整形外科インプラント手術を受ける患者にとって、細菌感染や感染によって引き起こされる免疫反応は常に生命を脅かすリスクです。従来の生物学的材料は生物学的汚染を受けやすく、細菌が損傷部位に侵入し、術後感染を引き起こします。したがって、整形外科インプラント用の抗感染および免疫回避コーティングを開発することが緊急に必要とされています。ここで、我々は潤滑整形外科用インプラント表面 (LOIS) と呼ばれる整形外科用インプラント用の高度な表面改質技術を開発しました。これは、ピッチャー植物のピッチャーの滑らかな表面からインスピレーションを得たものです。LOIS は、さまざまな液体や生体物質 (細胞、タンパク質、カルシウム、細菌など) に対して長期にわたる強力な撥液性を備えています。また、体外手術時に避けられない損傷を模擬し、傷に対する機械的耐久性や固定力を確認しました。ウサギ骨髄炎症性大腿骨骨折モデルを使用して、LOIS の抗生物学的スケーリング能力と抗感染能力を徹底的に研究しました。私たちは、生物付着防止特性と機械的耐久性を備えた LOIS が、感染のない整形外科手術の一歩となると考えています。
今日、全体的な高齢化により、整形外科疾患（高齢者の骨折、変形性関節疾患、骨粗鬆症など）に苦しむ患者の数が大幅に増加しています(1、2)。したがって、医療機関は、ネジ、プレート、釘、人工関節などの整形外科インプラントを含む整形外科を非常に重要視しています (3, 4)。しかし、従来の整形外科用インプラントは細菌の付着やバイオフィルムの形成を受けやすく、手術後に手術部位感染 (SSI) を引き起こす可能性があることが報告されています (5、6)。整形外科用インプラントの表面にバイオフィルムが形成されると、たとえ大量の抗生物質を使用したとしても、バイオフィルムを除去するのは非常に困難になります。したがって、通常は重度の術後感染症を引き起こします(7、8)。上記の問題のため、感染したインプラントの治療には、すべてのインプラントと周囲の組織の除去を含む再手術が含まれる必要があります。したがって、患者は激しい痛みとある程度のリスクに苦しむことになります(9、10)。
これらの問題のいくつかを解決するために、表面に付着した細菌を除去して感染を防ぐ、薬剤溶出性の整形外科用インプラントが開発されました (11、12)。ただし、この戦略にはまだいくつかの限界があります。薬剤溶出性インプラントを長期間植え込むと周囲の組織に損傷を与え、炎症を引き起こし、壊死を引き起こす可能性があることが報告されています(13、14)。さらに、薬剤溶出性の整形外科用インプラントの製造プロセス後に有機溶媒が存在する可能性があり、これは米国食品医薬品局によって厳しく禁止されており、その基準を満たすためには追加の精製手順が必要です(15)。薬剤溶出性インプラントは薬剤の制御放出が難しく、薬剤の充填量が限られているため、薬剤の長期適用は現実的ではありません(16)。
もう 1 つの一般的な戦略は、生体物質や細菌が表面に付着するのを防ぐために、インプラントを防汚ポリマーでコーティングすることです (17)。たとえば、両性イオンポリマーは、血漿タンパク質、細胞、細菌と接触しても非粘着性であるため、注目を集めています。しかし、長期安定性と機械的耐久性に関していくつかの制限があり、特に外科手術中の機械的擦過により、整形外科インプラントでの実用化が妨げられています(18、19)。さらに、その高い生体適合性、除去手術の必要性のなさ、腐食による表面洗浄特性により、生分解性材料で作られた整形外科用インプラントが使用されてきた(20、21)。腐食中に、ポリマーマトリックス間の化学結合が破壊されて表面から剥がれ、付着物が表面をきれいにします。ただし、表面洗浄による生物汚れ防止は短期間で効果があります。さらに、ポリ（乳酸-グリコール酸コポリマー）（PLGA）、ポリ乳酸（PLA）、マグネシウムベースの合金を含むほとんどの吸収性材料は、体内で不均一な生分解と侵食を受け、機械的安定性に悪影響を及ぼします。（22）。さらに、生分解性のプレートの破片は細菌の付着場所となり、長期的には感染の可能性が高まります。この機械的劣化と感染のリスクにより、形成外科の実際の適用が制限されます(23)。
蓮の葉の階層構造を模倣した超疎水性 (SHP) 表面は、防汚表面の潜在的な解決策となっています (24, 25)。SHP の表面が液体に浸されると、気泡が閉じ込められ、それによってエアポケットが形成され、細菌の付着が防止されます (26)。しかし、最近の研究では、SHP 表面には機械的耐久性と長期安定性に関連する欠点があり、それが医療用インプラントへの応用の妨げになっていることが示されています。さらに、エアポケットは溶解してその防汚特性を失い、その結果、SHP 表面の表面積が大きいために細菌がより広範囲に付着することになります (27、28)。最近、Aizenbergらは、ウツボカズラのウツボカズラにヒントを得て滑らかな表面を開発することにより、生物付着防止表面コーティングの革新的な方法を導入した(29, 30)。滑らかな表面は、水圧条件下で長期安定性を示し、生体液体に対して非常に撥液性があり、自己修復特性を備えています。しかし、複雑な形状の医療用インプラントにコーティングを施す方法はなく、移植後の損傷組織の治癒過程をサポートすることも証明されていません。
ここでは、潤滑整形外科用インプラント表面 (LOIS) を紹介します。これは、マイクロ/ナノ構造の整形外科用インプラント表面であり、骨折固定などの形成外科手術に伴う細菌感染を防ぐために、薄い潤滑層としっかりと結合しています。今回開発したLOISは、フッ素を修飾したミクロ・ナノレベルの構造が潤滑剤を構造上に強固に固定するため、各種液体の付着を十分に弾き、長期にわたって防汚性能を維持することができます。LOIS コーティングは、骨合成を目的としたさまざまな形状の材料に適用できます。LOIS のバイオフィルム細菌 [緑膿菌およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 (MRSA)] および生体物質 (細胞、タンパク質、カルシウム) に対する優れた抗生物付着特性は、in vitro で確認されています。基材への広範囲接着の接着率は1%未満です。また、表面に傷が付くなどの機械的ストレスが加わった後でも、潤滑剤の浸透による自己修復作用により防汚性が維持されます。機械的耐久性テストの結果は、構造的および化学的変更を行った後でも、全体の強度が大幅に低下しないことを示しています。さらに、LOIS が形成手術中に発生するさまざまな機械的ストレスに耐えられることを証明するために、手術環境における機械的ストレスをシミュレートする in vitro 実験が実施されました。最後に、ウサギベースの生体内大腿骨骨折モデルを使用し、LOIS が優れた抗菌特性と生体適合性を備えていることを証明しました。放射線学的および組織学的結果により、移植後 4 週間以内の安定した潤滑剤の挙動と抗生物付着特性により、骨の治癒プロセスを遅らせることなく効果的な抗感染および免疫回避性能を達成できることが確認されました。
図 1A は、開発された LOIS の概略図を示しています。LOIS はウサギの大腿骨骨折モデルにマイクロ/ナノスケール構造を移植され、その優れた抗生物学的ファウリングおよび抗感染特性を確認しています。生体模倣法は、植木鉢の表面をシミュレートし、表面のマイクロ/ナノ構造内に潤滑剤層を組み込むことで生物付着を防止するために実行されます。潤滑剤を注入した表面により、生体物質と表面との接触を最小限に抑えることができます。そのため、表面に安定した化学結合が形成されるため、優れた防汚性能と長期安定性を発揮します。その結果、潤滑表面の抗生物付着特性により、生物医学研究におけるさまざまな実用化が可能になります。しかし、この特殊な表面が体内でどのように相互作用するかについての広範な研究はまだ完了していません。アルブミンおよびバイオフィルム細菌を使用して、LOIS を in vitro で裸の基質と比較することにより、LOIS の非接着性を確認できます (図 1B)。また、傾斜したベア基板やLOIS基板上の水滴を転がり落とすことで、生物汚染性能を実証することができます（図S1、動画S1）。蛍光顕微鏡画像に示されているように、タンパク質と細菌の懸濁液中でインキュベートされた露出した基板には、表面に大量の生物学的物質が付着していることが示されました。しかし、LOIS はその優れた抗生物付着特性により、蛍光をほとんど示しません。LOIS の抗生物付着特性と抗感染特性を確認するために、骨合成用の整形外科用インプラント (プレートとネジ) の表面に LOIS を適用し、ウサギの骨折モデルに配置しました。移植前に、裸の整形外科用インプラントと LOIS を細菌懸濁液中で 12 時間インキュベートしました。プレインキュベーションにより、比較のために露出したインプラントの表面にバイオフィルムが形成されることが確認されます。図 1C は、移植後 4 週間の骨折部位の写真を示しています。左側では、裸の整形外科用インプラントを装着したウサギは、インプラントの表面にバイオフィルムが形成されたため、重篤なレベルの炎症を示しました。LOIS を移植したウサギでは反対の結果が観察されました。つまり、LOIS の周囲の組織は感染の兆候も炎症の兆候も示さなかったのです。さらに、左側の光学画像は、インプラントが露出したウサギの手術部位を示しており、露出したインプラントの表面に存在する複数の接着剤が LOIS の表面に見つからなかったことを示しています。これは、LOIS が長期安定性を持ち、その抗生物汚れおよび抗付着特性を維持する能力があることを示しています。
(A) ウサギの大腿骨骨折モデルにおける LOIS とその移植の概略図。(B) 裸の表面および LOIS 基板上のタンパク質および細菌バイオフィルムの蛍光顕微鏡画像。移植から 4 週間後の (C) 骨折部位の写真画像と (D) X 線画像 (赤い四角で強調表示)。画像提供：チェ・キョミン、延世大学。
滅菌され、露出された陰性移植されたウサギは、炎症や感染の兆候もなく、正常な骨治癒プロセスを示しました。一方、細菌懸濁液中でプレインキュベートされた SHP インプラントは、周囲の組織に感染に関連した炎症を示します。これは、細菌の付着を長期間阻害できないことに起因すると考えられます (図 S2)。LOIS が治癒過程に影響を与えず、移植に関連する感染の可能性を抑制することを証明するために、露出した陽性マトリックスの X 線画像と骨折部位の LOIS を比較しました (図 1D)。ベアポジティブインプラントの X 線画像には持続的な骨溶解線が示されており、骨が完全に治癒していないことが示されました。これは、感染に関連した炎症により、骨の回復プロセスが大幅に遅れる可能性があることを示唆しています。逆に、LOISを移植したウサギは治癒し、明らかな骨折部位が見られないことが示されました。
長期安定性と機能性（生物付着に対する耐性を含む）を備えた医療用​​インプラントを開発するために、多くの努力がなされてきました。しかし、さまざまな生物学的物質の存在と組織接着のダイナミクスにより、臨床的に信頼できる方法の開発が制限されます。これらの欠点を克服するために、当社はマイクロ/ナノ層構造と化学的に修飾された表面を開発しました。これは、高い毛管力と化学親和力によって最適化され、滑らかな潤滑剤を最大限に維持します。図 2A は、LOIS の全体的な製造プロセスを示しています。まず、医療グレードのステンレス鋼 (SS) 304 基板を準備します。次に、フッ酸（HF）溶液を用いた化学エッチングにより、SS基板上にマイクロ・ナノ構造を形成します。SS の耐食性を回復するために、エッチングされた基板を硝酸 (HNO3) 溶液 (31) で処理します。不動態化により SS 基板の耐食性が向上し、LOIS の全体的な性能を低下させる可能性がある腐食プロセスが大幅に遅くなります。次に、1H、1H、2H、2H-パーフルオロオクチルトリエトキシシラン (POTS) で自己組織化単分子層 (SAM) を形成することで、表面を化学的に修飾し、表面と滑らかな潤滑剤の親和性との間の化学的相互作用を改善します。表面改質により、作製されたマイクロ/ナノスケール構造表面の表面エネルギーが大幅に低下し、滑らかな潤滑剤の表面エネルギーと一致します。これにより潤滑剤が完全に濡れ、表面に安定した潤滑剤層が形成されます。修飾された表面は疎水性が向上します。結果は、滑りやすい潤滑剤が、マイクロ/ナノ構造によって引き起こされる高い化学親和力と毛管力により、LOIS上で安定した挙動を示すことを示しています(32、33)。表面改質および潤滑剤注入後のSS表面の光学的変化を研究した。表面に形成されるマイクロ/ナノ層状構造は視覚的な変化を引き起こし、表面を暗くすることがあります。この現象は、粗い表面上で光散乱効果が強化され、光トラップ機構 (34) によって引き起こされる拡散反射が増加することに起因します。また、潤滑剤を注入した後は、LOIS が暗くなります。潤滑層により基板から反射される光が少なくなり、LOIS が暗くなります。最小の滑り角 (SA) を示し、耐生物付着性能を達成するようにミクロ構造/ナノ構造を最適化するために、走査型電子顕微鏡 (SEM) と原子ペアを使用して、異なる HF エッチング時間 (0、3) を実行しました。、15 分および 60 分）力顕微鏡（AFM）（図 2B）。SEM および AFM 画像は、短時間のエッチング (3 分間のエッチング) の後、裸の基板に不均一なナノスケールの粗さが形成されていることを示しています。表面粗さはエッチング時間とともに変化します(図S3)。時間変化曲線は、表面粗さが増加し続け、15 分のエッチングでピークに達し、その後 30 分のエッチングで粗さ値のわずかな減少が観察されるだけであることを示しています。このとき、ナノレベルの粗さはエッチングされ、ミクロレベルの粗さが激しく発達し、粗さの変化がより安定します。30 分を超えるエッチングの後、粗さのさらなる増加が観察されます。これについては次のように詳しく説明します。SS は鉄、クロム、ニッケル、モリブデン、その他多くの元素を含む元素と合金化された鋼で構成されています。これらの元素のうち、鉄、クロム、モリブデンは、HF エッチングによって SS にミクロン/ナノスケールの粗さを形成するのに重要な役割を果たします。モリブデンはモリブデンより耐食性が高いため、腐食の初期段階では主に鉄とクロムが腐食されます。エッチングが進行するにつれて、エッチング溶液は局所的な過飽和に達し、エッチングによってフッ化物や酸化物が形成されます。フッ化物と酸化物が沈殿し、最終的には表面に再堆積し、ミクロン/ナノ範囲の表面粗さを形成します (31)。このマイクロ/ナノレベルの粗さは、LOIS の自己修復特性において重要な役割を果たします。二重のスケール表面が相乗効果を生み出し、毛細管力が大幅に向上します。この現象により潤滑剤が安定して表面に浸透し、自己修復性に寄与します(35)。凹凸の形成はエッチング時間に依存する。10 分間のエッチングでは、表面にはナノスケールの粗さしかなく、生物付着耐性を持たせるのに十分な潤滑剤を保持するには不十分です (36)。一方、エッチング時間が３０分を超えると、鉄とクロムの再析出によって形成されたナノスケールの凹凸が消失し、モリブデンによるマイクロスケールの凹凸のみが残る。オーバーエッチングされた表面にはナノスケールの粗さが欠けており、2 段階の粗さの相乗効果が失われ、LOIS の自己修復特性に悪影響を及ぼします。防汚性能を証明するために、異なるエッチング時間で基板に対して SA 測定を実行しました。粘度や表面エネルギーに基づいて、脱イオン (DI) 水、血液、エチレングリコール (EG)、エタノール (EtOH)、ヘキサデカン (HD) などのさまざまな種類の液体が選択されました (図 S4)。時間変化するエッチング パターンは、表面エネルギーと粘度が異なるさまざまな液体について、15 分間のエッチング後の LOIS の SA が最も低いことを示しています。したがって、LOIS は、潤滑剤の耐久性と優れた防汚性を効果的に維持するのに適したミクロンおよびナノスケールの粗さを形成するために 15 分間エッチングするように最適化されています。
(A) LOIS の 4 段階の製造プロセスの概略図。挿入図は、基板上に形成された SAM を示しています。(B) 異なるエッチング時間の下で基板のマイクロ/ナノ構造を最適化するために使用される SEM および AFM 画像。表面不動態化および SAM コーティング後の (C) Cr2p および (D) F1s の X 線光電子分光法 (XPS) スペクトル。au、任意単位。(E) 裸の、エッチングされた、SHP および LOIS 基板上の水滴の代表的な画像。(F) SHP および LOIS での異なる表面張力を持つ液体の接触角 (CA) および SA の測定。データは平均±SDとして表されます。
次に、表面の化学的性質の変化を確認するために、X 線光電子分光法 (XPS) を使用して、各表面コーティング後の基板表面の化学組成の変化を調べました。図２Ｃは、ＨＦエッチング表面およびＨＮＯ ３ 処理表面のＸＰＳ測定結果を示す。587.3 および 577.7 eV の 2 つの主なピークは、酸化クロム層に存在する Cr-O 結合に起因すると考えられ、これが HF エッチングされた表面との主な違いです。これは主に、HNO3 による表面の鉄とフッ化クロムの消費によるものです。HNO3 ベースのエッチングにより、クロムが表面に不動態化酸化物層を形成し、エッチングされた SS が再び耐腐食性になります。図 2D では、XPS スペクトルが得られ、SAM コーティング後の表面にフルオロカーボン系シランが形成されていることが確認されました。このシランは、EG、血液、EtOH に対しても非常に高い撥液性を示します。SAM コーティングは、シラン官能基とプラズマ処理によって形成されたヒドロキシル基を反応させることによって完成します。その結果、CF2 および CF3 ピークの大幅な増加が観察されました。286 ～ 296 eV の結合エネルギーは、SAM コーティングによる化学修飾が正常に完了したことを示しています。SHP は比較的大きな CF2 (290.1 eV) および CF3 (293.3 eV) のピークを示しますが、これは表面に形成されたフルオロカーボンベースのシランによって引き起こされます。図 2E は、裸水、エッチング水、SHP、および LOIS と接触した脱イオン水のさまざまなグループの接触角 (CA) 測定の代表的な光学画像を示しています。これらの画像は、化学エッチングによって形成されたマイクロ/ナノ構造により、エッチングされた表面が親水性になり、その構造に純水が吸収されることを示しています。しかし、SAMを基材にコーティングすると、基材が強い撥水性を示すため、表面にSHPが形成され、水と表面との接触面積が小さくなります。最後に、LOIS では CA の減少が観察されました。これは、潤滑剤が微細構造に浸透し、それによって接触面積が増加したことに起因すると考えられます。表面が優れた撥液性と非粘着性を有することを証明するために、さまざまな液体を使用して CA と SA を測定することにより LOIS を SHP 基板と比較しました (図 2F)。脱イオン水、血液、EG、EtOH、HD など、粘度と表面エネルギーに基づいてさまざまな種類の液体が選択されました (図 S4)。CA の測定結果は、CA が HD になる傾向がある場合、CA の減少値が低下し、CA の表面エネルギーが最も低くなることを示しています。さらに、CA 全体の LOIS は低いです。しかし、SA測定では全く異なる現象が見られます。イオン水を除くすべての液体は、SHP基板に滑り落ちずに付着します。一方、LOIS は非常に低い SA を示し、すべての液体が 10° ～ 15° 未満の角度で傾斜すると、すべての液体が転がり落ちます。これは、LOIS の非粘着性が SHP 表面の非粘着性よりも優れていることを強く示しています。さらに、LOIS コーティングは、チタン (Ti)、ポリフェニルスルホン (PPSU)、ポリオキシメチレン (POM)、ポリエーテル エーテル ケトン (PEEK)、生体吸収性ポリマー (PLGA) などのさまざまな種類の材料にも適用されており、これらは移植可能な整形外科用材料です (図S5))。LOIS によって処理された材料上の液滴の連続画像は、LOIS の抗生物付着特性がすべての基板上で同じであることを示しています。さらに、CA および SA の測定結果は、LOIS の非粘着特性が他の材料にも適用できることを示しています。
LOIS の防汚特性を確認するために、さまざまな種類の基材 (裸、エッチング、SHP、LOIS を含む) を緑膿菌および MRSA とインキュベートしました。これら 2 つの細菌は、バイオフィルムの形成を引き起こし、SSI を引き起こす可能性がある代表的な病院細菌として選択されました (37)。図 3 (A および B) は、それぞれ細菌懸濁液中で短期間 (12 時間) および長期間 (72 時間) 培養した基質の蛍光顕微鏡画像とコロニー形成単位 (CFU) の測定結果を示しています。短期間で細菌はクラスターを形成して大きくなり、粘液状の物質で覆われて除去できなくなります。ただし、72 時間の培養中に細菌は成熟し、より多くのコロニーまたはクラスターを形成するために分散しやすくなります。したがって、72 時間のインキュベーションは長期間であり、表面に強力なバイオフィルムを形成するのに適切なインキュベーション時間であると考えられます (38)。短期間で、エッチングされた表面と SHP の表面には細菌の付着が見られましたが、裸の基板と比較して約 25% ～ 50% 減少しました。しかし、LOIS はその優れた抗生物付着性能と安定性により、短期および長期にわたって細菌バイオフィルムの付着を示さなかった。概略図 (図 3C) は、エッチング液、SHP、および LOIS の生物学的ファウリング防止メカニズムの説明を示しています。親水性を備えたエッチングされた基板は、裸の基板よりも大きな表面積を持つことが想定されています。したがって、エッチングされた基板上にはより多くの細菌の付着が発生することになります。しかし、裸の基板と比較して、エッチングされた基板では、表面に形成されるバイオフィルムが大幅に少なくなります。これは、水分子が親水性の表面にしっかりと結合し、水の潤滑剤として機能するため、短期的には細菌の付着が妨げられるためです(39)。しかし、水分子の層は非常に薄く、細菌懸濁液に溶けます。そのため、水分子層が消失した状態が長期間続き、細菌が広範囲に付着・増殖することになります。SHP の場合、その短期間の非湿潤特性により、細菌の付着が抑制されます。細菌の付着力の低下は、層状構造に閉じ込められたエアポケットと表面エネルギーの低下に起因すると考えられ、それによって細菌の懸濁液と表面との接触が最小限に抑えられます。しかし、SHP では長期間にわたって防汚特性が失われていたため、広範な細菌の付着が観察されました。これは主に、静水圧によるエアポケットの消失と水への空気の溶解によるものです。これは主に、溶解によるエアポケットの消失と、接着のためのより大きな表面積を提供する層状構造によるものです (27、40)。長期安定性に重要な影響を与えるこれら 2 つの基材とは異なり、LOIS に含まれる潤滑剤はマイクロ/ナノ構造に注入されており、長期でも消失しません。マイクロ・ナノ構造を充填した潤滑剤は非常に安定しており、高い化学親和性により表面に強力に吸着するため、長期間細菌の付着を防ぎます。図S6は、リン酸緩衝食塩水（PBS）に浸漬した潤滑剤注入基板の反射共焦点顕微鏡画像を示しています。連続画像は、120 時間のわずかな振動 (120 rpm) の後でも、LOIS 上の潤滑剤層は変化せず、流動条件下での長期安定性を示していることを示しています。これは、フッ素系ＳＡＭコーティングとパーフルオロカーボン系潤滑剤との化学親和性が高く、安定した潤滑層を形成できるためである。したがって、防汚性能が維持される。さらに、血漿中に存在する代表的なタンパク質（アルブミンおよびフィブリノーゲン）、免疫機能に密接に関連する細胞（マクロファージおよび線維芽細胞）、および骨形成に関連する細胞に対して、基材をテストしました。カルシウムの含有量が非常に多いです。(図 3D、1 および 2、および図 S7) (41、42)。さらに、フィブリノーゲン、アルブミン、カルシウムの接着試験の蛍光顕微鏡画像は、各基質グループの異なる接着特性を示しました（図S8）。骨の形成中、新しく形成された骨層とカルシウム層が整形外科用インプラントを囲む場合があり、これにより除去が困難になるだけでなく、除去プロセス中に患者に予期せぬ害を引き起こす可能性があります。したがって、骨プレートおよびネジ上のカルシウムの沈着レベルが低いことは、インプラントの除去が必要な整形外科手術にとって有益です。蛍光強度と細胞数に基づく付着面積の定量化により、LOISは他の基材と比較してあらゆる生体物質に対して優れた抗生物汚染性を示すことが確認されました。インビトロ実験の結果によると、抗生物学的ファウリング LOIS は整形外科用インプラントに適用でき、バイオフィルム細菌によって引き起こされる感染を阻害するだけでなく、体の能動的な免疫システムによって引き起こされる炎症も軽減することができます。
(A) 緑膿菌および MRSA 懸濁液中で 12 時間および 72 時間インキュベートした各グループ (裸、エッチング、SHP、および LOIS) の蛍光顕微鏡画像。(B) 各グループの表面に付着した緑膿菌および MRSA の CFU の数。(C) 短期および長期エッチング、SHP および LOIS の抗生物学的ファウリング機構の概略図。(D) (1) 各基板に接着した線維芽細胞の数とベアおよび LOIS に接着した細胞の蛍光顕微鏡画像。（２）骨治癒過程に関与する免疫関連タンパク質、アルブミンおよびカルシウムの接着試験（* P <0.05、** P <0.01、*** P <0.001および**** P <0.0001）。ns、重要ではありません。
避けられない集中応力の場合、機械的耐久性が常に防汚コーティングの適用における主な課題となってきました。従来の汚水防止ゲル法は、水溶性が低く壊れやすいポリマーに基づいています。したがって、生物医学用途では通常、機械的ストレスの影響を受けやすくなります。したがって、機械的に耐久性のある防汚コーティングは、整形外科用インプラントなどの用途にとって依然として課題となっている(43、44)。図 4A(1) は、整形外科用インプラントにかかる 2 つの主要なタイプの応力 (引っかき傷 (せん断応力) と圧縮を含む) を、鉗子によって生成された損傷したインプラントの光学画像とともに示しています。たとえば、ドライバーでネジを締めたり、外科医が骨プレートをピンセットでしっかりと保持して圧縮力を加えたりすると、プラスチック製の骨プレートはマクロスケールとマイクロ/ナノスケールの両方で損傷し、傷がつきます (図 4A、 2) 。製造されたLOISが整形手術中のこれらの損傷に耐えられるかどうかをテストするために、ナノインデンテーションを実行して、裸の基板の硬度とマイクロ/ナノスケールでのLOISを比較し、マイクロ/ナノ構造の機械的特性を研究しました。 4B）。概略図は、マイクロ/ナノ構造の存在による LOIS のさまざまな変形挙動を示しています。力-変位曲線は、ナノインデンテーションの結果に基づいて描画されました (図 4C)。青色の画像は裸の基板を表しており、最大押し込み深さ 0.26 μm からわかるように、わずかな変形しか示されていません。一方、LOIS で観察されたナノインデンテーション力と変位の徐々に増加 (赤い曲線) は、機械的特性の低下の兆候を示している可能性があり、その結果、ナノインデンテーションの深さは 1.61 μm になります。これは、LOIS に存在するマイクロ/ナノ構造がナノインデンターの先端に深い前進スペースを提供するため、その変形が裸の基板の変形よりも大きくなるからです。Konsta-Gdoutos ら。(45) は、ナノ構造の存在により、ナノインデンテーションとマイクロ/ナノ粗さが不規則なナノインデンテーション曲線を引き起こすと考えています。陰影のある領域はナノ構造に起因する不規則な変形曲線に対応し、陰影のない領域は微細構造に起因します。この変形は、保持潤滑剤のミクロ構造/ナノ構造を損傷し、その防汚性能に悪影響を与える可能性があります。LOIS に対する損傷の影響を研究するために、形成手術中にマイクロ/ナノ構造への避けられない損傷を体内で再現しました。血液およびタンパク質付着試験を使用することにより、in vitro 後の LOIS の抗生物付着特性の安定性を決定できます (図 4D)。一連の光学画像は、各基板の穴付近に生じた損傷を示しています。血液付着試験は、抗生物付着コーティングに対する機械的損傷の影響を実証するために実行されました (図 4E)。SHPと同様に損傷により防汚性能が失われますが、LOISは血液をはじくことにより優れた防汚性能を発揮します。これは、損傷領域を覆う毛細管現象によって表面エネルギーが駆動され、微細構造の潤滑剤内の流れが防汚特性を回復させるためです (35)。アルブミンを用いたタンパク質付着試験でも同様の傾向が見られました。損傷領域では、SHP 表面のタンパク質の付着が広く観察され、その面積範囲を測定することで、裸の基板の付着レベルの半分として定量化できます。一方、LOIS は付着を引き起こすことなく、その抗生物付着特性を維持しました (図 4、F および G)。さらに、ネジの表面は穴あけなどの強い機械的ストレスにさらされることが多いため、LOIS コーティングがネジ上に無傷で残る能力を in vitro で研究しました。図 4H は、裸ネジ、SHP、LOIS などのさまざまなネジの光学画像を示しています。赤い長方形は、骨移植中に強い機械的ストレスが発生するターゲット領域を表します。プレートのタンパク質付着試験と同様に、蛍光顕微鏡を使用してタンパク質付着を画像化し、被覆面積を測定して、強い機械的ストレス下であっても LOIS コーティングの完全性を証明します (図 4、I および J)。LOIS処理を施したネジは優れた防汚性能を発揮し、表面へのタンパク質の付着がほとんどありません。一方、裸ネジと SHP ネジではタンパク質の付着が観察され、SHP ネジの面積は裸ネジの 1/3 でした。さらに、図 4K に示すように、固定に使用される整形外科用インプラントは、骨折部位にかかる応力に耐えられるように機械的に強くなければなりません。したがって、機械的特性に対する化学修飾の影響を確認するために曲げ試験が実行されました。さらに、これはインプラントからの固定応力を維持するために行われます。インプラントが完全に折りたたまれ、応力-ひずみ曲線が得られるまで、垂直方向の機械力を加えます (図 4L、1)。ヤング率と曲げ強度を含む 2 つの特性を、機械的強度の指標として裸の基板と LOIS 基板の間で比較しました (図 4L、2 および 3)。ヤング率は、機械的変化に耐える材料の能力を示します。各基板のヤング率はそれぞれ 41.48±1.01 および 40.06±0.96 GPa です。観察された差は約 3.4% です。さらに、材料の靱性を決定する曲げ強度は、ベア基板で 102.34±1.51 GPa、SHP で 96.99±0.86 GPa であることが報告されています。裸の基板は約 5.3% 高いです。機械的特性のわずかな低下は、ノッチ効果によって引き起こされる可能性があります。ノッチ効果では、マイクロ/ナノ粗さが一連のノッチとして機能し、局所的な応力集中を引き起こし、インプラントの機械的特性に影響を与える可能性があります(46)。しかし、人間の皮質骨の剛性は 7.4 ～ 31.6 GPa であると報告されており、測定された LOIS 弾性率は人間の皮質骨の弾性率を超えているという事実に基づいて (47)、LOIS は骨折とその全体を支持するのに十分です。機械的特性は、表面改質による影響を最小限に抑えます。
(A) (1) 手術中に整形外科用インプラントに加えられる機械的応力、および (2) 損傷した整形外科用インプラントの光学画像の概略図。(B) 裸表面上のナノインデンテーションと LOIS によるナノ機械的特性測定の概略図。(C) 裸表面と LOIS のナノインデンテーション力-変位曲線。(D) インビトロ実験後、さまざまな種類の整形外科用プレートの光学画像をシミュレートし (損傷領域は赤い四角形で強調表示されます)、手術中に生じる機械的応力をシミュレートします。(E) 損傷した整形外科用プレート群の血液付着試験および (F) タンパク質付着試験。(G) プレートに付着したタンパク質の面積範囲を測定します。(H) インビトロ実験後のさまざまな種類の整形外科用ネジの光学画像。(I) さまざまなコーティングの完全性を研究するためのタンパク質付着試験。(J) ネジに付着したタンパク質の面積範囲を測定します。(K) ウサギの動きは、骨折した骨に一定の応力を発生させることを目的としています。(L) (1) 曲げ試験結果と曲げ前後の光学画像。ベアインプラントとSHPの(2)ヤング率と(3)曲げ強度の違い。データは平均±SD (*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001)として表されます。画像提供：チェ・キョミン、延世大学。
臨床状況では、ほとんどの細菌と生体物質および創傷部位との接触は、成熟したバイオフィルムから生じます(48)。したがって、米国疾病管理予防センターは、すべてのヒト感染症の 65% がバイオフィルムに関連していると推定しています (49)。この場合、インプラントの表面に一貫したバイオフィルムを形成する in vivo 実験デザインを提供する必要があります。したがって、我々は整形外科用インプラントを細菌懸濁液中でプレインキュベートした後、ウサギの大腿骨に移植して、生体内でのLOISの防汚特性を研究するウサギの大腿骨骨折モデルを開発しました。以下の 3 つの重要な事実により、細菌感染は細菌懸濁液を直接注入するのではなく、前培養によって誘発されます。 (i) ウサギの免疫系は本来、ヒトの免疫系よりも強いです。したがって、細菌懸濁液および浮遊細菌の注入が可能です。バイオフィルムの形成には影響を与えません。(ii) 浮遊細菌は抗生物質に対してより感受性があり、抗生物質は通常手術後に使用されます。最後に、(iii) 浮遊細菌懸濁液は動物の体液によって希釈され得る(50)。移植前に細菌懸濁液中でインプラントを前培養することにより、細菌感染や異物反応（FBR）が骨治癒過程に及ぼす悪影響を徹底的に研究することができます。骨の治癒プロセスに不可欠なオッセオインテグレーションは 4 週間以内に完了するため、ウサギは移植後 4 週間で屠殺されました。次に、下流の研究のためにウサギからインプラントが取り外されました。図5Aは細菌の増殖メカニズムを示しています。感染した整形外科用インプラントが体内に導入されます。細菌懸濁液中でのプレインキュベーションの結果、裸のインプラントを移植されたウサギ６匹中６匹が感染したが、LOIS処理インプラントを移植されたウサギは一匹も感染しなかった。細菌感染は、増殖、成熟、拡散の 3 段階で進行します (51)。まず、付着した細菌が表面で繁殖して成長し、その後細菌が細胞外ポリマー (EPS)、アミロイド、細胞外 DNA を排出するときにバイオフィルムを形成します。バイオフィルムは抗生物質の浸透を妨げるだけでなく、抗生物質分解酵素 (β-ラクタマーゼなど) の蓄積も促進します (52)。最後に、バイオフィルムは成熟した細菌を周囲の組織に広げます。したがって、感染が発生します。さらに、異物が体内に侵入すると、強い免疫反応を引き起こす感染症が起こり、重度の炎症、痛み、免疫力の低下を引き起こす可能性があります。図 5B は、細菌感染によって引き起こされる免疫応答ではなく、整形外科用インプラントの挿入によって引き起こされる FBR の概要を示しています。免疫系は挿入されたインプラントを異物として認識し、細胞や組織を反応させて異物をカプセル化します (53)。FBR の初期には、整形外科用インプラントの表面に供給マトリックスが形成され、その結果フィブリノーゲンが吸着されました。吸着されたフィブリノーゲンは高密度のフィブリンネットワークを形成し、白血球の付着を促進します (54)。フィブリンネットワークが形成されると、好中球の浸潤により急性炎症が起こります。この段階では、腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン-4（IL-4）、IL-βなどのさまざまなサイトカインが放出され、単球が移植部位に浸潤し始めて巨細胞に分化します。ファージ (41、55、56)。過剰なFBRは急性および慢性炎症を引き起こし、致命的な合併症を引き起こす可能性があるため、FBRを減らすことは常に課題でした。ベアインプラントおよび LOIS 周囲の組織における細菌感染の影響を評価するために、ヘマトキシリン アンド エオシン (H&E) およびマッソン トリクローム (MT) 染色が使用されました。裸の基質を移植したウサギの場合、重度の細菌感染が進行し、H&E 組織スライドには炎症による膿瘍と壊死がはっきりと示されました。一方、非常に強力な抗生物付着性の表面 LOIS は細菌の付着を阻害するため、感染の兆候を示さず、炎症を軽減します (図 5C)。MT染色の結果も同様の傾向を示した。しかし、MT 染色では LOIS を移植したウサギでも浮腫が見られ、回復が近づいていることが示されました (図 5D)。免疫応答の程度を研究するために、免疫応答に関連するサイトカイン TNF-α および IL-6 を使用して免疫組織化学 (IHC) 染色を実行しました。細菌に曝露されていない裸のネガティブインプラントを、細菌に曝露されているが感染していないLOISと比較して、細菌感染がない場合の治癒プロセスを研究しました。図５Ｅは、ＴＮＦ－αを発現するＩＨＣスライドの光学画像を示す。茶色の領域は免疫応答を表しており、LOIS の免疫応答がわずかに低下していることを示しています。さらに、LOIS における IL-6 の発現は、無菌裸の陰性発現よりも有意に低かった (図 5F)。サイトカインの発現は、サイトカインに対応する抗体染色の領域を測定することによって定量化されました（図5G）。陰性インプラントに曝露されたウサギと比較して、LOIS を移植されたウサギの発現レベルは低く、有意な差が示されました。サイトカイン発現の減少は、LOIS の長期安定した防汚特性が細菌感染の阻害だけでなく、基材に付着するマクロファージによって誘導される FBR の減少にも関連していることを示しています (53, 57、58）。したがって、LOIS の免疫回避特性による免疫反応の低下により、整形手術後の過剰な免疫反応など、移植後の副作用が解決される可能性があります。
(A) バイオフィルムの形成と感染した整形外科用インプラントの表面に広がるメカニズムの概略図。eDNA、細胞外DNA。(B) 整形外科用インプラント挿入後の免疫応答の模式図。(C) ベアポジティブおよび LOIS を使用した整形外科用インプラントの周囲組織の H&E 染色および (D) MT 染色。免疫関連サイトカインの IHC (E) TNF-α および (F) IL-6 は、裸陰性ウサギおよび LOIS 移植ウサギの染色画像です。(G) 面積範囲測定によるサイトカイン発現の定量化 (** P <0.01)。
LOIS の生体適合性と骨治癒過程に対するその効果は、画像診断 [X 線およびマイクロコンピュータ断層撮影 (CT)] および破骨細胞 IHC を使用して in vivo で検査されました。図 6A は、炎症、修復、リモデリングという 3 つの異なる段階を含む骨の治癒プロセスを示しています。骨折が発生すると、炎症細胞と線維芽細胞が骨折した骨に侵入し、血管組織内で成長し始めます。修復段階では、血管組織の内方成長が骨折部位の近くに広がります。血管組織は、カルスと呼ばれる新しい骨の形成に栄養を提供します。骨治癒プロセスの最終段階はリモデリング段階であり、活性化された破骨細胞のレベルの増加により仮骨のサイズが正常な骨のサイズに縮小されます(59)。各グループの仮骨形成レベルの違いを観察するために、マイクロ CT スキャンを使用して骨折部位の三次元 (3D) 再構成が実行されました。大腿骨の断面を観察して、骨折した骨の周囲の仮骨の厚さを観察します (図 6、B および C)。また、X 線を使用して毎週すべてのグループの骨折部位を検査し、各グループの異なる骨再生プロセスを観察しました (図 S9)。カルスと成熟骨はそれぞれ青/緑とアイボリーで表示されます。ほとんどの軟組織は、事前に設定されたしきい値でフィルタリングされます。ヌード陽性および SHP により、骨折部位の周囲に少量の仮骨の形成が確認されました。一方、露出した LOIS のネガと骨折部位は厚い仮骨に囲まれています。マイクロ CT 画像は、カルスの形成が細菌感染と感染に関連した炎症によって妨げられていることを示しました。これは、免疫系が骨の回復よりも、感染症に関連した炎症によって引き起こされる敗血症性損傷の治癒を優先するためです(60)。破骨細胞の活性と骨吸収を観察するために、IHC および酒石酸耐性酸性ホスファターゼ (TRAP) 染色が行われました (図 6D) (61)。ネイキッドポジティブおよびSHPでは、紫色に染色された活性化された破骨細胞が少数しか見つかりませんでした。一方、LOIS の裸の陽性骨と成熟骨の近くには、多くの活性化された破骨細胞が観察されました。この現象は、破骨細胞の存在下で、骨折部位周囲の仮骨が激しい再構築プロセスを受けていることを示しています (62)。マイクロ CT スキャンと IHC の結果を定量化するために、すべてのグループの骨折部位周囲の仮骨形成レベルを比較するために、仮骨の骨量と破骨細胞の発現面積を測定しました (図 6E、1 および 2)。予想通り、LOIS におけるネイキッド ネガティブとカルス形成は他のグループよりも有意に高く、ポジティブな骨リモデリングが起こったことを示しています (63)。図S10は、手術部位の光学画像、ネジの近くで収集された組織のMT染色結果、およびネジと骨の境界面を強調するTRAP染色結果を示しています。裸の基材では、強いカルスと線維症の形成が観察されましたが、LOIS 処理したインプラントは比較的接着されていない表面を示しました。同様に、白い矢印で示すように、裸の陰性と比較して、LOIS を移植したウサギでは線維症の低下が観察されました。さらに、固い浮腫 (青い矢印) は LOIS の免疫回避特性に起因すると考えられ、それによって重度の炎症が軽減されます。インプラント周囲の非粘着性の表面と線維化の減少は、除去プロセスが容易であることを示唆していますが、通常は他の骨折や炎症を引き起こします。ネジ除去後の骨治癒プロセスは、ネジと骨の界面での破骨細胞の活性によって評価されました。裸の骨と LOIS インプラント界面の両方が、骨の治癒を促進するために同レベルの破骨細胞を吸収しました。これは、LOIS コーティングが骨の治癒や免疫応答に悪影響を及ぼさないことを示しています。LOIS で行われた表面修飾が骨治癒プロセスを妨げないことを確認するために、X 線検査を使用して、マイナスイオンを曝露したウサギと LOIS を 6 週間移植したウサギの骨治癒を比較しました (図 6F)。結果は、非感染ヌード陽性グループと比較して、LOIS は同程度の骨治癒を示し、両グループに明らかな骨折の兆候 (連続的な骨溶解線) がないことを示しました。
(A) 骨折後の骨の治癒過程の模式図。(B) 各表面グループの仮骨形成度の違い、および (C) 骨折部位の断面画像。(D) 破骨細胞の活性と骨吸収を視覚化するための TRAP 染色。TRAP 活性に基づいて、皮質骨の外仮骨の形成を (E) (1) マイクロ CT および (2) 破骨細胞活性によって定量的に分析しました。(F) 移植の 6 週間後、露出したネガ (赤い破線の長方形で強調表示) および LOIS (青い破線の長方形で強調表示) の骨折した骨の X 線画像。統計分析は一元配置分散分析 (ANOVA) によって実行されました。* P <0.05。** P <0.01。
つまり、LOIS は、整形外科用インプラントに新しいタイプの抗菌感染戦略と免疫回避コーティングを提供します。SHP 機能を備えた従来の整形外科用インプラントは、短期的な抗生物付着特性を示しますが、その特性を長期間維持することはできません。基材の超疎水性により細菌と基材の間に気泡が閉じ込められ、エアポケットが形成され、細菌の感染が防止されます。ただし、空気の拡散により、これらのエアポケットは簡単に除去されます。一方で、LOIS はバイオフィルム関連の感染を防ぐ能力があることが十分に証明されています。したがって、層状マイクロ/ナノ構造表面に注入された潤滑剤層の抗拒絶特性により、感染に関連した炎症を防ぐことができます。LOIS 製造条件を最適化するために、SEM、AFM、XPS、CA 測定などのさまざまな特性評価方法が使用されます。さらに、LOIS は、PLGA、Ti、PE、POM、PPSU など、整形外科用固定装置で一般的に使用されるさまざまな生体材料にも適用できます。次に、LOIS は、細菌や免疫応答に関連する生物学的物質に対する抗生物付着特性を証明するために in vitro でテストされました。その結果、裸のインプラントと比較して、優れた抗菌効果と抗生物付着効果があることがわかりました。さらに、LOIS は形成外科では避けられない機械的ストレスを加えた後でも機械的強度を示します。マイクロ/ナノ構造の表面上の潤滑剤の自己修復特性により、LOIS はその抗生物汚れ特性を維持することに成功しました。LOIS の生体適合性と抗菌特性を in vivo で研究するために、LOIS をウサギの大腿骨に 4 週間移植しました。LOISを移植したウサギでは細菌感染は観察されませんでした。さらに、IHC の使用により局所免疫応答レベルの低下が実証され、LOIS が骨治癒プロセスを阻害しないことが示されました。LOIS は優れた抗菌性と免疫回避特性を示し、整形外科手術、特に骨合成の前後でバイオフィルムの形成を効果的に防止することが証明されています。ウサギ骨髄炎症性大腿骨骨折モデルを使用して、プレインキュベートされたインプラントによって誘発される骨治癒プロセスに対するバイオフィルム関連感染の影響が詳しく研究されました。今後の研究として、治癒過程全体でのバイオフィルム関連感染を完全に理解し予防するために、移植後の感染の可能性を研究するには、新しい in vivo モデルが必要です。さらに、骨誘導は、LOIS との統合において依然として未解決の課題です。この課題を克服するには、骨誘導細胞の選択的接着または再生医療と LOIS を組み合わせるには、さらなる研究が必要です。全体として、LOIS は、機械的堅牢性と優れた抗生物付着特性を備えた有望な整形外科用インプラント コーティングであり、SSI と免疫副作用を軽減できます。
15mm x 15mm x 1mm 304 SS 基板 (Dong Kang M-Tech Co.、韓国) をアセトン、EtOH、および脱イオン水で 15 分間洗浄して、汚染物質を除去します。表面にマイクロ/ナノレベルの構造を形成するために、洗浄した基板を50℃の48%～51%のHF溶液(DUKSAN Corp.、韓国)に浸漬します。エッチング時間は0分から60分まで変化します。次に、エッチングされた基板を脱イオン水で洗浄し、５０℃の６５％ＨＮＯ３（韓国ＤＵＫＳＡＮ社）溶液中に３０分間入れて、表面に酸化クロム不動態層を形成した。パッシベーション後、基板を脱イオン水で洗浄し、乾燥させて、層状構造を有する基板を得る。次に、基板を酸素プラズマに曝露し（１００Ｗ、３分間）、すぐに８．８８ｍＭ ＰＯＴＳ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ドイツ）のトルエン溶液に室温で１２時間浸漬した。次に、ＰＯＴＳでコーティングされた基板をＥｔＯＨで洗浄し、１５０℃で２時間アニールして、緻密なＰＯＴＳ ＳＡＭを得た。SAM コーティング後、パーフルオロポリエーテル潤滑剤 (Krytox 101、DuPont、USA) を 20 μm/cm 2 の塗布量で塗布することにより、基板上に潤滑剤層を形成しました。使用前に、潤滑剤を 0.2 ミクロンのフィルターで濾過します。45°の角度で 15 分間傾けて、余分な潤滑剤を除去します。304 SS 製の整形外科用インプラントにも同じ製造手順が使用されました (ロッキング プレートと皮質ロッキング ネジ、Dong Kang M-Tech Co.、韓国)。すべての整形外科用インプラントは、ウサギの大腿骨の形状に適合するように設計されています。
基板および整形外科用インプラントの表面形態は、電界放射型 SEM (Inspect F50、FEI、米国) および AFM (XE-100、Park Systems、韓国) によって検査されました。表面粗さ（Ｒａ、Ｒｑ）は、面積２０μｍ×２０μｍで測定する（ｎ＝４）。スポットサイズ 100μm2 の Al Kα X 線源を備えた XPS (PHI 5000 VersaProbe、ULVAC PHI、日本) システムを使用して、表面の化学組成を分析しました。液体CAおよびSAの測定には、動的画像キャプチャカメラを備えたCA測定システム（SmartDrop、FEMTOBIOMED、韓国）を使用しました。各測定では、6 ～ 10 μl の液滴 (脱イオン水、馬の血液、EG、30% エタノール、および HD) を表面に置き、CA を測定します。基板の傾斜角を２°／ｓの速度で増加させたとき（ｎ＝４）、液滴が落下するときのＳＡを測定する。
緑膿菌 [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] および MRSA (ATCC 25923) は ATCC (米国バージニア州マナサス) から購入し、保存培養物を -80°C で維持しました。使用前に、凍結培養物をトリプシン解凍大豆ブロス（Komed、韓国）中で37℃で18時間インキュベートし、その後2回移して活性化させた。インキュベーション後、培養物を４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、ＰＢＳ（ｐＨ７．３）溶液で２回洗浄した。遠心分離された培養物は、血液寒天プレート (BAP) 上で継代培養されます。MRSA および緑膿菌を一晩調製し、Luria-Bertani ブロスで培養しました。接種材料中の緑膿菌およびMRSAの濃度は、寒天上で段階希釈した懸濁液のCFUによって定量的に決定した。次に、細菌濃度を 0.5 マクファーランド標準 (108 CFU/ml に相当) に調整します。次に、作業用細菌懸濁液を 106 CFU/ml まで 100 倍に希釈します。抗菌接着特性をテストするために、基材は使用前に 121°C で 15 分間滅菌されました。次いで、基質を２５ｍｌの細菌懸濁液に移し、激しく振盪（２００ｒｐｍ）しながら３７℃で１２時間および７２時間インキュベートした。インキュベーション後、各基板をインキュベーターから取り出し、ＰＢＳで３回洗浄して、表面上の浮遊細菌を除去した。基板上のバイオフィルムを観察するために、メタノールでバイオフィルムを固定し、1mlのクリミジンオレンジで2分間染色した。次に、蛍光顕微鏡 (BX51TR、オリンパス、日本) を使用して、染色されたバイオフィルムの写真を撮影しました。基板上のバイオフィルムを定量するために、付着細菌を除去するのに最も適した方法と考えられるビーズボルテックス法により、付着細胞を基板から分離した（n = 4）。滅菌鉗子を使用して、成長培地から基板を取り外し、ウェルプレートを軽く叩いて余分な液体を取り除きます。緩く付着した細胞を、滅菌ＰＢＳで２回洗浄することによって除去した。次いで、各基質を、９ｍｌの０．１％プロテインエプト生理食塩水（ＰＳＷ）および２ｇの２０〜２５個の滅菌ガラスビーズ（直径０．４〜０．５ｍｍ）を含む滅菌試験管に移した。次に、サンプルから細胞を分離するために 3 分間ボルテックスしました。ボルテックスした後、懸濁液を０．１％ＰＳＷで１０倍に連続希釈し、次いで各希釈液０．１ｍｌをＢＡＰ上に接種した。37℃で24時間インキュベートした後、CFUを手動でカウントしました。
細胞としては、マウス線維芽細胞NIH/3T3（CRL-1658；American ATCC）およびマウスマクロファージRAW 264.7（TIB-71；American ATCC）を使用した。ダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM; LM001-05、Welgene、韓国) を使用してマウス線維芽細胞を培養し、10% 子牛血清 (S103-01、Welgene) および 1% ペニシリン - ストレプトマイシン (PS ; LS202-02、Welgene (Welgene) を補充します) ) 10% ウシ胎児血清 (S001-01、Welgene) および 1% PS を添加した DMEM を使用してマウス マクロファージを培養し、基質を 6 ウェル細胞培養プレートに置き、105 細胞/cm2 で細胞を接種します。細胞を 37℃、5% CO2 で一晩インキュベートし、細胞を 4% パラホルムアルデヒドで 20 分間固定し、0.5% Triton X に入れて 50nM テトラメチルローダミンに浸漬して 5 分間インキュベートしました。インキュベーションプロセス後、4',6-ジアミノ-2-フェニルインドール (H -1200、Vector Laboratories、英国) VECTASHIELD 固定培地を使用します (タンパク質の場合、n = 4)。 、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネートアルブミン（A9771、Sigma-Aldrich、ドイツ）およびヒト血漿 Alexa Fluor 488 結合フィブリノーゲン（F13191、Invitrogen、米国）を PBS（10 mM、pH 7.4）に溶解しました。アルブミンおよびフィブリノーゲンの濃度は、それぞれ1および150μg/mlであった。基板をタンパク質溶液に浸す前に、PBS でリンスして表面を再水和します。次に、タンパク質溶液を含む 6 ウェル プレートにすべての基質を浸し、37℃で 30 分間および 90 分間インキュベートします。インキュベーション後、基板をタンパク質溶液から取り出し、PBS で 3 回穏やかに洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで固定しました (各タンパク質につき n = 4)。カルシウムについては、塩化ナトリウム（０．２１Ｍ）およびリン酸カリウム（３．７７ｍＭ）を脱イオン水に溶解した。塩酸溶液（１Ｍ）を添加することにより、溶液のｐＨを２．０に調整した。次いで、塩化カルシウム（５．６２ｍＭ）を溶液に溶解した。1M トリス(ヒドロキシメチル)-アミノ メタンを添加することにより、溶液の pH が 7.4 に調整されます。1.5×リン酸カルシウム溶液を満たした6ウェルプレートにすべての基質を浸し、30分後に溶液から取り出します。染色には、アリザリン レッド S (CI 58005) 2 g を脱イオン水 100 ml と混合します。次に、10% 水酸化アンモニウムを使用して pH を 4 に調整します。基板をアリザリン レッド溶液で 5 分間染色し、その後余分な染料を振り落としてブロットします。振とう処理後、基板を取り外します。材料を脱水し、次にアセトンに５分間浸漬し、次にアセトン－キシレン（１：１）溶液に５分間浸漬し、最後にキシレンで洗浄する（ｎ＝４）。×10および×20の対物レンズを備えた蛍光顕微鏡（Axio Imager）を使用します。。A2m、Zeiss、ドイツ）はすべての基板を画像化します。ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) を使用して、4 つの異なるイメージング領域の各グループ上の生体物質の付着データを定量化しました。すべての画像を、基質比較用の固定しきい値を使用してバイナリ画像に変換します。
Zeiss LSM 700 共焦点顕微鏡を使用して、PBS 内の潤滑剤層の安定性を反射モードで監視しました。潤滑層を注入したフッ素ベースの SAM コーティングガラスサンプルを PBS 溶液に浸漬し、オービタルシェーカー (SHO-1D、Daihan Scientific、韓国) を使用して穏やかな振盪条件 (120 rpm) で試験しました。次にサンプルを採取し、反射光の損失を測定することで潤滑剤の損失を監視します。反射モードで蛍光画像を取得するには、光がサンプルから反射されるため、サンプルを 633 nm レーザーに照射して収集します。サンプルは、0、30、60、および 120 時間の時間間隔で測定されました。
整形外科用インプラントのナノ機械的特性に対する表面改質プロセスの影響を決定するために、三角錐形の Berkovich ダイヤモンドチップを備えたナノインデンター (TI 950 TriboIndenter、Hysitron、米国) を使用してナノインデンジオンを測定しました。ピーク荷重は10mN、面積は100μm×100μmです。すべての測定において、荷重および除荷時間は 10 秒、ピーク押し込み荷重下での保持時間は 2 秒です。5 つの異なる場所から測定し、平均を取ります。荷重下での機械的強度性能を評価するために、万能試験機 (Instron 5966、Instron、USA) を使用して横方向 3 点曲げ試験を実行しました。基板は、荷重を増加しながら 10 N/s の一定速度で圧縮されます。Bluehill Universal ソフトウェア プログラム (n = 3) を使用して、曲げ弾性率と最大圧縮応力を計算しました。
手術プロセスおよび手術中に生じる関連する機械的損傷をシミュレートするために、手術プロセスを in vitro で実行しました。大腿骨は処刑されたニュージーランド白ウサギから採取されました。大腿骨を洗浄し、4% パラホルムアルデヒドで 1 週間固定しました。動物実験方法で説明したように、固定された大腿骨は外科的に手術されました。手術後、整形外科用インプラントを血液 (馬の血、KISAN、韓国) に 10 秒間浸漬し、機械的損傷を加えた後に血液癒着が発生したかどうかを確認しました (n = 3)。
合計 24 匹の雄ニュージーランド白ウサギ (体重 3.0 ～ 3.5kg、平均月齢 6 か月) を、ヌード ネガティブ、ヌード ポジティブ、SHP、LOIS の 4 つのグループにランダムに分けました。動物を含むすべての手順は、施設内動物管理使用委員会の倫理基準 (IACUC 承認済み、KOREA-2017-0159) に従って実行されました。整形外科用インプラントは、骨折固定用の 5 つの穴 (長さ 41 mm、幅 7 mm、厚さ 2 mm) と皮質固定ネジ (長さ 12 mm、直径 2.7 mm) を備えたロッキング プレートで構成されます。ベアネガティブ群で使用したプレートとスクリューを除き、すべてのプレートとスクリューを MRSA 懸濁液 (106 CFU/ml) 中で 12 時間インキュベートしました。裸の陰性グループ (n=6) は、感染の陰性対照として、細菌懸濁液に曝露せずに裸の表面インプラントで治療されました。裸の陽性グループ (n = 6) は、感染症の陽性対照として、細菌に曝露された裸の表面インプラントで治療されました。SHP グループ (n = 6) は、細菌にさらされた SHP インプラントで治療されました。最後に、LOIS グループは細菌にさらされた LOIS インプラントで治療されました (n = 6)。すべての動物はケージに入れられ、大量の餌と水が与えられます。手術前にウサギを 12 時間絶食させた。誘導のためにキシラジン(5mg/kg)の筋肉内注射およびパクリタキセル(3mg/kg)の静脈内注射によって動物を麻酔した。その後、麻酔を維持するために、呼吸器系を通じて 2% イソフルランと 50% ～ 70% の医療用酸素 (流量 2 L/min) を供給します。これは、大腿骨外側に直接アプローチして埋め込まれます。皮膚を脱毛し、ポビドンヨードで消毒した後、左大腿骨中骨の外側に長さ約６ｃｍの切開を行った。大腿骨を覆っている筋肉の間の隙間を開けることで、大腿骨が完全に露出します。プレートを大腿骨骨幹部の前に置き、4 本のネジで固定します。固定後、鋸刃（厚さ 1 mm）を使用して、2 番目の穴と 4 番目の穴の間の領域に人工的に破断を作成します。手術の最後に、傷を生理食塩水で洗浄し、縫合糸で閉じました。各ウサギに、生理食塩水で３分の１に希釈したエンロフロキサシン（５ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射した。骨の骨切りを確認するために、すべての動物で大腿骨の術後 X 線写真を撮影しました (0、7、14、21、28、および 42 日)。深い麻酔の後、28日および42日にすべての動物を静脈内KCl(2mmol/kg)によって屠殺した。実行後、大腿骨をマイクロ CT でスキャンして、骨治癒過程と新骨形成を 4 つのグループ間で観察および比較しました。
実行後、整形外科用インプラントと直接接触していた軟組織が収集されました。組織を10%中性緩衝ホルマリン中で一晩固定し、その後EtOH中で脱水した。脱水した組織をパラフィンに包埋し、ミクロトーム (400CS; EXAKT, Germany) を使用して 40 μm の厚さに切片化しました。感染を視覚化するために、H&E 染色と MT 染色を実行しました。宿主の反応を確認するために、切片組織をウサギ抗 TNF-α 一次抗体 (AB6671、Abcam、米国) およびウサギ抗 IL-6 (AB6672、Abcam、米国) とインキュベートし、その後西洋わさびで処理しました。オキシダーゼ。メーカーの指示に従って、アビジン ビオチン複合体 (ABC) 染色システムを切片に適用します。茶色の反応生成物として現れるために、すべての部分で 3,3-ジアミノベンジジンを使用しました。デジタル スライド スキャナー (Pannoramic 250 Flash III、3DHISTECH、ハンガリー) を使用してすべてのスライスを視覚化し、各グループの少なくとも 4 つの基板を ImageJ ソフトウェアで分析しました。
骨折治癒をモニターするために、手術後および毎週、すべての動物の X 線画像を撮影しました (グループあたり n=6)。実行後、高解像度マイクロ CT を使用して、治癒後の大腿骨周囲の仮骨の形成を計算しました。得られた大腿骨を洗浄し、４％パラホルムアルデヒドで３日間固定し、７５％エタノールで脱水した。次に、マイクロ CT (SkyScan 1173、Brooke Micro-CT、キャンディ、ベルギー) を使用して脱水骨をスキャンし、骨サンプルの 3D ボクセル画像 (2240 × 2240 ピクセル) を生成しました。1.0 mm Al フィルターを使用して信号ノイズを低減し、すべてのスキャンに高解像度を適用します (E = 133 kVp、I = 60 μA、積分時間 = 500 ms)。Nrecon ソフトウェア (バージョン 1.6.9.8、Bruker microCT、コンティヒ、ベルギー) を使用して、取得した 2D 横方向投影からスキャンされたサンプルの 3D ボリュームを生成しました。解析のために、3D 再構成画像は骨折部位に応じて 10mm×10mm×10mm の立方体に分割されます。皮質骨の外側のカルスを計算します。DataViewer (バージョン 1.5.1.2; Bruker microCT、ベルギー、コンティヒ) ソフトウェアを使用して、スキャンした骨ボリュームをデジタル的にリダイレクトし、CT-Analyzer (バージョン 1.14.4.1、Bruker microCT、ベルギー、コンティヒ) ソフトウェアを分析に使用しました。成熟した骨と仮骨の相対的な X 線吸収係数はそれらの密度によって区別され、仮骨の体積が定量化されます (n = 4)。LOIS の生体適合性が骨治癒過程を遅らせないことを確認するために、裸陰性群と LOIS 群の 2 匹のウサギで追加の X 線およびマイクロ CT 分析を実行しました。両方のグループは 6 週間目に処刑されました。
屠殺した動物の大腿骨を収集し、4% パラホルムアルデヒド中で 3 日間固定しました。次に、整形外科用インプラントが大腿骨から慎重に除去されます。大腿骨は、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ＥＣ－９００、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して２１日間脱灰した。次に、脱灰した大腿骨を EtOH に浸漬して脱水しました。脱水した大腿骨をキシレン中で取り出し、パラフィンに包埋した。次に、サンプルを自動回転ミクロトーム (Leica RM2255、Leica Biosystems、ドイツ) で厚さ 3 μm にスライスしました。TRAP 染色 (F6760、Sigma-Aldrich、ドイツ) では、切片サンプルを脱パラフィンし、再水和し、TRAP 試薬中で 37°C で 1 時間インキュベートしました。画像は、スライド スキャナー (Pannoramic 250 Flash III、3DHISTECH、ハンガリー) を使用して取得し、染色領域の面積範囲を測定することによって定量化しました。各実験では、各グループの少なくとも 4 つの基板が ImageJ ソフトウェアによって分析されました。
統計的有意性分析は、GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.、米国) を使用して実行されました。対応のない t 検定と一元配置分散分析 (ANOVA) を使用して、評価グループ間の差異を検定しました。有意水準は図に次のように示されます:*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.0001。NS、大きな違いはありません。
この記事の補足資料については、http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1 を参照してください。
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整形外科用インプラントの抗菌コーティングおよび免疫回避コーティングは、感染症および感染症によって引き起こされる免疫反応を軽減します。
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