Pour les patients subissant une chirurgie implantaire orthopédique, les infections bactériennes et les réponses immunitaires induites par les infections ont toujours constitué des risques potentiellement mortels.Les matériaux biologiques conventionnels sont sensibles à la contamination biologique, ce qui provoque l'invasion de bactéries dans la zone blessée et provoque une infection postopératoire.Il existe donc un besoin urgent de développer des revêtements anti-infectieux et immunitaires pour les implants orthopédiques.Ici, nous avons développé une technologie avancée de modification de surface pour les implants orthopédiques appelée Surface d'implant orthopédique lubrifiée (LOIS), qui s'inspire de la surface lisse des pichets de pichet.LOIS a un pouvoir répulsif durable et puissant contre une variété de liquides et de substances biologiques (y compris les cellules, les protéines, le calcium et les bactéries).De plus, nous avons confirmé la durabilité mécanique contre les rayures et la force de fixation en simulant les dommages inévitables lors de la chirurgie in vitro.Le modèle de fracture fémorale inflammatoire de la moelle osseuse du lapin a été utilisé pour étudier en profondeur la capacité anti-biologique et anti-infectieuse du LOIS.Nous envisageons que LOIS, qui possède des propriétés anti-biofouling et une durabilité mécanique, constitue un pas en avant dans la chirurgie orthopédique sans infection.
Aujourd’hui, en raison du vieillissement généralisé, le nombre de patients souffrant de maladies orthopédiques (telles que les fractures chez les personnes âgées, les maladies dégénératives des articulations et l’ostéoporose) a considérablement augmenté (1, 2).Par conséquent, les établissements médicaux attachent une grande importance à la chirurgie orthopédique, y compris aux implants orthopédiques de vis, plaques, clous et articulations artificielles (3, 4).Cependant, il a été rapporté que les implants orthopédiques traditionnels sont sensibles à l'adhésion bactérienne et à la formation de biofilm, ce qui peut provoquer une infection du site opératoire (ISO) après une intervention chirurgicale (5, 6).Une fois le biofilm formé à la surface de l’implant orthopédique, son élimination devient extrêmement difficile, même avec l’utilisation de fortes doses d’antibiotiques.Par conséquent, cela conduit généralement à de graves infections postopératoires (7, 8).En raison des problèmes ci-dessus, le traitement des implants infectés doit inclure une réintervention, y compris le retrait de tous les implants et des tissus environnants ;par conséquent, le patient souffrira d'une douleur intense et de certains risques (9, 10).
Pour résoudre certains de ces problèmes, des implants orthopédiques à élution médicamenteuse ont été développés pour prévenir l'infection en éliminant les bactéries fixées à la surface (11, 12).Cependant, la stratégie présente encore plusieurs limites.Il a été rapporté que l’implantation à long terme d’implants à élution médicamenteuse avait endommagé les tissus environnants et provoqué une inflammation pouvant conduire à une nécrose (13, 14).De plus, les solvants organiques qui peuvent exister après le processus de fabrication des implants orthopédiques à élution médicamenteuse, qui sont strictement interdits par la Food and Drug Administration des États-Unis, nécessitent des étapes de purification supplémentaires pour répondre à ses normes (15).Les implants à élution médicamenteuse sont difficiles à libérer de manière contrôlée et, en raison de leur charge limitée en médicament, une application à long terme du médicament n'est pas réalisable (16).
Une autre stratégie courante consiste à recouvrir l'implant d'un polymère antisalissure pour empêcher les matières biologiques et les bactéries d'adhérer à la surface (17).Par exemple, les polymères zwitterioniques ont attiré l’attention en raison de leurs propriétés non adhésives au contact des protéines plasmatiques, des cellules et des bactéries.Cependant, il présente certaines limites liées à la stabilité à long terme et à la durabilité mécanique, qui entravent son application pratique dans les implants orthopédiques, notamment en raison du grattage mécanique lors des interventions chirurgicales (18, 19).De plus, en raison de leur biocompatibilité élevée, de l’absence de recours à une intervention chirurgicale et de leurs propriétés de nettoyage des surfaces par corrosion, des implants orthopédiques fabriqués à partir de matériaux biodégradables ont été utilisés (20, 21).Lors de la corrosion, les liaisons chimiques entre la matrice polymère sont rompues et détachées de la surface, et les adhérents nettoient la surface.Cependant, l'encrassement antibiologique par nettoyage de surface est efficace dans un court laps de temps.De plus, la plupart des matériaux résorbables, notamment le poly(copolymère acide lactique-acide glycolique) (PLGA), l'acide polylactique (PLA) et les alliages à base de magnésium, subiront une biodégradation et une érosion inégales dans le corps, ce qui affectera négativement la stabilité mécanique.(vingt-deux).De plus, les fragments de plaques biodégradables offrent un espace de fixation aux bactéries, ce qui augmente le risque d'infection à long terme.Ce risque de dégradation mécanique et d'infection limite l'application pratique de la chirurgie plastique (23).
Les surfaces superhydrophobes (SHP) qui imitent la structure hiérarchique des feuilles de lotus sont devenues une solution potentielle pour les surfaces antisalissure (24, 25).Lorsque la surface du SHP est immergée dans un liquide, des bulles d'air seront piégées, formant ainsi des poches d'air et empêchant l'adhésion bactérienne (26).Cependant, des études récentes ont montré que la surface SHP présente des inconvénients liés à la durabilité mécanique et à la stabilité à long terme, ce qui entrave son application dans les implants médicaux.De plus, les poches d'air se dissoudront et perdront leurs propriétés antisalissure, entraînant ainsi une adhésion bactérienne plus large en raison de la grande surface de la surface SHP (27, 28).Récemment, Aizenberg et ses collègues ont introduit une méthode innovante de revêtement de surface anti-biofouling en développant une surface lisse inspirée de la sarracénie Nepenthes (29, 30).La surface lisse présente une stabilité à long terme dans des conditions hydrauliques, est extrêmement répulsive contre les liquides biologiques et possède des propriétés d'auto-réparation.Cependant, il n’existe aucune méthode permettant d’appliquer un revêtement sur un implant médical de forme complexe, et il n’est pas non plus prouvé qu’elle favorise le processus de guérison des tissus endommagés après l’implantation.
Ici, nous introduisons une surface d'implant orthopédique lubrifiée (LOIS), une surface d'implant orthopédique micro/nano-structurée et étroitement associée à une fine couche lubrifiante pour l'empêcher d'être associée à des infections bactériennes de chirurgie plastique, telles que la fixation de fractures.Parce que la structure micro/nano fonctionnalisée au fluor fixe fermement le lubrifiant sur la structure, le LOIS développé peut repousser complètement l'adhérence de divers liquides et maintenir les performances antisalissure pendant une longue période.Les revêtements LOIS peuvent être appliqués sur des matériaux de formes diverses destinés à la synthèse osseuse.Les excellentes propriétés anti-biofouling du LOIS contre les bactéries du biofilm [Pseudomonas aeruginosa et Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARM)] et les substances biologiques (cellules, protéines et calcium) ont été confirmées in vitro.Le taux d'adhérence étendue au substrat est inférieur à 1 %.De plus, même après des contraintes mécaniques telles que des rayures de surface, l'auto-cicatrisation provoquée par le lubrifiant pénétrant aide à maintenir ses propriétés antisalissure.Les résultats des tests de durabilité mécanique montrent que même après modification structurelle et chimique, la résistance totale ne sera pas réduite de manière significative.De plus, une expérience in vitro simulant les contraintes mécaniques dans l'environnement chirurgical a été réalisée pour prouver que LOIS peut résister à diverses contraintes mécaniques qui se produisent lors de la chirurgie plastique.Enfin, nous avons utilisé un modèle de fracture fémorale in vivo chez le lapin, qui a prouvé que LOIS possède des propriétés antibactériennes et une biocompatibilité supérieures.Les résultats radiologiques et histologiques ont confirmé qu'un comportement stable du lubrifiant et des propriétés anti-biofouling dans les 4 semaines suivant l'implantation peuvent permettre d'obtenir des performances anti-infectieuses et immunitaires efficaces sans retarder le processus de guérison osseuse.
La figure 1A montre un diagramme schématique du LOIS développé, qui est implanté avec des structures à micro/nano-échelle dans le modèle de fracture fémorale de lapin pour confirmer ses excellentes propriétés anti-encrassement biologique et anti-infectieuses.Une méthode biomimétique est mise en œuvre pour simuler la surface d'une plante en pot aquatique et pour prévenir l'encrassement biologique en incorporant une couche lubrifiante dans la structure micro/nano de la surface.La surface injectée de lubrifiant peut minimiser le contact entre les substances biologiques et la surface.Par conséquent, en raison de la formation de liaisons chimiques stables sur la surface, il présente d'excellentes performances antisalissure et une stabilité à long terme.En conséquence, les propriétés anti-biofouling de la surface lubrifiante permettent diverses applications pratiques dans la recherche biomédicale.Cependant, des recherches approfondies sur la façon dont cette surface spéciale interagit dans le corps n’ont pas encore été achevées.En comparant LOIS avec des substrats nus in vitro en utilisant de l’albumine et des bactéries biofilm, la non-adhésivité de LOIS peut être confirmée (Figure 1B).De plus, en faisant rouler les gouttelettes d'eau sur le substrat nu incliné et le substrat LOIS (Figure S1 et Film S1), les performances de contamination biologique peuvent être démontrées.Comme le montre l’image au microscope à fluorescence, le substrat exposé incubé dans une suspension de protéines et de bactéries présentait une grande quantité de matériel biologique adhérant à la surface.Cependant, en raison de ses excellentes propriétés anti-biofouling, LOIS ne présente pratiquement aucune fluorescence.Afin de confirmer ses propriétés anti-biofouling et anti-infectieuses, LOIS a été appliqué à la surface d'implants orthopédiques de synthèse osseuse (plaques et vis) et placé dans un modèle de fracture de lapin.Avant l'implantation, l'implant orthopédique nu et le LOIS ont été incubés dans une suspension bactérienne pendant 12 heures.La pré-incubation garantit la formation d'un biofilm sur la surface de l'implant exposé à des fins de comparaison.La figure 1C montre une photo du site de fracture 4 semaines après l'implantation.À gauche, un lapin porteur d’un implant orthopédique nu présentait un niveau d’inflammation sévère dû à la formation d’un biofilm à la surface de l’implant.Le résultat inverse a été observé chez les lapins implantés avec LOIS, c'est-à-dire que les tissus environnants du LOIS ne présentaient ni signes d'infection ni signes d'inflammation.De plus, l'image optique de gauche indique le site chirurgical du lapin avec l'implant exposé, indiquant qu'aucun adhésif multiple présent à la surface de l'implant exposé n'a été trouvé à la surface du LOIS.Cela montre que LOIS a une stabilité à long terme et a la capacité de conserver ses propriétés anti-encrassement biologique et anti-adhérence.
(A) Diagramme schématique du LOIS et de son implantation dans un modèle de fracture fémorale de lapin.(B) Image de microscopie à fluorescence de protéines et de biofilm bactérien sur surface nue et substrat LOIS.4 semaines après l'implantation, (C) une image photographique du site de fracture et (D) une image radiographique (mise en évidence par un rectangle rouge).Image fournie par : Kyomin Chae, Université Yonsei.
Les lapins stérilisés et exposés, implantés négativement, ont montré un processus de guérison osseuse normal sans aucun signe d’inflammation ou d’infection.D’autre part, les implants SHP pré-incubés dans une suspension bactérienne présentent une inflammation des tissus environnants liée à l’infection.Cela peut être attribué à son incapacité à inhiber l’adhésion bactérienne pendant une longue période (Figure S2).Afin de prouver que LOIS n’affecte pas le processus de guérison, mais inhibe d’éventuelles infections liées à l’implantation, des images radiographiques de la matrice positive exposée et du LOIS au site de fracture ont été comparées (Figure 1D).L’image radiographique de l’implant positif nu montrait des lignes d’ostéolyse persistantes, indiquant que l’os n’était pas complètement cicatrisé.Cela suggère que le processus de récupération osseuse peut être considérablement retardé en raison d’une inflammation liée à l’infection.Au contraire, cela a montré que les lapins implantés avec LOIS avaient guéri et ne présentaient aucun site de fracture évident.
Afin de développer des implants médicaux présentant une stabilité et une fonctionnalité à long terme (y compris une résistance à l'encrassement biologique), de nombreux efforts ont été déployés.Cependant, la présence de diverses substances biologiques et la dynamique de l’adhésion tissulaire limitent le développement de méthodes cliniquement fiables.Afin de surmonter ces défauts, nous avons développé une structure micro/nanocouche et une surface chimiquement modifiée, optimisée en raison de la force capillaire élevée et de l'affinité chimique pour conserver au maximum le lubrifiant le plus lisse.La figure 2A montre le processus de fabrication global de LOIS.Tout d’abord, préparez un substrat en acier inoxydable (SS) 304 de qualité médicale.Deuxièmement, la structure micro/nano est formée sur le substrat SS par gravure chimique à l'aide d'une solution d'acide fluorhydrique (HF).Afin de restaurer la résistance à la corrosion du SS, une solution d'acide nitrique (HNO3) (31) est utilisée pour traiter le substrat gravé.La passivation améliore la résistance à la corrosion du substrat SS et ralentit considérablement le processus de corrosion, ce qui peut réduire les performances globales du LOIS.Ensuite, en formant une monocouche auto-assemblée (SAM) avec du 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriéthoxysilane (POTS), la surface est chimiquement modifiée pour améliorer l'interaction chimique entre la surface et le lubrifiant lisse Affinity.La modification de surface réduit considérablement l'énergie de surface de la surface structurée fabriquée à l'échelle micro/nano, qui correspond à l'énergie de surface du lubrifiant lisse.Cela permet au lubrifiant d'être complètement mouillé, formant ainsi une couche lubrifiante stable sur la surface.La surface modifiée présente une hydrophobicité accrue.Les résultats montrent que le lubrifiant glissant présente un comportement stable sur LOIS en raison de la haute affinité chimique et de la force capillaire provoquée par la micro/nano structure (32, 33).Les changements optiques à la surface du SS après modification de la surface et injection de lubrifiant ont été étudiés.La structure micro/nano en couches formée sur la surface peut provoquer des changements visuels et assombrir la surface.Ce phénomène est attribué à l'effet amélioré de diffusion de la lumière sur la surface rugueuse, qui augmente la réflexion diffuse provoquée par le mécanisme de piégeage de la lumière (34).De plus, après l’injection du lubrifiant, le LOIS devient plus foncé.La couche lubrifiante fait que moins de lumière est réfléchie par le substrat, assombrissant ainsi le LOIS.Afin d'optimiser la microstructure/nanostructure afin de montrer le plus petit angle de glissement (SA) pour obtenir des performances anti-biofouling, la microscopie électronique à balayage (MEB) et des paires atomiques ont été utilisées pour effectuer différents temps de gravure HF (0, 3)., 15 et 60 minutes) Microscope de force (AFM) (Figure 2B).Les images SEM et AFM montrent qu'après une courte période de gravure (3 minutes de gravure), le substrat nu a formé une rugosité inégale à l'échelle nanométrique.La rugosité de la surface change avec le temps de gravure (Figure S3).La courbe variable dans le temps montre que la rugosité de la surface continue d'augmenter et atteint un pic à 15 minutes de gravure, puis seule une légère diminution de la valeur de rugosité est observée à 30 minutes de gravure.À ce stade, la rugosité au niveau nanométrique est éliminée, tandis que la rugosité au niveau micro se développe vigoureusement, rendant le changement de rugosité plus stable.Après une gravure de plus de 30 minutes, une nouvelle augmentation de la rugosité est observée, qui s'explique en détail comme suit : le SS est composé d'acier allié à des éléments tels que le fer, le chrome, le nickel, le molybdène et de nombreux autres éléments.Parmi ces éléments, le fer, le chrome et le molybdène jouent un rôle important dans la formation d’une rugosité à l’échelle micronique/nano sur le SS par gravure HF.Aux premiers stades de la corrosion, le fer et le chrome sont principalement corrodés car le molybdène a une résistance à la corrosion plus élevée que le molybdène.Au fur et à mesure que la gravure progresse, la solution de gravure atteint une sursaturation locale, formant des fluorures et des oxydes provoqués par la gravure.Le fluorure et l'oxyde précipitent et finissent par se redéposer sur la surface, formant une rugosité de surface de l'ordre du micron/nano (31).Cette rugosité au niveau micro/nano joue un rôle important dans les propriétés d’auto-guérison du LOIS.La surface à double échelle produit un effet synergique, augmentant considérablement la force capillaire.Ce phénomène permet au lubrifiant de pénétrer de manière stable dans la surface et contribue aux propriétés d'auto-guérison (35).La formation de rugosité dépend du temps de gravure.En moins de 10 minutes de gravure, la surface ne contient qu'une rugosité à l'échelle nanométrique, ce qui n'est pas suffisant pour contenir suffisamment de lubrifiant pour avoir une résistance au biosalissure (36).En revanche, si le temps de gravure dépasse 30 minutes, la rugosité nanométrique formée par le redéposition du fer et du chrome disparaîtra, et seule la rugosité micrométrique restera due au molybdène.La surface sur-gravée manque de rugosité à l'échelle nanométrique et perd l'effet synergique de la rugosité en deux étapes, ce qui affecte négativement les caractéristiques d'auto-guérison du LOIS.Des mesures SA ont été effectuées sur des substrats avec différents temps de gravure pour prouver les performances antisalissure.Différents types de liquides ont été sélectionnés en fonction de leur viscosité et de leur énergie de surface, notamment l'eau désionisée (DI), le sang, l'éthylène glycol (EG), l'éthanol (EtOH) et l'hexadécane (HD) (Figure S4).Le modèle de gravure variable dans le temps montre que pour divers liquides ayant des énergies de surface et des viscosités différentes, le SA de LOIS après 15 minutes de gravure est le plus bas.Par conséquent, LOIS est optimisé pour graver pendant 15 minutes afin de former une rugosité à l'échelle micronique et nanométrique, ce qui convient pour maintenir efficacement la durabilité du lubrifiant et d'excellentes propriétés antisalissure.
(A) Diagramme schématique du processus de fabrication en quatre étapes de LOIS.L'encadré montre le SAM formé sur le substrat.(B) Images SEM et AFM, utilisées pour optimiser la structure micro/nano du substrat sous différents temps de gravure.Spectres de spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) de (C) Cr2p et (D) F1 après passivation de surface et revêtement SAM.au, unité arbitraire.(E) Images représentatives de gouttelettes d’eau sur des substrats nus, gravés, SHP et LOIS.(F) L’angle de contact (CA) et la mesure SA de liquides avec différentes tensions superficielles sur SHP et LOIS.Les données sont exprimées en moyenne ± SD.
Ensuite, afin de confirmer le changement dans les propriétés chimiques de la surface, la spectroscopie photoélectronique à rayons X (XPS) a été utilisée pour étudier le changement dans la composition chimique de la surface du substrat après chaque revêtement de surface.La figure 2C montre les résultats de mesure XPS de la surface gravée par HF et de la surface traitée par HNO 3 .Les deux principaux pics à 587,3 et 577,7 eV peuvent être attribués à la liaison Cr-O existant dans la couche d'oxyde de chrome, qui constitue la principale différence avec la surface gravée HF.Ceci est principalement dû à la consommation de fer et de fluorure de chrome en surface par le HNO3.La gravure à base de HNO3 permet au chrome de former une couche d'oxyde passivant sur la surface, ce qui rend le SS gravé à nouveau résistant à la corrosion.Sur la figure 2D, des spectres XPS ont été obtenus pour confirmer que du silane à base de fluorocarbone s'est formé sur la surface après le revêtement SAM, qui présente un pouvoir répulsif aux liquides extrêmement élevé, même pour l'EG, le sang et l'EtOH.Le revêtement SAM est complété par la réaction de groupes fonctionnels silane avec des groupes hydroxyles formés par traitement plasma.En conséquence, une augmentation significative des pics CF2 et CF3 a été observée.L'énergie de liaison comprise entre 286 et 296 eV indique que la modification chimique a été réalisée avec succès par le revêtement SAM.SHP présente des pics CF2 (290,1 ​​​​eV) et CF3 (293,3 eV) relativement importants, provoqués par le silane à base de fluorocarbone formé à la surface.La figure 2E montre des images optiques représentatives des mesures d’angle de contact (CA) pour différents groupes d’eau déminéralisée en contact avec de l’eau nue, gravée, SHP et LOIS.Ces images montrent que la surface gravée devient hydrophile en raison de la structure micro/nano formée par gravure chimique, de sorte que l'eau déminéralisée est absorbée dans la structure.Cependant, lorsque le substrat est revêtu de SAM, le substrat présente un fort pouvoir hydrofuge, de sorte qu'un SHP de surface se forme et la zone de contact entre l'eau et la surface est petite.Enfin, une diminution du CA a été observée dans LOIS, qui peut être attribuée à la pénétration du lubrifiant dans la microstructure, augmentant ainsi la surface de contact.Afin de prouver que la surface possède d’excellentes propriétés répulsives et non adhésives, le LOIS a été comparé au substrat SHP en mesurant CA et SA à l’aide de divers liquides (figure 2F).Différents types de liquides ont été sélectionnés en fonction de leur viscosité et de leur énergie de surface, notamment l'eau déminéralisée, le sang, l'EG, l'EtOH et le HD (Figure S4).Les résultats des mesures de CA montrent que lorsque CA tend vers HD, la valeur de réduction de CA, où CA a l'énergie de surface la plus faible.De plus, le LOIS de l’ensemble du CA est faible.Cependant, la mesure SA montre un phénomène complètement différent.À l'exception de l'eau ionisée, tous les liquides adhèrent au substrat SHP sans glisser.D'un autre côté, LOIS montre un SA très faible, où lorsque tout le liquide est incliné à un angle inférieur à 10° à 15°, tout le liquide s'écoule.Cela montre clairement que la non-adhésivité de LOIS est meilleure que celle de la surface SHP.De plus, les revêtements LOIS sont également appliqués sur divers types de matériaux, notamment le titane (Ti), le polyphénylsulfone (PPSU), le polyoxyméthylène (POM), le polyéther éther cétone (PEEK) et les polymères bioabsorbables (PLGA). Ce sont des matériaux orthopédiques implantables (Figure S5)).Les images séquentielles des gouttelettes sur le matériau traité par LOIS montrent que les propriétés anti-biofouling de LOIS sont les mêmes sur tous les substrats.De plus, les résultats de mesure de CA et SA montrent que les propriétés non adhésives du LOIS peuvent être appliquées à d'autres matériaux.
Afin de confirmer les propriétés antisalissure du LOIS, différents types de substrats (y compris nus, gravés, SHP et LOIS) ont été incubés avec Pseudomonas aeruginosa et MRSA.Ces deux bactéries ont été sélectionnées comme bactéries hospitalières représentatives, pouvant conduire à la formation de biofilms, conduisant à des SSI (37).La figure 3 (A et B) montre les images au microscope à fluorescence et les résultats de mesure de l’unité formant colonie (CFU) des substrats incubés dans la suspension bactérienne à court terme (12 heures) et à long terme (72 heures), respectivement.En peu de temps, les bactéries formeront des amas et grossiront, se recouvrant de substances ressemblant à du mucus et empêchant leur élimination.Cependant, au cours des 72 heures d’incubation, les bactéries mûriront et deviendront faciles à disperser pour former davantage de colonies ou de groupes.Par conséquent, on peut considérer qu’une incubation de 72 heures est une durée d’incubation à long terme et constitue la durée d’incubation appropriée pour former un biofilm solide à la surface (38).En peu de temps, la surface gravée et la surface du SHP ont présenté une adhésion bactérienne, qui a été réduite d'environ 25 % à 50 % par rapport au substrat nu.Cependant, en raison de ses excellentes performances anti-biofouling et de sa stabilité, LOIS n’a pas montré d’adhésion de biofilm bactérien à court et à long terme.Le diagramme schématique (Figure 3C) décrit l’explication du mécanisme d’encrassement anti-biologique de la solution de gravure, SHP et LOIS.L’hypothèse est que le substrat gravé ayant des propriétés hydrophiles aura une plus grande surface que le substrat nu.Par conséquent, une plus grande adhérence bactérienne se produira sur le substrat gravé.Cependant, par rapport au substrat nu, le substrat gravé présente beaucoup moins de biofilm formé à la surface.En effet, les molécules d’eau se lient fermement à la surface hydrophile et agissent comme un lubrifiant pour l’eau, interférant ainsi à court terme avec l’adhésion des bactéries (39).Cependant, la couche de molécules d’eau est très fine et soluble dans les suspensions bactériennes.Par conséquent, la couche moléculaire de l’eau disparaît pendant une longue période, entraînant une adhésion et une prolifération bactérienne étendues.Pour le SHP, en raison de ses propriétés non mouillantes à court terme, l’adhésion bactérienne est inhibée.L'adhésion bactérienne réduite peut être attribuée aux poches d'air emprisonnées dans la structure en couches et à une énergie de surface plus faible, minimisant ainsi le contact entre la suspension bactérienne et la surface.Cependant, une adhésion bactérienne importante a été observée dans le SHP car il a perdu ses propriétés antisalissure pendant une longue période.Ceci est dû principalement à la disparition des poches d’air dues à la pression hydrostatique et à la dissolution de l’air dans l’eau.Ceci est principalement dû à la disparition des poches d'air due à la dissolution et à la structure en couches qui offre une plus grande surface d'adhésion (27, 40).Contrairement à ces deux substrats qui ont un effet important sur la stabilité à long terme, le lubrifiant lubrifiant contenu dans LOIS est injecté dans la micro/nano structure et ne disparaîtra pas même à long terme.Les lubrifiants chargés de micro/nanostructures sont très stables et sont fortement attirés par la surface en raison de leur haute affinité chimique, empêchant ainsi pendant longtemps l'adhésion bactérienne.La figure S6 montre une image au microscope confocal à réflexion d'un substrat infusé de lubrifiant immergé dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).Des images continues montrent que même après 120 heures de légères secousses (120 tr/min), la couche lubrifiante sur le LOIS reste inchangée, indiquant une stabilité à long terme dans des conditions d'écoulement.Cela est dû à la grande affinité chimique entre le revêtement SAM à base de fluor et le lubrifiant à base de perfluorocarbone, de sorte qu'une couche lubrifiante stable peut être formée.Par conséquent, les performances antisalissure sont maintenues.De plus, le substrat a été testé contre des protéines représentatives (albumine et fibrinogène) présentes dans le plasma, des cellules étroitement liées à la fonction immunitaire (macrophages et fibroblastes) et celles liées à la formation osseuse.La teneur en calcium est très élevée.(Figure 3D, 1 et 2 et figure S7) (41, 42).De plus, les images au microscope à fluorescence du test d'adhésion pour le fibrinogène, l'albumine et le calcium ont montré différentes caractéristiques d'adhésion de chaque groupe de substrat (Figure S8).Au cours de la formation osseuse, des couches d'os et de calcium nouvellement formées peuvent entourer l'implant orthopédique, ce qui non seulement rend le retrait difficile, mais peut également causer des dommages inattendus au patient pendant le processus de retrait.Par conséquent, de faibles niveaux de dépôts de calcium sur les plaques osseuses et les vis sont bénéfiques pour la chirurgie orthopédique nécessitant le retrait des implants.Sur la base de la quantification de la zone attachée basée sur l'intensité de fluorescence et le nombre de cellules, nous avons confirmé que LOIS présente d'excellentes propriétés anti-biofouling pour toutes les substances biologiques par rapport à d'autres substrats.Selon les résultats d'expériences in vitro, l'anti-encrassement biologique LOIS peut être appliqué aux implants orthopédiques, ce qui peut non seulement inhiber les infections causées par les bactéries du biofilm, mais également réduire l'inflammation provoquée par le système immunitaire actif du corps.
(A) Images au microscope à fluorescence de chaque groupe (nu, gravé, SHP et LOIS) incubées dans des suspensions de Pseudomonas aeruginosa et de SARM pendant 12 et 72 heures.(B) Le nombre d’UFC adhérentes de Pseudomonas aeruginosa et de SARM à la surface de chaque groupe.(C) Diagramme schématique du mécanisme d’encrassement antibiologique de la gravure à court et à long terme, SHP et LOIS.(D) (1) Le nombre de fibroblastes adhérés à chaque substrat et les images au microscope à fluorescence des cellules adhérées au nu et au LOIS.(2) Test d'adhésion des protéines d'origine immunitaire, de l'albumine et du calcium impliquées dans le processus de cicatrisation osseuse (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 et **** P <0,0001).ns, pas important.
Dans le cas de contraintes concentrées inévitables, la durabilité mécanique a toujours été le principal défi pour l’application de revêtements antifouling.Les méthodes traditionnelles de gel anti-eaux usées sont basées sur des polymères à faible solubilité dans l’eau et fragilité.Par conséquent, ils sont généralement sensibles aux contraintes mécaniques dans les applications biomédicales.Par conséquent, les revêtements antisalissure mécaniquement durables restent un défi pour des applications telles que les implants orthopédiques (43, 44).La figure 4A (1) montre les deux principaux types de contraintes appliquées aux implants orthopédiques, notamment le grattage (contrainte de cisaillement) et la compression avec l'image optique de l'implant endommagé produite par la pince.Par exemple, lorsque la vis est serrée avec un tournevis, ou lorsque le chirurgien maintient fermement la plaque osseuse avec une pince à épiler et applique une force de compression, la plaque osseuse en plastique sera endommagée et rayée à la fois aux échelles macro et micro/nano (Figure 4A, 2) .Afin de tester si le LOIS fabriqué peut résister à ces dommages lors de la chirurgie plastique, une nanoindentation a été réalisée pour comparer la dureté du substrat nu et le LOIS à l'échelle micro/nano afin d'étudier les propriétés mécaniques de la structure micro/nano. Impact (Figure 4B).Le diagramme schématique montre les différents comportements de déformation du LOIS en raison de la présence de micro/nano structures.Une courbe force-déplacement a été tracée sur la base des résultats de la nanoindentation (Figure 4C).L'image bleue représente le substrat nu, qui ne présente qu'une légère déformation, comme le montre la profondeur d'indentation maximale de 0,26 µm.D'autre part, l'augmentation progressive de la force de nanoindentation et du déplacement observés dans LOIS (courbe rouge) peut montrer des signes de propriétés mécaniques réduites, entraînant une profondeur de nanoindentation de 1,61 μm.En effet, la structure micro/nano présente dans le LOIS offre un espace d'avancement plus profond pour la pointe du nanoindenteur, de sorte que sa déformation est supérieure à celle du substrat nu.Konsta-Gdoutos et al.(45) estime qu'en raison de la présence de nanostructures, la nanoindentation et la micro/nano rugosité conduisent à des courbes de nanoindentation irrégulières.La zone grisée correspond à la courbe de déformation irrégulière attribuée à la nanostructure, tandis que la zone non grisée est attribuée à la microstructure.Cette déformation peut endommager la microstructure/nanostructure du lubrifiant de maintien et affecter négativement ses performances antisalissure.Afin d'étudier l'impact des dommages sur le LOIS, les dommages inévitables aux micro/nano structures ont été reproduits dans le corps lors de la chirurgie plastique.En utilisant des tests d’adhésion sanguine et protéique, la stabilité des propriétés anti-biofouling du LOIS après in vitro peut être déterminée (Figure 4D).Une série d'images optiques montre les dommages survenus à proximité des trous de chaque substrat.Un test d’adhésion sanguine a été réalisé pour démontrer l’effet des dommages mécaniques sur le revêtement anti-biofouling (Figure 4E).Comme le SHP, les propriétés antisalissure sont perdues en raison des dommages, et LOIS présente d'excellentes propriétés antisalissure en repoussant le sang.En effet, l'énergie de surface étant entraînée par l'action capillaire recouvrant la zone endommagée, l'écoulement dans le lubrifiant microstructuré restaure les propriétés antisalissure (35).La même tendance a été observée dans le test d’adhésion des protéines utilisant l’albumine.Dans la zone endommagée, l’adhésion des protéines à la surface du SHP est largement observée et, en mesurant sa couverture, elle peut être quantifiée comme la moitié du niveau d’adhésion du substrat nu.D’autre part, LOIS a conservé ses propriétés anti-biofouling sans provoquer d’adhésion (Figure 4, F et G).De plus, la surface de la vis est souvent soumise à de fortes contraintes mécaniques, comme le perçage, nous avons donc étudié la capacité du revêtement LOIS à rester intact sur la vis in vitro.La figure 4H montre des images optiques de différentes vis, y compris nues, SHP et LOIS.Le rectangle rouge représente la zone cible où se produisent de fortes contraintes mécaniques lors de l'implantation osseuse.Semblable au test d’adhésion protéique de la plaque, un microscope à fluorescence est utilisé pour imager l’adhésion protéique et mesurer la zone de couverture afin de prouver l’intégrité du revêtement LOIS, même sous forte contrainte mécanique (Figure 4, I et J).Les vis traitées LOIS présentent d'excellentes performances antisalissure et presque aucune protéine n'adhère à la surface.D'autre part, l'adhésion des protéines a été observée dans les vis nues et les vis SHP, où la zone de couverture des vis SHP était un tiers de celle des vis nues.De plus, l’implant orthopédique utilisé pour la fixation doit être mécaniquement solide pour résister aux contraintes appliquées au site de fracture, comme le montre la figure 4K.Par conséquent, un test de flexion a été réalisé pour déterminer l’effet de la modification chimique sur les propriétés mécaniques.De plus, cela est fait pour maintenir la contrainte fixe de l'implant.Appliquer une force mécanique verticale jusqu’à ce que l’implant soit complètement plié et qu’une courbe contrainte-déformation soit obtenue (Figure 4L, 1).Deux propriétés, dont le module d'Young et la résistance à la flexion, ont été comparées entre les substrats nus et LOIS comme indicateurs de leur résistance mécanique (Figure 4L, 2 et 3).Le module d'Young indique la capacité d'un matériau à résister aux changements mécaniques.Le module d'Young de chaque substrat est respectivement de 41,48 ± 1,01 et 40,06 ± 0,96 GPa ;la différence observée est d'environ 3,4 %.De plus, il est rapporté que la résistance à la flexion, qui détermine la ténacité du matériau, est de 102,34 ± 1,51 GPa pour le substrat nu et de 96,99 ± 0,86 GPa pour le SHP.Le substrat nu est environ 5,3 % plus haut.La légère diminution des propriétés mécaniques peut être provoquée par l'effet d'entaille.Dans l'effet d'entaille, la micro/nano rugosité peut agir comme un ensemble d'encoches, conduisant à une concentration locale de contraintes et affectant les propriétés mécaniques de l'implant (46).Cependant, sur la base du fait que la rigidité de l'os cortical humain est comprise entre 7,4 et 31,6 GPa et que le module LOIS mesuré dépasse celui de l'os cortical humain (47), le LOIS est suffisant pour supporter la fracture et son ensemble. les propriétés mécaniques sont peu affectées par la modification de la surface.
(A) Diagramme schématique de (1) la contrainte mécanique appliquée à l’implant orthopédique pendant l’opération, et (2) l’image optique de l’implant orthopédique endommagé.(B) Diagramme schématique de la mesure des propriétés nanomécaniques par nanoindentation et LOIS sur la surface nue.(C) Courbe force-déplacement de nanoindentation de la surface nue et LOIS.(D) Après des expériences in vitro, simulez les images optiques de différents types de plaques orthopédiques (la zone endommagée est mise en évidence par un rectangle rouge) pour simuler le stress mécanique provoqué lors de l’opération.(E) Test d’adhésion sanguine et (F) Test d’adhésion protéique du groupe de plaques orthopédiques endommagées.(G) Mesurer la zone de couverture de la protéine adhérant à la plaque.(H) Images optiques de différents types de vis orthopédiques après l’expérience in vitro.(I) Test d’adhésion des protéines pour étudier l’intégrité des différents revêtements.(J) Mesurez la zone de couverture de la protéine adhérant à la vis.(K) Le mouvement du lapin est destiné à générer une contrainte fixe sur l'os fracturé.(L) (1) Résultats des tests de pliage et images optiques avant et après pliage.La différence de (2) module de Young et (3) résistance à la flexion entre l'implant nu et le SHP.Les données sont exprimées en moyenne ± SD (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 et **** P <0,0001).Image fournie par : Kyomin Chae, Université Yonsei.
Dans les situations cliniques, la plupart des contacts bactériens avec du matériel biologique et des sites de plaies proviennent de biofilms matures et matures (48).Ainsi, les Centers for Disease Control and Prevention des États-Unis estiment que 65 % de toutes les infections humaines sont liées aux biofilms (49).Dans ce cas, il est nécessaire de proposer un modèle expérimental in vivo permettant une formation cohérente de biofilm à la surface de l’implant.Par conséquent, nous avons développé un modèle de fracture fémorale de lapin dans lequel des implants orthopédiques ont été pré-incubés dans une suspension bactérienne puis implantés dans des fémurs de lapin pour étudier les propriétés antisalissure du LOIS in vivo.En raison des trois faits importants suivants, les infections bactériennes sont induites par pré-culture plutôt que par injection directe de suspensions bactériennes : (i) Le système immunitaire des lapins est naturellement plus fort que celui des humains ;l'injection de suspensions bactériennes et de bactéries planctoniques est donc possible. Elle n'a aucun effet sur la formation de biofilms.(Ii) Les bactéries planctoniques sont plus sensibles aux antibiotiques, et les antibiotiques sont généralement utilisés après une intervention chirurgicale ;enfin, (iii) la suspension de bactéries planctoniques peut être diluée par les fluides corporels de l'animal (50).En pré-cultivant l'implant dans une suspension bactérienne avant l'implantation, nous pouvons étudier en profondeur les effets nocifs de l'infection bactérienne et de la réaction à un corps étranger (FBR) sur le processus de cicatrisation osseuse.Les lapins ont été sacrifiés 4 semaines après l'implantation, car l'ostéointégration indispensable au processus de cicatrisation osseuse sera achevée en 4 semaines.Ensuite, les implants ont été retirés des lapins pour des études en aval.La figure 5A montre le mécanisme de prolifération des bactéries.L'implant orthopédique infecté est introduit dans le corps.À la suite de la pré-incubation en suspension bactérienne, six des six lapins implantés avec des implants nus ont été infectés, alors qu'aucun des lapins implantés avec des implants traités au LOIS n'a été infecté.Les infections bactériennes se déroulent en trois étapes, à savoir la croissance, la maturation et la dispersion (51).Tout d’abord, les bactéries attachées se reproduisent et se développent à la surface, puis elles forment un biofilm lorsqu’elles excrètent du polymère extracellulaire (EPS), de l’amyloïde et de l’ADN extracellulaire.Le biofilm interfère non seulement avec la pénétration des antibiotiques, mais favorise également l’accumulation d’enzymes dégradant les antibiotiques (telles que la β-lactamase) (52).Enfin, le biofilm propage les bactéries matures dans les tissus environnants.Une infection se produit donc.De plus, lorsqu’un corps étranger pénètre dans l’organisme, une infection pouvant provoquer une forte réponse immunitaire peut provoquer une inflammation grave, des douleurs et une diminution de l’immunité.La figure 5B donne un aperçu du FBR provoqué par l'insertion d'un implant orthopédique, plutôt que de la réponse immunitaire provoquée par une infection bactérienne.Le système immunitaire reconnaît l’implant inséré comme un corps étranger, puis fait réagir les cellules et les tissus pour encapsuler le corps étranger (53).Au début du FBR, une matrice d’approvisionnement se formait à la surface des implants orthopédiques, ce qui entraînait l’adsorption du fibrinogène.Le fibrinogène adsorbé forme alors un réseau de fibrine très dense, qui favorise la fixation des leucocytes (54).Une fois le réseau de fibrine formé, une inflammation aiguë se produira en raison de l’infiltration de neutrophiles.Au cours de cette étape, diverses cytokines telles que le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α), l'interleukine-4 (IL-4) et l'IL-β sont libérées, et les monocytes commencent à infiltrer le site d'implantation et à se différencier en cellules géantes.Phages (41, 55, 56).La réduction du FBR a toujours été un défi, car un excès de FBR peut provoquer une inflammation aiguë et chronique, pouvant entraîner des complications mortelles.Afin d'évaluer l'impact des infections bactériennes dans les tissus entourant l'implant nu et le LOIS, une coloration à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) et au trichrome de Masson (MT) a été utilisée.Pour les lapins implantés avec des substrats nus, de graves infections bactériennes ont progressé et les lames de tissus H&E ont clairement montré des abcès et des nécroses provoqués par une inflammation.D’autre part, la surface anti-biofouling extrêmement puissante LOIS inhibe l’adhésion bactérienne, elle ne montre donc aucun signe d’infection et réduit l’inflammation (Figure 5C).Les résultats de la coloration MT ont montré la même tendance.Cependant, la coloration MT a également montré un œdème chez les lapins implantés avec LOIS, indiquant que la récupération est sur le point de se produire (Figure 5D).Afin d'étudier le degré de réponse immunitaire, une coloration immunohistochimique (IHC) a été réalisée à l'aide des cytokines TNF-α et IL-6 liées à la réponse immunitaire.Un implant nu négatif qui n’a pas été exposé à des bactéries a été comparé à un LOIS qui a été exposé à des bactéries mais non infecté pour étudier le processus de guérison en l’absence d’infection bactérienne.La figure 5E montre une image optique d'une lame IHC qui exprime le TNF-α.La zone brune représente la réponse immunitaire, indiquant que la réponse immunitaire dans LOIS est légèrement réduite.De plus, l'expression de l'IL-6 dans LOIS était significativement inférieure à l'expression négative de nu stérile (Figure 5F).L'expression de la cytokine a été quantifiée en mesurant la zone de coloration des anticorps correspondant à la cytokine (Figure 5G).Comparés aux lapins exposés aux implants négatifs, les niveaux d’expression des lapins implantés avec LOIS étaient plus faibles, montrant une différence significative.La diminution de l'expression des cytokines indique que les propriétés antisalissure stables à long terme du LOIS ne sont pas seulement liées à l'inhibition des infections bactériennes, mais également à la diminution du FBR, induit par les macrophages adhérant au substrat (53, 57, 58).Par conséquent, la réponse immunitaire réduite due aux propriétés d’évasion immunitaire du LOIS peut résoudre les effets secondaires après l’implantation, tels qu’une réponse immunitaire excessive après une chirurgie plastique.
(A) Un diagramme schématique du mécanisme de formation et de propagation du biofilm à la surface d’un implant orthopédique infecté.ADNe, ADN extracellulaire.(B) Diagramme schématique de la réponse immunitaire après l’insertion d’un implant orthopédique.(C) Coloration H&E et (D) Coloration MT des tissus environnants des implants orthopédiques avec positif nu et LOIS.Les IHC des cytokines liées au système immunitaire (E) TNF-α et (F) IL-6 sont des images colorées de lapins nus négatifs et implantés par LOIS.(G) Quantification de l’expression des cytokines par mesure de la couverture de zone (** P <0,01).
La biocompatibilité du LOIS et son effet sur le processus de guérison osseuse ont été examinés in vivo à l'aide d'imagerie diagnostique [rayons X et tomodensitométrie (CT)] et d'ostéoclastes IHC.La figure 6A montre le processus de guérison osseuse impliquant trois étapes différentes : inflammation, réparation et remodelage.Lorsqu’une fracture survient, les cellules inflammatoires et les fibroblastes pénètrent dans l’os fracturé et commencent à se développer dans le tissu vasculaire.Pendant la phase de réparation, la croissance interne du tissu vasculaire se propage à proximité du site de fracture.Le tissu vasculaire fournit des nutriments nécessaires à la formation de nouveaux os, appelés cals.La dernière étape du processus de guérison osseuse est l’étape de remodelage, au cours de laquelle la taille du cal est réduite à la taille d’un os normal grâce à une augmentation du niveau d’ostéoclastes activés (59).Une reconstruction tridimensionnelle (3D) du site de fracture a été réalisée à l'aide de micro-tomodensitométries pour observer les différences dans le niveau de formation de callosités dans chaque groupe.Observez la coupe transversale du fémur pour observer l’épaisseur du cal entourant l’os fracturé (Figure 6, B et C).Des radiographies ont également été utilisées chaque semaine pour examiner les sites de fracture de tous les groupes afin d'observer les différents processus de régénération osseuse dans chaque groupe (Figure S9).Les callosités et les os matures sont représentés respectivement en bleu/vert et ivoire.La plupart des tissus mous sont filtrés avec un seuil prédéfini.Nude positif et SHP ont confirmé la formation d’une petite quantité de cals autour du site de fracture.En revanche, le négatif exposé du LOIS et le site de fracture sont entourés de cals épais.Les images micro-CT ont montré que la formation de callosités était entravée par une infection bactérienne et une inflammation liée à l’infection.En effet, le système immunitaire donne la priorité à la guérison des lésions septiques causées par une inflammation liée à une infection plutôt qu’à la récupération osseuse (60).Une coloration IHC et à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) a été réalisée pour observer l'activité des ostéoclastes et la résorption osseuse (Figure 6D) (61).Seuls quelques ostéoclastes activés colorés en violet ont été trouvés dans les positifs nus et les SHP.En revanche, de nombreux ostéoclastes activés ont été observés à proximité des os nus positifs et matures du LOIS.Ce phénomène indique qu'en présence d'ostéoclastes, le cal autour du site de fracture subit un violent processus de remodelage (62).Le volume osseux et la zone d'expression des ostéoclastes du cal ont été mesurés pour comparer le niveau de formation de cals autour du site de fracture dans tous les groupes, de manière à quantifier les résultats du micro-CT scan et de l'IHC (Figure 6E, 1 et 2).Comme prévu, les négatifs nus et la formation de cals dans LOIS étaient significativement plus élevés que dans les autres groupes, indiquant qu'un remodelage osseux positif s'est produit (63).La figure S10 montre l'image optique du site chirurgical, le résultat de la coloration MT du tissu collecté près de la vis et le résultat de la coloration TRAP mettant en évidence l'interface vis-os.Dans le substrat nu, une forte formation de cals et de fibrose a été observée, tandis que l'implant traité par LOIS présentait une surface relativement peu adhérente.De même, par rapport aux négatifs nus, une fibrose plus faible a été observée chez les lapins implantés avec LOIS, comme l'indiquent les flèches blanches.De plus, l’œdème ferme (flèche bleue) peut être attribué aux propriétés d’évasion immunitaire du LOIS, réduisant ainsi l’inflammation sévère.La surface antiadhésive autour de l'implant et la fibrose réduite suggèrent que le processus de retrait est plus facile, ce qui entraîne généralement d'autres fractures ou inflammations.Le processus de cicatrisation osseuse après retrait des vis a été évalué par l’activité des ostéoclastes à l’interface vis-os.L'os nu et l'interface de l'implant LOIS ont absorbé des niveaux similaires d'ostéoclastes pour favoriser la cicatrisation osseuse, ce qui indique que le revêtement LOIS n'a aucun effet négatif sur la cicatrisation osseuse ou la réponse immunitaire.Afin de confirmer que la modification de surface effectuée sur le LOIS n'interfère pas avec le processus de guérison osseuse, un examen aux rayons X a été utilisé pour comparer la guérison osseuse des lapins avec des ions négatifs exposés et 6 semaines d'implantation du LOIS (Figure 6F).Les résultats ont montré que par rapport au groupe nu positif non infecté, LOIS présentait le même degré de cicatrisation osseuse et il n'y avait aucun signe évident de fracture (ligne d'ostéolyse continue) dans les deux groupes.
(A) Diagramme schématique du processus de guérison osseuse après fracture.(B) La différence dans le degré de formation de cals de chaque groupe de surface et (C) l’image en coupe transversale du site de fracture.(D) Coloration TRAP pour visualiser l’activité des ostéoclastes et la résorption osseuse.Sur la base de l'activité TRAP, la formation de cals externes de l'os cortical a été analysée quantitativement par (E) (1) micro-CT et (2) activité des ostéoclastes.(F) 6 semaines après l'implantation, images radiographiques de l'os fracturé du négatif exposé (mis en évidence par le rectangle en pointillés rouges) et LOIS (mis en évidence par le rectangle en pointillés bleu).L'analyse statistique a été réalisée par analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA).*P<0,05.** P <0,01.
En bref, LOIS propose un nouveau type de stratégie d’infection antibactérienne et un revêtement d’échappement immunitaire pour les implants orthopédiques.Les implants orthopédiques conventionnels avec fonctionnalisation SHP présentent des propriétés anti-biofouling à court terme, mais ne peuvent pas conserver leurs propriétés pendant une longue période.La superhydrophobie du substrat emprisonne les bulles d'air entre les bactéries et le substrat, formant ainsi des poches d'air, empêchant ainsi l'infection bactérienne.Cependant, du fait de la diffusion de l’air, ces poches d’air s’éliminent facilement.D’un autre côté, LOIS a bien prouvé sa capacité à prévenir les infections liées aux biofilms.Par conséquent, grâce aux propriétés anti-rejet de la couche lubrifiante injectée dans la surface de la micro/nanostructure en couches, l’inflammation liée à l’infection peut être évitée.Diverses méthodes de caractérisation, notamment les mesures SEM, AFM, XPS et CA, sont utilisées pour optimiser les conditions de fabrication du LOIS.De plus, LOIS peut également être appliqué à divers matériaux biologiques couramment utilisés dans les équipements de fixation orthopédique, tels que le PLGA, le Ti, le PE, le POM et le PPSU.Ensuite, LOIS a été testé in vitro pour prouver ses propriétés anti-biofouling contre les bactéries et les substances biologiques liées à la réponse immunitaire.Les résultats montrent qu’il présente d’excellents effets antibactériens et anti-biofouling par rapport à l’implant nu.De plus, LOIS présente une résistance mécanique même après application d'une contrainte mécanique, ce qui est inévitable en chirurgie plastique.Grâce aux propriétés auto-cicatrisantes du lubrifiant à la surface de la micro/nano structure, LOIS a réussi à conserver ses propriétés anti-encrassement biologiques.Afin d'étudier la biocompatibilité et les propriétés antibactériennes du LOIS in vivo, LOIS a été implanté dans du fémur de lapin pendant 4 semaines.Aucune infection bactérienne n’a été observée chez les lapins implantés avec LOIS.De plus, l’utilisation de l’IHC a démontré un niveau réduit de réponse immunitaire locale, indiquant que LOIS n’inhibe pas le processus de guérison osseuse.LOIS présente d'excellentes propriétés antibactériennes et d'évasion immunitaire et il a été prouvé qu'il prévient efficacement la formation de biofilm avant et pendant la chirurgie orthopédique, en particulier pour la synthèse osseuse.En utilisant un modèle de fracture fémorale inflammatoire de la moelle osseuse de lapin, l’effet des infections liées au biofilm sur le processus de cicatrisation osseuse induit par des implants pré-incubés a été étudié en profondeur.En tant qu'étude future, un nouveau modèle in vivo est nécessaire pour étudier les infections possibles après l'implantation afin de bien comprendre et prévenir les infections liées au biofilm pendant tout le processus de guérison.De plus, l’ostéoinduction reste un défi non résolu en matière d’intégration avec LOIS.Des recherches supplémentaires sont nécessaires pour combiner l’adhésion sélective des cellules ostéoinductives ou la médecine régénérative avec LOIS afin de relever ce défi.Dans l’ensemble, LOIS représente un revêtement d’implant orthopédique prometteur doté d’une robustesse mécanique et d’excellentes propriétés anti-biofouling, qui peuvent réduire les effets secondaires SSI et immunitaires.
Lavez le substrat 304 SS de 15 mm x 15 mm x 1 mm (Dong Kang M-Tech Co., Corée) dans de l'acétone, de l'EtOH et de l'eau DI pendant 15 minutes pour éliminer les contaminants.Afin de former une structure micro/nano sur la surface, le substrat nettoyé est immergé dans une solution de 48 % à 51 % de HF (DUKSAN Corp., Corée du Sud) à 50°C.Le temps de gravure varie de 0 à 60 minutes.Ensuite, le substrat gravé a été nettoyé avec de l'eau déionisée et placé dans une solution à 65 % de HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) à 50 °C pendant 30 minutes pour former une couche de passivation d'oxyde de chrome sur la surface.Après passivation, le substrat est lavé avec de l'eau déminéralisée et séché pour obtenir un substrat à structure en couches.Ensuite, le substrat a été exposé à un plasma d'oxygène (100 W, 3 minutes) et immédiatement immergé dans une solution de POTS à 8, 88 mM (Sigma-Aldrich, Allemagne) dans du toluène à température ambiante pendant 12 heures.Ensuite, le substrat recouvert de POTS a été nettoyé avec EtOH et recuit à 150 ° C pendant 2 heures pour obtenir un POTS SAM dense.Après revêtement SAM, une couche lubrifiante a été formée sur le substrat en appliquant un lubrifiant perfluoropolyéther (Krytox 101 ; DuPont, USA) avec un volume de chargement de 20 µm/cm2. Avant utilisation, filtrer le lubrifiant à travers un filtre de 0,2 micron.Retirez l'excès de lubrifiant en l'inclinant à un angle de 45° pendant 15 minutes.Le même procédé de fabrication a été utilisé pour les implants orthopédiques en acier inoxydable 304 (plaque de verrouillage et vis de verrouillage corticale ; Dong Kang M-Tech Co., Corée).Tous les implants orthopédiques sont conçus pour s'adapter à la géométrie du fémur du lapin.
La morphologie de surface du substrat et des implants orthopédiques a été inspectée par SEM à émission de champ (Inspect F50, FEI, USA) et AFM (XE-100, Park Systems, Corée du Sud).La rugosité de surface (Ra, Rq) est mesurée en multipliant l'aire de 20 μm par 20 μm (n=4).Un système XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japon) équipé d'une source de rayons X Al Kα avec une taille de spot de 100 μm2 a été utilisé pour analyser la composition chimique de la surface.Un système de mesure CA équipé d'une caméra de capture d'image dynamique (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​​​Corée du Sud) a été utilisé pour mesurer le CA et le SA liquides.Pour chaque mesure, 6 à 10 µl de gouttelettes (eau déminéralisée, sang de cheval, EG, éthanol 30% et HD) sont déposés sur la surface pour mesurer le CA.Lorsque l'angle d'inclinaison du substrat augmente à une vitesse de 2°/s (n = 4), le SA est mesuré à la chute de la gouttelette.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] et le SARM (ATCC 25923) ont été achetés auprès de l'ATCC (Manassas, Virginie, USA), et la culture mère a été maintenue à -80°C.Avant utilisation, la culture congelée a été incubée dans un bouillon de soja décongelé à la trypsine (Komed, Corée) à 37 ° C pendant 18 heures, puis transférée deux fois pour l'activer.Après incubation, la culture a été centrifugée à 10 000 tr/min pendant 10 minutes à 4°C et lavée deux fois avec une solution de PBS (pH 7,3).La culture centrifugée est ensuite repiquée sur des plaques de gélose au sang (BAP).Le SARM et Pseudomonas aeruginosa ont été préparés pendant la nuit et cultivés dans un bouillon Luria-Bertani.La concentration de Pseudomonas aeruginosa et de SARM dans l'inoculum a été déterminée quantitativement par les UFC de la suspension dans des dilutions en série sur gélose.Ensuite, ajustez la concentration bactérienne à 0,5 norme McFarland, ce qui équivaut à 108 CFU/ml.Diluer ensuite la suspension bactérienne de travail 100 fois jusqu'à 106 UFC/ml.Pour tester les propriétés d'adhésion antibactériennes, le substrat a été stérilisé à 121°C pendant 15 minutes avant utilisation.Le substrat a ensuite été transféré dans 25 ml de suspension bactérienne et incubé à 37°C sous agitation vigoureuse (200 tr/min) pendant 12 et 72 heures.Après incubation, chaque substrat a été retiré de l'incubateur et lavé 3 fois avec du PBS pour éliminer toute bactérie flottante à la surface.Afin d'observer le biofilm sur le substrat, le biofilm a été fixé avec du méthanol et coloré avec 1 ml d'orange de crimidine pendant 2 minutes.Ensuite, un microscope à fluorescence (BX51TR, Olympus, Japon) a été utilisé pour prendre des photos du biofilm coloré.Afin de quantifier le biofilm sur le substrat, les cellules attachées ont été séparées du substrat par la méthode du vortex de billes, qui a été considérée comme la méthode la plus appropriée pour éliminer les bactéries attachées (n = 4).À l’aide de pinces stériles, retirez le substrat du milieu de croissance et tapotez la plaque à puits pour éliminer l’excès de liquide.Les cellules faiblement attachées ont été éliminées par lavage deux fois avec du PBS stérile.Chaque substrat a ensuite été transféré dans un tube à essai stérile contenant 9 ml de solution saline protéique à 0,1% (PSW) et 2 g de 20 à 25 billes de verre stériles (0,4 à 0,5 mm de diamètre).Il a ensuite été vortexé pendant 3 minutes pour détacher les cellules de l'échantillon.Après agitation au vortex, la suspension a été diluée en série 10 fois avec 0,1% de PSW, puis 0,1 ml de chaque dilution a été inoculée sur du BAP.Après 24 heures d'incubation à 37°C, les CFU ont été comptées manuellement.
Pour les cellules, des fibroblastes de souris NIH/3T3 (CRL-1658 ; American ATCC) et des macrophages de souris RAW 264.7 (TIB-71 ; American ATCC) ont été utilisés.Utilisez le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM ; LM001-05, Welgene, Corée) pour cultiver des fibroblastes de souris et complétez avec 10 % de sérum de veau (S103-01, Welgene) et 1 % de pénicilline-streptomycine (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene ). Utilisez du DMEM pour cultiver des macrophages de souris, complété par 10 % de sérum bovin fœtal (S001-01, Welgene) et 1 % de PS. Placez le substrat dans une plaque de culture cellulaire à six puits et inoculez les cellules à 105 cellules/cm2. Les cellules ont été incubées pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO2. Pour la coloration cellulaire, les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 minutes et placées dans du Triton X Incubate à 0,5% pendant 5 minutes à -100 °C. à 37 ° C pendant 30 minutes. Après le processus d'incubation, utilisez le substrat avec le milieu de fixation 4′, 6-diamino-2-phénylindole (H -1200, Vector Laboratories, UK) (n = 4 par cellule). , fluorescéine, isothiocyanate-albumine de fluorescéine (A9771, Sigma-Aldrich, Allemagne) et plasma humain. Le fibrinogène conjugué Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, USA) a été dissous dans du PBS (10 mM, pH 7,4).Les concentrations d'albumine et de fibrinogène étaient respectivement de 1 et 150 µg/ml.Après le substrat Avant de les plonger dans la solution protéique, les rincer au PBS pour réhydrater la surface.Plongez ensuite tous les substrats dans une plaque six puits contenant la solution protéique et incubez à 37°C pendant 30 et 90 minutes.Après incubation, le substrat a ensuite été retiré de la solution protéique, lavé doucement avec du PBS 3 fois et fixé avec du paraformaldéhyde à 4 % (n = 4 pour chaque protéine).Pour le calcium, du chlorure de sodium (0,21 M) et du phosphate de potassium (3,77 mM) ont été dissous dans de l'eau déminéralisée.Le pH de la solution a été ajusté à 2,0 en ajoutant une solution de chlorhydrate (1 M).Ensuite, du chlorure de calcium (5,62 mM) a été dissous dans la solution.En ajoutant du tris(hydroxyméthyl)-amino méthane 1M, le pH de la solution est ajusté à 7,4.Plongez tous les substrats dans une plaque à six puits remplie d’une solution de phosphate de calcium 1,5 × et retirez-les de la solution après 30 minutes.Pour la coloration, 2 g de Rouge Alizarine S (CI 58005) à mélanger avec 100 ml d'eau déminéralisée.Ensuite, utilisez 10 % d'hydroxyde d'ammonium pour ajuster le pH à 4. Teignez le substrat avec une solution de rouge alizarine pendant 5 minutes, puis secouez l'excès de colorant et épongez.Après le processus d'agitation, retirez le substrat.Le matériau est déshydraté, puis immergé dans l'acétone pendant 5 minutes, puis immergé dans une solution acétone-xylène (1:1) pendant 5 minutes, et enfin lavé au xylène (n = 4).Un microscope à fluorescence (Axio Imager) avec des objectifs ×10 et ×20 est utilisé..A2m, Zeiss, Allemagne) image tous les substrats.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) a été utilisé pour quantifier les données d'adhésion de substances biologiques sur chaque groupe de quatre zones d'imagerie différentes.Convertissez toutes les images en images binaires avec des seuils fixes pour la comparaison des substrats.
Un microscope confocal Zeiss LSM 700 a été utilisé pour surveiller la stabilité de la couche lubrifiante dans le PBS en mode réflexion.L'échantillon de verre recouvert de SAM à base de fluor avec une couche lubrifiante injectée a été immergé dans une solution PBS et testé à l'aide d'un agitateur orbital (SHO-1D ; Daihan Scientific, Corée du Sud) dans des conditions d'agitation douce (120 tr/min).Prélevez ensuite l’échantillon et surveillez la perte de lubrifiant en mesurant la perte de lumière réfléchie.Pour acquérir des images de fluorescence en mode réflexion, l'échantillon est exposé à un laser à 633 nm puis collecté, car la lumière sera réfléchie par l'échantillon.Les échantillons ont été mesurés à des intervalles de temps de 0, 30, 60 et 120 heures.
Afin de déterminer l'influence du processus de modification de surface sur les propriétés nanomécaniques des implants orthopédiques, un nanoindenteur (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) équipé d'une pointe en diamant Berkovich en forme de pyramide à trois côtés a été utilisé pour mesurer la nanoindènedione.La charge maximale est de 10 mN et la surface est de 100 μm x 100 μm.Pour toutes les mesures, le temps de chargement et de déchargement est de 10 s et le temps de maintien sous charge d'indentation maximale est de 2 s.Prenez des mesures à cinq endroits différents et faites la moyenne.Afin d'évaluer les performances de résistance mécanique sous charge, un essai de flexion transversale en trois points a été réalisé à l'aide d'une machine d'essai universelle (Instron 5966, Instron, USA).Le substrat est comprimé à un taux constant de 10 N/s avec une charge accrue.Le logiciel Bluehill Universal (n = 3) a été utilisé pour calculer le module de flexion et la contrainte de compression maximale.
Afin de simuler le processus opératoire et les dommages mécaniques associés provoqués pendant l’opération, le processus opératoire a été réalisé in vitro.Les fémurs ont été collectés sur des lapins blancs néo-zélandais exécutés.Le fémur a été nettoyé et fixé dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 1 semaine.Comme décrit dans la méthode d'expérimentation animale, le fémur fixe a été opéré chirurgicalement.Après l'opération, l'implant orthopédique a été immergé dans du sang (sang de cheval, KISAN, Corée) pendant 10 s pour confirmer si des adhérences sanguines se sont produites après l'application de la blessure mécanique (n = 3).
Au total, 24 lapins blancs mâles de Nouvelle-Zélande (poids de 3,0 à 3,5 kg, âge moyen de 6 mois) ont été répartis au hasard en quatre groupes : nu négatif, nu positif, SHP et LOIS.Toutes les procédures impliquant des animaux ont été réalisées conformément aux normes éthiques du comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (approuvé par l'IACUC, KOREA-2017-0159).L'implant orthopédique se compose d'une plaque de verrouillage à cinq trous (longueur 41 mm, largeur 7 mm et épaisseur 2 mm) et de vis de verrouillage corticales (longueur 12 mm, diamètre 2,7 mm) pour la fixation des fractures.À l'exception des plaques et des vis utilisées dans le groupe nu-négatif, toutes les plaques et vis ont été incubées dans une suspension de SARM (106 UFC/ml) pendant 12 heures.Le groupe nu négatif (n = 6) a été traité avec des implants à surface nue sans exposition à une suspension bactérienne, comme contrôle négatif de l'infection.Le groupe strictement positif (n = 6) a été traité avec un implant à surface nue exposé à des bactéries comme contrôle positif de l'infection.Le groupe SHP (n = 6) a été traité avec des implants SHP exposés à des bactéries.Enfin, le groupe LOIS a été traité avec des implants LOIS exposés aux bactéries (n = 6).Tous les animaux sont gardés dans une cage et beaucoup de nourriture et d'eau sont fournis.Avant l’opération, les lapins étaient à jeun pendant 12 heures.Les animaux ont été anesthésiés par injection intramusculaire de xylazine (5 mg/kg) et injection intraveineuse de paclitaxel (3 mg/kg) pour l'induction.Après cela, délivrez 2 % d’isoflurane et 50 % à 70 % d’oxygène médical (débit 2 L/min) à travers le système respiratoire pour maintenir l’anesthésie.Il est implanté par approche directe du fémur latéral.Après épilation et désinfection de la peau à la povidone iodée, une incision d'environ 6 cm de long a été pratiquée à l'extérieur du fémur moyen gauche.En ouvrant l'espace entre les muscles recouvrant le fémur, le fémur est entièrement exposé.Placer la plaque devant la diaphyse fémorale et la fixer avec quatre vis.Après la fixation, utilisez une lame de scie (1 mm d'épaisseur) pour créer artificiellement une fracture dans la zone située entre le deuxième trou et le quatrième trou.A la fin de l’opération, la plaie a été lavée avec une solution saline et refermée avec des sutures.Chaque lapin a reçu une injection sous-cutanée d'enrofloxacine (5 mg/kg) diluée au tiers dans une solution saline.Des radiographies postopératoires du fémur ont été prises chez tous les animaux (0, 7, 14, 21, 28 et 42 jours) pour confirmer l'ostéotomie de l'os.Après une anesthésie profonde, tous les animaux ont été sacrifiés par KCl intraveineux (2 mmol/kg) aux jours 28 et 42.Après l'exécution, le fémur a été scanné par micro-CT pour observer et comparer le processus de cicatrisation osseuse et la formation de nouveaux os entre les quatre groupes.
Après exécution, les tissus mous en contact direct avec les implants orthopédiques ont été collectés.Le tissu a été fixé dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant une nuit, puis déshydraté dans EtOH.Le tissu déshydraté a été inclus dans de la paraffine et sectionné à une épaisseur de 40 µm à l'aide d'un microtome (400CS ; EXAKT, Allemagne).Afin de visualiser l’infection, une coloration H&E et une coloration MT ont été réalisées.Afin de vérifier la réponse de l'hôte, le tissu sectionné a été incubé avec un anticorps primaire de lapin anti-TNF-α (AB6671, Abcam, USA) et un anticorps primaire de lapin anti-IL-6 (AB6672 ; Abcam, USA), puis traité avec du raifort.Oxydase.Appliquer le système de coloration complexe avidine-biotine (ABC) sur les coupes selon les instructions du fabricant.Afin d'apparaître comme un produit de réaction brun, de la 3,3-diaminobenzidine a été utilisée dans toutes les parties.Un scanner de diapositives numérique (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hongrie) a été utilisé pour visualiser toutes les tranches et au moins quatre substrats de chaque groupe ont été analysés par le logiciel ImageJ.
Des images radiographiques ont été prises chez tous les animaux après la chirurgie et chaque semaine pour surveiller la guérison des fractures (n = 6 par groupe).Après exécution, une micro-CT haute résolution a été utilisée pour calculer la formation de cals autour du fémur après cicatrisation.Le fémur obtenu a été nettoyé, fixé dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 3 jours et déshydraté dans de l'éthanol à 75 %.Les os déshydratés ont ensuite été numérisés à l'aide d'un micro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgique) pour générer des images voxels 3D (2 240 x 2 240 pixels) de l'échantillon osseux.Utilisez un filtre Al de 1,0 mm pour réduire le bruit du signal et appliquer une haute résolution à tous les balayages (E = 133 kVp, I = 60 μA, temps d’intégration = 500 ms).Le logiciel Nrecon (version 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgique) a été utilisé pour générer un volume 3D de l'échantillon numérisé à partir de la projection latérale 2D acquise.Pour l'analyse, l'image reconstruite 3D est divisée en cubes de 10 mm × 10 mm × 10 mm en fonction du site de fracture.Calculez le cal à l’extérieur de l’os cortical.Le logiciel DataViewer (version 1.5.1.2 ; Bruker microCT, Kontich, Belgique) a été utilisé pour rediriger numériquement le volume osseux numérisé, et le logiciel CT-Analyzer (version 1.14.4.1 ; Bruker microCT, Kontich, Belgique) a été utilisé pour l'analyse.Les coefficients relatifs d’absorption des rayons X dans les os matures et les cals se distinguent par leur densité, puis le volume des cals est quantifié (n = 4).Afin de confirmer que la biocompatibilité du LOIS ne retarde pas le processus de cicatrisation osseuse, des analyses radiographiques et micro-CT supplémentaires ont été réalisées chez deux lapins : les groupes nu-négatif et LOIS.Les deux groupes ont été exécutés au cours de la 6ème semaine.
Les fémurs des animaux sacrifiés ont été collectés et fixés dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 3 jours.L'implant orthopédique est ensuite soigneusement retiré du fémur.Le fémur a été décalcifié pendant 21 jours en utilisant 0,5 M d'EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Ensuite, le fémur décalcifié a été immergé dans EtOH pour le déshydrater.Le fémur déshydraté a été retiré dans du xylène et inclus dans de la paraffine.Ensuite, l'échantillon a été découpé avec un microtome rotatif automatique (Leica RM2255, Leica Biosystems, Allemagne) d'une épaisseur de 3 µm.Pour la coloration TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Allemagne), les échantillons sectionnés ont été déparaffinés, réhydratés et incubés dans le réactif TRAP à 37 ° C pendant 1 heure.Les images ont été acquises à l'aide d'un scanner de diapositives (Panoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hongrie) et quantifiées en mesurant la couverture de la zone colorée.Dans chaque expérience, au moins quatre substrats de chaque groupe ont été analysés par le logiciel ImageJ.
L'analyse de signification statistique a été réalisée à l'aide de GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Un test t non apparié et une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) ont été utilisés pour tester les différences entre les groupes d'évaluation.Le niveau de signification est indiqué dans la figure comme suit : *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 et ****P<0,0001 ;NS, pas de différence significative.
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