Для пацієнтів, які перенесли операцію з ортопедичної імплантації, бактеріальні інфекції та спричинені інфекцією імунні відповіді завжди були небезпечними для життя.Звичайні біологічні матеріали сприйнятливі до біологічного забруднення, яке спричиняє проникнення бактерій у пошкоджену ділянку та спричиняє післяопераційну інфекцію.Тому існує нагальна потреба в розробці протиінфекційних та імунних покриттів для ортопедичних імплантатів.Тут ми розробили вдосконалену технологію модифікації поверхні для ортопедичних імплантатів під назвою «Змащена поверхня ортопедичних імплантатів» (LOIS), на яку надихнула гладка поверхня глечиків для рослин.LOIS має тривалу та сильну здатність відштовхувати різноманітні рідини та біологічні речовини (включаючи клітини, білки, кальцій та бактерії).Крім того, ми підтвердили механічну стійкість до подряпин і силу фіксації, імітуючи неминучі пошкодження під час операції in vitro.Модель запального перелому стегнової кістки кролика була використана для ретельного вивчення антибіологічного масштабування та протиінфекційної здатності LOIS.Ми передбачаємо, що LOIS, який має властивості проти біологічного забруднення та механічну міцність, є кроком вперед у безінфекційній ортопедичній хірургії.
Сьогодні через загальне старіння значно зросла кількість пацієнтів, які страждають на ортопедичні захворювання (такі як переломи в літньому віці, дегенеративні захворювання суглобів, остеопороз) (1, 2).Тому медичні установи надають великого значення ортопедичній хірургії, включаючи ортопедичні імплантати гвинтів, пластин, цвяхів і штучних суглобів (3, 4).Проте традиційні ортопедичні імплантати, як повідомляється, сприйнятливі до бактеріальної адгезії та утворення біоплівки, що може спричинити інфекцію місця хірургічного втручання (SSI) після операції (5, 6).Як тільки біоплівка утворюється на поверхні ортопедичного імплантату, видалення біоплівки стає надзвичайно складним навіть із застосуванням великих доз антибіотиків.Тому це зазвичай призводить до важких післяопераційних інфекцій (7, 8).У зв’язку з вищезазначеними проблемами лікування інфікованих імплантатів повинно включати повторну операцію, включаючи видалення всіх імплантатів і навколишніх тканин;отже, пацієнт буде відчувати сильний біль і певні ризики (9, 10).
Щоб вирішити деякі з цих проблем, були розроблені ортопедичні імплантати з лікарським покриттям для запобігання інфекції шляхом знищення бактерій, прикріплених до поверхні (11, 12).Однак стратегія все ще має кілька обмежень.Повідомлялося, що довгострокова імплантація імплантатів, що виділяють лікарський засіб, спричинила пошкодження навколишніх тканин і викликала запалення, яке може призвести до некрозу (13, 14).Крім того, органічні розчинники, які можуть існувати після виробничого процесу ортопедичних імплантатів із виділенням ліків, які суворо заборонені Управлінням з контролю за продуктами й ліками США, вимагають додаткових етапів очищення, щоб відповідати його стандартам (15).Імплантати, що виділяють ліки, є складними для контрольованого вивільнення ліків, і через їх обмежене навантаження ліків довготривале застосування препарату є неможливим (16).
Інша поширена стратегія полягає в тому, щоб покрити імплантат полімером проти обростання, щоб запобігти прилипанню біологічних речовин і бактерій до поверхні (17).Наприклад, цвіттеріонні полімери привернули увагу завдяки своїм неадгезивним властивостям при контакті з білками плазми, клітинами та бактеріями.Однак він має деякі обмеження, пов’язані з довгостроковою стабільністю та механічною довговічністю, які перешкоджають його практичному застосуванню в ортопедичних імплантатах, особливо через механічне зіскоблювання під час хірургічних процедур (18, 19).Крім того, завдяки високій біосумісності, відсутності необхідності хірургічного втручання та властивостям очищення поверхні від корозії використовувалися ортопедичні імплантати, виготовлені з біорозкладаних матеріалів (20, 21).Під час корозії хімічні зв’язки між полімерною матрицею руйнуються та від’єднуються від поверхні, а адгези очищають поверхню.Однак антибіологічне забруднення шляхом очищення поверхні є ефективним за короткий період часу.Крім того, більшість поглинаючих матеріалів, включаючи сополімер полі(молочної кислоти та гліколевої кислоти) (PLGA), полімолочну кислоту (PLA) і сплави на основі магнію, зазнають нерівномірного біологічного розкладання та ерозії в тілі, що негативно вплине на механічну стабільність.(двадцять два).Крім того, біорозкладні фрагменти пластини забезпечують місце для прикріплення бактерій, що збільшує ймовірність інфікування в довгостроковій перспективі.Цей ризик механічної деградації та інфекції обмежує практичне застосування пластичної хірургії (23).
Супергідрофобні (SHP) поверхні, які імітують ієрархічну структуру листя лотоса, стали потенційним рішенням для поверхонь проти обростання (24, 25).Коли поверхня SHP занурена в рідину, бульбашки повітря будуть захоплені, утворюючи повітряні кишені та запобігаючи прилипанню бактерій (26).Однак останні дослідження показали, що поверхня SHP має недоліки, пов’язані з механічною міцністю та довгостроковою стабільністю, що перешкоджає її застосуванню в медичних імплантатах.Крім того, повітряні кишені розчиняться і втрачають свої властивості проти обростання, що призводить до ширшого прилипання бактерій через велику площу поверхні SHP (27, 28).Нещодавно Айзенберг і його колеги представили інноваційний метод покриття поверхні проти біообростання, створивши гладку поверхню на основі рослини Непентес (29, 30).Гладка поверхня демонструє довгострокову стабільність в гідравлічних умовах, надзвичайно відштовхує рідини для біологічних рідин і має властивості самовідновлення.Однак не існує ані методу нанесення покриття на медичний імплантат складної форми, а також не доведено, що він підтримує процес загоєння пошкодженої тканини після імплантації.
Тут ми представляємо змащену поверхню ортопедичного імплантату (LOIS), мікро/наноструктуровану поверхню ортопедичного імплантату, щільно поєднану з тонким шаром мастила, щоб запобігти її пов’язанню з бактеріальними інфекціями пластичної хірургії, такими як фіксація переломів.Оскільки мікро-/нанорівнева структура з функціоналом фтору міцно фіксує мастило на структурі, розроблений LOIS може повністю відштовхувати адгезію різних рідин і підтримувати ефективність захисту від обростання протягом тривалого часу.Покриття LOIS можна наносити на матеріали різної форми, призначені для синтезу кісткової тканини.Чудові властивості LOIS проти біологічного обростання бактерій біоплівки [Pseudomonas aeruginosa та метицилінрезистентного Staphylococcus aureus (MRSA)] та біологічних речовин (клітин, білків і кальцію) були підтверджені in vitro.Ступінь адгезії екстенсивного зчеплення з основою менше 1%.Крім того, навіть після механічного впливу, такого як поверхневі подряпини, самовідновлення, викликане проникаючим мастилом, допомагає зберегти його властивості проти обростання.Результати випробувань на механічну міцність показують, що навіть після структурної та хімічної модифікації загальна міцність не буде значно знижена.Крім того, був проведений експеримент in vitro, який імітує механічне навантаження в операційному середовищі, щоб довести, що LOIS може витримувати різні механічні навантаження, які виникають під час пластичної хірургії.Нарешті, ми використали модель перелому стегнової кістки in vivo на кроликах, яка довела, що LOIS має чудові антибактеріальні властивості та біосумісність.Рентгенологічні та гістологічні результати підтвердили, що стабільна мастильна поведінка та властивості проти біологічного обростання протягом 4 тижнів після імплантації можуть досягти ефективної протиінфекційної та імунної ефективності без затримки процесу загоєння кістки.
На малюнку 1A показано схематичну діаграму розробленого LOIS, який імплантовано з мікро/нанорозмірними структурами в модель перелому стегнової кістки кролика, щоб підтвердити його чудові антибіологічні властивості та протиінфекційні властивості.Біоміметичний метод використовується для імітації поверхні горщикової рослини та запобігання біологічному обростанню шляхом включення шару мастила в мікро/наноструктуру поверхні.Поверхня, на яку вводять мастило, може мінімізувати контакт між біологічними речовинами та поверхнею.Таким чином, завдяки утворенню стійких хімічних зв’язків на поверхні, він має чудові антиобростаючі властивості та тривалу стабільність.Як наслідок, властивості мастильної поверхні проти біологічного обростання дозволяють різні практичні застосування в біомедичних дослідженнях.Однак масштабні дослідження того, як ця особлива поверхня взаємодіє в організмі, ще не завершені.Порівнюючи LOIS з оголеними субстратами in vitro з використанням альбуміну та бактерій біоплівки, можна підтвердити відсутність адгезивності LOIS (рис. 1B).Крім того, шляхом скочування крапель води на похилій голій підкладці та підкладці LOIS (малюнок S1 і фільм S1) можна продемонструвати ефективність біологічного забруднення.Як показано на зображенні флуоресцентного мікроскопа, відкритий субстрат, інкубований у суспензії білка та бактерій, демонструє велику кількість біологічного матеріалу, що прилип до поверхні.Однак, завдяки чудовим властивостям проти біообростання, LOIS майже не виявляє флуоресценції.Для підтвердження його властивостей проти біологічних забруднень та проти інфекцій LOIS наносили на поверхню ортопедичних імплантатів для синтезу кістки (пластини та гвинти) і поміщали в модель перелому кролика.Перед імплантацією оголений ортопедичний імплантат і LOIS інкубували в бактеріальній суспензії протягом 12 годин.Попередня інкубація забезпечує формування біоплівки на поверхні експонованого імплантату для порівняння.На малюнку 1C показано фотографію місця перелому через 4 тижні після імплантації.Ліворуч у кролика з оголеним ортопедичним імплантатом спостерігалося серйозне запалення через утворення біоплівки на поверхні імплантату.Протилежний результат спостерігався у кроликів, яким імплантували LOIS, тобто навколишні тканини LOIS не виявляли ні ознак інфекції, ні ознак запалення.Крім того, оптичне зображення ліворуч вказує на місце хірургічного втручання кролика з оголеним імплантатом, вказуючи на те, що на поверхні LOIS не було виявлено жодних множинних адгезивів, присутніх на поверхні оголеного імплантату.Це показує, що LOIS має тривалу стабільність і здатність зберігати свої антибіологічні властивості, що запобігають засміченню та антиадгезії.
(A) Схематична діаграма LOIS та її імплантація в модель перелому стегнової кістки кролика.(B) Флуоресцентне мікроскопічне зображення білкової та бактеріальної біоплівки на голій поверхні та підкладці LOIS.Через 4 тижні після імплантації (C) фотознімок місця перелому та (D) рентгенівський знімок (виділений червоним прямокутником).Зображення надано: Kyomin Chae, Yonsei University.
У стерилізованих кроликів із негативною імплантацією спостерігався нормальний процес загоєння кісток без будь-яких ознак запалення чи інфекції.З іншого боку, імплантати SHP, попередньо інкубовані в бактеріальній суспензії, демонструють пов’язане з інфекцією запалення навколишніх тканин.Це можна пояснити його нездатністю пригнічувати адгезію бактерій протягом тривалого часу (рис. S2).Щоб довести, що LOIS не впливає на процес загоєння, але пригнічує можливі інфекції, пов’язані з імплантацією, порівняли рентгенівські зображення відкритої позитивної матриці та LOIS у місці перелому (рис. 1D).Рентгенівське зображення оголеного позитивного імплантату показало стійкі лінії остеолізу, що вказує на те, що кістка не повністю зажила.Це свідчить про те, що процес відновлення кісток може бути значно затриманий через запалення, пов’язане з інфекцією.Навпаки, це показало, що кролики, яким імплантували LOIS, зажили і не показали жодного явного місця перелому.
Щоб розробити медичні імплантати з довгостроковою стабільністю та функціональністю (включаючи стійкість до біообростання), було докладено багато зусиль.Однак наявність різноманітних біологічних речовин і динаміка тканинної адгезії обмежує розробку їх клінічно надійних методів.Щоб подолати ці недоліки, ми розробили мікро-/наношарову структуру та хімічно модифіковану поверхню, яка оптимізована завдяки високій капілярній силі та хімічній спорідненості, щоб максимально підтримувати найгладкіший мастильний матеріал.На малюнку 2A показано загальний процес виробництва LOIS.Спочатку підготуйте підкладку з нержавіючої сталі медичного класу (SS) 304.По-друге, мікро/наноструктура формується на підкладці з нержавіючої сталі шляхом хімічного травлення з використанням розчину плавикової кислоти (HF).Щоб відновити корозійну стійкість нержавіючої сталі, для обробки протравленої підкладки використовується розчин азотної кислоти (HNO3) (31).Пасивація підвищує корозійну стійкість підкладки з нержавіючої сталі та значно уповільнює процес корозії, що може знизити загальну продуктивність LOIS.Потім шляхом утворення самозбірного моношару (SAM) з 1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктилтриетоксисилану (POTS) поверхня хімічно модифікується для покращення хімічної взаємодії між поверхнею та гладким мастильним матеріалом Affinity.Модифікація поверхні значно зменшує поверхневу енергію виготовленої мікро/нанорозмірної структурованої поверхні, яка відповідає поверхневій енергії гладкого мастила.Це дозволяє мастилу повністю змочити, тим самим утворюючи стабільний шар мастила на поверхні.Модифікована поверхня демонструє підвищену гідрофобність.Результати показують, що слизьке мастило демонструє стабільну поведінку на LOIS завдяки високій хімічній спорідненості та капілярній силі, спричиненій мікро/наноструктурою (32, 33).Досліджено оптичні зміни на поверхні НС після модифікації поверхні та введення мастила.Мікро/наношарова структура, утворена на поверхні, може спричинити візуальні зміни та затемнити поверхню.Це явище пояснюється посиленим ефектом розсіювання світла на шорсткій поверхні, що збільшує дифузне відбиття, викликане механізмом захоплення світла (34).Крім того, після введення лубриканту LOIS стає темнішим.Змащувальний шар зменшує відображення світла від підкладки, тим самим затемнюючи LOIS.Щоб оптимізувати мікроструктуру/наноструктуру, щоб показати найменший кут ковзання (SA) для досягнення ефективності проти біообростання, скануюча електронна мікроскопія (SEM) і атомні пари були використані для виконання різного часу ВЧ-травлення (0, 3)., 15 і 60 хвилин) Силовий мікроскоп (АСМ) (Малюнок 2B).Зображення SEM та AFM показують, що після короткого часу травлення (3 хвилини травлення) оголена підкладка утворила нерівномірну нанорозмірну шорсткість.Шорсткість поверхні змінюється з часом травлення (Малюнок S3).Крива, що змінюється в часі, показує, що шорсткість поверхні продовжує збільшуватися і досягає піку через 15 хвилин травлення, а потім лише незначне зменшення значення шорсткості спостерігається через 30 хвилин травлення.У цей момент шорсткість нанорівня витравлюється, тоді як шорсткість мікрорівня активно розвивається, роблячи зміну шорсткості більш стабільною.Після травлення протягом більше ніж 30 хвилин спостерігається подальше збільшення шорсткості, яке детально пояснюється наступним чином: SS складається зі сталі, легованої елементами, включаючи залізо, хром, нікель, молібден та багато інших елементів.Серед цих елементів залізо, хром і молібден відіграють важливу роль у формуванні мікронної/наномасштабної шорсткості на SS шляхом ВЧ-травлення.На ранніх стадіях корозії залізо та хром в основному піддаються корозії, оскільки молібден має вищу корозійну стійкість, ніж молібден.У міру травлення травильний розчин досягає локального перенасичення, утворюючи фториди та оксиди, викликані травленням.Фторид і оксид випадає в осад і, зрештою, знову відкладається на поверхні, утворюючи шорсткість поверхні в діапазоні мікрон/нано (31).Ця шорсткість на мікро/нанорівні відіграє важливу роль у властивостях самовідновлення LOIS.Поверхня подвійного масштабу створює синергетичний ефект, значно збільшуючи капілярну силу.Це явище дозволяє мастилу стабільно проникати на поверхню та сприяє самовідновленню (35).Утворення шорсткості залежить від часу травлення.Після 10 хвилин травлення поверхня містить лише нанорозмірну шорсткість, якої недостатньо, щоб утримувати достатньо мастила для стійкості до біообростання (36).З іншого боку, якщо час травлення перевищує 30 хвилин, нанорозмірна шорсткість, утворена переосадженням заліза та хрому, зникне, і залишиться лише мікромасштабна шорсткість через молібден.Поверхня з надмірним травленням не має нанорозмірної шорсткості та втрачає синергетичний ефект двоступеневої шорсткості, що негативно впливає на характеристики самовідновлення LOIS.Вимірювання SA проводили на підкладках із різним часом травлення, щоб підтвердити ефективність захисту від обростання.Було вибрано різні типи рідин на основі в’язкості та поверхневої енергії, включаючи деіонізовану (DI) воду, кров, етиленгліколь (EG), етанол (EtOH) і гексадекан (HD) (Малюнок S4).Картина травлення, що змінюється в часі, показує, що для різних рідин з різними поверхневими енергіями та в’язкістю SA LOIS після 15 хвилин травлення є найнижчим.Таким чином, LOIS оптимізовано для травлення протягом 15 хвилин для утворення мікронної та нанорозмірної шорсткості, яка підходить для ефективного збереження довговічності мастила та чудових властивостей проти обростання.
(A) Схематична діаграма чотирьохетапного процесу виробництва LOIS.На вставці показано SAM, сформований на підкладці.(B) SEM та AFM зображення, що використовуються для оптимізації мікро/наноструктури підкладки за різного часу травлення.Спектри рентгенівської фотоелектронної спектроскопії (XPS) (C) Cr2p і (D) F1s після пасивації поверхні та покриття SAM.au, довільна одиниця.(E) Репрезентативні зображення крапель води на голих, витравлених, SHP та LOIS підкладках.(F) Вимірювання контактного кута (CA) і SA рідин з різним поверхневим натягом на SHP і LOIS.Дані виражені як середнє ± SD.
Потім, щоб підтвердити зміну хімічних властивостей поверхні, використовували рентгенівську фотоелектронну спектроскопію (XPS) для вивчення зміни хімічного складу поверхні підкладки після кожного покриття поверхні.На малюнку 2C показано результати вимірювань XPS поверхні, протравленої HF, і поверхні, обробленої HNO 3 .Два основних піки при 587,3 і 577,7 еВ можна віднести до зв'язку Cr-O, що існує в шарі оксиду хрому, що є головною відмінністю від HF-травленої поверхні.В основному це пов'язано з споживанням фториду заліза та хрому на поверхні HNO3.Травлення на основі HNO3 дозволяє хрому утворювати пасивуючий оксидний шар на поверхні, що робить протравлений SS знову стійким до корозії.На малюнку 2D були отримані спектри XPS для підтвердження того, що силан на основі фторвуглецю утворився на поверхні після покриття SAM, яке має надзвичайно високу здатність відштовхувати рідину навіть для EG, крові та EtOH.Покриття SAM завершується реакцією силанових функціональних груп з гідроксильними групами, утвореними плазмовою обробкою.В результаті спостерігалося значне збільшення піків CF2 і CF3.Енергія зв’язку між 286 і 296 еВ вказує на те, що хімічна модифікація була успішно завершена покриттям SAM.SHP показує відносно великі піки CF2 (290,1 ​​еВ) і CF3 (293,3 еВ), які викликані силаном на основі фторуглероду, що утворюється на поверхні.На малюнку 2E показано репрезентативні оптичні зображення вимірювань контактного кута (CA) для різних груп деіонізованої води в контакті з голою, витравленою, SHP і LOIS.Ці зображення показують, що протравлена ​​поверхня стає гідрофільною завдяки мікро/наноструктурі, утвореній хімічним травленням, так що деіонізована вода поглинається структурою.Однак, коли підкладка покрита SAM, підкладка демонструє сильну водовідштовхувальну здатність, тому утворюється поверхнева SHP, а площа контакту між водою та поверхнею невелика.Нарешті, зниження CA спостерігалося в LOIS, що можна пояснити проникненням мастила в мікроструктуру, тим самим збільшуючи площу контакту.Щоб довести, що поверхня має чудові властивості відштовхування рідини та відсутність адгезії, LOIS порівняли з підкладкою SHP шляхом вимірювання CA та SA за допомогою різних рідин (рис. 2F).Було обрано різні типи рідин на основі в’язкості та поверхневої енергії, включаючи деіонізовану воду, кров, EG, EtOH та HD (рис. S4).Результати вимірювання CA показують, що коли CA прагне до HD, значення зменшення CA, де CA має найменшу поверхневу енергію.Крім того, LOIS загального CA низький.Однак вимірювання SA показує зовсім інше явище.За винятком іонізованої води, усі рідини прилипають до субстрату SHP, не зісковзуючи.З іншого боку, LOIS показує дуже низький SA, де, коли вся рідина нахилена під кутом менше 10° до 15°, уся рідина скочується.Це переконливо свідчить про те, що неклейкість поверхні LOIS краща, ніж у поверхні SHP.Крім того, покриття LOIS також наносять на різні типи матеріалів, включаючи титан (Ti), поліфенілсульфон (PPSU), поліоксиметилен (POM), поліефірний ефіркетон (PEEK) і біорозсмоктуючі полімери (PLGA). Вони є ортопедичними матеріалами для імплантації (рис. S5)).Послідовні зображення крапель на матеріалі, обробленому LOIS, показують, що властивості LOIS проти біообростання однакові на всіх субстратах.Крім того, результати вимірювань CA і SA показують, що неклейкі властивості LOIS можна застосувати до інших матеріалів.
Щоб підтвердити властивості LOIS проти обростання, різні типи субстратів (включаючи оголені, протравлені, SHP і LOIS) інкубували з Pseudomonas aeruginosa та MRSA.Ці дві бактерії були обрані як репрезентативні лікарняні бактерії, які можуть призводити до утворення біоплівок, що призводить до SSI (37).На рисунку 3 (A і B) показані зображення флуоресцентного мікроскопа та результати вимірювання колонієутворюючої одиниці (КУО) субстратів, інкубованих у бактеріальній суспензії протягом короткочасного (12 годин) і тривалого (72 години), відповідно.За короткий проміжок часу бактерії утворюють скупчення і збільшуються в розмірах, покриваючись слизоподібними речовинами і перешкоджаючи їх видаленню.Однак під час 72-годинної інкубації бактерії дозрівають і легко розсіюються, щоб утворити більше колоній або скупчень.Таким чином, можна вважати, що 72-годинна інкубація є тривалою і є відповідним часом інкубації для утворення міцної біоплівки на поверхні (38).За короткий проміжок часу протравлена ​​поверхня та поверхня SHP показали бактеріальну адгезію, яка була знижена приблизно на 25% до 50% порівняно з оголеною підкладкою.Однак завдяки чудовій ефективності та стабільності проти біологічного обростання LOIS не продемонстрував адгезії бактеріальної біоплівки в короткостроковій та довгостроковій перспективі.Схематична діаграма (рис. 3C) описує механізм антибіологічного забруднення травильного розчину, SHP і LOIS.Припускається, що протравлена ​​підкладка з гідрофільними властивостями матиме більшу площу поверхні, ніж оголена підкладка.Таким чином, на витравленій підкладці виникне більше бактеріальної адгезії.Однак, порівняно з голою підкладкою, протравлена ​​підкладка має значно менше біоплівки, утвореної на поверхні.Це пов’язано з тим, що молекули води міцно зв’язуються з гідрофільною поверхнею і діють як мастило для води, таким чином перешкоджаючи адгезії бактерій у короткостроковій перспективі (39).Однак шар молекул води дуже тонкий і розчинний у бактеріальних суспензіях.Таким чином, водний молекулярний шар зникає на довгий час, що призводить до великої бактеріальної адгезії та проліферації.Для SHP, завдяки його короткочасним незмочуючим властивостям, пригнічується бактеріальна адгезія.Зменшення адгезії бактерій можна пояснити повітряними кишенями, які застрягли в шаруватій структурі, і меншою поверхневою енергією, що мінімізує контакт між суспензією бактерій і поверхнею.Однак у SHP спостерігалася велика адгезія бактерій, оскільки він протягом тривалого часу втрачав свої властивості проти обростання.В основному це пов’язано з зникненням повітряних кишень через гідростатичний тиск і розчинення повітря у воді.Це головним чином пов’язано з зникненням повітряних кишень через розчинення та шаруватою структурою, яка забезпечує більшу площу поверхні для адгезії (27, 40).На відміну від цих двох субстратів, які мають важливий вплив на довгострокову стабільність, мастило, що міститься в LOIS, вводиться в мікро/наноструктуру і не зникне навіть у довгостроковій перспективі.Мастила, наповнені мікро/наноструктурами, дуже стабільні та сильно притягуються до поверхні завдяки своїй високій хімічній спорідненості, тим самим запобігаючи прилипанню бактерій протягом тривалого часу.На малюнку S6 показано зображення, отримане за допомогою відбивного конфокального мікроскопа, просоченого мастилом субстрату, зануреного у фосфатно-сольовий буфер (PBS).Безперервні зображення показують, що навіть після 120 годин легкого струшування (120 об/хв) мастильний шар на LOIS залишається незмінним, що вказує на тривалу стабільність в умовах потоку.Це пов’язано з високою хімічною спорідненістю між покриттям SAM на основі фтору та мастилом на основі перфторвуглецю, завдяки чому може бути сформований стабільний шар мастила.Таким чином, ефективність захисту від обростання зберігається.Крім того, субстрат перевіряли на репрезентативні білки (альбумін і фібриноген), які знаходяться в плазмі, клітини, тісно пов’язані з імунною функцією (макрофаги та фібробласти), і ті, що пов’язані з формуванням кісток.Вміст кальцію дуже високий.(Малюнок 3D, 1 і 2, і Малюнок S7) (41, 42).Крім того, зображення флуоресцентного мікроскопа тесту на адгезію для фібриногену, альбуміну та кальцію показали різні характеристики адгезії кожної групи субстрату (рис. S8).Під час формування кістки новоутворена кістка та кальцієві шари можуть оточувати ортопедичний імплантат, що не тільки ускладнює видалення, але також може завдати неочікуваної шкоди пацієнту під час процесу видалення.Таким чином, низький рівень відкладень кальцію на кісткових пластинах і гвинтах є корисним для ортопедичної хірургії, яка потребує видалення імплантату.Ґрунтуючись на кількісному визначенні прикріпленої області на основі інтенсивності флуоресценції та кількості клітин, ми підтвердили, що LOIS демонструє відмінні властивості проти біологічного обростання для всіх біологічних речовин порівняно з іншими субстратами.Згідно з результатами експериментів in vitro, антибіологічне забруднення LOIS можна застосовувати до ортопедичних імплантатів, які можуть не тільки пригнічувати інфекції, спричинені бактеріями біоплівки, але й зменшувати запалення, викликане активною імунною системою організму.
(A) Флуоресцентні мікроскопічні зображення кожної групи (голі, витравлені, SHP і LOIS), інкубовані в суспензії Pseudomonas aeruginosa і MRSA протягом 12 і 72 годин.(B) Кількість прикріплених КУО Pseudomonas aeruginosa та MRSA на поверхні кожної групи.(C) Схематична діаграма механізму антибіологічного забруднення короткочасного та тривалого травлення, SHP та LOIS.(D) (1) Кількість фібробластів, прикріплених до кожного субстрату, і зображення клітин, прикріплених до оголеної поверхні та LOIS, отримані за допомогою флуоресцентного мікроскопа.(2) Тест на адгезію імунозалежних білків, альбуміну та кальцію, які беруть участь у процесі загоєння кістки (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 і **** P <0,0001).ns, не важливо.
У разі неминучих зосереджених навантажень механічна довговічність завжди була основною проблемою для нанесення покриттів проти обростання.Традиційні гелеві методи боротьби з нечистотами базуються на полімерах з низькою водорозчинністю та крихкістю.Тому вони зазвичай чутливі до механічного впливу в біомедичних застосуваннях.Таким чином, механічно міцні покриття проти обростання залишаються проблемою для таких застосувань, як ортопедичні імплантати (43, 44).На малюнку 4A (1) показано два основних типи напруги, застосованої до ортопедичних імплантатів, включаючи подряпини (напруга зсуву) і стиснення з оптичним зображенням пошкодженого імплантату, створеним щипцями.Наприклад, коли гвинт закручується викруткою або коли хірург міцно тримає кісткову пластину пінцетом і застосовує стискаючу силу, пластикова кісткова пластина буде пошкоджена та подряпана як у макро-, так і в мікро/нано масштабі (Малюнок 4A, 2) .Щоб перевірити, чи може виготовлений LOIS витримати ці пошкодження під час пластичної хірургії, було виконано наноіндентування для порівняння твердості оголеної підкладки та LOIS у мікро/наношкалі для вивчення механічних властивостей мікро/наноструктури Impact (рис. 4B).Схематична діаграма показує різну поведінку деформації LOIS через наявність мікро/наноструктур.На основі результатів наноіндентування була побудована крива сила-переміщення (рис. 4C).Синє зображення представляє оголену підкладку, яка демонструє лише незначну деформацію, що видно з максимальної глибини відступу 0,26 мкм.З іншого боку, поступове збільшення сили наноіндентування та зміщення, що спостерігається в LOIS (червона крива), може демонструвати ознаки зниження механічних властивостей, що призводить до глибини наноіндентування 1,61 мкм.Це пояснюється тим, що мікро/наноструктура, присутня в LOIS, забезпечує глибший простір для просування кінчика наноіндентера, тому його деформація є більшою, ніж деформація оголеної підкладки.Конста-Гдутос та ін.(45) вважає, що через наявність наноструктур наноіндентування та мікро/нано шорсткість призводять до нерегулярних кривих наноіндентування.Заштрихована ділянка відповідає кривій нерегулярної деформації, яка приписується наноструктурі, тоді як незаштрихована ділянка відноситься до мікроструктури.Ця деформація може пошкодити мікроструктуру/наноструктуру утримуючого мастила та негативно вплинути на його ефективність проти обростання.Щоб вивчити вплив пошкодження на LOIS, неминуче пошкодження мікро/наноструктур було відтворено в організмі під час пластичної хірургії.Використовуючи тести на адгезію крові та білків, можна визначити стабільність властивостей LOIS проти біообростання після in vitro (Рис. 4D).Серія оптичних зображень показує пошкодження, які виникли біля отворів кожної підкладки.Випробування на адгезію крові було проведено, щоб продемонструвати вплив механічних пошкоджень на покриття проти біологічного обростання (Рис. 4E).Як і SHP, властивості захисту від обростання втрачаються через пошкодження, а LOIS демонструє чудові властивості проти обростання, відштовхуючи кров.Це пояснюється тим, що, оскільки поверхнева енергія керується капілярною дією, що покриває пошкоджену ділянку, потік у мікроструктурованому мастильному мастилі відновлює властивості проти обростання (35).Така ж тенденція спостерігалася в тесті на адгезію білка з використанням альбуміну.На пошкодженій ділянці широко спостерігається адгезія білка на поверхні SHP, і, вимірявши охоплення площі, її можна кількісно визначити як половину рівня адгезії оголеної підкладки.З іншого боку, LOIS зберігав свої властивості проти біообростання, не викликаючи адгезії (рис. 4, F і G).Крім того, поверхня гвинта часто піддається сильним механічним навантаженням, таким як свердління, тому ми вивчали здатність покриття LOIS залишатися неушкодженим на гвинті in vitro.На малюнку 4H показано оптичні зображення різних гвинтів, включаючи оголені, SHP і LOIS.Червоний прямокутник представляє цільову область, де виникає сильна механічна напруга під час імплантації кістки.Подібно до випробування білкової адгезії пластини, флуоресцентний мікроскоп використовується для зображення білкової адгезії та вимірювання площі покриття, щоб підтвердити цілісність покриття LOIS, навіть за сильного механічного навантаження (Малюнок 4, I та J).Шурупи, оброблені LOIS, демонструють чудову ефективність проти обростання, і білок майже не прилипає до поверхні.З іншого боку, білкова адгезія спостерігалася в оголених гвинтах і гвинтах SHP, де покриття площі шурупів SHP становило одну третину від покриття оголених гвинтів.Крім того, ортопедичний імплантат, який використовується для фіксації, має бути механічно міцним, щоб витримувати навантаження на місце перелому, як показано на малюнку 4K.Тому було проведено випробування на вигин, щоб визначити вплив хімічної модифікації на механічні властивості.Крім того, це робиться для підтримки фіксованого напруги від імплантату.Застосовуйте вертикальну механічну силу, доки імплантат не буде повністю складений і не буде отримана крива напруги-деформації (Малюнок 4L, 1).Дві властивості, включаючи модуль Юнга та міцність на вигин, порівнювалися між оголеними підкладками та підкладками LOIS як показники їх механічної міцності (рис. 4L, 2 і 3).Модуль Юнга вказує на здатність матеріалу протистояти механічним змінам.Модуль Юнга кожної підкладки становить 41,48±1,01 і 40,06±0,96 ГПа відповідно;спостережувана різниця становить близько 3,4%.Крім того, повідомляється, що міцність на вигин, яка визначає міцність матеріалу, становить 102,34±1,51 ГПа для оголеної підкладки та 96,99±0,86 ГПа для SHP.Гола підкладка приблизно на 5,3% вище.Невелике зниження механічних властивостей може бути викликано ефектом надрізу.У ефекті виїмки мікро/наношорсткість може діяти як набір виїмок, що призводить до локальної концентрації напруги та впливає на механічні властивості імплантату (46).Однак, виходячи з того факту, що жорсткість кортикальної кістки людини становить від 7,4 до 31,6 ГПа, а виміряний модуль LOIS перевищує модуль кортикальної кістки людини (47), LOIS є достатнім для підтримки перелому та його загальної на механічні властивості мінімально впливає модифікація поверхні.
(A) Схематична діаграма (1) механічного впливу на ортопедичний імплантат під час операції та (2) оптичного зображення пошкодженого ортопедичного імплантату.(B) Схематична діаграма вимірювання наномеханічних властивостей за допомогою наноіндентування та LOIS на голій поверхні.(C) Крива сила-переміщення наноіндентації голої поверхні та LOIS.(D) Після експериментів in vitro змоделюйте оптичні зображення різних типів ортопедичних пластин (пошкоджена ділянка виділена червоним прямокутником), щоб імітувати механічне навантаження, викликане під час операції.(E) Тест на адгезію крові та (F) тест на адгезію білка групи пошкодженої ортопедичної пластини.(G) Виміряйте площу покриття білка, що прилипає до пластини.(H) Оптичні зображення різних типів ортопедичних гвинтів після експерименту in vitro.(I) Тест на адгезію білка для вивчення цілісності різних покриттів.(J) Виміряйте площу покриття білка, що прилипає до гвинта.(K) Рух кролика спрямований на створення фіксованого навантаження на зламану кістку.(L) (1) Результати випробувань на згинання та оптичні зображення до та після згинання.Різниця в (2) модулі Юнга та (3) міцності на вигин між оголеним імплантатом і SHP.Дані виражені як середнє значення ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 і ****P<0,0001).Зображення надано: Kyomin Chae, Yonsei University.
У клінічних ситуаціях більшість бактеріальних контактів з біологічними матеріалами та ділянками ран відбувається через зрілі, зрілі біоплівки (48).Таким чином, за оцінками Центру з контролю та профілактики захворювань США, 65% усіх інфекцій людини пов’язані з біоплівками (49).У цьому випадку необхідно створити експериментальний дизайн in vivo, який забезпечує послідовне формування біоплівки на поверхні імплантату.Тому ми розробили модель перелому стегнової кістки кролика, в якій ортопедичні імплантати попередньо інкубували в бактеріальній суспензії, а потім імплантували в стегнові кістки кролика для вивчення властивостей LOIS проти забруднення in vivo.Завдяки наступним трьом важливим фактам бактеріальні інфекції викликаються попереднім культивуванням, а не прямою ін’єкцією бактеріальних суспензій: (i) імунна система кроликів від природи сильніша, ніж імунна система людини;тому можливе введення бактеріальних суспензій і планктонних бактерій Це не впливає на утворення біоплівок.(Ii) Планктонні бактерії більш чутливі до антибіотиків, і антибіотики зазвичай застосовуються після операції;нарешті, (iii) суспензію планктонних бактерій можна розбавити рідинами тіла тварини (50).Попередньо культивуючи імплантат у бактеріальній суспензії перед імплантацією, ми можемо ретельно вивчити шкідливий вплив бактеріальної інфекції та реакції на стороннє тіло (FBR) на процес загоєння кістки.Кроликів умертвили через 4 тижні після імплантації, оскільки остеоінтеграція, необхідна для процесу загоєння кістки, завершиться протягом 4 тижнів.Потім імплантати були вилучені з кроликів для подальших досліджень.На рисунку 5А показано механізм проліферації бактерій.Інфікований ортопедичний імплантат впроваджується в організм.В результаті попередньої інкубації в бактеріальній суспензії шість із шести кроликів, яким імплантували оголені імплантати, були інфіковані, тоді як жоден із кроликів, яким імплантували імплантати, оброблені LOIS, не був інфікований.Бактеріальні інфекції протікають у три етапи, включаючи ріст, дозрівання та розповсюдження (51).Спочатку прикріплені бактерії розмножуються і ростуть на поверхні, а потім бактерії утворюють біоплівку, коли виділяють позаклітинний полімер (EPS), амілоїд і позаклітинну ДНК.Біоплівка не тільки перешкоджає проникненню антибіотиків, але також сприяє накопиченню ферментів, що розкладають антибіотик (таких як β-лактамаза) (52).Нарешті, біоплівка поширює зрілі бактерії в навколишні тканини.Тому відбувається зараження.Крім того, коли в організм потрапляє чужорідне тіло, інфекція, яка може викликати сильну імунну відповідь, може викликати сильне запалення, біль і зниження імунітету.На малюнку 5B представлено огляд FBR, спричиненого вставкою ортопедичного імплантату, а не імунної відповіді, спричиненої бактеріальною інфекцією.Імунна система розпізнає вставлений імплантат як чужорідне тіло, а потім змушує клітини та тканини реагувати на інкапсуляцію чужорідного тіла (53).На початку FBR на поверхні ортопедичних імплантатів формувався живильний матрикс, що призводило до адсорбції фібриногену.Потім адсорбований фібриноген утворює дуже щільну мережу фібрину, яка сприяє прикріпленню лейкоцитів (54).Після формування фібринової сітки виникає гостре запалення через інфільтрацію нейтрофілів.На цьому етапі вивільняються різноманітні цитокіни, такі як фактор некрозу пухлини-α (TNF-α), інтерлейкін-4 (IL-4) та IL-β, і моноцити починають проникати в місце імплантації та диференціюватись у гігантські клітини.Фаг (41, 55, 56).Зниження FBR завжди було проблемою, оскільки надмірне FBR може спричинити гостре та хронічне запалення, яке може призвести до летальних ускладнень.Щоб оцінити вплив бактеріальних інфекцій на тканини, що оточують оголений імплантат і LOIS, використовували фарбування гематоксиліном і еозином (H&E) і трихромом по Массону (MT).У кроликів, яким імплантували оголені субстрати, важкі бактеріальні інфекції прогресували, а на слайдах тканини H&E чітко виявлялися абсцеси та некроз, спричинені запаленням.З іншого боку, надзвичайно сильна поверхня LOIS проти біообростання пригнічує адгезію бактерій, тому на ній немає ознак інфекції та зменшується запалення (Малюнок 5C).Результати фарбування МТ показали ту саму тенденцію.Проте фарбування МТ також показало набряк у кроликів, яким імплантували LOIS, що вказує на те, що скоро відбудеться одужання (Рис. 5D).З метою вивчення ступеня імунної відповіді проводили імуногістохімічне (ІГХ) фарбування з використанням цитокінів TNF-α та IL-6, пов’язаних з імунною відповіддю.Оголений негативний імплантат, який не піддавався впливу бактерій, порівнювали з LOIS, який піддавався впливу бактерій, але не був інфікований, щоб вивчити процес загоєння за відсутності бактеріальної інфекції.На малюнку 5E показано оптичне зображення препарату IHC, який експресує TNF-α.Коричнева область представляє імунну відповідь, що вказує на те, що імунна відповідь у LOIS дещо знижена.Крім того, експресія IL-6 в LOIS була значно меншою, ніж негативна експресія стерильного голого (Фігура 5F).Експресію цитокіну кількісно визначали шляхом вимірювання площі фарбування антитіл, що відповідає цитокіну (Фігура 5G).Порівняно з кроликами, які піддавалися впливу негативних імплантатів, рівні експресії у кроликів, яким імплантували LOIS, були нижчими, демонструючи значущу різницю.Зменшення експресії цитокінів вказує на те, що довгострокові стабільні властивості LOIS проти обростання пов’язані не лише з інгібуванням бактеріальних інфекцій, але й зі зниженням FBR, яке індукується макрофагами, що прилипають до субстрату (53, 57, 58).Таким чином, знижена імунна відповідь через властивості LOIS уникати імунітету може вирішити побічні ефекти після імплантації, такі як надмірна імунна відповідь після пластичної операції.
(A) Схематична діаграма механізму утворення та поширення біоплівки на поверхні інфікованого ортопедичного імплантату.еДНК, позаклітинна ДНК.(B) Схематична діаграма імунної відповіді після встановлення ортопедичного імплантату.(C) H&E фарбування та (D) MT фарбування навколишніх тканин ортопедичних імплантатів з голим позитивним результатом і LOIS.IHC імунозалежних цитокінів (E) TNF-α та (F) IL-6 є пофарбованими зображеннями голих негативних кроликів та кроликів з імплантацією LOIS.(G) Кількісна оцінка експресії цитокінів шляхом вимірювання охоплення площі (** P <0,01).
Біосумісність LOIS та його вплив на процес загоєння кісток досліджували in vivo за допомогою діагностичної візуалізації [рентгенівського випромінювання та мікрокомп’ютерної томографії (КТ)] та IHC остеокластів.На малюнку 6A показано процес загоєння кістки, який включає три різні стадії: запалення, відновлення та ремоделювання.Коли відбувається перелом, клітини запалення та фібробласти проникають у зламану кістку та починають проростати в судинну тканину.Під час фази відновлення вростання судинної тканини поширюється поблизу місця перелому.Судинна тканина забезпечує поживними речовинами для утворення нової кістки, яка називається мозолем.Останнім етапом процесу загоєння кістки є етап ремоделювання, на якому розмір кісткової мозолі зменшується до розміру нормальної кістки за допомогою підвищення рівня активованих остеокластів (59).Тривимірну (3D) реконструкцію місця перелому виконували за допомогою мікро-КТ, щоб спостерігати за різницею в рівні утворення мозолі в кожній групі.Спостерігайте за поперечним розрізом стегнової кістки, щоб визначити товщину мозолі, що оточує зламану кістку (рис. 6, B і C).Рентгенівські промені також використовувалися для огляду місць переломів у всіх групах щотижня, щоб спостерігати за різними процесами регенерації кісток у кожній групі (Малюнок S9).Мозоль і зрілі кістки показані синім/зеленим кольором і слоновою кісткою відповідно.Більшість м’яких тканин відфільтровується за попередньо встановленим порогом.Оголений позитивний результат і SHP підтвердили утворення невеликої кількості мозолі навколо місця перелому.З іншого боку, оголений негатив LOIS і місце перелому оточені товстою кістковою мозоллю.Зображення мікроКТ показали, що утворенню мозолі перешкоджає бактеріальна інфекція та пов’язане з інфекцією запалення.Це пояснюється тим, що імунна система надає пріоритет загоєнню септичних ушкоджень, викликаних запаленням, пов’язаним з інфекцією, а не відновленню кісток (60).Для спостереження за активністю остеокластів і резорбцією кісткової тканини було проведено фарбування IHC і стійкою до тартрату кислотною фосфатазою (TRAP) (рис. 6D) (61).Лише кілька активованих остеокластів, пофарбованих у фіолетовий колір, були знайдені в голих позитивних результатах і SHP.З іншого боку, багато активованих остеокластів спостерігалося поблизу оголених позитивних і зрілих кісток LOIS.Це явище вказує на те, що за наявності остеокластів мозоль навколо місця перелому зазнає бурхливого процесу ремоделювання (62).Вимірювали об’єм кістки та площу експресії остеокластів у мозолі, щоб порівняти рівень утворення мозолі навколо місця перелому в усіх групах, щоб кількісно визначити результати мікро-КТ та ІГХ (рис. 6E, 1 і 2).Як і очікувалося, оголені негативи та утворення мозолів у LOIS були значно вищими, ніж в інших групах, що вказує на те, що відбулося позитивне ремоделювання кістки (63).На рисунку S10 показано оптичне зображення місця хірургічного втручання, результат фарбування МТ тканини, зібраної біля гвинта, і результат фарбування TRAP, що підкреслює межу гвинт-кістка.На оголеному субстраті спостерігалося утворення сильної кісткової мозолі та фіброзу, тоді як імплантат, оброблений LOIS, показав відносно неприклеєну поверхню.Подібним чином, порівняно з голими негативами, менший фіброз спостерігався у кроликів, імплантованих LOIS, як показано білими стрілками.Крім того, стійкий набряк (блакитна стрілка) можна пояснити властивостями LOIS проти імунітету, завдяки чому зменшується важке запалення.Антипригарна поверхня навколо імплантату та зменшений фіброз свідчать про те, що процес видалення легший, що зазвичай призводить до інших переломів або запалення.Процес загоєння кістки після видалення гвинта оцінювали за активністю остеокластів на межі гвинт-кістка.І оголена кістка, і інтерфейс імплантату LOIS поглинули однакові рівні остеокластів для подальшого загоєння кістки, що вказує на те, що покриття LOIS не має негативного впливу на загоєння кістки чи імунну відповідь.Щоб підтвердити, що модифікація поверхні, виконана на LOIS, не перешкоджає процесу загоєння кісток, було використано рентгенівське обстеження для порівняння загоєння кісток кроликів із відкритими негативними іонами та 6 тижнів імплантації LOIS (рис. 6F).Результати показали, що порівняно з неінфікованою оголеною позитивною групою LOIS продемонстрував однаковий ступінь загоєння кістки, і не було явних ознак перелому (безперервна лінія остеолізу) в обох групах.
(А) Схематична схема процесу загоєння кістки після перелому.(B) Різниця в ступені утворення мозолі кожної групи поверхні та (C) зображення поперечного перерізу місця перелому.(D) Фарбування TRAP для візуалізації активності остеокластів і резорбції кістки.На основі активності TRAP утворення зовнішньої мозолі кортикальної кістки кількісно аналізували за допомогою (E) (1) мікро-КТ та (2) активності остеокластів.(F) Через 6 тижнів після імплантації рентгенівські зображення зламаної кістки експонованого негативу (виділено червоним пунктирним прямокутником) і LOIS (виділено синім пунктирним прямокутником).Статистичний аналіз проводили одностороннім дисперсійним аналізом (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Коротше кажучи, LOIS пропонує новий тип антибактеріальної стратегії інфекцій та імунного покриття для ортопедичних імплантатів.Звичайні ортопедичні імплантати з функціоналізацією SHP виявляють короткочасні властивості проти біообростання, але не можуть зберігати свої властивості протягом тривалого часу.Супергідрофобність субстрату затримує бульбашки повітря між бактеріями та субстратом, таким чином утворюючи повітряні кишені, тим самим запобігаючи бактеріальній інфекції.Однак завдяки дифузії повітря ці повітряні кишені легко видаляються.З іншого боку, LOIS добре довів свою здатність запобігати інфекціям, пов’язаним з біоплівкою.Таким чином, завдяки властивостям проти відторгнення мастильного шару, введеного в шарувату поверхню мікро/наноструктури, можна запобігти запаленню, пов’язаному з інфекцією.Для оптимізації умов виробництва LOIS використовуються різні методи визначення характеристик, включаючи вимірювання SEM, AFM, XPS і CA.Крім того, LOIS також можна застосовувати до різних біологічних матеріалів, які зазвичай використовуються в ортопедичному фіксуючому обладнанні, таких як PLGA, Ti, PE, POM і PPSU.Потім LOIS було протестовано in vitro, щоб підтвердити його властивості проти біообростання проти бактерій і біологічних речовин, пов’язаних з імунною відповіддю.Результати показують, що він має відмінну антибактеріальну дію та дію проти біологічного забруднення порівняно з чистим імплантатом.Крім того, LOIS демонструє механічну міцність навіть після застосування механічного навантаження, якого не уникнути в пластичній хірургії.Завдяки властивостям самовідновлення мастила на поверхні мікро/наноструктури LOIS успішно зберігав свої антибіологічні властивості, що запобігають забрудненню.Щоб вивчити біосумісність і антибактеріальні властивості LOIS in vivo, LOIS імплантували в стегнову кістку кролика на 4 тижні.У кроликів, імплантованих LOIS, бактеріальної інфекції не спостерігалося.Крім того, використання IHC продемонструвало знижений рівень місцевої імунної відповіді, що вказує на те, що LOIS не пригнічує процес загоєння кісток.LOIS демонструє відмінні антибактеріальні та імунні властивості, а також доведено, що він ефективно запобігає утворенню біоплівки до та під час ортопедичних операцій, особливо для синтезу кісткової тканини.Використовуючи модель запального перелому стегнової кістки кролика, було ретельно вивчено вплив інфекцій, пов’язаних із біоплівкою, на процес загоєння кісток, індукований попередньо інкубованими імплантатами.У якості майбутнього дослідження необхідна нова модель in vivo для вивчення можливих інфекцій після імплантації, щоб повністю зрозуміти та запобігти інфекціям, пов’язаним з біоплівкою, протягом усього процесу загоєння.Крім того, остеоіндукція все ще залишається невирішеною проблемою в інтеграції з LOIS.Необхідні подальші дослідження, щоб поєднати селективну адгезію остеоіндуктивних клітин або регенеративну медицину з LOIS, щоб подолати проблему.Загалом LOIS являє собою багатообіцяюче покриття для ортопедичних імплантатів із механічною міцністю та відмінними властивостями проти біологічного забруднення, що може зменшити SSI та імунні побічні ефекти.
Промийте підкладку 304 SS розміром 15 мм x 15 мм x 1 мм (Dong Kang M-Tech Co., Корея) в ацетоні, EtOH та діоновій воді протягом 15 хвилин, щоб видалити забруднення.Щоб сформувати на поверхні мікро/нанорівневу структуру, очищену підкладку занурюють у 48-51% розчин HF (DUKSAN Corp., Південна Корея) при 50°C.Час травлення коливається від 0 до 60 хвилин.Потім протравлену підкладку очищали деіонізованою водою та поміщали в 65% розчин HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) при 50°C на 30 хвилин для утворення шару пасивації оксиду хрому на поверхні.Після пасивації підкладку промивають деіонізованою водою і висушують для отримання підкладки з шаруватою структурою.Далі підкладку піддавали впливу кисневої плазми (100 Вт, 3 хвилини) і негайно занурювали в розчин 8,88 мМ POTS (Sigma-Aldrich, Німеччина) у толуолі при кімнатній температурі на 12 годин.Потім підкладку, покриту POTS, очищали EtOH і відпалювали при 150°C протягом 2 годин, щоб отримати щільний POTS SAM.Після покриття SAM на підкладці було сформовано мастильний шар шляхом нанесення перфторполіефірного мастила (Krytox 101; DuPont, США) з об’ємом завантаження 20 мкм/см 2. Перед використанням відфільтруйте мастило через 0,2 мікронний фільтр.Видаліть надлишки мастила, нахиливши під кутом 45° протягом 15 хвилин.Така ж виробнича процедура була використана для ортопедичних імплантатів, виготовлених з нержавіючої сталі 304 (фіксуюча пластина та кортикальний фіксуючий гвинт; Dong Kang M-Tech Co., Корея).Усі ортопедичні імплантати розроблені відповідно до геометрії стегнової кістки кролика.
Морфологію поверхні підкладки та ортопедичних імплантатів перевіряли методом польової емісії SEM (Inspect F50, FEI, США) та AFM (XE-100, Park Systems, Південна Корея).Шорсткість поверхні (Ra, Rq) вимірюється шляхом множення площі 20 мкм на 20 мкм (n=4).Для аналізу хімічного складу поверхні використовувалася система XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Японія), оснащена джерелом рентгенівського випромінювання Al Kα з розміром плями 100 мкм2.Для вимірювання рідких CA та SA використовувалася система вимірювання CA, оснащена камерою динамічного захоплення зображення (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Південна Корея).Для кожного вимірювання на поверхню поміщають від 6 до 10 мкл крапель (деіонізована вода, кінська кров, EG, 30% етанол і HD) для вимірювання CA.Коли кут нахилу підкладки збільшується зі швидкістю 2°/с (n = 4), SA вимірюється при падінні краплі.
Pseudomonas aeruginosa [Американська колекція типових культур (ATCC) 27853] і MRSA (ATCC 25923) були придбані в ATCC (Манассас, Вірджинія, США), а базову культуру підтримували при -80°C.Перед використанням заморожену культуру інкубували в розмороженому трипсином соєвому бульйоні (Komed, Корея) при 37°C протягом 18 годин, а потім двічі переносили для її активації.Після інкубації культуру центрифугували при 10000 об/хв протягом 10 хвилин при 4°C і двічі промивали розчином PBS (pH 7,3).Потім центрифуговану культуру пересівають на чашки з кров’яним агаром (BAP).MRSA та Pseudomonas aeruginosa готували протягом ночі та культивували в бульйоні Лурії-Бертані.Концентрацію Pseudomonas aeruginosa та MRSA в посівному матеріалі кількісно визначали за КУО суспензії в серійних розведеннях на агарі.Потім доведіть концентрацію бактерій до 0,5 стандарту МакФарланда, що еквівалентно 108 КУО/мл.Потім розведіть робочу бактеріальну суспензію в 100 разів до 106 КУО/мл.Щоб перевірити антибактеріальну адгезію, перед використанням субстрат стерилізували при 121°C протягом 15 хвилин.Субстрат потім переносили в 25 мл бактеріальної суспензії та інкубували при 37°C з інтенсивним струшуванням (200 об/хв) протягом 12 і 72 годин.Після інкубації кожен субстрат виймали з інкубатора і промивали 3 рази PBS, щоб видалити будь-які плаваючі бактерії на поверхні.Щоб спостерігати біоплівку на підкладці, біоплівку фіксували метанолом і фарбували 1 мл кримідинового оранжевого протягом 2 хвилин.Потім флуоресцентний мікроскоп (BX51TR, Olympus, Японія) використовувався для фотографування пофарбованої біоплівки.Для кількісного визначення біоплівки на підкладці прикріплені клітини відокремлювали від підкладки за допомогою вихрового методу, який вважався найбільш підходящим методом для видалення прикріплених бактерій (n = 4).Використовуючи стерильні щипці, видаліть субстрат із середовища для росту та постукайте по планшету з лунками, щоб видалити надлишок рідини.Нещільно прикріплені клітини видаляли дворазовим промиванням стерильним PBS.Потім кожен субстрат переносили в стерильну пробірку, що містила 9 мл 0,1% білкового ept фізіологічного розчину (PSW) і 2 г 20-25 стерильних скляних кульок (діаметром від 0,4 до 0,5 мм).Потім його перемішували протягом 3 хвилин, щоб відокремити клітини від зразка.Після перемішування на вортексі суспензію послідовно розбавляли в 10 разів 0,1% PSW, а потім 0,1 мл кожного розведення інокулював на BAP.Після 24 годин інкубації при 37°C КУО підраховували вручну.
Для клітин використовували мишачі фібробласти NIH/3T3 (CRL-1658; американський ATCC) і мишачі макрофаги RAW 264.7 (TIB-71; американський ATCC).Використовуйте модифіковане середовище Ігла Дульбекко (DMEM; LM001-05, Welgene, Корея) для культивування фібробластів миші та додайте 10% телячої сироватки (S103-01, Welgene) і 1% пеніцилін-стрептоміцину (PS; LS202-02, Welgene (Welgene) Використовуйте DMEM для культивування макрофагів миші з додаванням 10% фетальної сироватки великої рогатої худоби (S001-01, Welgene) і 1% PS у планшеті з шістьма лунками та інокулюйте клітини при 105 клітин/см2. Клітини інкубували протягом ночі при 37°C і 5% CO2. Для фарбування клітини фіксували 4% параформальдегідом протягом 20 хвилин і поміщали в 0,5% Triton X Incubate на 5 хвилин у -100°С при 37°C протягом 30 хвилин. Після процесу інкубації використовуйте субстрат із фіксуючим середовищем 4′,6-діаміно-2-феніліндол (H -1200, Vector Laboratories, Великобританія) (n = 4 на клітинку). , флуоресцеїн, флуоресцеїн ізотіоціанат-альбумін (A9771, Sigma-Aldrich, Німеччина) і плазма крові людини Alexa Fluor 488-кон’югований фібриноген (F13191, Invitrogen, США) розчиняли в PBS (10 мМ, pH 7,4).Концентрації альбуміну та фібриногену становили 1 та 150 мкг/мл відповідно.Після субстрату Перед зануренням у білковий розчин промийте їх PBS, щоб повторно зволожити поверхню.Потім занурте всі субстрати в шестилунковий планшет, що містить розчин білка, та інкубуйте при 37°C протягом 30 і 90 хвилин.Після інкубації субстрат видаляли з розчину білка, обережно промивали PBS 3 рази та фіксували 4% параформальдегідом (n = 4 для кожного білка).Для кальцію хлорид натрію (0,21 М) і фосфат калію (3,77 мМ) розчиняли в деіонізованій воді.рН розчину доводили до 2,0 додаванням розчину гідрохлориду (1М).Потім у розчині розчиняли хлорид кальцію (5,62 мМ).Шляхом додавання 1М трис(гідроксиметил)-аміно метану регулюють рН розчину до 7,4.Занурте всі субстрати в шестилунковий планшет, наповнений 1,5× розчином фосфату кальцію, і вийміть із розчину через 30 хвилин.Для фарбування 2 г Alizarin Red S (CI 58005) змішайте зі 100 мл деіонізованої води.Потім використовуйте 10% гідроксид амонію, щоб довести рН до 4. Пофарбуйте субстрат розчином алізаринового червоного протягом 5 хвилин, потім струсіть надлишок барвника та промокніть.Після процесу струшування зніміть субстрат.Матеріал зневоднюють, потім занурюють в ацетон на 5 хвилин, потім занурюють у розчин ацетон-ксилол (1:1) на 5 хвилин і, нарешті, промивають ксилолом (n = 4).Використовується флуоресцентний мікроскоп (Axio Imager) з об’єктивами ×10 і ×20..A2m, Zeiss, Німеччина) зображення всіх підкладок.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) використовувався для кількісного визначення даних адгезії біологічних речовин у кожній групі з чотирьох різних областей зображення.Перетворюйте всі зображення на двійкові зображення з фіксованими пороговими значеннями для порівняння субстрату.
Конфокальний мікроскоп Zeiss LSM 700 використовувався для моніторингу стабільності шару мастила в PBS у режимі відбиття.Зразок скла, покритого SAM на основі фтору, із введеним мастильним шаром занурювали в розчин PBS і тестували за допомогою орбітального шейкера (SHO-1D; Daihan Scientific, Південна Корея) в умовах м’якого струшування (120 об/хв).Потім візьміть зразок і відстежте втрату мастила, вимірявши втрату відбитого світла.Щоб отримати флуоресцентні зображення в режимі відбиття, зразок піддається впливу лазера з довжиною довжини 633 нм, а потім збирається, оскільки світло відбиватиметься від зразка.Зразки вимірювали з інтервалами часу 0, 30, 60 і 120 годин.
Щоб визначити вплив процесу модифікації поверхні на наномеханічні властивості ортопедичних імплантатів, для вимірювання наноіндендіону використовували наноіндентор (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, США), оснащений алмазним наконечником Берковіча у формі тригранної піраміди.Пікове навантаження становить 10 мН, а площа становить 100 мкм x 100 мкм.Для всіх вимірювань час завантаження та розвантаження становить 10 с, а час витримки під піковим навантаженням на вдавлення становить 2 с.Виконайте вимірювання в п’яти різних місцях і візьміть середнє значення.Для оцінки механічної міцності під навантаженням було проведено випробування на поперечний триточковий згин за допомогою універсальної випробувальної машини (Instron 5966, Instron, США).Субстрат стискається з постійною швидкістю 10 Н/с із збільшеним навантаженням.Програма Bluehill Universal (n = 3) була використана для розрахунку модуля пружності при вигині та максимальної напруги при стиску.
Щоб імітувати процес операції та відповідні механічні пошкодження під час операції, процес операції проводили in vitro.Стегнові кістки були зібрані у страчених новозеландських білих кроликів.Стегнову кістку очищали і фіксували в 4% параформальдегіді протягом 1 тижня.Як описано в методі експерименту на тваринах, фіксована стегнова кістка була хірургічно оперована.Після операції ортопедичний імплантат занурювали в кров (кінська кров, KISAN, Корея) на 10 с, щоб підтвердити, чи відбулося зрощення крові після нанесення механічної травми (n = 3).
Загалом 24 самці новозеландських білих кролів (вага від 3,0 до 3,5 кг, середній вік 6 місяців) були випадковим чином розділені на чотири групи: голі негативні, голі позитивні, SHP і LOIS.Усі процедури із залученням тварин виконувалися відповідно до етичних стандартів Комітету з догляду за тваринами та їх використання (схвалено IACUC, KOREA-2017-0159).Ортопедичний імплантат складається з фіксуючої пластини з п'ятьма отворами (довжина 41 мм, ширина 7 мм і товщина 2 мм) і кортикальні фіксуючі гвинти (довжина 12 мм, діаметр 2,7 мм) для фіксації перелому.За винятком тих пластин і гвинтів, які використовувалися в групі без негативного результату, усі пластини та гвинти інкубували в суспензії MRSA (106 КУО/мл) протягом 12 годин.Негативну групу (n=6) обробляли імплантатами з оголеною поверхнею без впливу бактеріальної суспензії як негативний контроль на інфекцію.Позитивну групу з голою поверхнею (n = 6) обробляли імплантатом з голою поверхнею, підданому впливу бактерій, як позитивний контроль на інфекцію.Групу SHP (n = 6) лікували імплантатами SHP, опромінених бактеріями.І, нарешті, групу LOIS лікували імплантатами LOIS з бактеріальним впливом (n = 6).Усіх тварин тримають у клітці, дають багато їжі та води.Перед операцією кролів голодували 12 годин.Тваринам анестезували шляхом внутрішньом’язової ін’єкції ксилазину (5 мг/кг) і внутрішньовенної ін’єкції паклітакселу (3 мг/кг) для індукції.Після цього подайте 2% ізофлурану та 50–70% медичного кисню (швидкість потоку 2 л/хв) через дихальну систему для підтримки анестезії.Імплантується через прямий доступ до латеральної стегнової кістки.Після видалення волосся та повідон-йодної дезінфекції шкіри на лівій середній стегновій кістці зробили розріз довжиною близько 6 см.Розкриваючи щілину між м’язами, що покривають стегнову кістку, стегнова кістка повністю оголюється.Помістіть пластину перед діафізом стегнової кістки та зафіксуйте її чотирма гвинтами.Після фіксації полотном пилки (товщиною 1 мм) штучно створюють перелом в області між другим отвором і четвертим отвором.Після закінчення операції рану промивають фізіологічним розчином і зашивають.Кожному кролику підшкірно вводили енрофлоксацин (5 мг/кг), розведений на одну третину фізіологічним розчином.Післяопераційні рентгенівські знімки стегнової кістки були зроблені всім тваринам (0, 7, 14, 21, 28 і 42 дні) для підтвердження остеотомії кістки.Після глибокої анестезії всіх тварин умертвляли внутрішньовенним введенням KCl (2 ммоль/кг) на 28 і 42 дні.Після страти стегнову кістку сканували за допомогою мікроКТ, щоб спостерігати та порівнювати процес загоєння кістки та формування нової кістки між чотирма групами.
Після виконання були зібрані м’які тканини, які безпосередньо контактували з ортопедичними імплантатами.Тканина була фіксована в 10% нейтральному забуференому формаліні протягом ночі, а потім зневоднена в EtOH.Зневоднену тканину заливали в парафін і розрізали на зрізи товщиною 40 мкм за допомогою мікротома (400CS; EXAKT, Німеччина).Для візуалізації інфекції було проведено фарбування H&E та MT.Щоб перевірити реакцію хазяїна, зрізану тканину інкубували з первинним антитілом кролика проти TNF-α (AB6671, Abcam, США) і кролячим анти-IL-6 (AB6672; Abcam, США), а потім обробляли хроном.Оксидаза.Нанесіть систему фарбування авідин-біотинового комплексу (ABC) на зрізи відповідно до інструкцій виробника.Для того, щоб продукт реакції виглядав як коричневий, 3,3-діамінобензидин використовувався у всіх частинах.Цифровий слайд-сканер (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Угорщина) використовувався для візуалізації всіх зрізів, і принаймні чотири субстрати в кожній групі були проаналізовані за допомогою програмного забезпечення ImageJ.
Рентгенівські зображення робили всім тваринам після операції та щотижня для моніторингу загоєння переломів (n=6 на групу).Після страти використовували мікроКТ з високою роздільною здатністю, щоб обчислити утворення мозолі навколо стегнової кістки після загоєння.Отриману стегнову кістку очищали, фіксували в 4% параформальдегіді протягом 3 днів і зневоднювали в 75% етанолі.Потім зневоднені кістки сканували за допомогою мікро-КТ (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Канді, Бельгія) для створення 3D-воксельних зображень (2240×2240 пікселів) зразка кістки.Використовуйте 1,0 мм алюмінієвий фільтр, щоб зменшити шум сигналу та застосувати високу роздільну здатність до всіх сканувань (E = 133 кВ, I = 60 мкА, час інтеграції = 500 мс).Програмне забезпечення Nrecon (версія 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Бельгія) було використано для створення 3D-об’єму відсканованого зразка з отриманої 2D-бічної проекції.Для аналізу 3D-реконструйоване зображення ділиться на куби 10 мм × 10 мм × 10 мм відповідно до місця перелому.Обчисліть кісткову мозоль поза кортикальною кісткою.Програмне забезпечення DataViewer (версія 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Бельгія) використовувалося для цифрового перенаправлення сканованого об’єму кістки, а програмне забезпечення CT-Analyzer (версія 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Бельгія) використовувалося для аналізу.Відносні коефіцієнти поглинання рентгенівського випромінювання в зрілій кістці та мозолі розрізняють за їх щільністю, а потім кількісно визначають об’єм мозолі (n = 4).Для того, щоб підтвердити, що біосумісність LOIS не затримує процес загоєння кісток, було проведено додатковий рентгенівський і мікро-КТ-аналіз у двох кроликів: голих негативних груп і LOIS.Обидві групи були страчені на 6-му тижні.
Стегнові кістки убитих тварин збирали і фіксували в 4% параформальдегіді протягом 3 днів.Потім ортопедичний імплантат акуратно видаляють зі стегнової кістки.Стегнову кістку декальцинували протягом 21 дня за допомогою 0,5 М EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Потім декальциновану стегнову кістку занурювали в EtOH, щоб зробити її зневодненою.Зневоднену стегнову кістку видаляли в ксилолі і заливали в парафін.Потім зразок нарізали автоматичним ротаційним мікротомом (Leica RM2255, Leica Biosystems, Німеччина) товщиною 3 мкм.Для фарбування TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Німеччина) зрізи зразків депарафінізували, повторно гідратували та інкубували в реагенті TRAP при 37°C протягом 1 години.Зображення були отримані за допомогою слайд-сканера (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Угорщина) і кількісно визначені шляхом вимірювання охоплення площі пофарбованої ділянки.У кожному експерименті принаймні чотири субстрати в кожній групі аналізувалися за допомогою програмного забезпечення ImageJ.
Аналіз статистичної значущості проводили за допомогою GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., США).Непарний t-тест і односторонній дисперсійний аналіз (ANOVA) використовувалися для перевірки відмінностей між групами оцінювання.Рівень значущості вказано на малюнку таким чином: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 і ****P<0,0001;NS, без істотної різниці.
Додаткові матеріали до цієї статті див.
Це стаття відкритого доступу, яка розповсюджується згідно з умовами Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, яка дозволяє використовувати, розповсюджувати та відтворювати будь-яким носієм, якщо використання не призначено для отримання комерційної вигоди та передумовою є те, що оригінал робота правильна.довідка.
Примітка. Ми просимо вас лише вказати адресу електронної пошти, щоб особа, яку ви рекомендуєте на сторінку, знала, що ви хочете, щоб вона побачила цей електронний лист і що цей електронний лист не є спамом.Ми не будемо фіксувати жодні електронні адреси.
Це запитання використовується, щоб перевірити, чи є ви відвідувачем, і запобігти автоматичному надсиланню спаму.
Чхве Гюн Мін, О Ян Чан, Пак Чжун Джун, Лі Чжин Хьок, Кім Хен Чхоль, Лі Кюн Мун, Лі Чанг Кю, Лі Йон Тек, Лі Сун Ук, Чон Моруї
Антибактеріальні та імунні покриття ортопедичних імплантатів можуть зменшити інфекції та імунні відповіді, викликані інфекціями.
Чхве Гюн Мін, О Ян Чан, Пак Чжун Джун, Лі Чжин Хьок, Кім Хен Чхоль, Лі Кюн Мун, Лі Чанг Кю, Лі Йон Тек, Лі Сун Ук, Чон Моруї
Антибактеріальні та імунні покриття ортопедичних імплантатів можуть зменшити інфекції та імунні відповіді, викликані інфекціями.
©2021 Американська асоціація сприяння розвитку науки.всі права захищені.AAAS є партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef і COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.