannelse mellom de fire gruppene.
Etter utførelse ble bløtvevet som var i direkte kontakt med de ortopediske implantatene samlet.Vevet ble fiksert i 10 % nøytralt bufret formalin over natten og deretter dehydrert i EtOH.Det dehydrerte vevet ble innebygd i parafin og snittet i en tykkelse på 40 μm ved bruk av en mikrotom (400CS; EXAKT, Tyskland).For å visualisere infeksjonen ble H&E-farging og MT-farging utført.For å sjekke vertsresponsen ble det seksjonerte vevet inkubert med kanin anti-TNF-α primært antistoff (AB6671, Abcam, USA) og kanin anti-IL-6 (AB6672; Abcam, USA), og deretter behandlet med pepperrot.Oksidase.Påfør fargesystemet avidin-biotinkompleks (ABC) på seksjonene i henhold til produsentens instruksjoner.For å fremstå som et brunt reaksjonsprodukt ble 3,3-diaminobenzidin brukt i alle deler.En digital lysbildeskanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungarn) ble brukt til å visualisere alle skiver, og minst fire substrater i hver gruppe ble analysert med ImageJ-programvare.
Røntgenbilder ble tatt av alle dyr etter operasjon og hver uke for å overvåke bruddtilheling (n=6 per gruppe).Etter utførelse ble høyoppløselig mikro-CT brukt for å beregne dannelsen av callus rundt lårbenet etter tilheling.Det oppnådde lårbenet ble renset, fiksert i 4 % paraformaldehyd i 3 dager og dehydrert i 75 % etanol.De dehydrerte beinene ble deretter skannet ved å bruke mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgia) for å generere 3D voxel-bilder (2240×2240 piksler) av beinprøven.Bruk 1,0 mm Al-filter for å redusere signalstøy og bruke høy oppløsning på alle skanninger (E = 133 kVp, I = 60 μA, integreringstid = 500 ms).Nrecon-programvare (versjon 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgia) ble brukt til å generere et 3D-volum av den skannede prøven fra den ervervede 2D-lateralprojeksjonen.For analyse er det 3D-rekonstruerte bildet delt inn i 10 mm×10 mm×10 mm terninger i henhold til bruddstedet.Beregn callus utenfor det kortikale beinet.DataViewer (versjon 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgia) programvare ble brukt til digitalt omdirigere det skannede beinvolumet, og CT-Analyzer (versjon 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgia) programvare ble brukt for analyse.De relative røntgenabsorpsjonskoeffisientene i modent bein og callus utmerker seg ved deres tetthet, og deretter kvantifiseres volumet av callus (n = 4).For å bekrefte at biokompatibiliteten til LOIS ikke forsinker beinhelingsprosessen, ble ytterligere røntgen- og mikro-CT-analyse utført i to kaniner: den nakne-negative og LOIS-gruppen.Begge gruppene ble henrettet i den 6. uken.
Lårbenene fra ofrede dyr ble samlet og fiksert i 4% paraformaldehyd i 3 dager.Det ortopediske implantatet fjernes deretter forsiktig fra lårbenet.Lårbenet ble avkalket i 21 dager ved å bruke 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Deretter ble det avkalkede lårbenet nedsenket i EtOH for å gjøre det dehydrert.Det dehydrerte lårbenet ble fjernet i xylen og innebygd i parafin.Deretter ble prøven skåret i skiver med en automatisk roterende mikrotom (Leica RM2255, Leica Biosystems, Tyskland) med en tykkelse på 3 μm.For TRAP-farging (F6760, Sigma-Aldrich, Tyskland) ble de seksjonerte prøvene avparafinisert, rehydrert og inkubert i TRAP-reagens ved 37 °C i 1 time.Bilder ble tatt med en lysbildeskanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungarn) og kvantifisert ved å måle områdedekningen til det fargede området.I hvert eksperiment ble minst fire substrater i hver gruppe analysert med ImageJ-programvare.
Statistisk signifikansanalyse ble utført ved å bruke GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Uparet t-test og enveis variansanalyse (ANOVA) ble brukt for å teste forskjellene mellom evalueringsgruppene.Signifikansnivået er angitt i figuren som følger: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 og ****P<0,0001;NS, ingen vesentlig forskjell.
For tilleggsmateriell for denne artikkelen, se http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Dette er en artikkel med åpen tilgang distribuert under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillater bruk, distribusjon og reproduksjon i et hvilket som helst medium, så lenge bruken ikke er for kommersiell vinning og forutsetningen er at originalen arbeidet er riktig.Henvisning.
Merk: Vi ber deg kun oppgi en e-postadresse slik at personen du anbefaler til siden vet at du vil at de skal se e-posten og at e-posten ikke er spam.Vi vil ikke registrere noen e-postadresser.
Dette spørsmålet brukes til å teste om du er en menneskelig besøkende og for å forhindre automatiske spam-innsendinger.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
De antibakterielle og immune fluktbeleggene til ortopediske implantater kan redusere infeksjoner og immunresponser forårsaket av infeksjoner.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
De antibakterielle og immune fluktbeleggene til ortopediske implantater kan redusere infeksjoner og immunresponser forårsaket av infeksjoner.
©2021 American Association for the Advancement of Science.alle rettigheter forbeholdt.AAAS er partner av HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.