برای بیمارانی که تحت عمل جراحی ایمپلنت ارتوپدی قرار می‌گیرند، عفونت‌های باکتریایی و پاسخ‌های ایمنی ناشی از عفونت همیشه خطرات تهدیدکننده زندگی بوده‌اند.مواد بیولوژیکی معمولی مستعد آلودگی بیولوژیکی هستند که باعث می شود باکتری ها به ناحیه آسیب دیده حمله کنند و باعث عفونت بعد از عمل شوند.بنابراین، نیاز فوری به ایجاد پوشش های ضد عفونت و فرار ایمنی برای ایمپلنت های ارتوپدی وجود دارد.در اینجا، ما یک فناوری پیشرفته اصلاح سطح برای ایمپلنت های ارتوپدی به نام سطح ایمپلنت ارتوپدی روغنی (LOIS) ایجاد کرده ایم که از سطح صاف پارچ های گیاه پارچ الهام گرفته شده است.LOIS دارای دافع مایعات طولانی مدت و قوی در برابر انواع مایعات و مواد بیولوژیکی (شامل سلول ها، پروتئین ها، کلسیم و باکتری ها) است.علاوه بر این، ما دوام مکانیکی در برابر خراش و نیروی ثابت را با شبیه سازی آسیب اجتناب ناپذیر در طول جراحی آزمایشگاهی تایید کردیم.مدل شکستگی استخوان ران التهابی مغز استخوان خرگوش برای مطالعه کامل پوسته‌گیری ضد بیولوژیکی و توانایی ضد عفونت LOIS مورد استفاده قرار گرفت.ما تصور می کنیم که LOIS، که دارای خواص ضد رسوب زیستی و دوام مکانیکی است، گامی رو به جلو در جراحی ارتوپدی بدون عفونت است.
امروزه به دلیل پیری کلی، تعداد بیماران مبتلا به بیماری های ارتوپدی (مانند شکستگی سالمندان، بیماری های دژنراتیو مفصل و پوکی استخوان) به شدت افزایش یافته است (1، 2).بنابراین موسسات پزشکی به جراحی ارتوپدی از جمله کاشت ارتوپدی پیچ، صفحه، ناخن و مفاصل مصنوعی اهمیت زیادی می دهند (3و4).با این حال، گزارش شده است که ایمپلنت های ارتوپدی سنتی نسبت به چسبندگی باکتریایی و تشکیل بیوفیلم حساس هستند، که می تواند باعث عفونت محل جراحی (SSI) پس از جراحی شود (5، 6).هنگامی که بیوفیلم روی سطح ایمپلنت ارتوپدی تشکیل شد، حذف بیوفیلم حتی با استفاده از دوزهای زیاد آنتی بیوتیک بسیار دشوار می شود.بنابراین معمولاً منجر به عفونت های شدید بعد از عمل می شود (7و8).با توجه به مشکلات فوق، درمان ایمپلنت های آلوده باید شامل جراحی مجدد، از جمله برداشتن تمام ایمپلنت ها و بافت های اطراف باشد.بنابراین بیمار دچار درد شدید و خطراتی خواهد شد (9 و 10).
برای حل برخی از این مشکلات، ایمپلنت های ارتوپدی حاوی دارو برای جلوگیری از عفونت با از بین بردن باکتری های چسبیده به سطح ایجاد شده اند (11، 12).با این حال، استراتژی هنوز چندین محدودیت را نشان می دهد.گزارش شده است که کاشت طولانی‌مدت ایمپلنت‌های حاوی دارو باعث آسیب به بافت‌های اطراف و ایجاد التهاب شده است که ممکن است منجر به نکروز شود (13، 14).علاوه بر این، حلال‌های آلی که ممکن است پس از فرآیند تولید ایمپلنت‌های ارتوپدی حاوی دارو وجود داشته باشند، که توسط سازمان غذا و داروی ایالات متحده اکیداً ممنوع هستند، نیاز به مراحل تصفیه اضافی برای برآورده کردن استانداردهای آن دارند (15).ایمپلنت های دارویی برای آزادسازی کنترل شده داروها چالش برانگیز هستند و به دلیل بارگذاری دارویی محدود آنها، استفاده طولانی مدت از دارو امکان پذیر نیست (16).
یکی دیگر از استراتژی های رایج پوشاندن ایمپلنت با یک پلیمر ضد رسوب برای جلوگیری از چسبیدن مواد بیولوژیکی و باکتری ها به سطح است (17).به عنوان مثال، پلیمرهای زوئیتریونی به دلیل خاصیت غیرچسبندگی خود در تماس با پروتئین‌های پلاسما، سلول‌ها و باکتری‌ها مورد توجه قرار گرفته‌اند.با این حال، محدودیت‌هایی در رابطه با پایداری طولانی‌مدت و دوام مکانیکی دارد که مانع کاربرد عملی آن در ایمپلنت‌های ارتوپدی می‌شود، به‌ویژه به دلیل خراشیدن مکانیکی در طول روش‌های جراحی (18، 19).علاوه بر این، به دلیل زیست سازگاری بالا، عدم نیاز به جراحی برداشتن و خاصیت تمیز کنندگی سطح از طریق خوردگی، از ایمپلنت های ارتوپدی ساخته شده از مواد زیست تخریب پذیر استفاده شده است (20، 21).در هنگام خوردگی، پیوندهای شیمیایی بین ماتریس پلیمری شکسته شده و از سطح جدا می شود و چسبنده ها سطح را تمیز می کنند.با این حال، رسوب ضد بیولوژیکی با تمیز کردن سطوح در مدت زمان کوتاهی موثر است.علاوه بر این، بیشتر مواد قابل جذب از جمله پلی (پلیمر اسید لاکتیک-گلیکولیک اسید) (PLGA)، پلی لاکتیک اسید (PLA) و آلیاژهای مبتنی بر منیزیم در بدن دچار تخریب بیولوژیکی و فرسایش نابرابر می شوند که بر پایداری مکانیکی تأثیر منفی می گذارد.(بیست و دو).علاوه بر این، قطعات صفحه زیست تخریب پذیر مکانی را برای اتصال باکتری ها فراهم می کند که احتمال عفونت را در دراز مدت افزایش می دهد.این خطر تخریب مکانیکی و عفونت، کاربرد عملی جراحی پلاستیک را محدود می کند (23).
سطوح فوق آبگریز (SHP) که ساختار سلسله مراتبی برگ های نیلوفر آبی را تقلید می کنند، به یک راه حل بالقوه برای سطوح ضد رسوب تبدیل شده اند (24، 25).هنگامی که سطح SHP در مایع غوطه ور می شود، حباب های هوا به دام می افتند، در نتیجه حفره های هوا تشکیل می شود و از چسبندگی باکتری ها جلوگیری می شود (26).با این حال، مطالعات اخیر نشان داده است که سطح SHP دارای معایب مربوط به دوام مکانیکی و پایداری طولانی مدت است که مانع از کاربرد آن در ایمپلنت های پزشکی می شود.علاوه بر این، حفره‌های هوا حل می‌شوند و خاصیت ضد رسوب خود را از دست می‌دهند، در نتیجه به دلیل مساحت سطح بزرگ سطح SHP، چسبندگی باکتری‌ها گسترده‌تر می‌شود (27، 28).اخیرا، آیزنبرگ و همکارانش یک روش نوآورانه برای پوشش سطح ضد رسوب زیستی با ایجاد سطحی صاف با الهام از گیاه پارچ Nepenthes معرفی کردند (29، 30).سطح صاف در شرایط هیدرولیک پایداری طولانی مدت را نشان می دهد، مایعات بیولوژیکی بسیار دافع مایع است و دارای خواص خود ترمیم شوندگی است.با این حال، نه روشی برای اعمال پوشش روی یک ایمپلنت پزشکی پیچیده وجود دارد و نه ثابت شده است که از روند بهبود بافت آسیب دیده پس از کاشت پشتیبانی می کند.
در اینجا، سطح ایمپلنت ارتوپدی روغن کاری شده (LOIS) را معرفی می کنیم، یک سطح ایمپلنت ارتوپدی با ساختار میکرو/نانو و به طور محکم با یک لایه روان کننده نازک ترکیب شده است تا از مرتبط شدن آن با جراحی پلاستیک، عفونت های باکتریایی، مانند تثبیت شکستگی، جلوگیری کند.از آنجایی که ساختار میکرو/نانو با عملکرد فلوئور، روان کننده را روی ساختار محکم می کند، LOIS توسعه یافته می تواند به طور کامل چسبندگی مایعات مختلف را دفع کند و عملکرد ضد رسوب را برای مدت طولانی حفظ کند.پوشش های LOIS را می توان برای موادی با اشکال مختلف در نظر گرفته شده برای سنتز استخوان اعمال کرد.خواص ضد رسوب زیستی عالی LOIS در برابر باکتری های بیوفیلم [پسودوموناس آئروژینوزا و استافیلوکوکوس اورئوس مقاوم به متی سیلین (MRSA)] و مواد بیولوژیکی (سلول ها، پروتئین ها و کلسیم) در شرایط آزمایشگاهی تایید شده است.میزان چسبندگی چسبندگی گسترده به بستر کمتر از 1٪ است.علاوه بر این، حتی پس از ایجاد استرس مکانیکی مانند خراش سطح، خود ترمیمی ناشی از روان کننده نافذ به حفظ خاصیت ضد رسوب آن کمک می کند.نتایج آزمون دوام مکانیکی نشان می دهد که حتی پس از اصلاح ساختاری و شیمیایی، استحکام کل به طور قابل توجهی کاهش نمی یابد.علاوه بر این، یک آزمایش آزمایشگاهی که استرس مکانیکی را در محیط جراحی شبیه‌سازی می‌کند، انجام شد تا ثابت کند که LOIS می‌تواند در برابر تنش‌های مکانیکی مختلفی که در طول جراحی پلاستیک رخ می‌دهد، مقاومت کند.در نهایت، ما از یک مدل شکستگی استخوان ران مبتنی بر خرگوش در داخل بدن استفاده کردیم، که ثابت کرد LOIS دارای خواص ضد باکتریایی و زیست سازگاری برتر است.نتایج رادیولوژی و بافت شناسی تایید کرد که رفتار روان کننده پایدار و خواص ضد رسوب زیستی در عرض 4 هفته پس از کاشت می تواند عملکرد موثر ضد عفونت و فرار ایمنی را بدون به تاخیر انداختن روند بهبود استخوان به دست آورد.
شکل 1A یک نمودار شماتیک از LOIS توسعه یافته را نشان می دهد که با ساختارهای میکرو/نانو در مدل شکستگی استخوان فمور خرگوش کاشته شده است تا خواص ضد عفونی و ضد عفونی عالی آن را تایید کند.یک روش بیومیمتیک برای شبیه سازی سطح یک گیاه گلدان آب و برای جلوگیری از رسوب زیستی با ترکیب یک لایه روان کننده در ساختار میکرو/نانو سطح انجام می شود.سطح تزریق شده با روان کننده می تواند تماس بین مواد بیولوژیکی و سطح را به حداقل برساند.بنابراین به دلیل تشکیل پیوندهای شیمیایی پایدار بر روی سطح، عملکرد ضد رسوب عالی و پایداری طولانی مدت دارد.در نتیجه، خواص ضد رسوب زیستی سطح روانکاری، کاربردهای عملی مختلفی را در تحقیقات زیست پزشکی امکان پذیر می کند.با این حال، تحقیقات گسترده در مورد نحوه تعامل این سطح ویژه در بدن هنوز کامل نشده است.با مقایسه LOIS با بسترهای برهنه در شرایط آزمایشگاهی با استفاده از آلبومین و باکتری های بیوفیلم، می توان عدم چسبندگی LOIS را تایید کرد (شکل 1B).علاوه بر این، با ریختن قطرات آب روی بستر لخت شیبدار و بستر LOIS (شکل S1 و فیلم S1)، عملکرد آلودگی بیولوژیکی را می توان نشان داد.همانطور که در تصویر میکروسکوپ فلورسانس نشان داده شده است، سوبسترای در معرض انکوبه شده در سوسپانسیون پروتئین و باکتری، مقدار زیادی از مواد بیولوژیکی را نشان داد که به سطح چسبیده است.با این حال، به دلیل خواص ضد رسوب زیستی عالی، LOIS به سختی فلورسانس را نشان می دهد.به منظور تایید خواص ضد رسوب زیستی و ضد عفونت آن، LOIS روی سطح ایمپلنت های ارتوپدی برای سنتز استخوان (صفحات و پیچ ها) اعمال شد و در مدل شکستگی خرگوش قرار گرفت.قبل از کاشت، ایمپلنت ارتوپدی برهنه و LOIS در یک سوسپانسیون باکتریایی به مدت 12 ساعت انکوبه شدند.پیش جوجه کشی تضمین می کند که یک بیوفیلم روی سطح ایمپلنت در معرض برای مقایسه تشکیل می شود.شکل 1C عکسی از محل شکستگی را 4 هفته پس از کاشت نشان می دهد.در سمت چپ، یک خرگوش با ایمپلنت ارتوپدی برهنه به دلیل تشکیل یک بیوفیلم روی سطح ایمپلنت، سطح شدید التهاب را نشان داد.نتیجه معکوس در خرگوش های کاشته شده با LOIS مشاهده شد، یعنی بافت های اطراف LOIS نه علائم عفونت و نه علائم التهاب را نشان دادند.علاوه بر این، تصویر نوری سمت چپ، محل جراحی خرگوش با ایمپلنت در معرض دید را نشان می‌دهد، که نشان می‌دهد هیچ چسب چندگانه‌ای روی سطح ایمپلنت در معرض دید در سطح LOIS یافت نشد.این نشان می دهد که LOIS پایداری طولانی مدت دارد و توانایی حفظ رسوب ضد بیولوژیکی و ضد چسبندگی خود را دارد.
(الف) نمودار شماتیک LOIS و کاشت آن در مدل شکستگی استخوان ران خرگوش.(ب) تصویر میکروسکوپ فلورسانس از پروتئین و بیوفیلم باکتریایی روی سطح خالی و بستر LOIS.4 هفته پس از کاشت، (C) یک تصویر عکاسی از محل شکستگی و (D) یک تصویر اشعه ایکس (با یک مستطیل قرمز برجسته شده است).تصویر: کیومین چای، دانشگاه یونسی.
خرگوش‌های عقیم‌شده و کاشته‌شده منفی، روند ترمیم استخوان طبیعی را بدون هیچ نشانه‌ای از التهاب یا عفونت نشان دادند.از سوی دیگر، ایمپلنت‌های SHP که از قبل در یک سوسپانسیون باکتریایی انکوبه شده‌اند، التهاب مرتبط با عفونت را در بافت‌های اطراف نشان می‌دهند.این را می توان به ناتوانی آن در مهار چسبندگی باکتری برای مدت طولانی نسبت داد (شکل S2).به منظور اثبات اینکه LOIS بر روند بهبودی تأثیر نمی گذارد، اما عفونت های احتمالی مرتبط با کاشت را مهار می کند، تصاویر اشعه ایکس از ماتریکس مثبت در معرض و LOIS در محل شکستگی مقایسه شدند (شکل 1D).تصویر اشعه ایکس از ایمپلنت مثبت لخت خطوط استئولیز پایدار را نشان داد که نشان می‌دهد استخوان به طور کامل بهبود نیافته است.این نشان می دهد که فرآیند بازیابی استخوان ممکن است به دلیل التهاب مرتبط با عفونت تا حد زیادی به تاخیر بیفتد.برعکس، نشان داد که خرگوش‌های کاشته‌شده با LOIS بهبود یافته‌اند و محل شکستگی آشکاری را نشان نمی‌دهند.
به منظور توسعه ایمپلنت های پزشکی با ثبات و عملکرد طولانی مدت (از جمله مقاومت در برابر رسوب زیستی)، تلاش های زیادی انجام شده است.با این حال، حضور مواد بیولوژیکی مختلف و پویایی چسبندگی بافت، توسعه روش های قابل اعتماد بالینی آنها را محدود می کند.برای غلبه بر این کاستی‌ها، ما یک ساختار لایه‌ای میکرو/نانو و سطح اصلاح‌شده شیمیایی ایجاد کرده‌ایم که به دلیل نیروی مویرگی بالا و میل ترکیبی شیمیایی بهینه شده است تا صاف‌ترین روان‌کننده را تا حد زیادی حفظ کند.شکل 2A روند کلی تولید LOIS را نشان می دهد.ابتدا یک زیرلایه فولاد ضد زنگ درجه پزشکی (SS) 304 تهیه کنید.در مرحله دوم، ساختار میکرو/نانو بر روی بستر SS با اچ شیمیایی با استفاده از محلول هیدروفلوریک اسید (HF) تشکیل می‌شود.به منظور بازیابی مقاومت به خوردگی SS، از محلول اسید نیتریک (HNO3) (31) برای پردازش زیرلایه اچ شده استفاده می شود.غیرفعال سازی مقاومت به خوردگی زیرلایه SS را افزایش می دهد و به طور قابل توجهی روند خوردگی را کاهش می دهد که ممکن است عملکرد کلی LOIS را کاهش دهد.سپس، با تشکیل یک تک لایه خود مونتاژ شده (SAM) با 1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyltriethoxysilane (POTS)، سطح از نظر شیمیایی اصلاح می شود تا تعامل شیمیایی بین سطح و روان کننده صاف را بهبود بخشد.اصلاح سطح به طور قابل توجهی انرژی سطحی سطح ساختاری میکرو/نانو ساخته شده را کاهش می دهد که با انرژی سطح روان کننده صاف مطابقت دارد.این اجازه می دهد تا روان کننده به طور کامل خیس شود و در نتیجه یک لایه روان کننده پایدار بر روی سطح تشکیل شود.سطح اصلاح شده آب گریزی افزایش یافته را نشان می دهد.نتایج نشان می‌دهد که روان‌کننده لغزنده رفتار پایداری را در LOIS به دلیل میل ترکیبی شیمیایی بالا و نیروی مویرگی ناشی از ساختار میکرو/نانو از خود نشان می‌دهد (32، 33).تغییرات نوری روی سطح SS پس از اصلاح سطح و تزریق روان کننده مورد مطالعه قرار گرفت.ساختار لایه‌ای میکرو/نانو تشکیل شده روی سطح می‌تواند باعث تغییرات بصری و تیره شدن سطح شود.این پدیده به افزایش اثر پراکندگی نور بر روی سطح ناهموار نسبت داده می شود که بازتاب انتشار ناشی از مکانیسم به دام انداختن نور را افزایش می دهد (34).علاوه بر این، پس از تزریق روان کننده، LOIS تیره تر می شود.لایه روان کننده باعث می شود نور کمتری از بستر منعکس شود و در نتیجه LOIS تیره شود.به منظور بهینه سازی ریزساختار/نانو ساختار برای نشان دادن کوچکترین زاویه لغزش (SA) برای دستیابی به عملکرد ضد رسوب زیستی، میکروسکوپ الکترونی روبشی (SEM) و جفت های اتمی برای انجام زمان های مختلف اچینگ HF (0، 3) استفاده شد.، 15 و 60 دقیقه) میکروسکوپ نیرو (AFM) (شکل 2B).تصاویر SEM و AFM نشان می دهد که پس از مدت کوتاهی اچینگ (3 دقیقه اچ)، زیرلایه لخت زبری ناهمواری در مقیاس نانو ایجاد کرده است.زبری سطح با زمان اچ تغییر می کند (شکل S3).منحنی متغیر زمان نشان می دهد که زبری سطح همچنان افزایش می یابد و در 15 دقیقه اچ به اوج می رسد و سپس در 30 دقیقه اچ تنها کاهش جزئی در مقدار زبری مشاهده می شود.در این مرحله، زبری سطح نانو از بین می رود، در حالی که زبری سطح میکرو به شدت توسعه می یابد و تغییر زبری را پایدارتر می کند.پس از اچ برای بیش از 30 دقیقه، افزایش بیشتری در زبری مشاهده می شود که به طور مفصل توضیح داده شده است: SS از فولاد تشکیل شده است که با عناصری از جمله آهن، کروم، نیکل، مولیبدن و بسیاری از عناصر دیگر آلیاژ شده است.در میان این عناصر، آهن، کروم و مولیبدن نقش مهمی در ایجاد زبری در مقیاس میکرون/نانو در SS با اچینگ HF دارند.در مراحل اولیه خوردگی، آهن و کروم عمدتاً خورده می شوند زیرا مولیبدن مقاومت به خوردگی بالاتری نسبت به مولیبدن دارد.با پیشرفت اچ، محلول اچ به اشباع بیش از حد موضعی می رسد و فلوریدها و اکسیدهای ناشی از اچ را تشکیل می دهد.فلوراید و اکسید رسوب می کنند و در نهایت دوباره روی سطح رسوب می کنند و زبری سطحی در محدوده میکرون/نانو تشکیل می دهند (31).این زبری در سطح میکرو/نانو نقش مهمی در خواص خود ترمیمی LOIS ایفا می کند.سطح مقیاس دوگانه یک اثر هم افزایی ایجاد می کند و نیروی مویرگی را تا حد زیادی افزایش می دهد.این پدیده به روان کننده اجازه می دهد تا به طور پایدار به سطح نفوذ کند و به خواص خود ترمیمی کمک می کند (35).شکل گیری زبری بستگی به زمان اچ دارد.در کمتر از 10 دقیقه اچینگ، سطح فقط دارای زبری در مقیاس نانو است که برای نگهداری روان کننده کافی برای داشتن مقاومت رسوب زیستی کافی نیست (36).از سوی دیگر، اگر زمان اچینگ بیش از 30 دقیقه باشد، زبری نانومقیاسی که در اثر رسوب مجدد آهن و کروم ایجاد می‌شود، از بین می‌رود و تنها زبری در مقیاس میکرو به دلیل مولیبدن باقی می‌ماند.سطح بیش از حد اچ شده فاقد زبری در مقیاس نانو است و اثر هم افزایی زبری دو مرحله ای را از دست می دهد، که بر ویژگی های خود ترمیمی LOIS تأثیر منفی می گذارد.اندازه‌گیری‌های SA بر روی بسترهایی با زمان‌های اچ متفاوت برای اثبات عملکرد ضد رسوب انجام شد.انواع مختلفی از مایعات بر اساس ویسکوزیته و انرژی سطحی، از جمله آب دیونیزه (DI)، خون، اتیلن گلیکول (EG)، اتانول (EtOH) و هگزادکان (HD) انتخاب شدند (شکل S4).الگوی اچ متغیر با زمان نشان می دهد که برای مایعات مختلف با انرژی های سطحی و ویسکوزیته های مختلف، SA LOIS پس از 15 دقیقه اچ کمترین میزان است.بنابراین، LOIS برای حکاکی به مدت 15 دقیقه برای ایجاد زبری در مقیاس میکرونی و نانویی بهینه شده است که برای حفظ موثر دوام روان کننده و خواص ضد رسوب عالی مناسب است.
(الف) نمودار شماتیک فرآیند تولید چهار مرحله ای LOIS.قسمت داخلی SAM تشکیل شده روی بستر را نشان می دهد.(ب) تصاویر SEM و AFM که برای بهینه سازی ساختار میکرو/نانو زیرلایه در زمان های مختلف اچینگ استفاده می شوند.طیف سنجی فوتوالکترون اشعه ایکس (XPS) طیف (C) Cr2p و (D) F1s پس از غیرفعال سازی سطح و پوشش SAM.au، واحد دلخواه(E) تصاویری از قطرات آب روی بسترهای لخت، حکاکی شده، SHP و LOIS.(F) زاویه تماس (CA) و اندازه گیری SA مایعات با کشش های سطحی مختلف در SHP و LOIS.داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار بیان می شوند.
سپس به منظور تایید تغییر در خواص شیمیایی سطح، از طیف‌سنجی فوتوالکترون پرتو ایکس (XPS) برای بررسی تغییر در ترکیب شیمیایی سطح زیرلایه پس از هر پوشش سطحی استفاده شد.شکل 2C نتایج اندازه گیری XPS سطح اچ شده HF و سطح تیمار شده با HNO 3 را نشان می دهد.دو پیک اصلی در 587.3 و 577.7 eV را می توان به پیوند Cr-O موجود در لایه اکسید کروم نسبت داد که تفاوت اصلی با سطح اچ شده HF است.این عمدتا به دلیل مصرف آهن و فلوراید کروم بر روی سطح توسط HNO3 است.اچ مبتنی بر HNO3 به کروم اجازه می دهد تا یک لایه اکسید غیرفعال بر روی سطح تشکیل دهد که باعث می شود SS حکاکی شده دوباره در برابر خوردگی مقاوم شود.در شکل 2D، طیف XPS برای تایید اینکه سیلان مبتنی بر فلوئوروکربن بر روی سطح پس از پوشش SAM تشکیل شده است، به دست آمد که دارای دافع مایع بسیار بالا حتی برای EG، خون و EtOH است.پوشش SAM با واکنش گروه‌های عاملی سیلان با گروه‌های هیدروکسیل تشکیل شده توسط تیمار پلاسما تکمیل می‌شود.در نتیجه افزایش قابل توجهی در پیک های CF2 و CF3 مشاهده شد.انرژی اتصال بین 286 و 296 eV نشان می دهد که اصلاح شیمیایی با موفقیت توسط پوشش SAM تکمیل شده است.SHP پیک های نسبتاً بزرگ CF2 (290.1 ​​eV) و CF3 (293.3 eV) را نشان می دهد که توسط سیلان مبتنی بر فلوئوروکربن تشکیل شده در سطح ایجاد می شود.شکل 2E تصاویر نوری نماینده اندازه گیری زاویه تماس (CA) را برای گروه های مختلف آب دیونیزه شده در تماس با لخت، اچ شده، SHP و LOIS نشان می دهد.این تصاویر نشان می‌دهند که سطح اچ شده به دلیل ساختار میکرو/نانوی تشکیل‌شده توسط اچ شیمیایی آب‌دوست می‌شود به طوری که آب دیونیزه شده به ساختار جذب می‌شود.با این حال، هنگامی که بستر با SAM پوشانده می شود، زیرلایه آب گریزی قوی نشان می دهد، بنابراین یک سطح SHP تشکیل می شود و سطح تماس بین آب و سطح کوچک است.در نهایت، کاهش CA در LOIS مشاهده شد که می‌توان آن را به نفوذ روان‌کننده به ریزساختار نسبت داد و در نتیجه سطح تماس را افزایش داد.به منظور اثبات اینکه سطح دارای خاصیت دافع مایع و غیر چسبندگی عالی است، LOIS با زیرلایه SHP با اندازه گیری CA و SA با استفاده از مایعات مختلف مقایسه شد (شکل 2F).انواع مختلفی از مایعات بر اساس ویسکوزیته و انرژی سطحی، از جمله آب دیونیزه، خون، EG، EtOH و HD انتخاب شدند (شکل S4).نتایج اندازه گیری CA نشان می دهد که وقتی CA به HD تمایل دارد، مقدار کاهش CA، جایی که CA کمترین انرژی سطحی را دارد.علاوه بر این، LOIS CA کلی پایین است.با این حال، اندازه گیری SA پدیده کاملا متفاوتی را نشان می دهد.به جز آب یونیزه شده، همه مایعات بدون لیز خوردن به زیرلایه SHP می چسبند.از سوی دیگر، LOIS یک SA بسیار پایین را نشان می دهد، که در آن وقتی تمام مایع در زاویه ای کمتر از 10 درجه تا 15 درجه کج می شود، تمام مایع خارج می شود.این به شدت نشان می دهد که عدم چسبندگی LOIS بهتر از سطح SHP است.علاوه بر این، پوشش های LOIS برای انواع مختلفی از مواد از جمله تیتانیوم (Ti)، پلی فنیل سولفون (PPSU)، پلی اکسی متیلن (POM)، کتون پلی اتر اتر (PEEK) و پلیمرهای قابل جذب زیستی (PLGA) اعمال می شوند، آنها مواد ارتوپدی قابل کاشت هستند (شکل) S5)).تصاویر متوالی قطرات روی مواد تحت درمان با LOIS نشان می دهد که خواص ضد رسوب زیستی LOIS در همه بسترها یکسان است.علاوه بر این، نتایج اندازه‌گیری CA و SA نشان می‌دهد که خواص غیرچسبندگی LOIS را می‌توان برای سایر مواد نیز اعمال کرد.
به منظور تایید خواص ضد رسوب LOIS، انواع مختلف بستر (از جمله برهنه، اچ شده، SHP و LOIS) با سودوموناس آئروژینوزا و MRSA انکوبه شدند.این دو باکتری به عنوان باکتری های بیمارستانی نماینده انتخاب شدند که می تواند منجر به تشکیل بیوفیلم شود که منجر به SSI می شود (37).شکل 3 (A و B) تصاویر میکروسکوپ فلورسانس و نتایج اندازه گیری واحد تشکیل کلنی (CFU) از بسترهای انکوبه شده در سوسپانسیون باکتریایی را به ترتیب برای کوتاه مدت (12 ساعت) و طولانی مدت (72 ساعت) نشان می دهد.در مدت زمان کوتاهی، باکتری‌ها خوشه‌هایی تشکیل می‌دهند و بزرگ می‌شوند و خود را با مواد مخاطی می‌پوشانند و از حذف آن‌ها جلوگیری می‌کنند.با این حال، در طول انکوباسیون 72 ساعته، باکتری ها بالغ می شوند و به راحتی پراکنده می شوند تا کلنی ها یا خوشه های بیشتری را تشکیل دهند.بنابراین می توان در نظر گرفت که جوجه کشی 72 ساعته طولانی مدت بوده و زمان مناسب جوجه کشی برای تشکیل یک بیوفیلم قوی در سطح است (38).در مدت زمان کوتاهی، سطح اچ شده و سطح SHP چسبندگی باکتریایی را نشان دادند که در مقایسه با بستر لخت حدود 25 تا 50 درصد کاهش یافت.با این حال، به دلیل عملکرد عالی و پایداری ضد رسوب زیستی، LOIS چسبندگی بیوفیلم باکتریایی را در کوتاه مدت و بلند مدت نشان نداد.نمودار شماتیک (شکل 3C) توضیح مکانیسم رسوب ضد بیولوژیکی محلول اچینگ، SHP و LOIS را شرح می دهد.فرض بر این است که زیرلایه اچ شده با خواص آب دوست، سطح بیشتری نسبت به بستر لخت دارد.بنابراین چسبندگی باکتریایی بیشتری روی بستر اچ شده ایجاد می شود.با این حال، در مقایسه با بستر لخت، بستر اچ شده دارای بیوفیلم کمتری بر روی سطح است.این به این دلیل است که مولکول های آب به طور محکم به سطح آب دوست متصل می شوند و به عنوان روان کننده آب عمل می کنند، بنابراین در چسبندگی باکتری ها در کوتاه مدت دخالت می کنند (39).با این حال، لایه مولکول های آب بسیار نازک و محلول در سوسپانسیون های باکتریایی است.بنابراین، لایه مولکولی آب برای مدت طولانی ناپدید می شود و منجر به چسبندگی و تکثیر گسترده باکتری ها می شود.برای SHP، به دلیل خواص کوتاه مدت غیر مرطوب کننده، چسبندگی باکتری مهار می شود.کاهش چسبندگی باکتری را می توان به حباب های هوای محبوس شده در ساختار لایه ای و انرژی سطح پایین تر نسبت داد، در نتیجه تماس بین سوسپانسیون باکتری و سطح را به حداقل می رساند.با این حال، چسبندگی باکتریایی گسترده در SHP مشاهده شد زیرا برای مدت طولانی خاصیت ضد رسوب خود را از دست داد.این عمدتا به دلیل ناپدید شدن حفره های هوا به دلیل فشار هیدرواستاتیک و حل شدن هوا در آب است.این عمدتاً به دلیل ناپدید شدن حفره های هوا به دلیل انحلال و ساختار لایه ای است که سطح بیشتری را برای چسبندگی فراهم می کند (27، 40).بر خلاف این دو بستر که تأثیر مهمی بر پایداری طولانی مدت دارند، روان کننده روان کننده موجود در LOIS به ساختار میکرو/نانو تزریق می شود و حتی در طولانی مدت از بین نمی رود.روان کننده های پر شده با ساختارهای میکرو/نانو بسیار پایدار هستند و به دلیل میل ترکیبی شیمیایی بالا به شدت به سطح جذب می شوند و در نتیجه از چسبندگی باکتری ها برای مدت طولانی جلوگیری می کنند.شکل S6 یک تصویر میکروسکوپ کانفوکال بازتابی از یک بستر تزریق شده با روان کننده غوطه ور در سالین بافر فسفات (PBS) را نشان می دهد.تصاویر پیوسته نشان می دهد که حتی پس از 120 ساعت تکان دادن خفیف (120 دور در دقیقه)، لایه روان کننده روی LOIS بدون تغییر باقی می ماند که نشان دهنده پایداری طولانی مدت در شرایط جریان است.این به دلیل تمایل شیمیایی بالا بین پوشش SAM مبتنی بر فلوئور و روان کننده مبتنی بر پرفلوئوروکربن است، به طوری که یک لایه روان کننده پایدار می تواند تشکیل شود.بنابراین، عملکرد ضد رسوب حفظ می شود.علاوه بر این، سوبسترا در برابر پروتئین‌های نماینده (آلبومین و فیبرینوژن)، که در پلاسما، سلول‌هایی که ارتباط نزدیکی با عملکرد ایمنی (ماکروفاژها و فیبروبلاست‌ها) دارند، و آنهایی که با تشکیل استخوان مرتبط هستند، مورد آزمایش قرار گرفت.محتوای کلسیم بسیار زیاد است.(شکل 3D، 1 و 2، و شکل S7) (41، 42).علاوه بر این، تصاویر میکروسکوپ فلورسانس تست چسبندگی فیبرینوژن، آلبومین و کلسیم ویژگی‌های چسبندگی متفاوتی را در هر گروه زیرلایه نشان داد (شکل S8).در طول تشکیل استخوان، استخوان و لایه های کلسیمی تازه تشکیل شده ممکن است اطراف ایمپلنت ارتوپدی را احاطه کنند که نه تنها برداشتن آن را دشوار می کند، بلکه ممکن است در طول فرآیند برداشتن باعث آسیب غیرمنتظره به بیمار شود.بنابراین، سطوح پایین رسوبات کلسیم روی صفحات استخوانی و پیچ‌ها برای جراحی ارتوپدی که نیاز به برداشتن ایمپلنت دارد، مفید است.بر اساس کمی سازی ناحیه متصل بر اساس شدت فلورسانس و تعداد سلول، ما تأیید کردیم که LOIS خواص ضد رسوب زیستی عالی را برای همه مواد بیولوژیکی در مقایسه با سایر بسترها نشان می دهد.با توجه به نتایج آزمایش‌های آزمایشگاهی، LOIS ضد رسوب بیولوژیکی را می‌توان روی ایمپلنت‌های ارتوپدی اعمال کرد که نه تنها می‌تواند عفونت‌های ناشی از باکتری‌های بیوفیلم را مهار کند، بلکه التهاب ناشی از سیستم ایمنی فعال بدن را نیز کاهش می‌دهد.
(الف) تصاویر میکروسکوپ فلورسانس از هر گروه (برهنه، اچ شده، SHP و LOIS) در سوسپانسیون سودوموناس آئروژینوزا و MRSA به مدت 12 و 72 ساعت انکوبه شدند.(ب) تعداد CFU چسبنده سودوموناس آئروژینوزا و MRSA در سطح هر گروه.(C) نمودار شماتیک مکانیسم رسوب ضد بیولوژیکی اچینگ کوتاه مدت و بلند مدت، SHP و LOIS.(د) (1) تعداد فیبروبلاست‌های چسبیده به هر بستر و تصاویر میکروسکوپ فلورسانس از سلول‌های چسبیده به لایه برهنه و LOIS.(2) تست چسبندگی پروتئین‌های مرتبط با ایمنی، آلبومین و کلسیم که در فرآیند بهبود استخوان نقش دارند (* P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001 و **** P <0.0001).ns، مهم نیست.
در مورد تنش های متمرکز اجتناب ناپذیر، دوام مکانیکی همیشه چالش اصلی برای اعمال پوشش های ضد رسوب بوده است.روش های سنتی ژل ضد فاضلاب بر پایه پلیمرهایی با حلالیت و شکنندگی آب کم است.بنابراین، معمولاً در کاربردهای زیست پزشکی مستعد استرس مکانیکی هستند.بنابراین، پوشش‌های ضد رسوب با دوام مکانیکی همچنان یک چالش برای کاربردهایی مانند ایمپلنت‌های ارتوپدی هستند (43، 44).شکل 4A(1) دو نوع اصلی استرس اعمال شده بر ایمپلنت های ارتوپدی را نشان می دهد، از جمله خراش (تنش برشی) و فشرده سازی با تصویر نوری ایمپلنت آسیب دیده تولید شده توسط فورسپس.به عنوان مثال، هنگامی که پیچ با پیچ گوشتی سفت می شود، یا زمانی که جراح صفحه استخوان را با موچین محکم می گیرد و نیروی فشاری اعمال می کند، صفحه استخوانی پلاستیکی در هر دو مقیاس ماکرو و میکرو/نانو خراشیده می شود (شکل 4A, 2) .به منظور آزمایش اینکه آیا LOIS ساخته شده می‌تواند این آسیب‌ها را در طی جراحی پلاستیک تحمل کند، نانو فرورفتگی برای مقایسه سختی زیرلایه لخت و LOIS در مقیاس میکرو/نانو برای بررسی خواص مکانیکی ساختار میکرو/نانو تاثیر انجام شد (شکل 4B).نمودار شماتیک رفتار تغییر شکل متفاوت LOIS را به دلیل وجود ساختارهای میکرو/نانو نشان می دهد.منحنی نیرو-جابجایی بر اساس نتایج نانو دندانه‌گذاری ترسیم شد (شکل 4C).تصویر آبی زیرلایه لخت را نشان می دهد، که تنها تغییر شکل جزئی را نشان می دهد، همانطور که با حداکثر عمق فرورفتگی 0.26 میکرومتر دیده می شود.از سوی دیگر، افزایش تدریجی نیروی نانو فرورفتگی و جابجایی مشاهده شده در LOIS (منحنی قرمز) ممکن است نشانه‌هایی از کاهش خواص مکانیکی را نشان دهد که منجر به عمق نانو فرورفتگی 1.61 میکرومتر می‌شود.این به این دلیل است که ساختار میکرو/نانو موجود در LOIS فضای پیشروی عمیق‌تری را برای نوک نانودنتر فراهم می‌کند، بنابراین تغییر شکل آن بیشتر از زیرلایه خالی است.کنستا گدوتوس و همکاران(45) معتقد است که به دلیل وجود نانوساختارها، نانو فرورفتگی و زبری میکرو/نانو منجر به منحنی های نامنظم نانو فرورفتگی می شود.ناحیه سایه‌دار مربوط به منحنی تغییر شکل نامنظم نسبت داده‌شده به نانوساختار است، در حالی که ناحیه غیر سایه‌دار به ریزساختار نسبت داده می‌شود.این تغییر شکل ممکن است به ریزساختار/نانو ساختار روان کننده نگهدارنده آسیب برساند و بر عملکرد ضد رسوب آن تأثیر منفی بگذارد.به منظور مطالعه تاثیر آسیب بر LOIS، آسیب اجتناب ناپذیر به ساختارهای میکرو/نانو در طول جراحی پلاستیک در بدن تکرار شد.با استفاده از آزمایشات چسبندگی خون و پروتئین، پایداری خواص ضد رسوب زیستی LOIS پس از آزمایشگاهی قابل تعیین است (شکل 4D).مجموعه ای از تصاویر نوری آسیب هایی را نشان می دهد که در نزدیکی سوراخ های هر زیرلایه رخ داده است.آزمایش چسبندگی خون برای نشان دادن اثر آسیب مکانیکی بر روی پوشش ضد رسوب زیستی انجام شد (شکل 4E).مانند SHP، خواص ضد رسوب به دلیل آسیب از بین می رود و LOIS با دفع خون، خاصیت ضد رسوب بسیار خوبی از خود نشان می دهد.دلیل آن این است که، چون انرژی سطحی توسط عمل مویرگی که ناحیه آسیب دیده را می پوشاند هدایت می شود، جریان در روان کننده روان ساز ریزساختار خاصیت ضد رسوب را بازیابی می کند (35).همین روند در تست چسبندگی پروتئین با استفاده از آلبومین مشاهده شد.در ناحیه آسیب دیده، چسبندگی پروتئین در سطح SHP به طور گسترده مشاهده می شود و با اندازه گیری سطح پوشش آن، می توان آن را به عنوان نیمی از سطح چسبندگی بستر لخت تعیین کرد.از سوی دیگر، LOIS خواص ضد رسوب زیستی خود را بدون ایجاد چسبندگی حفظ کرد (شکل 4، F و G).علاوه بر این، سطح پیچ اغلب تحت فشار مکانیکی قوی مانند سوراخ کاری قرار می گیرد، بنابراین ما توانایی پوشش LOIS را برای دست نخورده ماندن روی پیچ در شرایط آزمایشگاهی مطالعه کردیم.شکل 4H تصاویر نوری پیچ های مختلف از جمله برهنه، SHP و LOIS را نشان می دهد.مستطیل قرمز ناحیه مورد نظر را نشان می دهد که در آن استرس مکانیکی قوی در طول کاشت استخوان رخ می دهد.مشابه آزمایش چسبندگی پروتئین صفحه، از یک میکروسکوپ فلورسانس برای تصویربرداری از چسبندگی پروتئین و اندازه گیری ناحیه پوشش برای اثبات یکپارچگی پوشش LOIS، حتی تحت فشار مکانیکی قوی استفاده می شود (شکل 4، I و J).پیچ های درمان شده با LOIS عملکرد ضد رسوب بسیار خوبی از خود نشان می دهند و تقریباً هیچ پروتئینی به سطح نمی چسبد.از سوی دیگر، چسبندگی پروتئین در پیچ های لخت و پیچ های SHP مشاهده شد که سطح پوشش پیچ های SHP یک سوم پیچ های لخت بود.علاوه بر این، ایمپلنت ارتوپدی مورد استفاده برای تثبیت باید از نظر مکانیکی قوی باشد تا در برابر استرس وارده به محل شکستگی مقاومت کند، همانطور که در شکل 4K نشان داده شده است.بنابراین، آزمایش خمشی برای تعیین تأثیر اصلاح شیمیایی بر خواص مکانیکی انجام شد.علاوه بر این، این کار برای حفظ استرس ثابت از ایمپلنت انجام می شود.نیروی مکانیکی عمودی را اعمال کنید تا ایمپلنت کاملاً تا شود و منحنی تنش-کرنش به دست آید (شکل 4L، 1).دو ویژگی شامل مدول یانگ و استحکام خمشی بین بسترهای لخت و LOIS به عنوان شاخص مقاومت مکانیکی آنها مقایسه شد (شکل 4L، 2 و 3).مدول یانگ نشان دهنده توانایی یک ماده برای مقاومت در برابر تغییرات مکانیکی است.مدول یانگ هر زیرلایه به ترتیب 1.01±41.48 و 0.96±40.06 گیگا پاسکال است.تفاوت مشاهده شده حدود 3.4٪ است.علاوه بر این، گزارش شده است که استحکام خمشی، که چقرمگی ماده را تعیین می‌کند، برای زیرلایه 1.51±102.34 گیگا پاسکال و برای SHP 96.99±0.86 گیگا پاسکال است.بستر لخت تقریباً 5.3٪ بالاتر است.کاهش جزئی در خواص مکانیکی ممکن است ناشی از اثر بریدگی باشد.در اثر بریدگی، زبری میکرو/نانو ممکن است به‌عنوان مجموعه‌ای از بریدگی‌ها عمل کند که منجر به تمرکز تنش موضعی شده و بر خواص مکانیکی ایمپلنت تأثیر می‌گذارد (46).با این حال، بر اساس این واقعیت که سفتی استخوان قشر انسان بین 7.4 تا 31.6 گیگا پاسکال گزارش شده است، و مدول LOIS اندازه گیری شده از استخوان قشر انسان بیشتر است (47)، LOIS برای حمایت از شکستگی و کلی آن کافی است. خواص مکانیکی حداقل تحت تأثیر اصلاح سطح قرار می گیرد.
(الف) نمودار شماتیک (1) تنش مکانیکی اعمال شده به ایمپلنت ارتوپدی در طول عمل، و (2) تصویر نوری ایمپلنت ارتوپدی آسیب دیده.(ب) نمودار شماتیک اندازه گیری خواص مکانیکی نانو توسط نانو دندانه و LOIS روی سطح خالی.(C) منحنی نیروی جابجایی نانو فرورفتگی سطح لخت و LOIS.(د) پس از آزمایش های آزمایشگاهی، تصاویر نوری انواع مختلف صفحات ارتوپدی را شبیه سازی کنید (ناحیه آسیب دیده با یک مستطیل قرمز برجسته شده است) تا استرس مکانیکی ایجاد شده در حین عملیات شبیه سازی شود.(E) تست چسبندگی خون و (F) تست چسبندگی پروتئین گروه صفحه ارتوپدی آسیب دیده.(ز) سطح پوشش پروتئین چسبیده به صفحه را اندازه گیری کنید.(H) تصاویر نوری انواع مختلف پیچ های ارتوپدی پس از آزمایش آزمایشگاهی.(I) تست چسبندگی پروتئین برای مطالعه یکپارچگی پوشش های مختلف.(J) سطح پوشش پروتئین چسبیده به پیچ را اندازه گیری کنید.(K) حرکت خرگوش برای ایجاد یک استرس ثابت بر روی استخوان شکسته در نظر گرفته شده است.(L) (1) نتایج آزمایش و تصاویر نوری را قبل و بعد از خم شدن خم کنید.تفاوت در (2) مدول یانگ و (3) استحکام خمشی بین ایمپلنت برهنه و SHP.داده ها به صورت میانگین ± انحراف معیار (*P<0.05، **P<0.01، ***P<0.001 و ****P<0.0001) بیان می شوند.تصویر: کیومین چای، دانشگاه یونسی.
در موقعیت‌های بالینی، بیشتر تماس باکتری‌ها با مواد بیولوژیکی و محل‌های زخم از بیوفیلم‌های بالغ و بالغ حاصل می‌شود (48).بنابراین، مرکز کنترل و پیشگیری از بیماری های ایالات متحده تخمین می زند که 65٪ از کل عفونت های انسانی مربوط به بیوفیلم ها است (49).در این مورد، ارائه یک طرح آزمایشی in vivo که تشکیل بیوفیلم ثابتی را بر روی سطح ایمپلنت فراهم می‌کند، ضروری است.بنابراین، ما یک مدل شکستگی استخوان ران خرگوش را توسعه دادیم که در آن ایمپلنت‌های ارتوپدی از قبل در یک سوسپانسیون باکتریایی انکوبه شدند و سپس در استخوان ران خرگوش کاشته شدند تا خواص ضد رسوب LOIS در داخل بدن بررسی شود.با توجه به سه واقعیت مهم زیر، عفونت های باکتریایی به جای تزریق مستقیم سوسپانسیون های باکتریایی، توسط قبل از کشت ایجاد می شوند: (1) سیستم ایمنی خرگوش ها به طور طبیعی قوی تر از انسان است.بنابراین امکان تزریق سوسپانسیون باکتریایی و باکتری پلانکتون وجود دارد و تاثیری بر تشکیل بیوفیلم ندارد.(II) باکتری های پلانکتون نسبت به آنتی بیوتیک ها حساس تر هستند و آنتی بیوتیک ها معمولاً بعد از جراحی استفاده می شوند.در نهایت، (iii) سوسپانسیون باکتری پلانکتون ممکن است توسط مایعات بدن حیوان رقیق شود (50).با پیش کشت ایمپلنت در یک سوسپانسیون باکتریایی قبل از کاشت، می‌توانیم اثرات مضر عفونت باکتریایی و واکنش جسم خارجی (FBR) را بر روند بهبود استخوان به طور کامل مطالعه کنیم.خرگوش ها 4 هفته پس از کاشت قربانی شدند، زیرا استئواینتگراسیون ضروری برای روند ترمیم استخوان در عرض 4 هفته کامل می شود.سپس، ایمپلنت ها برای مطالعات پایین دست از خرگوش ها خارج شدند.شکل 5A مکانیسم تکثیر باکتری ها را نشان می دهد.ایمپلنت ارتوپدی آلوده به بدن وارد می شود.در نتیجه قبل از جوجه کشی در سوسپانسیون باکتریایی، شش خرگوش از شش خرگوش کاشته شده با ایمپلنت های برهنه آلوده شدند، در حالی که هیچ یک از خرگوش های کاشته شده با ایمپلنت های درمان شده با LOIS آلوده نشدند.عفونت های باکتریایی در سه مرحله شامل رشد، بلوغ و پراکندگی انجام می شود (51).ابتدا باکتری های متصل شده تکثیر می شوند و در سطح رشد می کنند و سپس باکتری ها با دفع پلیمر خارج سلولی (EPS)، آمیلوئید و DNA خارج سلولی یک بیوفیلم تشکیل می دهند.بیوفیلم نه تنها با نفوذ آنتی بیوتیک ها تداخل می کند، بلکه باعث تجمع آنزیم های تجزیه کننده آنتی بیوتیک (مانند بتالاکتاماز) نیز می شود (52).در نهایت، بیوفیلم باکتری های بالغ را در بافت های اطراف پخش می کند.بنابراین، عفونت رخ می دهد.علاوه بر این، هنگامی که جسم خارجی وارد بدن می شود، عفونتی که می تواند پاسخ ایمنی قوی ایجاد کند، می تواند باعث التهاب شدید، درد و کاهش ایمنی شود.شکل 5B یک نمای کلی از FBR ناشی از قرار دادن یک ایمپلنت ارتوپدی به جای پاسخ ایمنی ناشی از عفونت باکتریایی ارائه می دهد.سیستم ایمنی ایمپلنت وارد شده را به عنوان یک جسم خارجی می شناسد و سپس سلول ها و بافت ها را وادار می کند تا برای محصور کردن جسم خارجی واکنش نشان دهند (53).در روزهای اولیه FBR، یک ماتریس تامین روی سطح ایمپلنت های ارتوپدی تشکیل شد که منجر به جذب فیبرینوژن شد.سپس فیبرینوژن جذب شده یک شبکه فیبرین بسیار متراکم را تشکیل می دهد که اتصال لکوسیت ها را تقویت می کند (54).هنگامی که شبکه فیبرین تشکیل شد، التهاب حاد به دلیل نفوذ نوتروفیل ها رخ می دهد.در این مرحله، انواع سیتوکین ها مانند فاکتور نکروز تومور-α (TNF-α)، اینترلوکین-4 (IL-4) و IL-β آزاد می شوند و مونوسیت ها شروع به نفوذ به محل کاشت و تمایز به سلول های غول پیکر می کنند.فاژ (41، 55، 56).کاهش FBR همیشه یک چالش بوده است زیرا FBR بیش از حد می تواند باعث التهاب حاد و مزمن شود که می تواند منجر به عوارض کشنده شود.به منظور ارزیابی تأثیر عفونت های باکتریایی در بافت های اطراف ایمپلنت برهنه و LOIS، رنگ آمیزی هماتوکسیلین و ائوزین (H&E) و ماسون تری کروم (MT) مورد استفاده قرار گرفت.برای خرگوش‌های کاشته‌شده با بسترهای لخت، عفونت‌های باکتریایی شدید پیشرفت کردند و اسلایدهای بافت H&E به وضوح آبسه و نکروز ناشی از التهاب را نشان دادند.از سوی دیگر، سطح بسیار قوی ضد رسوب زیستی LOIS از چسبندگی باکتری ها جلوگیری می کند، بنابراین هیچ نشانه ای از عفونت را نشان نمی دهد و التهاب را کاهش می دهد (شکل 5C).نتایج رنگ‌آمیزی MT نیز همین روند را نشان داد.با این حال، رنگ آمیزی MT همچنین ادم را در خرگوش های کاشته شده با LOIS نشان داد، که نشان می دهد بهبودی در شرف وقوع است (شکل 5D).به منظور بررسی میزان پاسخ ایمنی، رنگ‌آمیزی ایمونوهیستوشیمی (IHC) با استفاده از سیتوکین‌های TNF-α و IL-6 مربوط به پاسخ ایمنی انجام شد.یک ایمپلنت منفی برهنه که در معرض باکتری قرار نگرفته بود با یک LOIS که در معرض باکتری قرار گرفته بود اما آلوده نشده بود برای مطالعه روند بهبود در غیاب عفونت باکتریایی مقایسه شد.شکل 5E یک تصویر نوری از یک اسلاید IHC را نشان می دهد که TNF-α را بیان می کند.ناحیه قهوه ای نشان دهنده پاسخ ایمنی است که نشان می دهد پاسخ ایمنی در LOIS اندکی کاهش یافته است.علاوه بر این، بیان IL-6 در LOIS به طور قابل توجهی کمتر از بیان منفی برهنه استریل بود (شکل 5F).بیان سیتوکین با اندازه گیری ناحیه رنگ آمیزی آنتی بادی مربوط به سیتوکین اندازه گیری شد (شکل 5G).در مقایسه با خرگوش‌هایی که در معرض ایمپلنت‌های منفی قرار گرفتند، سطح بیان خرگوش‌های کاشته‌شده با LOIS پایین‌تر بود که تفاوت معنی‌داری را نشان داد.کاهش بیان سیتوکین نشان می دهد که خواص ضد رسوب طولانی مدت و پایدار LOIS نه تنها به مهار عفونت های باکتریایی مربوط می شود، بلکه به کاهش FBR نیز مربوط می شود که توسط ماکروفاژها چسبیده به بستر ایجاد می شود (53, 57، 58).بنابراین، کاهش پاسخ ایمنی به دلیل ویژگی های فرار ایمنی LOIS ممکن است عوارض جانبی پس از کاشت، مانند پاسخ ایمنی بیش از حد پس از جراحی پلاستیک را برطرف کند.
(الف) یک نمودار شماتیک از مکانیسم تشکیل بیوفیلم و گسترش آن بر روی سطح ایمپلنت ارتوپدی آلوده.eDNA، DNA خارج سلولی.(ب) نمودار شماتیک پاسخ ایمنی پس از قرار دادن ایمپلنت ارتوپدی.(C) رنگ آمیزی H&E و (D) رنگ آمیزی MT بافت های اطراف ایمپلنت های ارتوپدی با مثبت خالی و LOIS.IHC سیتوکین های مرتبط با ایمنی (E) TNF-α و (F) IL-6 تصاویر رنگ آمیزی شده از خرگوش های برهنه منفی و کاشته شده با LOIS هستند.(G) کمی بیان سیتوکین با اندازه گیری پوشش منطقه (** P <0.01).
زیست سازگاری LOIS و تأثیر آن بر روند ترمیم استخوان در داخل بدن با استفاده از تصویربرداری تشخیصی [اشعه ایکس و توموگرافی کامپیوتری میکرو (CT)] و استئوکلاست IHC مورد بررسی قرار گرفت.شکل 6A فرآیند بهبود استخوان را شامل سه مرحله مختلف نشان می دهد: التهاب، ترمیم و بازسازی.هنگامی که یک شکستگی رخ می دهد، سلول های التهابی و فیبروبلاست ها به استخوان شکسته نفوذ کرده و شروع به رشد در بافت عروقی می کنند.در مرحله ترمیم، رشد درونی بافت عروقی در نزدیکی محل شکستگی گسترش می یابد.بافت عروقی مواد مغذی را برای تشکیل استخوان جدید که کالوس نامیده می شود، فراهم می کند.مرحله نهایی فرآیند ترمیم استخوان، مرحله بازسازی است که در آن اندازه کالوس به کمک افزایش سطح استئوکلاست‌های فعال شده به اندازه استخوان طبیعی کاهش می‌یابد (59).بازسازی سه بعدی (3 بعدی) محل شکستگی با استفاده از میکرو سی تی اسکن برای مشاهده تفاوت در سطح تشکیل کالوس در هر گروه انجام شد.برای مشاهده ضخامت کالوس اطراف استخوان شکسته، سطح مقطع استخوان ران را مشاهده کنید (شکل 6، B و C).همچنین از اشعه ایکس برای بررسی محل های شکستگی همه گروه ها هر هفته برای مشاهده فرآیندهای مختلف بازسازی استخوان در هر گروه استفاده شد (شکل S9).پینه و استخوان های بالغ به ترتیب به رنگ آبی/سبز و عاج نشان داده شده اند.اکثر بافت های نرم با یک آستانه از پیش تعیین شده فیلتر می شوند.برهنه مثبت و SHP تشکیل مقدار کمی کالوس در اطراف محل شکستگی را تایید کرد.از طرف دیگر، نگاتیو LOIS و محل شکستگی توسط کالوس ضخیم احاطه شده است.تصاویر Micro-CT نشان داد که تشکیل کالوس توسط عفونت باکتریایی و التهاب مرتبط با عفونت مانع شده است.این به این دلیل است که سیستم ایمنی به جای بهبودی استخوان، التیام صدمات سپتیک ناشی از التهاب ناشی از عفونت را در اولویت قرار می دهد (60).رنگ آمیزی IHC و اسید فسفاتاز مقاوم به تارتارات (TRAP) برای مشاهده فعالیت استئوکلاست و تحلیل استخوان انجام شد (شکل 6D) (61).تنها تعداد کمی از استئوکلاست‌های فعال شده با رنگ ارغوانی در افراد مثبت برهنه و SHP یافت شدند.از سوی دیگر، بسیاری از استئوکلاست‌های فعال در نزدیکی استخوان‌های برهنه مثبت و بالغ LOIS مشاهده شدند.این پدیده نشان می دهد که در حضور استئوکلاست ها، کالوس اطراف محل شکستگی تحت یک فرآیند بازسازی خشونت آمیز قرار می گیرد (62).حجم استخوان و ناحیه بیان استئوکلاست کالوس برای مقایسه سطح تشکیل پینه در اطراف محل شکستگی در همه گروه‌ها اندازه‌گیری شد تا نتایج میکرو سی‌تی اسکن و IHC را کمی‌سازی کنند (شکل 6E، 1 و 2).همانطور که انتظار می رفت، نگاتیو برهنه و تشکیل کالوس در LOIS به طور قابل توجهی بیشتر از سایر گروه ها بود، که نشان می دهد بازسازی استخوان مثبت رخ داده است (63).شکل S10 تصویر نوری محل جراحی، نتیجه رنگ آمیزی MT بافت جمع آوری شده در نزدیکی پیچ و نتیجه رنگ آمیزی TRAP را نشان می دهد که رابط پیچ و استخوان را برجسته می کند.در بستر لخت، تشکیل کالوس قوی و فیبروز مشاهده شد، در حالی که ایمپلنت تحت درمان با LOIS سطح نسبتاً چسبیده ای را نشان داد.به طور مشابه، در مقایسه با نگاتیو برهنه، فیبروز کمتری در خرگوش‌های کاشته‌شده با LOIS مشاهده شد، همانطور که با فلش‌های سفید نشان داده شد.علاوه بر این، ادم محکم (پیکان آبی) را می توان به ویژگی های فرار ایمنی LOIS نسبت داد، در نتیجه التهاب شدید را کاهش می دهد.سطح نچسب اطراف ایمپلنت و کاهش فیبروز نشان می دهد که فرآیند برداشتن آسان تر است که معمولاً منجر به شکستگی یا التهاب دیگری می شود.فرآیند ترمیم استخوان پس از برداشتن پیچ توسط فعالیت استئوکلاست در سطح مشترک پیچ و استخوان ارزیابی شد.هر دو استخوان لخت و رابط ایمپلنت LOIS سطوح مشابهی از استئوکلاست ها را برای بهبود بیشتر استخوان جذب کردند، که نشان می دهد پوشش LOIS هیچ تاثیر منفی بر بهبود استخوان یا پاسخ ایمنی ندارد.به منظور تأیید اینکه اصلاح سطح انجام شده در LOIS با روند بهبود استخوان تداخلی ندارد، از معاینه اشعه ایکس برای مقایسه بهبود استخوان خرگوش ها با یون های منفی در معرض و 6 هفته کاشت LOIS استفاده شد (شکل 6F).نتایج نشان داد که در مقایسه با گروه برهنه مثبت غیر عفونی، LOIS همان درجه بهبودی استخوان را نشان داد و هیچ نشانه آشکاری از شکستگی (خط استئولیز مداوم) در هر دو گروه وجود نداشت.
(الف) نمودار شماتیک فرآیند ترمیم استخوان پس از شکستگی.(ب) تفاوت در درجه تشکیل کالوس در هر گروه سطحی و (C) تصویر مقطعی محل شکستگی.(د) رنگ آمیزی TRAP برای تجسم فعالیت استئوکلاست و تحلیل استخوان.بر اساس فعالیت TRAP، تشکیل کالوس خارجی استخوان قشر مغز توسط (E) (1) میکرو CT و (2) فعالیت استئوکلاست مورد تجزیه و تحلیل کمی قرار گرفت.(F) 6 هفته پس از کاشت، تصاویر اشعه ایکس از استخوان شکسته نگاتیو در معرض (که با مستطیل قرمز چین برجسته شده است) و LOIS (با مستطیل چین آبی برجسته شده است).تجزیه و تحلیل آماری با استفاده از آنالیز واریانس یک طرفه (ANOVA) انجام شد.* P <0.05.** P <0.01.
به طور خلاصه، LOIS نوع جدیدی از استراتژی عفونت ضد باکتریایی و پوشش فرار ایمنی را برای ایمپلنت های ارتوپدی فراهم می کند.ایمپلنت های ارتوپدی معمولی با عملکرد SHP دارای خواص ضد رسوب زیستی کوتاه مدت هستند، اما نمی توانند خواص خود را برای مدت طولانی حفظ کنند.فوق آبگریز بودن زیرلایه حباب های هوا را بین باکتری و بستر به دام می اندازد و در نتیجه حفره های هوا را تشکیل می دهد و در نتیجه از عفونت باکتریایی جلوگیری می کند.با این حال، به دلیل انتشار هوا، این حفره های هوا به راحتی جدا می شوند.از سوی دیگر، LOIS توانایی خود را در جلوگیری از عفونت های مرتبط با بیوفیلم به خوبی ثابت کرده است.بنابراین، با توجه به خواص ضد رد لایه روان کننده تزریق شده به سطح ساختار لایه لایه میکرو/نانو، می توان از التهاب مرتبط با عفونت جلوگیری کرد.برای بهینه‌سازی شرایط تولید LOIS از روش‌های مختلف مشخص‌سازی از جمله اندازه‌گیری‌های SEM، AFM، XPS و CA استفاده می‌شود.علاوه بر این، LOIS را می توان برای مواد بیولوژیکی مختلف که معمولاً در تجهیزات ثابت ارتوپدی استفاده می شود، مانند PLGA، Ti، PE، POM و PPSU اعمال کرد.سپس، LOIS در شرایط آزمایشگاهی مورد آزمایش قرار گرفت تا خواص ضد رسوب زیستی آن در برابر باکتری ها و مواد بیولوژیکی مرتبط با پاسخ ایمنی ثابت شود.نتایج نشان می دهد که در مقایسه با ایمپلنت لخت، اثرات ضد باکتریایی و ضد رسوب زیستی بسیار خوبی دارد.علاوه بر این، LOIS استحکام مکانیکی را حتی پس از اعمال تنش مکانیکی نشان می دهد که در جراحی پلاستیک اجتناب ناپذیر است.با توجه به خواص خود ترمیم شوندگی روان کننده بر روی سطح ساختار میکرو/نانو، LOIS با موفقیت خاصیت رسوب ضد بیولوژیکی خود را حفظ کرد.به منظور مطالعه زیست سازگاری و خواص ضد باکتریایی LOIS در داخل بدن، LOIS به مدت 4 هفته در استخوان ران خرگوش کاشته شد.هیچ عفونت باکتریایی در خرگوش های کاشته شده با LOIS مشاهده نشد.علاوه بر این، استفاده از IHC کاهش سطح پاسخ ایمنی موضعی را نشان داد، که نشان می‌دهد LOIS روند بهبود استخوان را مهار نمی‌کند.LOIS دارای خواص ضد باکتریایی و فرار ایمنی عالی است و ثابت شده است که به طور موثر از تشکیل بیوفیلم قبل و در حین جراحی ارتوپدی، به ویژه برای سنتز استخوان جلوگیری می کند.با استفاده از مدل شکستگی استخوان ران التهابی مغز استخوان خرگوش، تأثیر عفونت‌های مرتبط با بیوفیلم بر روند بهبود استخوان ناشی از ایمپلنت‌های از قبل انکوبه شده عمیقاً مورد مطالعه قرار گرفت.به عنوان یک مطالعه آینده، یک مدل in vivo جدید برای مطالعه عفونت‌های احتمالی پس از کاشت برای درک کامل و جلوگیری از عفونت‌های مرتبط با بیوفیلم در طول کل فرآیند بهبود مورد نیاز است.علاوه بر این، القای استخوان هنوز یک چالش حل نشده در ادغام با LOIS است.تحقیقات بیشتری برای ترکیب چسبندگی انتخابی سلول‌های القای استخوان یا طب احیاکننده با LOIS برای غلبه بر چالش مورد نیاز است.به طور کلی، LOIS نمایانگر یک پوشش ایمپلنت ارتوپدی امیدوارکننده با استحکام مکانیکی و خواص ضد رسوب بسیار عالی است که می‌تواند عوارض جانبی SSI و ایمنی را کاهش دهد.
زیرلایه 304 SS 15mm x 15mm x 1mm (Dong Kang M-Tech Co., Korea) را در آب استون، EtOH و DI به مدت 15 دقیقه بشویید تا آلودگی ها حذف شوند.به منظور تشکیل ساختاری در سطح میکرو/نانو بر روی سطح، بستر تمیز شده در محلول 48 تا 51 درصد HF (DUKSAN Corp.، کره جنوبی) در دمای 50 درجه سانتی گراد غوطه ور می شود.زمان اچینگ از 0 تا 60 دقیقه متغیر است.سپس، بستر اچ شده با آب دیونیزه شده تمیز شد و در محلول 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) در دمای 50 درجه سانتی گراد به مدت 30 دقیقه قرار داده شد تا یک لایه غیرفعال سازی اکسید کروم روی سطح ایجاد شود.پس از غیر فعال سازی، بستر با آب دیونیزه شسته و خشک می شود تا بستری با ساختار لایه ای به دست آید.سپس، بستر در معرض پلاسمای اکسیژن (100 وات، 3 دقیقه)، و بلافاصله در محلول 8.88 میلی مولار POTS (Sigma-Aldrich، آلمان) در تولوئن در دمای اتاق به مدت 12 ساعت غوطه ور شد.سپس، بستر پوشش داده شده با POTS با EtOH تمیز شد و در دمای 150 درجه سانتی گراد به مدت 2 ساعت آنیل شد تا یک POTS SAM متراکم به دست آید.پس از پوشش SAM، با اعمال یک روان کننده پرفلوروپلی اتر (Krytox 101؛ DuPont، USA) با حجم بارگذاری 20 میکرومتر بر سانتی متر مربع، یک لایه روان کننده بر روی بستر تشکیل شد. قبل از استفاده، روان کننده را از طریق یک فیلتر 0.2 میکرون فیلتر کنید.روان کننده اضافی را با کج کردن در زاویه 45 درجه به مدت 15 دقیقه پاک کنید.همان روش تولید برای ایمپلنت های ارتوپدی ساخته شده از 304 SS (صفحه قفل کننده و پیچ قفل کننده قشر مغز، شرکت Dong Kang M-Tech، کره) استفاده شد.تمام ایمپلنت های ارتوپدی به گونه ای طراحی شده اند که با هندسه استخوان ران خرگوش مطابقت داشته باشد.
مورفولوژی سطح زیرلایه و ایمپلنت های ارتوپدی با انتشار میدانی SEM (Inspect F50، FEI، ایالات متحده آمریکا) و AFM (XE-100، Park Systems، کره جنوبی) بررسی شد.زبری سطح (Ra, Rq) با ضرب مساحت 20 میکرومتر در 20 میکرومتر (n=4) اندازه گیری می شود.یک سیستم XPS (PHI 5000 VersaProbe، ULVAC PHI، ژاپن) مجهز به منبع اشعه ایکس Al Kα با اندازه نقطه 100μm2 برای تجزیه و تحلیل ترکیب شیمیایی سطح استفاده شد.یک سیستم اندازه گیری CA مجهز به دوربین ثبت تصویر پویا (SmartDrop، FEMTOBIOMED، کره جنوبی) برای اندازه گیری CA و SA مایع استفاده شد.برای هر اندازه گیری، 6 تا 10 میکرولیتر قطره (آب دیونیزه، خون اسب، EG، اتانول 30 درصد و HD) روی سطح قرار می گیرد تا CA اندازه گیری شود.هنگامی که زاویه شیب بستر با سرعت 2 درجه بر ثانیه (n = 4) افزایش می یابد، SA در هنگام سقوط قطره اندازه گیری می شود.
سودوموناس آئروژینوزا [مجموعه کشت نوع آمریکایی (ATCC) 27853] و MRSA (ATCC 25923) از ATCC (ماناساس، ویرجینیا، ایالات متحده آمریکا) خریداری شدند و کشت انبار در 80- درجه سانتیگراد نگهداری شد.قبل از استفاده، کشت منجمد در آبگوشت سویای ذوب شده با تریپسین (کومد، کره) در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 18 ساعت انکوبه شد و سپس دو بار برای فعال سازی آن منتقل شد.پس از انکوباسیون، کشت با سرعت 10000 دور در دقیقه به مدت 10 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد سانتریفیوژ شد و دو بار با محلول PBS (pH 7.3) شستشو شد.سپس کشت سانتریفیوژ شده روی صفحات خون آگار (BAP) زیر کشت قرار می گیرد.MRSA و سودوموناس آئروژینوزا یک شبه تهیه و در آبگوشت لوریا برتانی کشت داده شدند.غلظت سودوموناس آئروژینوزا و MRSA در تلقیح به طور کمی توسط CFU سوسپانسیون در رقت های سریال روی آگار تعیین شد.سپس غلظت باکتری را روی استاندارد مک فارلند 0.5 تنظیم کنید که معادل 108 CFU/ml است.سپس سوسپانسیون باکتریایی کار را 100 بار تا 106 CFU/ml رقیق کنید.برای آزمایش خاصیت چسبندگی ضد باکتریایی، بستر قبل از استفاده در دمای 121 درجه سانتی گراد به مدت 15 دقیقه استریل شد.سپس بستر به 25 میلی لیتر سوسپانسیون باکتریایی منتقل شد و در دمای 37 درجه سانتی گراد با تکان دادن شدید (200 دور در دقیقه) به مدت 12 و 72 ساعت انکوبه شد.پس از انکوباسیون، هر بستر از انکوباتور خارج شد و 3 بار با PBS شسته شد تا باکتری های شناور روی سطح حذف شوند.به منظور مشاهده بیوفیلم روی بستر، بیوفیلم با متانول تثبیت شد و با 1 میلی لیتر پرتقال کریمیدین به مدت 2 دقیقه رنگ آمیزی شد.سپس از یک میکروسکوپ فلورسانس (BX51TR، Olympus، ژاپن) برای عکسبرداری از بیوفیلم رنگ‌آمیزی استفاده شد.به منظور تعیین کمیت بیوفیلم روی بستر، سلول‌های متصل شده با روش گرداب مهره‌ای از بستر جدا شدند که مناسب‌ترین روش برای حذف باکتری‌های چسبیده در نظر گرفته شد (n=4).با استفاده از فورسپس استریل، بستر را از محیط رشد جدا کنید و روی صفحه چاه ضربه بزنید تا مایع اضافی خارج شود.سلول‌های متصل به هم با دو بار شستشو با PBS استریل حذف شدند.سپس هر سوبسترا به یک لوله آزمایش استریل حاوی 9 میلی‌لیتر 0.1 درصد پروتئین ept saline (PSW) و 2 گرم از 20 تا 25 مهره شیشه‌ای استریل (قطر 0.4 تا 0.5 میلی‌متر) منتقل شد.سپس به مدت 3 دقیقه گرداب شد تا سلول ها از نمونه جدا شوند.پس از گرداب، سوسپانسیون به صورت سریال 10 برابر با 0.1٪ PSW رقیق شد و سپس 0.1 میلی لیتر از هر رقت بر روی BAP تلقیح شد.پس از 24 ساعت انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتی گراد، CFU به صورت دستی شمارش شد.
برای سلول‌ها، فیبروبلاست‌های موش NIH/3T3 (CRL-1658؛ ATCC آمریکایی) و ماکروفاژهای موش RAW 264.7 (TIB-71؛ ATCC آمریکایی) استفاده شد.از محیط Eagle اصلاح شده Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) برای کشت فیبروبلاست موش و مکمل با 10% سرم گوساله (S103-01, Welgene) و 1% پنی سیلین-استرپتومایسین (PS ; LS202-02, Wegenel) استفاده کنید. از DMEM برای کشت ماکروفاژهای موش، با 10% سرم جنینی (S001-01، Welgene) و 1% PS استفاده کنید. سلولها در یک شب در دمای 37 درجه سانتیگراد و 5% CO2 انکوبه شدند در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 30 دقیقه، از بستر با 4',6-diamino-2-phenylindole (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD برای پروتئین استفاده کنید فلورسئین، فلورسئین ایزوتیوسیانات-آلبومین (A9771، سیگما آلدریچ، آلمان) و پلاسمای انسانی فیبرینوژن کونژوگه الکسا فلور 488 (F13191، Invitrogen، USA) در PBS (10.7 میلی مولار، pH) حل شد.غلظت آلبومین و فیبرینوژن به ترتیب 1 و 150 میکروگرم در میلی لیتر بود.بعد از بستر قبل از غوطه ور شدن در محلول پروتئین، آنها را با PBS بشویید تا سطح را دوباره آب کنید.سپس تمام بسترها را در یک صفحه شش چاهی حاوی محلول پروتئین غوطه ور کرده و در دمای 37 درجه سانتی گراد به مدت 30 و 90 دقیقه انکوبه کنید.پس از انکوباسیون، سوبسترا از محلول پروتئین خارج شد، به آرامی با PBS 3 بار شسته شد و با 4% پارافورمالدئید (تعداد = 4 برای هر پروتئین) ثابت شد.برای کلسیم، کلرید سدیم (0.21 مولار) و فسفات پتاسیم (3.77 میلی مولار)) در آب دیونیزه حل شد.pH محلول با افزودن محلول هیدروکلراید (1M) به 2.0 تنظیم شد.سپس کلرید کلسیم (62/5 میلی مولار) در محلول حل شد.با افزودن 1M تریس(هیدروکسی متیل) آمینو متان pH محلول را روی 7.4 تنظیم می کند.تمام بسترها را در یک صفحه شش چاهی پر از محلول فسفات کلسیم 1.5 × غوطه ور کنید و پس از 30 دقیقه از محلول خارج کنید.برای رنگ آمیزی، 2 گرم Alizarin Red S (CI 58005) با 100 میلی لیتر آب دیونیزه مخلوط کنید.سپس از هیدروکسید آمونیوم 10 درصد برای تنظیم pH روی 4 استفاده کنید. بستر را با محلول آلیزارین رد به مدت 5 دقیقه رنگ آمیزی کنید و سپس رنگ اضافی را تکان دهید و لکه بردارید.پس از فرآیند تکان دادن، بستر را بردارید.این ماده خشک می شود، سپس به مدت 5 دقیقه در استون غوطه ور می شود، سپس به مدت 5 دقیقه در محلول استون-زایلن (1:1) غوطه ور می شود و در نهایت با زایلن (n = 4) شسته می شود.از میکروسکوپ فلورسانس (Axio Imager) با لنزهای شیئی ×10 و ×20 استفاده شده است..A2m، Zeiss، آلمان) همه بسترها را تصویر می کند.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) برای تعیین کمیت داده های چسبندگی مواد بیولوژیکی در هر گروه از چهار ناحیه مختلف تصویربرداری استفاده شد.همه تصاویر را به تصاویر باینری با آستانه های ثابت برای مقایسه زیرلایه تبدیل کنید.
یک میکروسکوپ کانفوکال Zeiss LSM 700 برای نظارت بر پایداری لایه روان کننده در PBS در حالت بازتاب استفاده شد.نمونه شیشه ای با پوشش SAM مبتنی بر فلوئور با یک لایه روان کننده تزریقی در محلول PBS غوطه ور شد و با استفاده از تکان دهنده مداری (SHO-1D؛ Daihan Scientific، کره جنوبی) تحت شرایط لرزش ملایم (120 دور در دقیقه) آزمایش شد.سپس نمونه بردارید و با اندازه گیری افت نور منعکس شده، هدررفت روان کننده را کنترل کنید.برای به دست آوردن تصاویر فلورسانس در حالت بازتاب، نمونه در معرض لیزر 633 نانومتری قرار می گیرد و سپس جمع آوری می شود، زیرا نور از نمونه به عقب بازتاب می شود.نمونه ها در فواصل زمانی 0، 30، 60 و 120 ساعت اندازه گیری شدند.
به منظور تعیین تأثیر فرآیند اصلاح سطح بر خواص نانومکانیکی ایمپلنت‌های ارتوپدی، از یک نانو دندانه (TI 950 TriboIndenter، Hysitron، ایالات متحده آمریکا) مجهز به نوک الماس برکوویچ هرمی شکل سه‌وجهی برای اندازه‌گیری نانوایندندیون استفاده شد.اوج بار 10 mN و منطقه 100μmx 100μm است.برای همه اندازه‌گیری‌ها، زمان بارگیری و تخلیه 10 ثانیه و زمان نگهداری تحت بار تورفتگی اوج 2 ثانیه است.از پنج مکان مختلف اندازه گیری کنید و میانگین را بگیرید.به منظور ارزیابی عملکرد مقاومت مکانیکی تحت بار، یک آزمایش خمش عرضی سه نقطه ای با استفاده از دستگاه تست جهانی (Instron 5966، Instron، ایالات متحده آمریکا) انجام شد.زیرلایه با سرعت ثابت 10 نیوتن بر ثانیه با افزایش بار فشرده می شود.برای محاسبه مدول خمشی و حداکثر تنش فشاری از نرم افزار Bluehill Universal (n=3) استفاده شد.
به منظور شبیه سازی فرآیند عملیات و آسیب های مکانیکی ناشی از آن در حین عملیات، فرآیند عملیات در شرایط آزمایشگاهی انجام شد.استخوان ران از خرگوش های سفید اعدام شده نیوزیلندی جمع آوری شد.استخوان ران به مدت 1 هفته در پارافورمالدئید 4 درصد تمیز و ثابت شد.همانطور که در روش آزمایش حیوانی توضیح داده شد، استخوان ران ثابت با عمل جراحی انجام شد.پس از عمل، ایمپلنت ارتوپدی به مدت 10 ثانیه در خون (خون اسب، KISAN، کره) غوطه ور شد تا تأیید شود که آیا چسبندگی خون پس از اعمال آسیب مکانیکی رخ داده است (n = 3).
در مجموع 24 خرگوش سفید نر نیوزیلندی (وزن 3.0 تا 3.5 کیلوگرم، میانگین سنی 6 ماه) به طور تصادفی به چهار گروه منفی برهنه، مثبت برهنه، SHP و LOIS تقسیم شدند.تمام مراحل مربوط به حیوانات مطابق با استانداردهای اخلاقی کمیته مراقبت و استفاده از حیوانات سازمانی (تأیید IACUC، KOREA-2017-0159) انجام شد.ایمپلنت ارتوپدی شامل یک صفحه قفل کننده با پنج سوراخ (طول 41 میلی متر، عرض 7 میلی متر و ضخامت 2 میلی متر) و پیچ های قفل کننده کورتیکال (طول 12 میلی متر، قطر 2.7 میلی متر) برای تثبیت شکستگی است.به جز آن دسته از صفحات و پیچ‌هایی که در گروه برهنه منفی استفاده شد، همه صفحات و پیچ‌ها در سوسپانسیون MRSA (106 CFU/ml) به مدت 12 ساعت انکوبه شدند.گروه برهنه منفی (6 نفر) با ایمپلنت های سطح برهنه بدون قرار گرفتن در معرض سوسپانسیون باکتریایی، به عنوان کنترل منفی برای عفونت تحت درمان قرار گرفتند.گروه مثبت لخت (6 نفر) با یک ایمپلنت سطح برهنه در معرض باکتری به عنوان کنترل مثبت عفونت تحت درمان قرار گرفتند.گروه SHP (n = 6) با ایمپلنت های SHP در معرض باکتری تحت درمان قرار گرفتند.در نهایت، گروه LOIS با ایمپلنت‌های LOIS در معرض باکتری تحت درمان قرار گرفتند (6 نفر).همه حیوانات در قفس نگهداری می شوند و غذا و آب زیادی در اختیار آنها قرار می گیرد.قبل از عمل خرگوش ها 12 ساعت ناشتا بودند.حیوانات با تزریق عضلانی زایلازین (mg/kg 5) و تزریق داخل وریدی پاکلیتاکسل (mg/kg 3) برای القا بیهوش شدند.پس از آن، 2٪ ایزوفلوران و 50٪ تا 70٪ اکسیژن پزشکی (سرعت جریان 2 لیتر در دقیقه) را از طریق سیستم تنفسی برای حفظ بیهوشی تحویل دهید.از طریق یک رویکرد مستقیم به استخوان ران جانبی کاشته می شود.پس از برداشتن موهای زائد و ضد عفونی پوست با پوویدون ید، برشی به طول حدود 6 سانتی متر در قسمت خارجی استخوان ران میانی چپ ایجاد شد.با باز کردن شکاف بین عضلات پوشاننده استخوان ران، استخوان ران به طور کامل در معرض دید قرار می گیرد.صفحه را جلوی محور استخوان ران قرار دهید و با چهار پیچ آن را ثابت کنید.پس از تثبیت، از یک تیغ اره (ضخامت 1 میلی متر) استفاده کنید تا به طور مصنوعی در ناحیه بین سوراخ دوم و سوراخ چهارم شکستگی ایجاد کنید.در پایان عمل، زخم با سرم نمکی شسته و با بخیه بسته شد.به هر خرگوش به صورت زیر جلدی انروفلوکساسین (5 میلی گرم بر کیلوگرم) رقیق شده در سالین یک سوم تزریق شد.عکسبرداری با اشعه ایکس از استخوان ران در تمام حیوانات (0، 7، 14، 21، 28 و 42 روز) برای تایید استئوتومی استخوان انجام شد.پس از بیهوشی عمیق، همه حیوانات با پتاسیم داخل وریدی (2 میلی مول بر کیلوگرم) در روزهای 28 و 42 کشته شدند.پس از اعدام، استخوان ران توسط میکرو سی تی اسکن شد تا روند بهبود استخوان و تشکیل استخوان جدید بین چهار گروه مشاهده و مقایسه شود.
پس از اجرا، بافت های نرمی که در تماس مستقیم با ایمپلنت های ارتوپدی بودند جمع آوری شد.بافت در یک شب در فرمالین بافر خنثی 10 درصد تثبیت شد و سپس در EtOH آبگیری شد.بافت دهیدراته در پارافین جاسازی شده و با استفاده از میکروتوم (400CS؛ EXAKT، آلمان) در ضخامت 40 میکرومتر برش داده شد.برای مشاهده عفونت، رنگ‌آمیزی H&E و رنگ‌آمیزی MT انجام شد.به منظور بررسی پاسخ میزبان، بافت برش داده شده با آنتی بادی اولیه ضد TNF-α خرگوش (AB6671، Abcam، ایالات متحده) و خرگوش anti-IL-6 (AB6672؛ Abcam، ایالات متحده آمریکا) انکوبه شد و سپس با ترب کوهی تیمار شد.اکسیداز.سیستم رنگ آمیزی آویدین-بیوتین کمپلکس (ABC) را طبق دستورالعمل سازنده روی مقاطع اعمال کنید.برای اینکه به عنوان یک محصول واکنش قهوه ای ظاهر شود، 3،3-دیامینو بنزیدین در تمام قسمت ها استفاده شد.یک اسکنر اسلاید دیجیتال (Pannoramic 250 Flash III، 3DHISTECH، مجارستان) برای تجسم تمام برش ها استفاده شد و حداقل چهار بستر در هر گروه توسط نرم افزار ImageJ آنالیز شد.
تصاویر اشعه ایکس در تمام حیوانات پس از جراحی و هر هفته برای نظارت بر بهبود شکستگی (6 نفر در هر گروه) گرفته شد.پس از اجرا، از میکرو سی تی با وضوح بالا برای محاسبه تشکیل پینه در اطراف استخوان ران پس از بهبودی استفاده شد.استخوان ران به‌دست‌آمده تمیز شد، به مدت 3 روز در پارافورمالدئید 4 درصد ثابت شد و در اتانول 75 درصد آب‌گیری شد.سپس استخوان های دهیدراته شده با استفاده از میکرو سی تی (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgium) برای تولید تصاویر وکسل سه بعدی (2240×2240 پیکسل) از نمونه استخوان اسکن شدند.از فیلتر 1.0 میلی متری Al برای کاهش نویز سیگنال استفاده کنید و وضوح بالا را برای همه اسکن ها اعمال کنید (E = 133 kVp، I = 60 μA، زمان یکپارچه سازی = 500 ms).نرم افزار Nrecon (نسخه 1.6.9.8، Bruker microCT، Kontich، بلژیک) برای تولید حجم سه بعدی از نمونه اسکن شده از برجستگی جانبی دوبعدی به دست آمده استفاده شد.برای تجزیه و تحلیل، تصویر سه بعدی بازسازی شده با توجه به محل شکستگی به مکعب های 10mm×10mm×10mm تقسیم می شود.کالوس خارج از استخوان قشر مغز را محاسبه کنید.نرم افزار DataViewer (نسخه 1.5.1.2؛ Bruker microCT، Kontich، Belgium) برای تغییر مسیر دیجیتالی حجم استخوان اسکن شده و نرم افزار CT-Analyzer (نسخه 1.14.4.1؛ Bruker microCT، Kontich، Belgium) برای تجزیه و تحلیل استفاده شد.ضرایب جذب نسبی اشعه ایکس در استخوان بالغ و کالوس با چگالی آنها مشخص می شود و سپس حجم پینه کمیت می شود (n = 4).به منظور تأیید اینکه زیست سازگاری LOIS روند بهبود استخوان را به تاخیر نمی اندازد، تجزیه و تحلیل اشعه ایکس و میکرو CT اضافی در دو خرگوش انجام شد: گروه برهنه-منفی و LOIS.هر دو گروه در هفته ششم اعدام شدند.
فمورهای حیوانات قربانی جمع آوری و به مدت 3 روز در پارافورمالدئید 4 درصد ثابت شدند.سپس ایمپلنت ارتوپدی با دقت از استخوان ران خارج می شود.استخوان ران به مدت 21 روز با استفاده از 0.5 M EDTA (EC-900، National Diagnostics Corporation) کلسیم زدایی شد.سپس استخوان ران بدون کلسیم در EtOH غوطه ور شد تا آب آن کم شود.استخوان ران دهیدراته در زایلن برداشته شد و در پارافین جاسازی شد.سپس نمونه با میکروتوم چرخشی خودکار (Leica RM2255, Leica Biosystems, Germany) با ضخامت 3 میکرومتر برش داده شد.برای رنگ‌آمیزی TRAP (F6760، Sigma-Aldrich، آلمان)، نمونه‌های برش‌شده پارافین‌زدایی شدند، هیدراته شدند و در معرف TRAP در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 1 ساعت انکوبه شدند.تصاویر با استفاده از یک اسکنر اسلاید (Pannoramic 250 Flash III، 3DHISTECH، مجارستان) به دست آمد و با اندازه‌گیری سطح پوشش ناحیه رنگ‌آمیزی، کمیت‌سازی شد.در هر آزمایش حداقل چهار بستر در هر گروه با نرم افزار ImageJ آنالیز شد.
تجزیه و تحلیل معناداری آماری با استفاده از GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA) انجام شد.برای آزمون تفاوت بین گروه‌های ارزیابی از آزمون t غیر زوجی و آنالیز واریانس یک‌طرفه (ANOVA) استفاده شد.سطح معنی داری در شکل زیر نشان داده شده است: *P<0.05، **P<0.01، ***P<0.001 و ****P<0.0001;NS، تفاوت معنی داری وجود ندارد.
برای مطالب تکمیلی این مقاله، لطفاً به http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1 مراجعه کنید
این یک مقاله با دسترسی آزاد است که تحت شرایط مجوز Creative Commons Attribution-Non-Commercial توزیع شده است، که استفاده، توزیع و تکثیر را در هر رسانه ای مجاز می کند، تا زمانی که استفاده برای منافع تجاری نباشد و فرض بر این است که نسخه اصلی کار درست استارجاع.
توجه: ما فقط از شما می خواهیم که یک آدرس ایمیل ارائه دهید تا شخصی که به صفحه توصیه می کنید بداند که می خواهید ایمیل را ببیند و ایمیل اسپم نیست.ما هیچ آدرس ایمیلی را نمی گیریم.
این سوال برای آزمایش اینکه آیا شما یک بازدیدکننده انسانی هستید و برای جلوگیری از ارسال خودکار هرزنامه استفاده می شود.
چو کیونگ مین، اوه یانگ جانگ، پارک جون جون، لی جین هیوک، کیم هیون چول، لی کیونگ مون، لی چانگ کیو، لی یون تاک، لی سان اوک، جونگ موروی
پوشش های ضد باکتریایی و فرار ایمنی ایمپلنت های ارتوپدی می توانند عفونت ها و پاسخ های ایمنی ناشی از عفونت ها را کاهش دهند.
چو کیونگ مین، اوه یانگ جانگ، پارک جون جون، لی جین هیوک، کیم هیون چول، لی کیونگ مون، لی چانگ کیو، لی یون تاک، لی سان اوک، جونگ موروی
پوشش های ضد باکتریایی و فرار ایمنی ایمپلنت های ارتوپدی می توانند عفونت ها و پاسخ های ایمنی ناشی از عفونت ها را کاهش دهند.
©2021 انجمن آمریکایی برای پیشرفت علم.تمامی حقوق محفوظ استAAAS شریک HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef و COUNTER است.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.