Pacientiem, kuriem tiek veikta ortopēdiskā implanta operācija, bakteriālas infekcijas un infekciju izraisītas imūnās atbildes reakcijas vienmēr ir bijušas dzīvībai bīstamas.Tradicionālie bioloģiskie materiāli ir jutīgi pret bioloģisko piesārņojumu, kas izraisa baktēriju iebrukumu ievainotajā zonā un izraisa pēcoperācijas infekciju.Tāpēc ir steidzami jāizstrādā pretinfekcijas un imūnsistēmas evakuācijas pārklājumi ortopēdiskajiem implantiem.Šeit mēs esam izstrādājuši modernu ortopēdisko implantu virsmas modifikācijas tehnoloģiju, ko sauc par ieeļļotu ortopēdisko implantu virsmu (LOIS), ko iedvesmojusi krūku augu krūku gludā virsma.LOIS ir ilgstoša un spēcīga šķidrumu atgrūšanas spēja pret dažādiem šķidrumiem un bioloģiskām vielām (tostarp šūnām, olbaltumvielām, kalciju un baktērijām).Turklāt mēs apstiprinājām mehānisko izturību pret skrāpējumiem un fiksācijas spēku, imitējot neizbēgamos bojājumus in vitro operācijas laikā.Trušu kaulu smadzeņu iekaisuma augšstilba kaula lūzuma modelis tika izmantots, lai rūpīgi izpētītu LOIS pretbioloģisko mērogošanu un pretinfekcijas spēju.Mēs paredzam, ka LOIS, kam piemīt pretbiotikas un mehāniskās izturības īpašības, ir solis uz priekšu bezinfekcijas ortopēdiskajā ķirurģijā.
Mūsdienās kopējās novecošanas dēļ ir ievērojami pieaudzis to pacientu skaits, kuri cieš no ortopēdiskām slimībām (piemēram, gados vecāku cilvēku lūzumi, deģeneratīvas locītavu slimības un osteoporoze) (1, 2).Tāpēc ārstniecības iestādes lielu nozīmi piešķir ortopēdiskajai ķirurģijai, tai skaitā skrūvju, plākšņu, naglu un mākslīgo locītavu ortopēdiskajiem implantiem (3, 4).Tomēr ir ziņots, ka tradicionālie ortopēdiskie implanti ir jutīgi pret baktēriju adhēziju un bioplēves veidošanos, kas pēc operācijas var izraisīt ķirurģiskas vietas infekciju (SSI) (5, 6).Kad bioplēve ir izveidojusies uz ortopēdiskā implanta virsmas, bioplēves noņemšana kļūst ārkārtīgi sarežģīta pat tad, ja tiek lietotas lielas antibiotiku devas.Tāpēc tas parasti noved pie smagām pēcoperācijas infekcijām (7, 8).Iepriekš minēto problēmu dēļ inficēto implantu ārstēšanā jāiekļauj atkārtota operācija, ieskaitot visu implantu un apkārtējo audu izņemšanu;tādēļ pacients cietīs stipras sāpes un dažus riskus (9, 10).
Lai atrisinātu dažas no šīm problēmām, ir izstrādāti medikamentu eluējoši ortopēdiskie implanti, lai novērstu infekciju, likvidējot baktērijas, kas pievienotas virsmai (11, 12).Tomēr stratēģija joprojām parāda vairākus ierobežojumus.Ir ziņots, ka ilgstoša medikamentu eluējošu implantu implantācija ir izraisījusi apkārtējo audu bojājumus un izraisījusi iekaisumu, kas var izraisīt nekrozi (13, 14).Turklāt organiskajiem šķīdinātājiem, kas var pastāvēt pēc zāļu eluējošu ortopēdisko implantu ražošanas procesa, kurus stingri aizliedz ASV Pārtikas un zāļu pārvalde, ir nepieciešami papildu attīrīšanas posmi, lai tie atbilstu tās standartiem (15).Medikamentu izdaloši implanti ir izaicinājums kontrolētai zāļu izdalīšanai, un to ierobežotās zāļu slodzes dēļ zāļu ilgstoša lietošana nav iespējama (16).
Vēl viena izplatīta stratēģija ir implanta pārklāšana ar pretapaugšanas polimēru, lai novērstu bioloģisko vielu un baktēriju pielipšanu virsmai (17).Piemēram, cviterjonu polimēri ir piesaistījuši uzmanību to nelīmējošo īpašību dēļ, saskaroties ar plazmas olbaltumvielām, šūnām un baktērijām.Tomēr tam ir daži ierobežojumi, kas saistīti ar ilgtermiņa stabilitāti un mehānisko izturību, kas kavē tā praktisko pielietojumu ortopēdiskajos implantos, jo īpaši mehāniskās skrāpēšanas dēļ ķirurģisko procedūru laikā (18, 19).Turklāt, ņemot vērā tā augsto bioloģisko saderību, izņemšanas operācijas nepieciešamību un virsmas tīrīšanas īpašības ar koroziju, ir izmantoti ortopēdiskie implanti, kas izgatavoti no bioloģiski noārdāmiem materiāliem (20, 21).Korozijas laikā ķīmiskās saites starp polimēru matricu tiek noārdītas un atdalītas no virsmas, un adherenti attīra virsmu.Tomēr virsmas tīrīšanas līdzeklis pret bioloģisko piesārņojumu ir efektīvs īsā laika periodā.Turklāt lielākā daļa absorbējamo materiālu, tostarp poli(pienskābes-glikolskābes kopolimērs) (PLGA), polipienskābe (PLA) un magnija sakausējumi, organismā tiks pakļauti nevienmērīgai bioloģiskai noārdīšanai un erozijai, kas negatīvi ietekmēs mehānisko stabilitāti.(divdesmit divi).Turklāt bioloģiski noārdāmie plākšņu fragmenti nodrošina vietu baktērijām pieķerties, kas ilgtermiņā palielina infekcijas iespējamību.Šis mehāniskās degradācijas un infekcijas risks ierobežo plastiskās ķirurģijas praktisko pielietojumu (23).
Superhidrofobiskas (SHP) virsmas, kas atdarina lotosa lapu hierarhisko struktūru, ir kļuvušas par potenciālu risinājumu pretapaugšanas virsmām (24, 25).Kad SHP virsma ir iegremdēta šķidrumā, gaisa burbuļi tiks iesprostoti, tādējādi veidojot gaisa kabatas un novēršot baktēriju adhēziju (26).Tomēr jaunākie pētījumi liecina, ka SHP virsmai ir trūkumi, kas saistīti ar mehānisko izturību un ilgtermiņa stabilitāti, kas kavē tās pielietošanu medicīniskajos implantos.Turklāt gaisa kabatas izšķīst un zaudēs pretapaugšanas īpašības, tādējādi radot plašāku baktēriju adhēziju SHP virsmas lielās virsmas dēļ (27, 28).Nesen Aizenbergs un kolēģi ieviesa inovatīvu metodi virsmas pārklāšanai pret bioapaugšanu, izstrādājot gludu virsmu, iedvesmojoties no Nepenthes krūkas auga (29, 30).Gludā virsma uzrāda ilgstošu stabilitāti hidrauliskos apstākļos, ir ārkārtīgi šķidrumu atgrūdoša pret bioloģiskiem šķidrumiem, un tai ir pašatjaunojošas īpašības.Tomēr nav ne metodes, kā uzklāt pārklājumu sarežģītas formas medicīniskajam implantam, ne arī pierādīts, ka tā atbalstītu bojāto audu dzīšanas procesu pēc implantācijas.
Šeit mēs ieviešam eļļotu ortopēdisko implantu virsmu (LOIS), mikro/nano strukturētu ortopēdisko implantu virsmu un cieši apvienotu ar plānu smērvielas slāni, lai novērstu to saistību ar plastisko ķirurģiju Baktēriju infekcijas, piemēram, lūzumu fiksācija.Tā kā fluora funkcionalizētā mikro/nano līmeņa struktūra stingri nostiprina smērvielu uz struktūras, izstrādātais LOIS var pilnībā atvairīt dažādu šķidrumu saķeri un ilgstoši uzturēt pretapaugšanas veiktspēju.LOIS pārklājumus var uzklāt uz dažādu formu materiāliem, kas paredzēti kaulu sintēzei.In vitro ir apstiprinātas LOIS lieliskās pret bioapaugšanas īpašības pret bioplēves baktērijām [Pseudomonas aeruginosa un pret meticilīnu rezistentu Staphylococcus aureus (MRSA)] un bioloģiskām vielām (šūnām, olbaltumvielām un kalciju).Ekstensīvas adhēzijas adhēzijas līmenis ar pamatni ir mazāks par 1%.Turklāt pat pēc mehāniskas slodzes, piemēram, virsmas skrāpējumiem, iesūcošās smērvielas izraisītā pašdziedināšanās palīdz saglabāt tās pretapaugšanas īpašības.Mehāniskās izturības testa rezultāti liecina, ka pat pēc strukturālās un ķīmiskās modifikācijas kopējā izturība būtiski nesamazināsies.Turklāt tika veikts in vitro eksperiments, kas simulē mehānisko spriegumu ķirurģiskajā vidē, lai pierādītu, ka LOIS spēj izturēt dažādus mehāniskos spriegumus, kas rodas plastiskās ķirurģijas laikā.Visbeidzot, mēs izmantojām uz truša balstītu augšstilba kaula lūzuma modeli in vivo, kas pierādīja, ka LOIS ir izcilas antibakteriālās īpašības un bioloģiskā saderība.Radioloģiskie un histoloģiskie rezultāti apstiprināja, ka stabila smērvielas uzvedība un anti-bioapaugļošanās īpašības 4 nedēļu laikā pēc implantācijas var nodrošināt efektīvu pretinfekciju un imūnsistēmu, neaizkavējot kaulu dzīšanas procesu.
1A attēlā parādīta izstrādātā LOIS shematiska diagramma, kas ir implantēta ar mikro/nano mēroga struktūrām truša augšstilba kaula lūzuma modelī, lai apstiprinātu tās lieliskās pretbioloģiskās piesārņošanas un pretinfekcijas īpašības.Tiek veikta biomimētiskā metode, lai imitētu ūdens podu auga virsmu un novērstu bioloģisko piesārņojumu, virsmas mikro/nano struktūrā iekļaujot smērvielu slāni.Virsma, kas injicēta ar smērvielu, var samazināt kontaktu starp bioloģiskajām vielām un virsmu.Tāpēc, pateicoties stabilu ķīmisko saišu veidošanai uz virsmas, tai ir lieliska pretapaugšanas veiktspēja un ilgstoša stabilitāte.Rezultātā eļļošanas virsmas pretbioapaugļošanās īpašības ļauj izmantot dažādus praktiskus pielietojumus biomedicīnas pētījumos.Tomēr plaši pētījumi par šīs īpašās virsmas mijiedarbību organismā vēl nav pabeigti.Salīdzinot LOIS ar neapbruņotiem substrātiem in vitro, izmantojot albumīna un bioplēves baktērijas, var apstiprināt LOIS nelīpspēju (1.B attēls).Turklāt, notecinot ūdens pilienus uz slīpā tukšā pamatnes un LOIS substrāta (attēls S1 un filma S1), var parādīt bioloģiskā piesārņojuma veiktspēju.Kā parādīts fluorescences mikroskopa attēlā, eksponētais substrāts, kas inkubēts olbaltumvielu un baktēriju suspensijā, parādīja lielu daudzumu bioloģiskā materiāla, kas pielipa virsmai.Tomēr, pateicoties tā lieliskām anti-biofouling īpašībām, LOIS gandrīz neuzrāda fluorescenci.Lai apstiprinātu tā pretbioapaugļošanās un pretinfekcijas īpašības, LOIS tika uzklāts uz ortopēdisko implantu virsmas kaulu sintēzei (plāksnēm un skrūvēm) un ievietots truša lūzuma modelī.Pirms implantācijas kails ortopēdiskais implants un LOIS tika inkubēti baktēriju suspensijā 12 stundas.Iepriekšēja inkubācija nodrošina bioplēves veidošanos uz eksponētā implanta virsmas salīdzinājumam.1C attēlā parādīts lūzuma vietas fotoattēls 4 nedēļas pēc implantācijas.Kreisajā pusē trusis ar kailu ortopēdisko implantu uzrādīja smagu iekaisuma līmeni, jo uz implanta virsmas veidojās bioplēve.Pretējs rezultāts tika novērots trušiem, kuriem tika implantēts LOIS, tas ir, LOIS apkārtējiem audiem nebija ne infekcijas, ne iekaisuma pazīmju.Turklāt optiskais attēls kreisajā pusē norāda uz truša ķirurģisko vietu ar eksponēto implantu, norādot, ka uz LOIS virsmas netika atrastas vairākas līmvielas, kas atrodas uz eksponētā implanta virsmas.Tas parāda, ka LOIS ir ilgstoša stabilitāte un spēja saglabāt savas pretbioloģiskās piesārņošanas un pretsaķeres īpašības.
(A) LOIS shematiskā diagramma un tās implantācija truša augšstilba kaula lūzuma modelī.(B) Olbaltumvielu un baktēriju bioplēves fluorescences mikroskopijas attēls uz tukšas virsmas un LOIS substrāta.4 nedēļas pēc implantācijas (C) lūzuma vietas fotogrāfisks attēls un (D) rentgena attēls (izcelts ar sarkanu taisnstūri).Attēlu sniedza: Kyomin Chae, Jonsejas universitāte.
Sterilizētajiem, eksponētajiem negatīvi implantētajiem trušiem bija normāls kaulu dzīšanas process bez iekaisuma vai infekcijas pazīmēm.No otras puses, SHP implanti, kas iepriekš inkubēti baktēriju suspensijā, uzrāda ar infekciju saistītu iekaisumu apkārtējos audos.To var saistīt ar tā nespēju ilgstoši kavēt baktēriju adhēziju (S2 attēls).Lai pierādītu, ka LOIS neietekmē dzīšanas procesu, bet kavē iespējamās infekcijas, kas saistītas ar implantāciju, tika salīdzināti eksponētās pozitīvās matricas un LOIS rentgena attēli lūzuma vietā (1. D attēls).Kaila pozitīvā implanta rentgena attēlā bija redzamas noturīgas osteolīzes līnijas, kas liecina, ka kauls nav pilnībā sadzijis.Tas liecina, ka kaulu atveseļošanās process var ievērojami aizkavēties ar infekciju saistīta iekaisuma dēļ.Gluži pretēji, tas parādīja, ka truši, kuriem tika implantēts LOIS, bija sadzijuši un neuzrādīja nekādu acīmredzamu lūzuma vietu.
Lai izstrādātu medicīniskos implantus ar ilgtermiņa stabilitāti un funkcionalitāti (ieskaitot izturību pret biopiesārņojumu), ir pieliktas daudzas pūles.Tomēr dažādu bioloģisko vielu klātbūtne un audu adhēzijas dinamika ierobežo to klīniski uzticamu metožu izstrādi.Lai novērstu šos trūkumus, esam izstrādājuši mikro/nano slāņveida struktūru un ķīmiski modificētu virsmu, kas ir optimizēta augstā kapilārā spēka un ķīmiskās afinitātes dēļ, lai maksimāli saglabātu gludāko smērvielu.2.A attēlā parādīts kopējais LOIS ražošanas process.Vispirms sagatavojiet medicīniskās kvalitātes nerūsējošā tērauda (SS) 304 substrātu.Otrkārt, mikro/nano struktūra tiek veidota uz SS substrāta, ķīmiski kodinot, izmantojot fluorūdeņražskābes (HF) šķīdumu.Lai atjaunotu SS izturību pret koroziju, kodinātās substrāta apstrādei izmanto slāpekļskābes (HNO3) šķīdumu (31).Pasivācija uzlabo SS substrāta izturību pret koroziju un ievērojami palēnina korozijas procesu, kas var samazināt LOIS kopējo veiktspēju.Pēc tam, veidojot pašmontētu monoslāni (SAM) ar 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktiltrietoksisilānu (POTS), virsma tiek ķīmiski modificēta, lai uzlabotu ķīmisko mijiedarbību starp virsmu un gludās smērvielas Affinity.Virsmas modifikācija ievērojami samazina izgatavotās mikro/nano mēroga strukturētās virsmas virsmas enerģiju, kas atbilst gludās smērvielas virsmas enerģijai.Tas ļauj smērvielu pilnībā samitrināt, tādējādi uz virsmas veidojot stabilu smērvielas slāni.Modificētajai virsmai ir pastiprināta hidrofobitāte.Rezultāti liecina, ka slidena smērviela uz LOIS uzrāda stabilu uzvedību, pateicoties augstajai ķīmiskajai afinitātei un kapilārajam spēkam, ko izraisa mikro/nano struktūra (32, 33).Tika pētītas optiskās izmaiņas uz SS virsmas pēc virsmas modifikācijas un smērvielas injekcijas.Uz virsmas izveidotā mikro/nano slāņveida struktūra var izraisīt vizuālas izmaiņas un padarīt virsmu tumšāku.Šī parādība ir saistīta ar pastiprinātu gaismas izkliedes efektu uz nelīdzenas virsmas, kas palielina gaismas uztveršanas mehānisma izraisīto difūzo atstarošanu (34).Turklāt pēc smērvielas ievadīšanas LOIS kļūst tumšāks.Eļļošanas slānis samazina gaismas atstarošanu no pamatnes, tādējādi padarot LOIS tumšāku.Lai optimizētu mikrostruktūru/nanostruktūru, lai parādītu mazāko slīdēšanas leņķi (SA), lai sasniegtu bioloģiskās apaugšanas novēršanas veiktspēju, tika izmantota skenējošā elektronu mikroskopija (SEM) un atomu pāri, lai veiktu dažādus HF kodināšanas laikus (0, 3)., 15 un 60 minūtes) Spēka mikroskops (AFM) (2.B attēls).SEM un AFM attēli rāda, ka pēc neilga kodināšanas (3 minūšu kodināšanas) plikajam substrātam ir izveidojies nevienmērīgs nanomēroga raupjums.Virsmas raupjums mainās līdz ar kodināšanas laiku (S3 attēls).Laika mainīgā līkne parāda, ka virsmas raupjums turpina palielināties un sasniedz maksimumu 15 minūšu kodināšanas laikā, un pēc tam 30 minūšu kodināšanas laikā tiek novērota tikai neliela raupjuma vērtības samazināšanās.Šajā brīdī nanolīmeņa raupjums tiek iegravēts, savukārt mikrolīmeņa raupjums strauji attīstās, padarot raupjuma maiņu stabilāku.Pēc vairāk nekā 30 minūšu ilgas kodināšanas tiek novērots turpmāks raupjuma pieaugums, kas sīkāk izskaidrots šādi: SS sastāv no tērauda, ​​kas leģēts ar elementiem, tostarp dzelzi, hromu, niķeli, molibdēnu un daudziem citiem elementiem.Starp šiem elementiem dzelzs, hroms un molibdēns spēlē svarīgu lomu mikronu/nano mēroga raupjuma veidošanā uz SS ar HF kodināšanu.Korozijas sākumposmā dzelzs un hroms galvenokārt tiek korodēti, jo molibdēnam ir augstāka izturība pret koroziju nekā molibdēnam.Kodinājumam progresējot, kodināšanas šķīdums sasniedz lokālu pārsātinājumu, veidojot kodināšanas radītos fluorīdus un oksīdus.Fluors un oksīds nogulsnējas un galu galā atkal nogulsnējas uz virsmas, veidojot virsmas raupjumu mikronu/nano diapazonā (31).Šim mikro/nano līmeņa raupjumam ir svarīga loma LOIS pašatveseļošanās īpašībās.Divkāršās skalas virsma rada sinerģisku efektu, ievērojami palielinot kapilāro spēku.Šī parādība ļauj smērvielai stabili iekļūt virsmā un veicina pašatveseļošanās īpašības (35).Nelīdzenuma veidošanās ir atkarīga no kodināšanas laika.Mazāk nekā 10 minūšu kodināšanas virsma satur tikai nanomēroga raupjumu, kas nav pietiekami, lai noturētu pietiekami daudz smērvielas, lai nodrošinātu bioloģisko piesārņojumu (36).Savukārt, ja kodināšanas laiks pārsniedz 30 minūtes, nanomēroga raupjums, ko veido dzelzs un hroma pārgulsnēšanās, izzudīs, un molibdēna dēļ paliks tikai mikro mēroga raupjums.Pārāk iegravētajai virsmai trūkst nano mēroga raupjuma un tā zaudē divpakāpju raupjuma sinerģisko efektu, kas negatīvi ietekmē LOIS pašatveseļošanās īpašības.SA mērījumi tika veikti substrātiem ar dažādiem kodināšanas laikiem, lai pierādītu pretapaugšanas veiktspēju.Pamatojoties uz viskozitāti un virsmas enerģiju, tika izvēlēti dažādi šķidrumu veidi, tostarp dejonizēts (DI) ūdens, asinis, etilēnglikols (EG), etanols (EtOH) un heksadekāns (HD) (S4. attēls).Laika gaitā mainīgais kodināšanas modelis parāda, ka dažādiem šķidrumiem ar atšķirīgu virsmas enerģiju un viskozitāti LOIS SA pēc 15 minūšu kodināšanas ir viszemākā.Tāpēc LOIS ir optimizēts kodināšanai 15 minūtes, veidojot mikronu un nano mēroga raupjumu, kas ir piemērots efektīvai smērvielas noturības un izcilu pretapaugšanas īpašību uzturēšanai.
(A) LOIS četrpakāpju ražošanas procesa shematiska diagramma.Ielaidums parāda uz pamatnes izveidoto SAM.(B) SEM un AFM attēli, ko izmanto, lai optimizētu substrāta mikro/nano struktūru dažādos kodināšanas laikos.(C) Cr2p un (D) F1s rentgenstaru fotoelektronu spektroskopijas (XPS) spektri pēc virsmas pasivācijas un SAM pārklājuma.au, patvaļīga vienība.(E) Reprezentatīvi ūdens pilienu attēli uz tukšiem, kodinātiem, SHP un LOIS substrātiem.(F) Kontakta leņķa (CA) un SA mērījumi šķidrumiem ar dažādu virsmas spraigumu uz SHP un LOIS.Dati ir izteikti kā vidējais ± SD.
Pēc tam, lai apstiprinātu virsmas ķīmisko īpašību izmaiņas, tika izmantota rentgena fotoelektronu spektroskopija (XPS), lai pētītu substrāta virsmas ķīmiskā sastāva izmaiņas pēc katra virsmas pārklājuma.2C attēlā parādīti HF kodinātās virsmas un ar HNO 3 apstrādātās virsmas XPS mērījumu rezultāti.Divus galvenos maksimumus pie 587, 3 un 577, 7 eV var attiecināt uz Cr-O saiti, kas atrodas hroma oksīda slānī, kas ir galvenā atšķirība no HF iegravētās virsmas.Tas galvenokārt ir saistīts ar dzelzs un hroma fluorīda patēriņu uz virsmas ar HNO3.Kodināšana uz HNO3 bāzes ļauj hromam veidot pasivējošu oksīda slāni uz virsmas, kas padara kodināto SS atkal izturīgu pret koroziju.Attēlā 2D tika iegūti XPS spektri, lai apstiprinātu, ka pēc SAM pārklājuma uz virsmas izveidojās silāns uz fluorogļūdeņraža bāzes, kuram ir ārkārtīgi augsta šķidruma atgrūšanas spēja pat attiecībā uz EG, asinīm un EtOH.SAM pārklājums tiek pabeigts, silāna funkcionālajām grupām reaģējot ar hidroksilgrupām, kas veidojas plazmas apstrādē.Rezultātā tika novērots ievērojams CF2 un CF3 maksimumu pieaugums.Saistīšanas enerģija no 286 līdz 296 eV norāda, ka ķīmiskā modifikācija ir veiksmīgi pabeigta ar SAM pārklājumu.SHP uzrāda salīdzinoši lielas CF2 (290,1 eV) un CF3 (293,3 eV) pīķus, ko izraisa uz virsmas izveidojies silāns uz fluorogļūdeņraža bāzes.2E attēlā parādīti kontaktleņķa (CA) mērījumu reprezentatīvi optiskie attēli dažādām dejonizēta ūdens grupām, kas saskaras ar tukšu, iegravētu, SHP un LOIS.Šie attēli parāda, ka kodinātā virsma kļūst hidrofila ķīmiskās kodināšanas rezultātā izveidotās mikro/nano struktūras dēļ, lai dejonizēts ūdens tiktu absorbēts struktūrā.Tomēr, ja substrāts ir pārklāts ar SAM, substrātam ir spēcīga ūdens atgrūšanas spēja, tāpēc veidojas virsmas SHP un saskares laukums starp ūdeni un virsmu ir mazs.Visbeidzot, LOIS tika novērota CA samazināšanās, ko var attiecināt uz smērvielas iekļūšanu mikrostruktūrā, tādējādi palielinot kontakta laukumu.Lai pierādītu, ka virsmai ir lieliskas šķidruma atgrūšanas un nelīpošās īpašības, LOIS tika salīdzināts ar SHP substrātu, mērot CA un SA, izmantojot dažādus šķidrumus (2.F attēls).Pamatojoties uz viskozitāti un virsmas enerģiju, tika atlasīti dažāda veida šķidrumi, tostarp dejonizēts ūdens, asinis, EG, EtOH un HD (attēls S4).CA mērījumu rezultāti liecina, ka tad, kad CA ir tendence uz HD, tiek samazināta CA samazināšanās vērtība, kur CA ir viszemākā virsmas enerģija.Turklāt kopējās CA LOIS ir zems.Tomēr SA mērījums parāda pavisam citu parādību.Visi šķidrumi, izņemot jonizēto ūdeni, pielīp pie SHP substrāta, neslīdot nost.No otras puses, LOIS parāda ļoti zemu SA, kur, visu šķidrumu sasverot leņķī, kas ir zemāks par 10° līdz 15°, viss šķidrums noripos.Tas skaidri parāda, ka LOIS nelīpspēja ir labāka nekā SHP virsmai.Turklāt LOIS pārklājumi tiek uzklāti arī uz dažāda veida materiāliem, tostarp titāna (Ti), polifenilsulfona (PPSU), polioksimetilēna (POM), poliētera ētera ketona (PEEK) un bioabsorbējamiem polimēriem (PLGA), tie ir implantējami ortopēdiski materiāli (attēls). S5)).Secīgie pilienu attēli uz materiāla, kas apstrādāts ar LOIS, parāda, ka LOIS pretbioloģiskās salipšanas īpašības ir vienādas uz visiem substrātiem.Turklāt CA un SA mērījumu rezultāti liecina, ka LOIS nelīpošās īpašības var pielietot arī citiem materiāliem.
Lai apstiprinātu LOIS pretapaugšanas īpašības, dažāda veida substrāti (tostarp tukši, kodināti, SHP un LOIS) tika inkubēti ar Pseudomonas aeruginosa un MRSA.Šīs divas baktērijas tika atlasītas kā reprezentatīvas slimnīcas baktērijas, kas var izraisīt bioplēvju veidošanos, izraisot SSI (37).3. attēlā (A un B) parādīti fluorescences mikroskopa attēli un koloniju veidojošās vienības (CFU) mērījumu rezultāti substrātiem, kas inkubēti baktēriju suspensijā attiecīgi īstermiņā (12 stundas) un ilgstoši (72 stundas).Īsā laika posmā baktērijas veidos kopas un pieaugs, pārklājoties ar gļotām līdzīgām vielām un neļaujot tām izvadīt.Tomēr 72 stundu inkubācijas laikā baktērijas nobriest un kļūst viegli izkliedējamas, veidojot vairāk koloniju vai kopu.Tāpēc var uzskatīt, ka 72 stundu inkubācija ir ilgstoša un ir piemērots inkubācijas laiks, lai uz virsmas izveidotu spēcīgu bioplēvi (38).Īsā laika periodā kodinātajai virsmai un SHP virsmai bija baktēriju adhēzija, kas tika samazināta par aptuveni 25% līdz 50%, salīdzinot ar tukšo substrātu.Tomēr, pateicoties tā lieliskām pretbiotikām un stabilitātei, LOIS neuzrādīja baktēriju bioplēves adhēziju īstermiņā un ilgtermiņā.Shematiskā diagramma (attēls 3C) apraksta kodināšanas šķīduma, SHP un LOIS, pretbioloģisko piesārņojumu novēršanas mehānismu.Tiek pieņemts, ka iegravētajam substrātam ar hidrofilām īpašībām būs lielāks virsmas laukums nekā tukšai substrātam.Tāpēc uz kodinātās pamatnes notiks vairāk baktēriju adhēzija.Tomēr, salīdzinot ar neapbruņotu substrātu, kodinātā substrāta virsmā ir ievērojami mazāka bioplēve.Tas ir tāpēc, ka ūdens molekulas cieši saistās ar hidrofilo virsmu un darbojas kā ūdens smērviela, tādējādi īstermiņā traucējot baktēriju adhēziju (39).Tomēr ūdens molekulu slānis ir ļoti plāns un šķīst baktēriju suspensijā.Tāpēc ūdens molekulārais slānis uz ilgu laiku pazūd, izraisot plašu baktēriju adhēziju un proliferāciju.SHP īstermiņa nesamitrinošo īpašību dēļ baktēriju adhēzija tiek kavēta.Samazināto baktēriju adhēziju var saistīt ar gaisa kabatām, kas iesprostoti slāņainajā struktūrā, un zemāku virsmas enerģiju, tādējādi samazinot kontaktu starp baktēriju suspensiju un virsmu.Tomēr SHP tika novērota plaša baktēriju adhēzija, jo tā ilgu laiku zaudēja savas pretapaugšanas īpašības.Tas galvenokārt ir saistīts ar gaisa kabatu izzušanu hidrostatiskā spiediena dēļ un gaisa šķīšanu ūdenī.Tas galvenokārt ir saistīts ar gaisa kabatu izzušanu šķīšanas dēļ un slāņaino struktūru, kas nodrošina lielāku virsmas laukumu adhēzijai (27, 40).Atšķirībā no šīm divām pamatnēm, kurām ir svarīga ietekme uz ilgtermiņa stabilitāti, LOIS sastāvā esošā smērviela tiek ievadīta mikro/nano struktūrā un nepazudīs pat ilgtermiņā.Smērvielas, kas pildītas ar mikro/nano struktūrām, ir ļoti stabilas un to augstās ķīmiskās afinitātes dēļ spēcīgi pievelkas virsmai, tādējādi ilgstoši novēršot baktēriju adhēziju.S6 attēlā parādīts atstarošanas konfokālā mikroskopa attēls ar smērvielu ievadītu substrātu, kas iegremdēts fosfātu buferšķīdumā (PBS).Nepārtraukti attēli liecina, ka pat pēc 120 stundu ilgas nelielas kratīšanas (120 apgr./min.) LOIS smērvielas slānis paliek nemainīgs, norādot uz ilgstošu stabilitāti plūsmas apstākļos.Tas ir saistīts ar augsto ķīmisko afinitāti starp SAM pārklājumu uz fluora bāzes un smērvielu uz perfluorogļūdeņraža bāzes, tādējādi var izveidoties stabils smērvielas slānis.Tādējādi tiek saglabāta pretapaugšanas veiktspēja.Turklāt substrāts tika pārbaudīts pret reprezentatīviem proteīniem (albumīnu un fibrinogēnu), kas atrodas plazmā, šūnās, kas ir cieši saistītas ar imūno funkciju (makrofāgiem un fibroblastiem), un tām, kas saistītas ar kaulu veidošanos.Kalcija saturs ir ļoti augsts.(3D, 1. un 2. attēls un S7 attēls) (41., 42.).Turklāt fibrinogēna, albumīna un kalcija adhēzijas testa fluorescences mikroskopa attēli uzrādīja dažādas katras substrātu grupas adhēzijas īpašības (S8. attēls).Kaulu veidošanās laikā ortopēdisko implantu var apņemt jaunizveidotie kaula un kalcija slāņi, kas ne tikai apgrūtina izņemšanu, bet arī var radīt negaidītu kaitējumu pacientam noņemšanas procesā.Tāpēc zems kalcija nogulšņu līmenis uz kaulu plāksnēm un skrūvēm ir izdevīgs ortopēdiskām operācijām, kurām nepieciešama implanta noņemšana.Pamatojoties uz pievienotā laukuma kvantitatīvo noteikšanu, pamatojoties uz fluorescences intensitāti un šūnu skaitu, mēs apstiprinājām, ka LOIS uzrāda lieliskas anti-biofouling īpašības visām bioloģiskajām vielām, salīdzinot ar citiem substrātiem.Saskaņā ar in vitro eksperimentu rezultātiem, ortopēdiskajiem implantiem var pielietot pretbioloģisko piesārņojumu LOIS, kas spēj ne tikai kavēt bioplēves baktēriju izraisītās infekcijas, bet arī mazināt organisma aktīvās imūnsistēmas izraisītos iekaisumus.
(A) Katras grupas fluorescences mikroskopa attēli (kaili, iegravēti, SHP un LOIS), kas inkubēti Pseudomonas aeruginosa un MRSA suspensijā 12 un 72 stundas.(B) Pseudomonas aeruginosa un MRSA pielipušo CFU skaits uz katras grupas virsmas.(C) Īslaicīgas un ilgstošas ​​kodināšanas, SHP un LOIS antibioloģiskā piesārņojuma mehānisma shematiskā diagramma.(D) (1) Fibroblastu skaits, kas pielipuši katram substrātam, un šūnu fluorescences mikroskopa attēli, kas pielipuši tukšajam un LOIS.(2) Ar imūnsistēmu saistīto proteīnu, albumīna un kalcija, kas iesaistīti kaulu dzīšanas procesā, adhēzijas tests (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 un **** P <0,0001).ns, nav svarīgi.
Nenovēršamu koncentrētu spriegumu gadījumā mehāniskā izturība vienmēr ir bijusi galvenais izaicinājums pretapaugšanas pārklājumu uzklāšanai.Tradicionālās pretnotekūdeņu gēla metodes ir balstītas uz polimēriem ar zemu šķīdību ūdenī un trauslumu.Tāpēc biomedicīnas lietojumos tie parasti ir jutīgi pret mehānisku spriegumu.Tāpēc mehāniski izturīgi pretapaugšanas pārklājumi joprojām ir izaicinājums tādiem lietojumiem kā ortopēdiskie implanti (43, 44).Attēlā 4A(1) parādīti divi galvenie ortopēdiskajiem implantiem pielietotie spriedzes veidi, tostarp skrāpējumi (bīdes spriegums) un saspiešana ar knaiblēm radīto bojātā implanta optisko attēlu.Piemēram, pievelkot skrūvi ar skrūvgriezi vai ķirurgam cieši turot kaulu plāksni ar pinceti un pieliekot spiedes spēku, plastmasas kaula plāksne tiks bojāta un saskrāpēta gan uz makro, gan mikro/nano svariem (4.A attēls, 2) .Lai pārbaudītu, vai ražotais LOIS var izturēt šos bojājumus plastiskās ķirurģijas laikā, tika veikta nanoindentācija, lai salīdzinātu tukšās pamatnes cietību un LOIS mikro/nano mērogā, lai pētītu mikro/nano struktūras mehāniskās īpašības Impact (attēls 4B).Shematiskā diagramma parāda atšķirīgo LOIS deformācijas izturēšanos mikro/nano struktūru klātbūtnes dēļ.Spēka-nobīdes līkne tika uzzīmēta, pamatojoties uz nanoindentācijas rezultātiem (4.C attēls).Zilais attēls attēlo tukšo substrātu, kas parāda tikai nelielu deformāciju, kā redzams ar maksimālo ievilkuma dziļumu 0, 26 μm.No otras puses, pakāpeniskajam nanoindentācijas spēka un nobīdes pieaugumam, kas novērots LOIS (sarkanajā līknē), var būt samazinātas mehāniskās īpašības, kā rezultātā nanoindentācijas dziļums ir 1, 61 μm.Tas ir tāpēc, ka LOIS esošā mikro/nano struktūra nodrošina dziļāku vietu nanoindentera galam, tāpēc tā deformācija ir lielāka nekā tukšā substrāta deformācija.Konsta-Gdoutos et al.(45) uzskata, ka nanostruktūru klātbūtnes dēļ nanoievilkums un mikro/nano raupjums rada neregulāras nanoindentācijas līknes.Aizēnotais laukums atbilst neregulārajai deformācijas līknei, kas tiek attiecināta uz nanostruktūru, bet neēnotais laukums tiek attiecināts uz mikrostruktūru.Šī deformācija var sabojāt noturošās smērvielas mikrostruktūru/nanostruktūru un negatīvi ietekmēt tās pretapaugšanas veiktspēju.Lai izpētītu bojājumu ietekmi uz LOIS, plastiskās ķirurģijas laikā organismā tika atkārtots neizbēgams mikro/nano struktūru bojājums.Izmantojot asins un olbaltumvielu adhēzijas testus, var noteikt LOIS pretbiopieaugšanas īpašību stabilitāti pēc in vitro (4.D attēls).Optisko attēlu sērija parāda bojājumus, kas radušies katra substrāta caurumu tuvumā.Tika veikts asins adhēzijas tests, lai pierādītu mehānisko bojājumu ietekmi uz pretbioapaugļošanās pārklājumu (4.E attēls).Tāpat kā SHP, pretapaugšanas īpašības tiek zaudētas bojājumu dēļ, un LOIS piemīt lieliskas pretapaugšanas īpašības, atbaidot asinis.Tas ir tāpēc, ka virsmas enerģiju virza kapilārā darbība, kas aptver bojāto zonu, mikrostrukturētās smērvielas smērvielas plūsma atjauno pretapaugšanas īpašības (35).Tāda pati tendence tika novērota olbaltumvielu adhēzijas testā, izmantojot albumīnu.Bojātajā zonā plaši tiek novērota proteīna adhēzija uz SHP virsmas, un, mērot tās platības pārklājumu, to var kvantitatīvi noteikt kā pusi no tukšās pamatnes adhēzijas līmeņa.No otras puses, LOIS saglabāja savas bioloģiskās apaugšanas īpašības, neizraisot adhēziju (4. attēls, F un G).Turklāt skrūves virsma bieži tiek pakļauta spēcīgai mehāniskai slodzei, piemēram, urbšanai, tāpēc mēs pētījām LOIS pārklājuma spēju palikt neskartam uz skrūves in vitro.4H attēlā ir parādīti dažādu skrūvju optiskie attēli, tostarp tukšas, SHP un LOIS skrūves.Sarkanais taisnstūris apzīmē mērķa zonu, kurā kaulu implantācijas laikā rodas spēcīgs mehāniskais spriegums.Līdzīgi kā plāksnes proteīna adhēzijas testā, fluorescences mikroskopu izmanto, lai attēlotu proteīna adhēziju un izmērītu pārklājuma laukumu, lai pierādītu LOIS pārklājuma integritāti pat spēcīgas mehāniskās slodzes apstākļos (4. attēls, I un J).Ar LOIS apstrādātajām skrūvēm ir lieliska pretapaugšanas veiktspēja, un gandrīz neviens proteīns nepielīp pie virsmas.No otras puses, proteīna adhēzija tika novērota tukšām skrūvēm un SHP skrūvēm, kur SHP skrūvju platība bija viena trešdaļa no tukšajām skrūvēm.Turklāt fiksācijai izmantotajam ortopēdiskajam implantam jābūt mehāniski izturīgam, lai izturētu lūzuma vietai pielikto spriegumu, kā parādīts 4K attēlā.Tāpēc tika veikts lieces tests, lai noteiktu ķīmiskās modifikācijas ietekmi uz mehāniskajām īpašībām.Turklāt tas tiek darīts, lai saglabātu fiksēto spriegumu no implanta.Pielietojiet vertikālu mehānisku spēku, līdz implants ir pilnībā salocīts un tiek iegūta sprieguma-deformācijas līkne (4L, 1. attēls).Divas īpašības, tostarp Janga modulis un lieces izturība, tika salīdzinātas starp tukšajām un LOIS substrātiem kā to mehāniskās izturības indikatoriem (4L, 2. un 3. attēls).Younga modulis norāda uz materiāla spēju izturēt mehāniskās izmaiņas.Katra substrāta Younga modulis ir attiecīgi 41,48±1,01 un 40,06±0,96 GPa;novērotā atšķirība ir aptuveni 3,4%.Turklāt tiek ziņots, ka lieces izturība, kas nosaka materiāla stingrību, ir 102,34±1,51 GPa tukšai pamatnei un 96,99±0,86 GPa SHP.Tukšais substrāts ir aptuveni par 5,3% augstāks.Nelielo mehānisko īpašību samazināšanos var izraisīt iecirtuma efekts.Iecirtuma efektā mikro/nano raupjums var darboties kā iecirtumu kopums, izraisot lokālu sprieguma koncentrāciju un ietekmējot implanta mehāniskās īpašības (46).Tomēr, pamatojoties uz faktu, ka tiek ziņots, ka cilvēka garozas kaula stīvums ir no 7,4 līdz 31,6 GPa un izmērītais LOIS modulis pārsniedz cilvēka garozas kaula stīvumu (47), LOIS ir pietiekams, lai atbalstītu lūzumu un tā vispārējo. mehāniskās īpašības minimāli ietekmē virsmas modifikācijas.
(A) Shematiska diagramma par (1) ortopēdiskajam implantam operācijas laikā pielietoto mehānisko spriegumu un (2) bojātā ortopēdiskā implanta optisko attēlu.(B) Shematiskā diagramma nanomehānisko īpašību mērīšanai ar nanoindentāciju un LOIS uz tukšas virsmas.(C) Nanoindentation spēka un nobīdes līkne tukšai virsmai un LOIS.(D) Pēc in vitro eksperimentiem simulējiet dažādu veidu ortopēdisko plākšņu optiskos attēlus (bojātā vieta ir izcelta ar sarkanu taisnstūri), lai modelētu operācijas laikā radīto mehānisko spriegumu.(E) Bojātās ortopēdiskās plāksnes grupas asins adhēzijas tests un (F) proteīna adhēzijas tests.(G) Izmēriet plāksnei pielipušo proteīna apgabalu.(H) dažādu veidu ortopēdisko skrūvju optiskie attēli pēc in vitro eksperimenta.(I) Olbaltumvielu adhēzijas tests, lai izpētītu dažādu pārklājumu integritāti.(J) Izmēriet pie skrūves pielipušo proteīna apgabalu.(K) Truša kustība ir paredzēta, lai radītu fiksētu slodzi uz lūzuma kaula.(L) (1) Liekšanas testa rezultāti un optiskie attēli pirms un pēc lieces.Atšķirība (2) Janga modulī un (3) lieces stiprībā starp tukšu implantu un SHP.Dati ir izteikti kā vidējais ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 un ****P<0,0001).Attēls: Kyomin Chae, Jonsejas universitāte.
Klīniskās situācijās lielākā daļa baktēriju kontakta ar bioloģiskiem materiāliem un brūču vietām rodas no nobriedušām, nobriedušām bioplēvēm (48).Tāpēc ASV Slimību kontroles un profilakses centri lēš, ka 65% no visām cilvēku infekcijām ir saistītas ar bioplēvēm (49).Šajā gadījumā ir jānodrošina in vivo eksperimentāls dizains, kas nodrošina konsekventu bioplēves veidošanos uz implanta virsmas.Tāpēc mēs izstrādājām truša augšstilba kaula lūzuma modeli, kurā ortopēdiskie implanti tika iepriekš inkubēti baktēriju suspensijā un pēc tam implantēti trušu augšstilba kaulos, lai pētītu LOIS pretapaugšanas īpašības in vivo.Ņemot vērā šādus trīs svarīgus faktus, bakteriālas infekcijas izraisa iepriekšēja kultivēšana, nevis tieša baktēriju suspensiju injekcija: i) trušu imūnsistēma dabiski ir spēcīgāka nekā cilvēkiem;tādēļ iespējama baktēriju suspensiju un planktona baktēriju injicēšana. Tas neietekmē bioplēvju veidošanos.(Ii) Planktona baktērijas ir jutīgākas pret antibiotikām, un antibiotikas parasti lieto pēc operācijas;visbeidzot, (iii) planktona baktēriju suspensiju var atšķaidīt ar dzīvnieka ķermeņa šķidrumiem (50).Pirms implantācijas iepriekš kultivējot implantu baktēriju suspensijā, mēs varam rūpīgi izpētīt bakteriālās infekcijas un svešķermeņa reakcijas (SBR) kaitīgo ietekmi uz kaulu dzīšanas procesu.Truši tika nogalināti 4 nedēļas pēc implantācijas, jo kaulu dzīšanas procesam nepieciešamā osseointegrācija tiks pabeigta 4 nedēļu laikā.Pēc tam implanti tika izņemti no trušiem pakārtotajiem pētījumiem.5A attēlā parādīts baktēriju proliferācijas mehānisms.Inficētais ortopēdiskais implants tiek ievadīts ķermenī.Iepriekšējas inkubācijas rezultātā baktēriju suspensijā seši no sešiem trušiem, kas implantēti ar kailiem implantiem, tika inficēti, savukārt neviens no trušiem, kuriem implantēti ar LOIS apstrādāti implanti, nebija inficēts.Bakteriālas infekcijas notiek trīs posmos, tostarp augšanas, nobriešanas un izkliedes (51).Pirmkārt, pievienotās baktērijas vairojas un aug uz virsmas, un pēc tam baktērijas veido bioplēvi, kad tās izdala ārpusšūnu polimēru (EPS), amiloīdu un ekstracelulāro DNS.Bioplēve ne tikai traucē antibiotiku iekļūšanu, bet arī veicina antibiotiku noārdošo enzīmu (piemēram, β-laktamāzes) uzkrāšanos (52).Visbeidzot, bioplēve izplata nobriedušās baktērijas apkārtējos audos.Tāpēc infekcija notiek.Turklāt, svešķermenim nonākot organismā, infekcija, kas var izraisīt spēcīgu imūnreakciju, var izraisīt smagu iekaisumu, sāpes un samazinātu imunitāti.5.B attēlā ir sniegts pārskats par FBR, ko izraisa ortopēdiskā implanta ievietošana, nevis imūnās atbildes reakcija, ko izraisa bakteriāla infekcija.Imūnsistēma atpazīst ievietoto implantu kā svešķermeni un pēc tam liek šūnām un audiem reaģēt, lai iekapsulētu svešķermeni (53).FBR pirmajās dienās uz ortopēdisko implantu virsmas izveidojās piegādes matrica, kuras rezultātā notika fibrinogēna adsorbcija.Adsorbētais fibrinogēns pēc tam veido ļoti blīvu fibrīna tīklu, kas veicina leikocītu piesaisti (54).Kad fibrīna tīkls ir izveidots, neitrofilu infiltrācijas dēļ notiks akūts iekaisums.Šajā solī tiek atbrīvoti dažādi citokīni, piemēram, audzēja nekrozes faktors-α (TNF-α), interleikīns-4 (IL-4) un IL-β, un monocīti sāk infiltrēties implantācijas vietā un diferencēties milzu šūnās.Fāga (41, 55, 56).FBR samazināšana vienmēr ir bijusi problēma, jo pārmērīgs FBR var izraisīt akūtu un hronisku iekaisumu, kas var izraisīt letālas komplikācijas.Lai novērtētu bakteriālo infekciju ietekmi audos, kas ieskauj neapbruņotu implantu un LOIS, tika izmantota hematoksilīna un eozīna (H&E) un Masson trihroma (MT) krāsošana.Trušiem, kas implantēti ar tukšiem substrātiem, progresēja smagas bakteriālas infekcijas, un H&E audu priekšmetstikliņos bija skaidri redzami iekaisuma izraisīti abscesi un nekroze.No otras puses, ārkārtīgi spēcīgā virsma LOIS kavē baktēriju adhēziju, tāpēc tai nav infekcijas pazīmju un tas samazina iekaisumu (5. C attēls).MT krāsošanas rezultāti parādīja tādu pašu tendenci.Tomēr MT krāsošana arī parādīja tūsku trušiem, kuriem tika implantēts LOIS, norādot, ka drīz notiks atveseļošanās (5. D attēls).Lai izpētītu imūnās atbildes pakāpi, tika veikta imūnhistoķīmiskā (IHC) krāsošana, izmantojot citokīnus TNF-α un IL-6, kas saistīti ar imūnreakciju.Kails negatīvs implants, kas nebija pakļauts baktērijām, tika salīdzināts ar LOIS, kas bija pakļauts baktērijām, bet nebija inficēts, lai pētītu dzīšanas procesu, ja nav bakteriālas infekcijas.5E attēlā parādīts IHC priekšmetstikliņa optiskais attēls, kas izsaka TNF-α.Brūnais laukums apzīmē imūnreakciju, norādot, ka imūnreakcija LOIS ir nedaudz samazināta.Turklāt IL-6 ekspresija LOIS bija ievērojami mazāka nekā sterila kaila negatīvā ekspresija (attēls 5F).Citokīna ekspresija tika kvantitatīvi noteikta, mērot citokīnam atbilstošo antivielu iekrāsošanās laukumu (5G attēls).Salīdzinot ar trušiem, kas pakļauti negatīvajiem implantiem, ar LOIS implantēto trušu ekspresijas līmeņi bija zemāki, parādot būtisku atšķirību.Citokīnu ekspresijas samazināšanās norāda, ka LOIS ilgstošas, stabilas pretapaugšanas īpašības ir saistītas ne tikai ar bakteriālu infekciju inhibīciju, bet arī ar FBR samazināšanos, ko izraisa makrofāgi, kas pielīp pie substrāta (53, 57, 58).Tāpēc samazināta imūnreakcija, ko izraisa LOIS imūnās izvairīšanās īpašības, var atrisināt blakusparādības pēc implantācijas, piemēram, pārmērīgu imūnreakciju pēc plastiskās operācijas.
(A) Shematiska diagramma par bioplēves veidošanās mehānismu un izplatīšanos uz inficēta ortopēdiskā implanta virsmas.eDNS, ekstracelulārā DNS.(B) Imūnās atbildes shematiska diagramma pēc ortopēdiskā implanta ievietošanas.(C) ortopēdisko implantu apkārtējo audu H&E krāsošana un (D) MT krāsošana ar tukšu pozitīvu un LOIS.Ar imūnsistēmu saistīto citokīnu (E) TNF-α un (F) IL-6 IHC ir kailu negatīvu un ar LOIS implantētu trušu krāsoti attēli.(G) Citokīnu ekspresijas kvantitatīva noteikšana pēc platības pārklājuma mērījuma (** P <0,01).
LOIS bioloģiskā saderība un tās ietekme uz kaulu dzīšanas procesu tika pārbaudīta in vivo, izmantojot diagnostisko attēlveidošanu [rentgena un mikrodatortomogrāfija (CT)] un osteoklastu IHC.6.A attēlā parādīts kaulu dzīšanas process, kas ietver trīs dažādus posmus: iekaisumu, labošanu un pārveidošanu.Kad notiek lūzums, iekaisuma šūnas un fibroblasti iekļūs lūzuma kaulā un sāks augt asinsvadu audos.Atjaunošanas fāzē asinsvadu audu ieaugums izplatās netālu no lūzuma vietas.Asinsvadu audi nodrošina barības vielas jauna kaula veidošanai, ko sauc par kallusu.Kaulu dzīšanas procesa pēdējais posms ir remodelācijas stadija, kurā kalusa izmērs tiek samazināts līdz normāla kaula izmēram, palielinot aktivēto osteoklastu līmeni (59).Trīsdimensiju (3D) lūzuma vietas rekonstrukcija tika veikta, izmantojot mikro-CT skenēšanu, lai novērotu atšķirības kallusa veidošanās līmenī katrā grupā.Novērojiet augšstilba kaula šķērsgriezumu, lai novērotu kallusa biezumu, kas aptver lauzto kaulu (6. attēls, B un C).Rentgenstari tika izmantoti arī, lai katru nedēļu pārbaudītu visu grupu lūzumu vietas, lai novērotu dažādus kaulu reģenerācijas procesus katrā grupā (S9 attēls).Kalluss un nobriedušie kauli ir attiecīgi parādīti zilā/zaļā un ziloņkaula krāsā.Lielākā daļa mīksto audu tiek filtrēti ar iepriekš iestatītu slieksni.Nude pozitīvs un SHP apstiprināja neliela daudzuma kallusa veidošanos ap lūzuma vietu.No otras puses, atklāto LOIS negatīvo un lūzuma vietu ieskauj biezs kaluss.Mikro-CT attēli parādīja, ka kalusa veidošanos kavē bakteriāla infekcija un ar infekciju saistīts iekaisums.Tas ir tāpēc, ka imūnsistēma prioritāti piešķir septisku traumu, ko izraisa ar infekciju saistīts iekaisums, dziedināšanai, nevis kaulu atveseļošanai (60).Tika veikta IHC un pret tartrātu rezistenta skābes fosfatāzes (TRAP) krāsošana, lai novērotu osteoklastu aktivitāti un kaulu rezorbciju (6.D attēls) (61).Tikai daži aktivizēti osteoklasti, kas iekrāsoti purpursarkanā krāsā, tika konstatēti neapbruņotajos pozitīvos un SHP.No otras puses, daudzi aktivizēti osteoklasti tika novēroti netālu no LOIS kailajiem pozitīvajiem un nobriedušiem kauliem.Šī parādība norāda, ka osteoklastu klātbūtnē kalusā ap lūzuma vietu notiek vardarbīgs pārveidošanās process (62).Tika izmērīts kallusa kaulu tilpums un osteoklastu ekspresijas apgabals, lai salīdzinātu kallusa veidošanās līmeni ap lūzuma vietu visās grupās, lai kvantitatīvi noteiktu mikro-CT skenēšanas un IHC rezultātus (6.E, 1. un 2. attēls).Kā gaidīts, kaili negatīvi un kalusa veidošanās LOIS bija ievērojami augstāki nekā citās grupās, norādot, ka ir notikusi pozitīva kaulu remodelācija (63).S10 attēlā parādīts ķirurģiskās vietas optiskais attēls, skrūves tuvumā savākto audu MT krāsošanas rezultāts un TRAP krāsošanas rezultāts, izceļot skrūves kaula saskarni.Kailā substrātā tika novērota spēcīga kalusa un fibrozes veidošanās, savukārt ar LOIS apstrādātajam implantam bija relatīvi nepielipta virsma.Līdzīgi, salīdzinot ar neapbruņotiem negatīviem, trušiem, kuriem implantēti ar LOIS, tika novērota zemāka fibroze, kā norādīts ar baltajām bultiņām.Turklāt stingro tūsku (zilo bultiņu) var saistīt ar LOIS imūnās izvairīšanās īpašībām, tādējādi samazinot smagu iekaisumu.Nepiedegošā virsma ap implantu un samazināta fibroze liecina, ka noņemšanas process ir vieglāks, kā rezultātā parasti rodas citi lūzumi vai iekaisums.Kaulu dzīšanas process pēc skrūvju noņemšanas tika novērtēts pēc osteoklastu aktivitātes skrūvju kaula saskarnē.Gan tukšais kauls, gan LOIS implanta saskarne absorbēja līdzīgus osteoklastu līmeņus, lai turpinātu kaulu dzīšanu, norādot, ka LOIS pārklājumam nav negatīvas ietekmes uz kaulu dzīšanu vai imūnreakciju.Lai apstiprinātu, ka LOIS veiktā virsmas modifikācija netraucē kaulu dzīšanas procesu, tika izmantota rentgena izmeklēšana, lai salīdzinātu trušu kaulu sadzīšanu ar pakļautiem negatīviem joniem un 6 nedēļu LOIS implantāciju (6.F attēls).Rezultāti parādīja, ka, salīdzinot ar neinficēto kailu pozitīvo grupu, LOIS uzrādīja tādu pašu kaulu dzīšanas pakāpi, un abās grupās nebija acīmredzamu lūzuma pazīmju (nepārtraukta osteolīzes līnija).
(A) Kaulu dzīšanas procesa shematiska diagramma pēc lūzuma.(B) katras virsmas grupas kallusa veidošanās pakāpes atšķirība un (C) lūzuma vietas šķērsgriezuma attēls.(D) TRAP krāsošana, lai vizualizētu osteoklastu aktivitāti un kaulu rezorbciju.Pamatojoties uz TRAP aktivitāti, kortikālā kaula ārējā kallusa veidošanās tika kvantitatīvi analizēta ar (E) (1) mikro-CT un (2) osteoklastu aktivitāti.(F) 6 nedēļas pēc implantācijas atklātā negatīvā (izcelts ar sarkanu svītrotu taisnstūri) un LOIS (izcelts ar zilu svītrotu taisnstūri) lūzuma kaula rentgena attēli.Statistiskā analīze tika veikta ar vienvirziena dispersijas analīzi (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Īsāk sakot, LOIS nodrošina jauna veida antibakteriālas infekcijas stratēģijas un imūno aizsargpārklājumu ortopēdiskajiem implantiem.Tradicionālie ortopēdiskie implanti ar SHP funkcionalizāciju uzrāda īslaicīgas anti-biofouling īpašības, bet nevar saglabāt savas īpašības ilgu laiku.Substrāta superhidrofobitāte aiztur gaisa burbuļus starp baktērijām un substrātu, tādējādi veidojot gaisa kabatas, tādējādi novēršot baktēriju infekciju.Tomēr gaisa difūzijas dēļ šīs gaisa kabatas ir viegli noņemamas.No otras puses, LOIS ir labi pierādījis savu spēju novērst ar bioplēvi saistītas infekcijas.Tāpēc, pateicoties slāņainajā mikro/nano struktūras virsmā ievadītā smērvielas slāņa pretatgrūšanas īpašībām, var novērst ar infekciju saistītos iekaisumus.Lai optimizētu LOIS ražošanas apstākļus, tiek izmantotas dažādas raksturošanas metodes, tostarp SEM, AFM, XPS un CA mērījumi.Turklāt LOIS var pielietot arī dažādiem bioloģiskiem materiāliem, ko parasti izmanto ortopēdiskās fiksācijas iekārtās, piemēram, PLGA, Ti, PE, POM un PPSU.Pēc tam LOIS tika pārbaudīts in vitro, lai pierādītu tā antibiotiskās īpašības pret baktērijām un bioloģiskām vielām, kas saistītas ar imūnreakciju.Rezultāti liecina, ka salīdzinājumā ar neapbruņotu implantu tai ir lieliska antibakteriāla un pret bioloģisko piesārņojumu vērsta iedarbība.Turklāt LOIS uzrāda mehānisko izturību pat pēc mehāniskās slodzes, kas ir neizbēgama plastiskajā ķirurģijā.Pateicoties smērvielas pašdziedinošajām īpašībām uz mikro/nano struktūras virsmas, LOIS veiksmīgi saglabāja savas pretbioloģiskās netīrības īpašības.Lai izpētītu LOIS bioloģisko saderību un antibakteriālās īpašības in vivo, LOIS tika implantēts truša augšstilba kaulā 4 nedēļas.Trušiem, kas implantēti ar LOIS, bakteriāla infekcija netika novērota.Turklāt IHC lietošana parādīja samazinātu vietējās imūnās atbildes līmeni, norādot, ka LOIS neaizkavē kaulu dzīšanas procesu.LOIS piemīt lieliskas antibakteriālas un imūnās izvairīšanās īpašības, un ir pierādīts, ka tas efektīvi novērš bioplēves veidošanos pirms ortopēdiskās operācijas un tās laikā, īpaši kaulu sintēzes gadījumā.Izmantojot trušu kaulu smadzeņu iekaisuma augšstilba kaula lūzuma modeli, tika dziļi pētīta ar bioplēvi saistītu infekciju ietekme uz kaulu dzīšanas procesu, ko izraisīja iepriekš inkubēti implanti.Kā turpmākais pētījums ir nepieciešams jauns in vivo modelis, lai izpētītu iespējamās infekcijas pēc implantācijas, lai pilnībā izprastu un novērstu ar bioplēvi saistītas infekcijas visā dziedināšanas procesā.Turklāt osteoindukcija joprojām ir neatrisināts izaicinājums integrācijā ar LOIS.Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai apvienotu osteoinduktīvo šūnu selektīvo adhēziju vai reģeneratīvo medicīnu ar LOIS, lai pārvarētu izaicinājumu.Kopumā LOIS ir daudzsološs ortopēdiskais implantu pārklājums ar mehānisku noturību un izcilām antibiotikām īpašībām, kas var samazināt SSI un imūnsistēmas blakusparādības.
Mazgājiet 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS substrātu (Dong Kang M-Tech Co., Koreja) acetonā, EtOH un DI ūdenī 15 minūtes, lai noņemtu piesārņotājus.Lai uz virsmas izveidotu mikro/nanolīmeņa struktūru, notīrīto substrātu iegremdē 48% līdz 51% HF šķīdumā (DUKSAN Corp., Dienvidkoreja) 50°C temperatūrā.Kodināšanas laiks svārstās no 0 līdz 60 minūtēm.Pēc tam kodināto substrātu notīrīja ar dejonizētu ūdeni un ievietoja 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) šķīdumā 50 ° C temperatūrā 30 minūtes, lai uz virsmas izveidotu hroma oksīda pasivācijas slāni.Pēc pasivēšanas substrātu mazgā ar dejonizētu ūdeni un žāvē, lai iegūtu substrātu ar slāņainu struktūru.Pēc tam substrātu pakļāva skābekļa plazmai (100 W, 3 minūtes) un nekavējoties 12 stundas iegremdēja 8, 88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Vācija) šķīdumā toluolā istabas temperatūrā.Pēc tam substrāts, kas pārklāts ar POTS, tika notīrīts ar EtOH un 2 stundas atkvēlināts 150 ° C temperatūrā, lai iegūtu blīvu POTS SAM.Pēc SAM pārklājuma uz pamatnes tika izveidots smērvielas slānis, uzklājot perfluorpoliētera smērvielu (Krytox 101; DuPont, ASV) ar iekraušanas tilpumu 20 μm/cm 2. Pirms lietošanas smērvielu filtrē caur 0,2 mikronu filtru.Noņemiet lieko smērvielu, sasverot 45° leņķī 15 minūtes.Tāda pati ražošanas procedūra tika izmantota ortopēdiskajiem implantiem, kas izgatavoti no 304 SS (bloķēšanas plāksne un kortikālās bloķēšanas skrūve; Dong Kang M-Tech Co., Koreja).Visi ortopēdiskie implanti ir izstrādāti tā, lai tie atbilstu truša augšstilba kaula ģeometrijai.
Substrāta un ortopēdisko implantu virsmas morfoloģija tika pārbaudīta ar lauka emisijas SEM (Inspect F50, FEI, ASV) un AFM (XE-100, Park Systems, Dienvidkoreja).Virsmas raupjumu (Ra, Rq) mēra, reizinot laukumu 20 μm ar 20 μm (n = 4).Lai analizētu virsmas ķīmisko sastāvu, tika izmantota XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japāna) sistēma, kas aprīkota ar Al Kα rentgenstaru avotu ar plankuma izmēru 100 μm2.Šķidrā CA un SA mērīšanai tika izmantota CA mērīšanas sistēma, kas aprīkota ar dinamisku attēlu uztveršanas kameru (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Dienvidkoreja).Katram mērījumam uz virsmas novieto 6 līdz 10 μl pilienu (dejonizēts ūdens, zirga asinis, EG, 30% etanols un HD), lai izmērītu CA.Kad substrāta slīpuma leņķis palielinās ar ātrumu 2°/s (n = 4), SA tiek mērīts, kad piliens nokrīt.
Pseudomonas aeruginosa [Amerikas tipa kultūru kolekcija (ATCC) 27853] un MRSA (ATCC 25923) tika iegādātas no ATCC (Manasasa, Virdžīnija, ASV), un pamatkultūra tika uzturēta -80 °C temperatūrā.Pirms lietošanas saldētu kultūru 18 stundas inkubēja ar tripsīnu atkausētā sojas pupu buljonā (Komed, Koreja) 37 ° C temperatūrā un pēc tam divreiz pārnesa, lai to aktivizētu.Pēc inkubācijas kultūra tika centrifugēta ar ātrumu 10 000 apgr./min 10 minūtes 4 ° C temperatūrā un divas reizes mazgāta ar PBS (pH 7, 3) šķīdumu.Pēc tam centrifugētā kultūra tiek subkultūrēta uz asins agara plāksnēm (BAP).MRSA un Pseudomonas aeruginosa tika pagatavoti nakti un kultivēti Luria-Bertani buljonā.Pseudomonas aeruginosa un MRSA koncentrāciju inokulātā kvantitatīvi noteica ar suspensijas CFU sērijveida atšķaidījumos uz agara.Pēc tam noregulējiet baktēriju koncentrāciju līdz 0,5 McFarland standartam, kas atbilst 108 KVV/ml.Pēc tam darba baktēriju suspensiju atšķaida 100 reizes līdz 106 KVV/ml.Lai pārbaudītu antibakteriālās adhēzijas īpašības, substrāts pirms lietošanas tika sterilizēts 121°C 15 minūtes.Pēc tam substrātu pārnesa uz 25 ml baktēriju suspensijas un 12 un 72 stundas inkubēja 37 ° C temperatūrā ar spēcīgu kratīšanu (200 apgr./min.).Pēc inkubācijas katrs substrāts tika izņemts no inkubatora un 3 reizes mazgāts ar PBS, lai noņemtu visas peldošās baktērijas uz virsmas.Lai novērotu bioplēvi uz substrāta, bioplēve tika fiksēta ar metanolu un 2 minūtes iekrāsota ar 1 ml krimidīna apelsīna.Pēc tam iekrāsotās bioplēves fotografēšanai tika izmantots fluorescences mikroskops (BX51TR, Olympus, Japāna).Lai kvantitatīvi noteiktu bioplēvi uz substrāta, pievienotās šūnas tika atdalītas no substrāta ar lodīšu virpuļu metodi, kas tika uzskatīta par vispiemērotāko metodi piesaistīto baktēriju noņemšanai (n = 4).Izmantojot sterilas knaibles, noņemiet substrātu no augšanas barotnes un uzsitiet pa iedobes plāksni, lai noņemtu lieko šķidrumu.Vāji piestiprinātās šūnas tika noņemtas, divas reizes mazgājot ar sterilu PBS.Pēc tam katrs substrāts tika pārnests uz sterilu mēģeni, kas satur 9 ml 0, 1% proteīna ept sāls šķīduma (PSW) un 2 g 20 līdz 25 sterilas stikla lodītes (diametrs no 0, 4 līdz 0, 5 mm).Pēc tam tas tika maisīts 3 minūtes, lai atdalītu šūnas no parauga.Pēc vorteksēšanas suspensiju sērijveidā atšķaida 10 reizes ar 0, 1% PSW, un pēc tam 0, 1 ml katra atšķaidījuma tika inokulēta ar BAP.Pēc 24 stundu inkubācijas 37 ° C temperatūrā CFU tika skaitīts manuāli.
Šūnām tika izmantoti peles fibroblasti NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) un peles makrofāgi RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC).Izmantojiet Dulbecco modificēto Eagle barotni (DMEM; LM001-05, Welgene, Koreja), lai kultivētu peļu fibroblastus un papildinātu ar 10% teļa serumu (S103-01, Welgene) un 1% penicilīna-streptomicīnu (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene). ). Šūnas inkubēja nakti 37°C temperatūrā un 5% CO2. Šūnu krāsošanai šūnas tika fiksētas ar 4% paraformaldehīdu 20 minūtes un ievietotas 0,5% Triton X Incubate 5 minūtes. Iegremdējiet substrātu 50 nM tetrametilrodamīnā 37°C temperatūrā 30 minūtes. Pēc inkubācijas izmantojiet substrātu ar 4',6-diamino-2-fenilindolu (H-1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD fiksācijas barotni (n = 4 uz vienu šūnu). , fluoresceīns, fluoresceīna izotiocianāta albumīns (A9771, Sigma-Aldrich, Vācija) un cilvēka plazma Alexa Fluor 488 konjugēts fibrinogēns (F13191, Invitrogen, ASV) tika izšķīdināts PBS (10 mM, pH 7,4).Albumīna un fibrinogēna koncentrācija bija attiecīgi 1 un 150 μg/ml.Pēc substrāta Pirms iegremdēšanas proteīna šķīdumā, noskalojiet tos ar PBS, lai rehidrētu virsmu.Pēc tam iegremdējiet visus substrātus sešu iedobju plāksnē, kurā ir proteīna šķīdums, un inkubējiet 37°C 30 un 90 minūtes.Pēc inkubācijas substrāts tika izņemts no proteīna šķīduma, 3 reizes viegli nomazgāts ar PBS un fiksēts ar 4% paraformaldehīdu (n = 4 katram proteīnam).Kalcijam nātrija hlorīds (0,21 M) un kālija fosfāts (3,77 mM) tika izšķīdināts dejonizētā ūdenī.Šķīduma pH tika noregulēts uz 2,0, pievienojot hidrohlorīda šķīdumu (1 M).Pēc tam šķīdumā tika izšķīdināts kalcija hlorīds (5,62 mM).Pievienojot 1M tris(hidroksimetil)aminometānu, šķīduma pH tiek noregulēts uz 7,4.Iegremdējiet visus substrātus sešu iedobju plāksnē, kas piepildīta ar 1,5 × kalcija fosfāta šķīdumu, un pēc 30 minūtēm izņemiet no šķīduma.Krāsošanai 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Sajauc ar 100 ml dejonizēta ūdens.Pēc tam izmantojiet 10% amonija hidroksīdu, lai noregulētu pH līdz 4. Krāsojiet substrātu ar Alizarin Red šķīdumu 5 minūtes, pēc tam nokratiet lieko krāsu un noslaukiet.Pēc kratīšanas procesa noņemiet substrātu.Materiālu dehidrē, pēc tam 5 minūtes iegremdē acetonā, pēc tam 5 minūtes iegremdē acetona-ksilola (1:1) šķīdumā un visbeidzot mazgā ar ksilolu (n = 4).Tiek izmantots fluorescences mikroskops (Axio Imager) ar ×10 un ×20 objektīviem..A2m, Zeiss, Vācija) attēlo visus substrātus.ImageJ/FIJI (//imagej.nih.gov/ij/) tika izmantots, lai kvantitatīvi noteiktu bioloģisko vielu adhēzijas datus katrā četru dažādu attēlveidošanas apgabalu grupā.Konvertējiet visus attēlus bināros attēlos ar fiksētiem sliekšņiem substrāta salīdzināšanai.
Zeiss LSM 700 konfokālais mikroskops tika izmantots, lai uzraudzītu smērvielas slāņa stabilitāti PBS atstarošanas režīmā.Uz fluora bāzes pārklātais SAM stikla paraugs ar ievadītu eļļošanas slāni tika iegremdēts PBS šķīdumā un testēts, izmantojot orbitālo kratītāju (SHO-1D; Daihan Scientific, Dienvidkoreja) vieglos kratīšanas apstākļos (120 apgr./min.).Pēc tam paņemiet paraugu un uzraugiet smērvielas zudumu, mērot atstarotās gaismas zudumu.Lai iegūtu fluorescences attēlus atstarošanas režīmā, paraugu pakļauj 633 nm lāzeram un pēc tam savāc, jo gaisma tiks atstarota no parauga.Paraugi tika mērīti 0, 30, 60 un 120 stundu laika intervālos.
Lai noteiktu virsmas modifikācijas procesa ietekmi uz ortopēdisko implantu nanomehāniskajām īpašībām, nanoindenediona mērīšanai tika izmantots nanoindenteris (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, ASV), kas aprīkots ar trīspusēju piramīdas formas Berkoviča dimanta galu.Maksimālā slodze ir 10 mN un laukums ir 100 μm x 100 μm.Visiem mērījumiem iekraušanas un izkraušanas laiks ir 10 s, un turēšanas laiks pie maksimālās ievilkuma slodzes ir 2 s.Veiciet mērījumus no piecām dažādām vietām un ņemiet vidējo.Lai novērtētu mehāniskās stiprības veiktspēju zem slodzes, tika veikts šķērsvirziena trīspunktu lieces tests, izmantojot universālo testēšanas iekārtu (Instron 5966, Instron, ASV).Substrāts tiek saspiests ar nemainīgu ātrumu 10 N/s ar palielinātu slodzi.Programmatūra Bluehill Universal (n = 3) tika izmantota, lai aprēķinātu lieces moduli un maksimālo spiedes spriegumu.
Lai imitētu operācijas procesu un ar to saistītos operācijas laikā radušos mehāniskos bojājumus, operācijas process tika veikts in vitro.Ciskas kauli tika savākti no izpildītajiem Jaunzēlandes baltajiem trušiem.Ciskas kauls tika notīrīts un fiksēts 4% paraformaldehīdā 1 nedēļu.Kā aprakstīts eksperimenta ar dzīvniekiem metodē, fiksētais augšstilba kauls tika ķirurģiski operēts.Pēc operācijas ortopēdiskais implants tika iegremdēts asinīs (zirga asinis, KISAN, Koreja) uz 10 sekundēm, lai apstiprinātu, vai pēc mehāniskās traumas uzlikšanas radās asiņu saķeres (n = 3).
Pavisam 24 Jaunzēlandes balto trušu tēviņi (svars no 3,0 līdz 3,5 kg, vidējais vecums 6 mēneši) tika nejauši sadalīti četrās grupās: kaili negatīvi, kaili pozitīvi, SHP un LOIS.Visas procedūras, kas saistītas ar dzīvniekiem, tika veiktas saskaņā ar Institucionālās dzīvnieku kopšanas un lietošanas komitejas ētikas standartiem (IACUC apstiprināts, KOREA-2017-0159).Ortopēdiskais implants sastāv no fiksējošās plāksnes ar pieciem caurumiem (garums 41 mm, platums 7 mm un biezums 2 mm) un garozas fiksējošām skrūvēm (garums 12 mm, diametrs 2,7 mm) lūzuma fiksācijai.Izņemot tās plāksnes un skrūves, kas tika izmantotas tukšajā negatīvajā grupā, visas plāksnes un skrūves tika inkubētas MRSA suspensijā (106 KVV/ml) ​​12 stundas.Negatīvā grupa (n = 6) tika apstrādāta ar neapbruņotu virsmu implantiem, nepakļaujot baktēriju suspensiju, kā negatīvu infekcijas kontroli.Kaila pozitīvā grupa (n = 6) tika apstrādāta ar tukšas virsmas implantu, kas bija pakļauts baktērijām kā pozitīvu infekcijas kontroli.SHP grupa (n = 6) tika apstrādāta ar baktēriju iedarbībai pakļautiem SHP implantiem.Visbeidzot, LOIS grupa tika apstrādāta ar baktērijām pakļautiem LOIS implantiem (n = 6).Visi dzīvnieki tiek turēti būrī, tiek nodrošināts daudz barības un ūdens.Pirms operācijas truši tika badoti 12 stundas.Dzīvnieki tika anestēzēti, intramuskulāri ievadot ksilazīnu (5 mg/kg) un ievadot intravenozi paklitakselu (3 mg/kg).Pēc tam ievadiet 2% izoflurāna un 50% līdz 70% medicīniskā skābekļa (plūsmas ātrums 2 l/min) caur elpošanas sistēmu, lai saglabātu anestēziju.Tas tiek implantēts, izmantojot tiešu pieeju sānu augšstilba kaulam.Pēc apmatojuma noņemšanas un ādas dezinfekcijas ar povidonu-jodu kreisā vidusstilba kaula ārpusē tika veikts apmēram 6 cm garš iegriezums.Atverot spraugu starp muskuļiem, kas aptver augšstilba kaulu, augšstilba kauls tiek pilnībā pakļauts.Novietojiet plāksni augšstilba kaula priekšā un piestipriniet to ar četrām skrūvēm.Pēc fiksācijas izmantojiet zāģa asmeni (1 mm biezs), lai mākslīgi izveidotu lūzumu zonā starp otro un ceturto caurumu.Operācijas beigās brūce tika mazgāta ar fizioloģisko šķīdumu un aizvērta ar šuvēm.Katrs trusis tika injicēts subkutāni ar enrofloksacīnu (5 mg/kg), kas par vienu trešdaļu atšķaidīts fizioloģiskā šķīdumā.Visiem dzīvniekiem (0, 7, 14, 21, 28 un 42 dienas) tika veikti pēcoperācijas augšstilba kaula rentgenstari, lai apstiprinātu kaula osteotomiju.Pēc dziļas anestēzijas visi dzīvnieki tika nogalināti ar intravenozu KCl (2 mmol/kg) 28 un 42 dienās.Pēc izpildes augšstilba kauls tika skenēts ar mikro-CT, lai novērotu un salīdzinātu kaulu dzīšanas procesu un jaunu kaulu veidošanos starp četrām grupām.
Pēc izpildes tika savākti mīkstie audi, kas bija tiešā saskarē ar ortopēdiskajiem implantiem.Audus nakti fiksēja 10% neitrālā buferētā formalīnā un pēc tam dehidrēja EtOH.Dehidrētie audi tika iestrādāti parafīnā un sadalīti 40 μm biezumā, izmantojot mikrotomu (400CS; EXAKT, Vācija).Lai vizualizētu infekciju, tika veikta H&E krāsošana un MT krāsošana.Lai pārbaudītu saimniekorganisma reakciju, sadalītie audi tika inkubēti ar trušu anti-TNF-α primāro antivielu (AB6671, Abcam, ASV) un trušu anti-IL-6 (AB6672; Abcam, ASV), un pēc tam apstrādāti ar mārrutkiem.Oksidāze.Uzklājiet sekcijām avidīna-biotīna kompleksa (ABC) krāsošanas sistēmu saskaņā ar ražotāja norādījumiem.Lai parādītos kā brūns reakcijas produkts, 3,3-diaminobenzidīns tika izmantots visās daļās.Lai vizualizētu visas šķēles, tika izmantots digitālais slaidu skeneris (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungārija), un vismaz četri substrāti katrā grupā tika analizēti ar ImageJ programmatūru.
Rentgena attēli tika uzņemti visiem dzīvniekiem pēc operācijas un katru nedēļu, lai uzraudzītu lūzumu dzīšanu (n = 6 katrā grupā).Pēc izpildes tika izmantots augstas izšķirtspējas mikro-CT, lai aprēķinātu kalusa veidošanos ap augšstilbu pēc dziedināšanas.Iegūtais augšstilbs tika notīrīts, 3 dienas fiksēts 4% paraformaldehīdā un dehidrēts 75% etanolā.Pēc tam dehidrētie kauli tika skenēti, izmantojot mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Beļģija), lai izveidotu kaulu parauga 3D vokseļu attēlus (2240 ​​× 2240 pikseļi).Izmantojiet 1,0 mm Al filtru, lai samazinātu signāla troksni un visiem skenējumiem izmantotu augstu izšķirtspēju (E = 133 kVp, I = 60 μA, integrācijas laiks = 500 ms).Nrecon programmatūra (versija 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Beļģija) tika izmantota, lai ģenerētu skenētā parauga 3D tilpumu no iegūtās 2D sānu projekcijas.Analīzei 3D rekonstruētais attēls ir sadalīts 10 mm × 10 mm × 10 mm kubos atbilstoši lūzuma vietai.Aprēķiniet kallusu ārpus kortikālā kaula.Skenētā kaula tilpuma digitālai novirzīšanai tika izmantota programmatūra DataViewer (versija 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Beļģija), un analīzei tika izmantota programmatūra CT-Analyzer (versija 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Beļģija).Relatīvie rentgenstaru absorbcijas koeficienti nobriedušā kaulā un kalusā tiek izdalīti pēc to blīvuma, un pēc tam tiek kvantificēts kalusa tilpums (n = 4).Lai apstiprinātu, ka LOIS bioloģiskā saderība neaizkavē kaulu dzīšanas procesu, tika veikta papildu rentgena un mikro-CT analīze diviem trušiem: pliko negatīvo un LOIS grupām.Abām grupām nāvessods tika izpildīts 6. nedēļā.
Ciskas kauli no upurētajiem dzīvniekiem tika savākti un fiksēti 4% paraformaldehīdā 3 dienas.Pēc tam ortopēdiskais implants tiek rūpīgi izņemts no augšstilba kaula.Ciskas kauls tika atkaļķots 21 dienu, izmantojot 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Pēc tam atkaļķotais augšstilba kauls tika iegremdēts EtOH, lai padarītu to dehidrētu.Dehidrētais augšstilbs tika noņemts ksilolā un iestrādāts parafīnā.Pēc tam paraugs tika sagriezts ar automātisku rotējošu mikrotomu (Leica RM2255, Leica Biosystems, Vācija) ar biezumu 3 μm.TRAP krāsošanai (F6760, Sigma-Aldrich, Vācija) sadalītie paraugi tika deparafinēti, rehidrēti un inkubēti TRAP reaģentā 37 ° C temperatūrā 1 stundu.Attēli tika iegūti, izmantojot slaidu skeneri (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungārija), un kvantificēti, mērot iekrāsotās zonas pārklājumu.Katrā eksperimentā ar ImageJ programmatūru analizēja vismaz četrus substrātus katrā grupā.
Statistiskā nozīmīguma analīze tika veikta, izmantojot GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., ASV).Lai pārbaudītu atšķirības starp vērtēšanas grupām, tika izmantots nesapārotais t-tests un vienvirziena dispersijas analīze (ANOVA).Nozīmīguma līmenis attēlā norādīts šādi: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 un ****P<0,0001;NS, nav būtiskas atšķirības.
Papildu materiālus šim rakstam skatiet vietnē http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1.
Šis ir atvērtas piekļuves raksts, kas tiek izplatīts saskaņā ar Creative Commons Attribution-Non-Commercial License noteikumiem, kas ļauj izmantot, izplatīt un reproducēt jebkurā datu nesējā, ja vien izmantošana nav paredzēta komerciāla labuma gūšanai un priekšnoteikums ir tāds, ka oriģināls darbs ir korekts.Atsauce.
Piezīme. Mēs lūdzam jūs norādīt tikai e-pasta adresi, lai lapai ieteiktā persona zinātu, ka vēlaties, lai tā redz e-pastu un ka e-pasts nav mēstule.Mēs neuzņemsim nevienu e-pasta adresi.
Šis jautājums tiek izmantots, lai pārbaudītu, vai esat apmeklētājs, un lai novērstu automātisku surogātpasta iesniegšanu.
Čo Kjuns Mins, Ak Jangs Jangs, Parks Džūns Džons, Lī Džins Hjuks, Kima Hjuna Čeola, Lī Kjuns Mūns, Lī Čankju, Lī Jeons Taeks, Lī Sunuks, Džeongs Morui
Ortopēdisko implantu antibakteriālie un imūnsistēmas aizsargpārklājumi var samazināt infekcijas un infekciju izraisītās imūnās atbildes.
Čo Kjuns Mins, Ak Jangs Jangs, Parks Džūns Džons, Lī Džins Hjuks, Kima Hjuna Čeola, Lī Kjuns Mūns, Lī Čankju, Lī Jeons Taeks, Lī Sunuks, Džeongs Morui
Ortopēdisko implantu antibakteriālie un imūnsistēmas aizsargpārklājumi var samazināt infekcijas un infekciju izraisītās imūnās atbildes.
©2021 Amerikas Zinātnes attīstības asociācija.Visas tiesības aizsargātas.AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef un COUNTER partneris.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.