Dla pacjentów poddawanych operacji wszczepienia implantu ortopedycznego infekcje bakteryjne i wywołana infekcjami odpowiedź immunologiczna zawsze stanowiły ryzyko zagrażające życiu.Konwencjonalne materiały biologiczne są podatne na skażenie biologiczne, co powoduje przedostawanie się bakterii do uszkodzonego obszaru i wywoływanie infekcji pooperacyjnej.Dlatego istnieje pilna potrzeba opracowania powłok przeciwinfekcyjnych i ochronnych do implantów ortopedycznych.Tutaj opracowaliśmy zaawansowaną technologię modyfikacji powierzchni implantów ortopedycznych zwaną smarowaną powierzchnią implantu ortopedycznego (LOIS), która jest inspirowana gładką powierzchnią dzbanów roślin dzbanowych.LOIS ma długotrwałą i silną odporność na działanie cieczy i substancji biologicznych (w tym komórek, białek, wapnia i bakterii).Ponadto potwierdziliśmy wytrzymałość mechaniczną na zarysowania i siłę mocowania, symulując nieuniknione uszkodzenia podczas operacji in vitro.Do dokładnego zbadania właściwości przeciwbiologicznych i właściwości przeciwinfekcyjnych LOIS wykorzystano model złamania kości udowej z zapaleniem szpiku kostnego królika.Wyobrażamy sobie, że LOIS, który ma właściwości przeciwporostowe i trwałość mechaniczną, będzie krokiem naprzód w chirurgii ortopedycznej wolnej od infekcji.
Obecnie, w związku z ogólnym starzeniem się, liczba pacjentów cierpiących na choroby ortopedyczne (takie jak złamania u osób starszych, choroby zwyrodnieniowe stawów i osteoporoza) znacznie wzrosła (1, 2).Dlatego placówki medyczne przywiązują dużą wagę do chirurgii ortopedycznej, w tym do implantów ortopedycznych śrub, płytek, gwoździ i sztucznych stawów (3, 4).Jednakże donoszono, że tradycyjne implanty ortopedyczne są podatne na adhezję bakterii i tworzenie się biofilmu, co może powodować zakażenie miejsca operowanego (ZMO) po operacji (5, 6).Kiedy na powierzchni implantu ortopedycznego utworzy się biofilm, jego usunięcie staje się niezwykle trudne nawet przy stosowaniu dużych dawek antybiotyków.Dlatego zwykle prowadzi do ciężkich infekcji pooperacyjnych (7, 8).Ze względu na powyższe problemy leczenie zakażonych implantów powinno obejmować reoperację, obejmującą usunięcie wszystkich implantów i otaczających tkanek;dlatego pacjent będzie odczuwał silny ból i pewne ryzyko (9, 10).
Aby rozwiązać niektóre z tych problemów, opracowano implanty ortopedyczne uwalniające leki, które zapobiegają infekcjom poprzez eliminację bakterii przyczepionych do powierzchni (11, 12).Strategia ta nadal jednak wykazuje kilka ograniczeń.Donoszono, że długotrwałe wszczepienie implantów uwalniających leki spowodowało uszkodzenie otaczających tkanek i wywołało stan zapalny, który może prowadzić do martwicy (13, 14).Ponadto rozpuszczalniki organiczne, które mogą powstawać po procesie produkcji implantów ortopedycznych uwalniających leki, co jest surowo zabronione przez amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków, wymagają dodatkowych etapów oczyszczania, aby spełnić jej standardy (15).Implanty uwalniające leki stanowią wyzwanie w kontekście kontrolowanego uwalniania leków, a ze względu na ograniczone obciążenie lekiem długotrwałe stosowanie leku nie jest możliwe (16).
Inną powszechną strategią jest pokrycie implantu polimerem przeciwporostowym, aby zapobiec przyleganiu materii biologicznej i bakterii do powierzchni (17).Na przykład polimery obojnacze przyciągają uwagę ze względu na ich właściwości nieadhezyjne w kontakcie z białkami osocza, komórkami i bakteriami.Ma jednak pewne ograniczenia związane ze stabilnością długoterminową i trwałością mechaniczną, które utrudniają jego praktyczne zastosowanie w implantach ortopedycznych, zwłaszcza ze względu na mechaniczne zarysowania podczas zabiegów chirurgicznych (18, 19).Dodatkowo, ze względu na wysoką biokompatybilność, brak konieczności operacji usuwania oraz właściwości czyszczenia powierzchni poprzez korozję, stosuje się implanty ortopedyczne wykonane z materiałów biodegradowalnych (20, 21).Podczas korozji wiązania chemiczne pomiędzy matrycą polimerową zostają rozerwane i odłączone od powierzchni, a spoiwa oczyszczają powierzchnię.Jednakże zanieczyszczenia antybakteryjne poprzez czyszczenie powierzchni są skuteczne w krótkim czasie.Ponadto większość materiałów wchłanialnych, w tym poli(kopolimer kwasu mlekowego i kwasu glikolowego) (PLGA), kwas polimlekowy (PLA) i stopy na bazie magnezu, ulegną nierównomiernej biodegradacji i erozji w organizmie, co negatywnie wpłynie na stabilność mechaniczną.(dwadzieścia dwa).Ponadto biodegradowalne fragmenty płytek stanowią miejsce do przyczepiania się bakterii, co w dłuższej perspektywie zwiększa ryzyko infekcji.Ryzyko degradacji mechanicznej i infekcji ogranicza praktyczne zastosowanie chirurgii plastycznej (23).
Powierzchnie superhydrofobowe (SHP), które naśladują hierarchiczną strukturę liści lotosu, stały się potencjalnym rozwiązaniem dla powierzchni przeciwporostowych (24, 25).Gdy powierzchnia SHP zostanie zanurzona w cieczy, pęcherzyki powietrza zostaną uwięzione, tworząc w ten sposób kieszenie powietrzne i zapobiegając przyleganiu bakterii (26).Jednakże ostatnie badania wykazały, że powierzchnia SHP ma wady związane z trwałością mechaniczną i długoterminową stabilnością, co utrudnia jej zastosowanie w implantach medycznych.Co więcej, kieszenie powietrzne rozpuszczą się i stracą swoje właściwości przeciwporostowe, co spowoduje szerszą adhezję bakterii ze względu na dużą powierzchnię powierzchni SHP (27, 28).Niedawno Aizenberg i współpracownicy wprowadzili innowacyjną metodę powlekania powierzchni przeciw biofoulingowi, opracowując gładką powierzchnię inspirowaną rośliną dzbanową Nepenthes (29, 30).Gładka powierzchnia wykazuje długoterminową stabilność w warunkach hydraulicznych, jest wyjątkowo odporna na ciecze biologiczne i ma właściwości samonaprawy.Nie ma jednak metody nakładania powłoki na implant medyczny o złożonym kształcie ani nie udowodniono, że wspomaga ona proces gojenia uszkodzonej tkanki po wszczepieniu.
Tutaj przedstawiamy smarowaną powierzchnię implantu ortopedycznego (LOIS), powierzchnię implantu ortopedycznego o mikro/nanostrukturze, ściśle połączoną z cienką warstwą smaru, aby zapobiec powiązaniu jej z chirurgią plastyczną. Infekcje bakteryjne, takie jak stabilizacja złamania.Ponieważ struktura na poziomie mikro/nano funkcjonalizowana fluorem mocno utrwala smar na strukturze, opracowany LOIS może w pełni odeprzeć przyczepność różnych cieczy i utrzymać działanie przeciwporostowe przez długi czas.Powłoki LOIS można nakładać na materiały o różnych kształtach przeznaczone do syntezy kości.Doskonałe właściwości przeciwporostowe LOIS wobec bakterii biofilmu [Pseudomonas aeruginosa i opornego na metycylinę Staphylococcus aureus (MRSA)] oraz substancji biologicznych (komórki, białka i wapń) zostały potwierdzone in vitro.Stopień przyczepności ekstensywnej przyczepności do podłoża jest mniejszy niż 1%.Ponadto, nawet po wystąpieniu naprężeń mechanicznych, takich jak zarysowanie powierzchni, samonaprawa spowodowana przez penetrujący smar pomaga zachować jego właściwości przeciwporostowe.Wyniki badań wytrzymałości mechanicznej pokazują, że nawet po modyfikacji strukturalnej i chemicznej wytrzymałość całkowita nie ulegnie znacznemu zmniejszeniu.Ponadto przeprowadzono eksperyment in vitro symulujący naprężenia mechaniczne w środowisku chirurgicznym, aby wykazać, że LOIS może wytrzymać różne naprężenia mechaniczne występujące podczas chirurgii plastycznej.Na koniec zastosowaliśmy model złamania kości udowej in vivo na królikach, który udowodnił, że LOIS ma doskonałe właściwości antybakteryjne i biokompatybilność.Wyniki radiologiczne i histologiczne potwierdziły, że stabilne działanie smarne i właściwości przeciwporostowe w ciągu 4 tygodni po implantacji mogą zapewnić skuteczne działanie przeciw infekcjom i ucieczkę odporności bez opóźniania procesu gojenia kości.
Rysunek 1A przedstawia schematyczny diagram opracowanego LOIS, któremu wszczepiono struktury w skali mikro/nano w modelu złamania kości udowej królika, aby potwierdzić jego doskonałe właściwości przeciwporostowe i przeciwinfekcyjne.Przeprowadzono metodę biomimetyczną w celu symulacji powierzchni rośliny doniczkowej i zapobiegania biofoulingowi poprzez wprowadzenie warstwy smaru w mikro/nanostrukturę powierzchni.Powierzchnia natryskiwana smarem może zminimalizować kontakt substancji biologicznych z powierzchnią.Dlatego też, dzięki tworzeniu stabilnych wiązań chemicznych na powierzchni, ma doskonałe działanie przeciwporostowe i długoterminową stabilność.W rezultacie właściwości przeciwporostowe powierzchni smarującej umożliwiają różne praktyczne zastosowania w badaniach biomedycznych.Jednak szeroko zakrojone badania dotyczące interakcji tej specjalnej powierzchni w organizmie nie zostały jeszcze zakończone.Porównując LOIS z nagimi podłożami in vitro przy użyciu albuminy i bakterii biofilmu, można potwierdzić nieadhezję LOIS (Rysunek 1B).Ponadto, spływając kropelki wody po nachylonym, gołym podłożu i podłożu LOIS (rysunek S1 i film S1), można wykazać skuteczność zanieczyszczenia biologicznego.Jak pokazano na obrazie mikroskopu fluorescencyjnego, odsłonięty substrat inkubowany w zawiesinie białka i bakterii wykazywał dużą ilość materiału biologicznego przylegającego do powierzchni.Jednakże, ze względu na doskonałe właściwości przeciwporostowe, LOIS prawie nie wykazuje fluorescencji.W celu potwierdzenia właściwości przeciwporostowych i przeciwinfekcyjnych LOIS nałożono na powierzchnię implantów ortopedycznych do syntezy kości (płytki i śruby) i umieszczono w modelu złamania królika.Przed implantacją goły implant ortopedyczny i LOIS inkubowano w zawiesinie bakteryjnej przez 12 godzin.Wstępna inkubacja zapewnia utworzenie biofilmu na powierzchni odsłoniętego implantu dla porównania.Rycina 1C przedstawia zdjęcie miejsca złamania 4 tygodnie po implantacji.Po lewej stronie królik z gołym implantem ortopedycznym wykazywał poważny stan zapalny w wyniku tworzenia się biofilmu na powierzchni implantu.Odwrotny wynik zaobserwowano u królików, którym wszczepiono LOIS, to znaczy otaczające tkanki LOIS nie wykazywały ani oznak infekcji, ani objawów stanu zapalnego.Ponadto obraz optyczny po lewej stronie wskazuje miejsce operacji królika z odsłoniętym implantem, co wskazuje, że na powierzchni LOIS nie znaleziono wielu klejów obecnych na powierzchni odsłoniętego implantu.Pokazuje to, że LOIS ma długoterminową stabilność i zdolność do utrzymywania swoich właściwości przeciwporostowych i przeciwadhezyjnych.
(A) Schematyczny diagram LOIS i jego implantacji w modelu złamania kości udowej królika.(B) Obraz z mikroskopu fluorescencyjnego białka i biofilmu bakteryjnego na gołej powierzchni i podłożu LOIS.4 tygodnie po implantacji, (C) zdjęcie fotograficzne miejsca złamania oraz (D) zdjęcie rentgenowskie (zaznaczone czerwonym prostokątem).Zdjęcie dzięki uprzejmości: Kyomin Chae, Uniwersytet Yonsei.
Wysterylizowane króliki, którym wszczepiono negatywną implantację, wykazywały normalny proces gojenia kości, bez żadnych oznak stanu zapalnego lub infekcji.Z drugiej strony implanty SHP inkubowane wstępnie w zawiesinie bakteryjnej wykazują zapalenie otaczających tkanek związane z infekcją.Można to przypisać jego niezdolności do hamowania adhezji bakterii przez długi czas (rysunek S2).Aby wykazać, że LOIS nie wpływa na proces gojenia, a jedynie hamuje ewentualne infekcje związane z implantacją, porównano zdjęcia rentgenowskie odsłoniętej macierzy dodatniej z LOIS w miejscu złamania (ryc. 1D).Zdjęcie rentgenowskie gołego, dodatniego implantu wykazało utrzymujące się linie osteolizy, co wskazuje, że kość nie została całkowicie wygojona.Sugeruje to, że proces regeneracji kości może być znacznie opóźniony z powodu stanu zapalnego związanego z infekcją.Wręcz przeciwnie, wykazało, że króliki, którym wszczepiono LOIS, zagoiły się i nie wykazywały żadnego widocznego miejsca złamania.
W celu opracowania implantów medycznych charakteryzujących się długoterminową stabilnością i funkcjonalnością (w tym odpornością na biofouling) włożono wiele wysiłków.Jednakże obecność różnych substancji biologicznych oraz dynamika adhezji tkanek ogranicza rozwój ich klinicznie wiarygodnych metod.Aby przezwyciężyć te niedociągnięcia, opracowaliśmy strukturę mikro/nanowarstwową i chemicznie zmodyfikowaną powierzchnię, która jest zoptymalizowana ze względu na dużą siłę kapilarną i powinowactwo chemiczne, aby w największym stopniu zachować najgładszy smar.Rysunek 2A przedstawia ogólny proces produkcyjny LOIS.Najpierw przygotuj podłoże ze stali nierdzewnej (SS) 304 klasy medycznej.Po drugie, mikro/nanostruktura jest tworzona na podłożu ze stali nierdzewnej poprzez trawienie chemiczne przy użyciu roztworu kwasu fluorowodorowego (HF).Aby przywrócić odporność korozyjną stali nierdzewnej, do obróbki wytrawionego podłoża stosuje się roztwór kwasu azotowego (HNO3) (31).Pasywacja zwiększa odporność na korozję podłoża SS i znacznie spowalnia proces korozji, który może obniżyć ogólną wydajność LOIS.Następnie, tworząc samoorganizującą się monowarstwę (SAM) z 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktylotrietoksysilanem (POTS), powierzchnia jest modyfikowana chemicznie w celu poprawy interakcji chemicznej pomiędzy powierzchnią a gładkim smarem Affinity.Modyfikacja powierzchni znacznie zmniejsza energię powierzchniową wytworzonej powierzchni o strukturze mikro/nano, która odpowiada energii powierzchniowej gładkiego smaru.Umożliwia to całkowite zwilżenie smaru i utworzenie w ten sposób stabilnej warstwy smaru na powierzchni.Zmodyfikowana powierzchnia wykazuje zwiększoną hydrofobowość.Wyniki pokazują, że śliski smar wykazuje stabilne zachowanie na LOIS ze względu na wysokie powinowactwo chemiczne i siłę kapilarną powodowaną przez strukturę mikro/nano (32, 33).Badano zmiany optyczne na powierzchni SS po modyfikacji powierzchni i wstrzyknięciu środka smarnego.Struktura mikro/nanowarstwowa utworzona na powierzchni może powodować zmiany wizualne i przyciemnienie powierzchni.Zjawisko to przypisuje się zwiększonemu efektowi rozpraszania światła na chropowatej powierzchni, co zwiększa rozproszone odbicie spowodowane przez mechanizm wychwytywania światła (34).Dodatkowo po wtryśnięciu lubrykantu LOIS ciemnieje.Warstwa smarująca powoduje, że od podłoża odbija się mniej światła, co powoduje przyciemnienie LOIS.Aby zoptymalizować mikrostrukturę/nanostrukturę w celu wykazania najmniejszego kąta poślizgu (SA) w celu uzyskania działania przeciw biofoulingowi, zastosowano skaningową mikroskopię elektronową (SEM) i pary atomów w celu uzyskania różnych czasów trawienia HF (0, 3)., 15 i 60 minut) Mikroskop siłowy (AFM) (Rysunek 2B).Obrazy SEM i AFM pokazują, że po krótkim czasie trawienia (3 minuty trawienia) na gołym podłożu utworzyła się nierówna szorstkość w skali nano.Chropowatość powierzchni zmienia się wraz z czasem trawienia (rysunek S3).Krzywa zmieniająca się w czasie pokazuje, że chropowatość powierzchni stale rośnie i osiąga maksimum po 15 minutach trawienia, a następnie obserwuje się jedynie nieznaczny spadek wartości chropowatości po 30 minutach trawienia.W tym momencie szorstkość na poziomie nano zostaje wytrawiona, podczas gdy szorstkość na poziomie mikro rozwija się energicznie, dzięki czemu zmiana chropowatości jest bardziej stabilna.Po trawieniu trwającym ponad 30 minut obserwuje się dalszy wzrost chropowatości, co szczegółowo wyjaśniono w następujący sposób: SS składa się ze stali stopowej z takimi pierwiastkami, jak żelazo, chrom, nikiel, molibden i wiele innych pierwiastków.Wśród tych pierwiastków ważną rolę w tworzeniu chropowatości stali SS w skali mikronowej/nano w wyniku trawienia HF odgrywają żelazo, chrom i molibden.We wczesnych stadiach korozji koroduje głównie żelazo i chrom, ponieważ molibden ma wyższą odporność na korozję niż molibden.W miarę postępu trawienia roztwór trawiący osiąga miejscowe przesycenie, tworząc fluorki i tlenki powstałe w wyniku trawienia.Fluor i tlenek wytrącają się i ostatecznie ponownie osadzają na powierzchni, tworząc chropowatość powierzchni w zakresie mikronów/nano (31).Ta szorstkość na poziomie mikro/nano odgrywa ważną rolę w samonaprawiających się właściwościach LOIS.Powierzchnia o podwójnej skali daje efekt synergistyczny, znacznie zwiększając siłę kapilarną.Zjawisko to umożliwia smarowi stabilną penetrację powierzchni i przyczynia się do właściwości samonaprawy (35).Powstawanie szorstkości zależy od czasu trawienia.Po 10 minutach trawienia powierzchnia wykazuje jedynie szorstkość w skali nano, która nie jest wystarczająca, aby utrzymać wystarczającą ilość smaru, aby uzyskać odporność na biofouling (36).Z drugiej strony, jeśli czas trawienia przekracza 30 minut, szorstkość w skali nano, powstająca w wyniku ponownego osadzania się żelaza i chromu, zniknie, a pozostaną jedynie szorstkość w skali mikro, spowodowana molibdenem.Przetrawiona powierzchnia nie ma chropowatości w skali nano i traci synergistyczny efekt dwustopniowej chropowatości, co negatywnie wpływa na właściwości samonaprawy LOIS.Pomiary SA przeprowadzono na podłożach o różnym czasie trawienia, aby wykazać działanie przeciwporostowe.Na podstawie lepkości i energii powierzchniowej wybrano różne rodzaje cieczy, w tym wodę dejonizowaną (DI), krew, glikol etylenowy (EG), etanol (EtOH) i heksadekan (HD) (rysunek S4).Zmienny w czasie wzór trawienia pokazuje, że dla różnych cieczy o różnych energiach powierzchniowych i lepkościach SA LOIS po 15 minutach trawienia jest najniższy.Dlatego LOIS jest zoptymalizowany do trawienia przez 15 minut w celu uzyskania chropowatości w skali mikronowej i nano, która jest odpowiednia do skutecznego utrzymania trwałości smaru i doskonałych właściwości przeciwporostowych.
(A) Schematyczny diagram czteroetapowego procesu produkcyjnego LOIS.Wstawka przedstawia SAM utworzony na podłożu.(B) Obrazy SEM i AFM stosowane do optymalizacji mikro/nanostruktury podłoża w różnych czasach trawienia.Widma rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronów (XPS) (C) Cr2p i (D) F1s po pasywacji powierzchni i pokryciu SAM.au, dowolna jednostka.(E) Reprezentatywne obrazy kropelek wody na gołych, wytrawionych podłożach SHP i LOIS.(F) Pomiar kąta zwilżania (CA) i SA cieczy o różnych napięciach powierzchniowych na SHP i LOIS.Dane wyrażono jako średnią ± SD.
Następnie, w celu potwierdzenia zmiany właściwości chemicznych powierzchni, zastosowano rentgenowską spektroskopię fotoelektronów (XPS) do badania zmiany składu chemicznego powierzchni podłoża po każdym pokryciu powierzchni.Figura 2C przedstawia wyniki pomiarów XPS powierzchni trawionej HF i powierzchni poddanej obróbce HNO3.Dwa główne piki przy 587,3 i 577,7 eV można przypisać wiązaniu Cr-O występującemu w warstwie tlenku chromu, co stanowi główną różnicę w porównaniu z powierzchnią trawioną HF.Dzieje się tak głównie na skutek zużycia fluorku żelaza i chromu na powierzchni przez HNO3.Trawienie na bazie HNO3 umożliwia chromowi utworzenie na powierzchni pasywacyjnej warstwy tlenku, co sprawia, że ​​wytrawiony SS jest ponownie odporny na korozję.Na rysunku 2D uzyskano widma XPS w celu potwierdzenia, że ​​na powierzchni po nałożeniu powłoki SAM utworzył się silan na bazie fluorowęglowodoru, który ma wyjątkowo wysoką odporność na ciecze nawet w przypadku EG, krwi i EtOH.Powłoka SAM jest uzupełniana poprzez reakcję silanowych grup funkcyjnych z grupami hydroksylowymi utworzonymi w wyniku obróbki plazmowej.W rezultacie zaobserwowano znaczny wzrost pików CF2 i CF3.Energia wiązania pomiędzy 286 a 296 eV wskazuje, że modyfikacja chemiczna została pomyślnie zakończona przez powłokę SAM.SHP wykazuje stosunkowo duże piki CF2 (290,1 eV) i CF3 (293,3 eV), które są spowodowane tworzeniem się na powierzchni silanu na bazie fluorowęglowodoru.Rysunek 2E przedstawia reprezentatywne obrazy optyczne pomiarów kąta zwilżania (CA) dla różnych grup wody dejonizowanej w kontakcie z gołą, wytrawioną, SHP i LOIS.Obrazy te pokazują, że wytrawiona powierzchnia staje się hydrofilowa ze względu na mikro/nanostrukturę utworzoną w wyniku trawienia chemicznego, dzięki czemu woda dejonizowana jest wchłaniana przez strukturę.Jednakże, gdy podłoże jest pokryte SAM, podłoże wykazuje silną hydrofobowość, w związku z czym na powierzchni tworzy się SHP, a powierzchnia kontaktu wody z powierzchnią jest mała.Ostatecznie zaobserwowano spadek CA w LOIS, co można przypisać wnikaniu środka smarnego w mikrostrukturę, zwiększając w ten sposób powierzchnię styku.Aby udowodnić, że powierzchnia ma doskonałe właściwości hydrofobowe i nieprzylepne, LOIS porównano z podłożem SHP, mierząc CA i SA przy użyciu różnych cieczy (rysunek 2F).Na podstawie lepkości i energii powierzchniowej wybrano różne rodzaje cieczy, w tym wodę dejonizowaną, krew, EG, EtOH i HD (rysunek S4).Wyniki pomiarów CA pokazują, że gdy CA ma tendencję do HD, wartość redukcji CA, gdzie CA ma najniższą energię powierzchniową.Ponadto LOIS całego urzędu certyfikacji jest niski.Pomiar SA pokazuje jednak zupełnie inne zjawisko.Z wyjątkiem wody jonizowanej wszystkie płyny przylegają do podłoża SHP bez ześlizgiwania się.Z drugiej strony LOIS wykazuje bardzo niski SA, gdzie gdy cała ciecz zostanie przechylona pod kątem mniejszym niż 10° do 15°, cała ciecz spłynie.To wyraźnie pokazuje, że nieprzyczepność LOIS jest lepsza niż powierzchni SHP.Ponadto powłoki LOIS nakłada się także na różnego rodzaju materiały, w tym na tytan (Ti), polifenylosulfon (PPSU), polioksymetylen (POM), polieteroeteroketon (PEEK) i polimery bioabsorbowalne (PLGA). Są to wszczepialne materiały ortopedyczne (Rysunek S5)).Kolejne obrazy kropelek na materiale poddanym obróbce LOIS pokazują, że właściwości LOIS zapobiegające biofoulingowi są takie same na wszystkich podłożach.Ponadto wyniki pomiarów CA i SA pokazują, że nieadhezyjne właściwości LOIS można zastosować do innych materiałów.
W celu potwierdzenia właściwości przeciwporostowych LOIS, różne rodzaje podłoży (w tym gołe, trawione, SHP i LOIS) inkubowano z Pseudomonas aeruginosa i MRSA.Te dwie bakterie wybrano jako reprezentatywne bakterie szpitalne, które mogą prowadzić do tworzenia biofilmów prowadzących do ZMO (37).Figura 3 (A i B) przedstawia obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego i wyniki pomiarów jednostek tworzących kolonię (CFU) substratów inkubowanych w zawiesinie bakteryjnej odpowiednio przez krótki okres (12 godzin) i długoterminowy (72 godziny).W krótkim czasie bakterie utworzą skupiska i powiększą się, pokrywając się substancjami śluzopodobnymi i uniemożliwiając ich usunięcie.Jednakże podczas 72-godzinnej inkubacji bakterie dojrzeją i staną się łatwe do rozproszenia, tworząc więcej kolonii lub skupisk.Można zatem uznać, że 72-godzinna inkubacja jest długoterminowa i jest odpowiednim czasem inkubacji do wytworzenia silnego biofilmu na powierzchni (38).W krótkim czasie wytrawiona powierzchnia i powierzchnia SHP wykazywały adhezję bakteryjną, która została zmniejszona o około 25% do 50% w porównaniu do gołego podłoża.Jednakże, ze względu na doskonałe działanie przeciwporostowe i stabilność, LOIS nie wykazał adhezji biofilmu bakteryjnego w perspektywie krótko- i długoterminowej.Schematyczny diagram (ryc. 3C) opisuje wyjaśnienie mechanizmu przeciwbiologicznego zanieczyszczenia roztworem trawiącym, SHP i LOIS.Zakłada się, że wytrawione podłoże o właściwościach hydrofilowych będzie miało większą powierzchnię niż podłoże gołe.Dlatego na wytrawionym podłożu wystąpi większa adhezja bakterii.Jednakże w porównaniu z gołym podłożem, wytrawione podłoże zawiera znacznie mniej biofilmu utworzonego na powierzchni.Dzieje się tak, ponieważ cząsteczki wody mocno wiążą się z powierzchnią hydrofilową i działają jak środek smarujący dla wody, zakłócając w ten sposób adhezję bakterii w krótkim okresie (39).Jednakże warstwa cząsteczek wody jest bardzo cienka i rozpuszczalna w zawiesinach bakteryjnych.W związku z tym warstwa molekularna wody na długi czas zanika, co prowadzi do rozległej adhezji i proliferacji bakterii.W przypadku SHP, ze względu na krótkotrwałe właściwości niezwilżające, hamowana jest adhezja bakterii.Zmniejszoną adhezję bakterii można przypisać kieszeniom powietrznym uwięzionym w warstwowej strukturze i niższej energii powierzchniowej, minimalizując w ten sposób kontakt zawiesiny bakteryjnej z powierzchnią.Jednakże w SHP zaobserwowano silną adhezję bakteryjną, ponieważ na długi czas utraciła ona swoje właściwości przeciwporostowe.Dzieje się tak głównie na skutek zaniku kieszeni powietrznych pod wpływem ciśnienia hydrostatycznego i rozpuszczania powietrza w wodzie.Dzieje się tak głównie ze względu na zanik kieszeni powietrznych w wyniku rozpuszczania oraz warstwową strukturę zapewniającą większą powierzchnię przylegania (27, 40).W przeciwieństwie do tych dwóch substratów, które mają istotny wpływ na długoterminową stabilność, smar zawarty w LOIS jest wstrzykiwany w strukturę mikro/nano i nie znika nawet w długim okresie.Smary wypełnione strukturami mikro/nano są bardzo stabilne i silnie przyciągają się do powierzchni ze względu na duże powinowactwo chemiczne, przez co na długi czas zapobiegają przyleganiu bakterii.Rysunek S6 przedstawia obraz z odbicia z mikroskopu konfokalnego podłoża nasyconego środkiem smarnym, zanurzonego w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).Ciągłe obrazy pokazują, że nawet po 120 godzinach lekkiego wstrząsania (120 obr./min) warstwa smaru na LOIS pozostaje niezmieniona, co wskazuje na długoterminową stabilność w warunkach przepływu.Wynika to z wysokiego powinowactwa chemicznego pomiędzy powłoką SAM na bazie fluoru a smarem na bazie perfluorowęglowodoru, dzięki czemu można utworzyć stabilną warstwę smaru.Dzięki temu działanie przeciwporostowe zostaje utrzymane.Ponadto substrat przetestowano pod kątem reprezentatywnych białek (albuminy i fibrynogenu) znajdujących się w osoczu, komórek ściśle związanych z funkcją odpornościową (makrofagi i fibroblasty) oraz białek związanych z tworzeniem kości.Zawartość wapnia jest bardzo wysoka.(Rysunek 3D, 1 i 2 oraz Rysunek S7) (41, 42).Ponadto obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego testu adhezji dla fibrynogenu, albuminy i wapnia wykazały różne właściwości adhezji każdej grupy substratów (rysunek S8).Podczas tworzenia kości nowo powstałe warstwy kości i wapnia mogą otaczać implant ortopedyczny, co nie tylko utrudnia jego usunięcie, ale może również spowodować nieoczekiwane obrażenia pacjenta podczas procesu usuwania.Dlatego niski poziom osadów wapnia na płytkach kostnych i śrubach jest korzystny w przypadku chirurgii ortopedycznej wymagającej usunięcia implantu.Na podstawie ilościowej oceny przyłączonego obszaru na podstawie intensywności fluorescencji i liczby komórek potwierdziliśmy, że LOIS wykazuje doskonałe właściwości przeciwporostowe w przypadku wszystkich substancji biologicznych w porównaniu z innymi substratami.Wyniki doświadczeń in vitro wykazały, że na implantach ortopedycznych można zastosować powłokę antybakteryjną LOIS, która nie tylko hamuje infekcje wywołane bakteriami biofilmu, ale także zmniejsza stany zapalne wywołane przez aktywny układ odpornościowy organizmu.
(A) Obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego każdej grupy (nagiej, wytrawionej, SHP i LOIS) inkubowanej w zawiesinach Pseudomonas aeruginosa i MRSA przez 12 i 72 godziny.(B) Liczba przylegających CFU Pseudomonas aeruginosa i MRSA na powierzchni każdej grupy.(C) Schematyczny diagram mechanizmu zanieczyszczenia antybiologicznego podczas krótko- i długoterminowego trawienia, SHP i LOIS.(D) (1) Liczba fibroblastów przylegających do każdego podłoża i obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego komórek przylegających do gołego podłoża i LOIS.(2) Test adhezji białek pochodzenia immunologicznego, albuminy i wapnia biorących udział w procesie gojenia kości (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 i **** P <0,0001).nie, nie ważne.
W przypadku nieuniknionych naprężeń skupionych, głównym wyzwaniem przy stosowaniu powłok przeciwporostowych zawsze była trwałość mechaniczna.Tradycyjne metody żelów przeciwściekowych opierają się na polimerach o niskiej rozpuszczalności w wodzie i kruchości.Dlatego są one zwykle podatne na naprężenia mechaniczne w zastosowaniach biomedycznych.Dlatego też mechanicznie trwałe powłoki przeciwporostowe pozostają wyzwaniem w zastosowaniach takich jak implanty ortopedyczne (43, 44).Rysunek 4A(1) przedstawia dwa główne rodzaje naprężeń wywieranych na implanty ortopedyczne, w tym drapanie (naprężenie ścinające) i ściskanie z optycznym obrazem uszkodzonego implantu wytwarzanym przez kleszcze.Na przykład, gdy śruba zostanie dokręcona śrubokrętem lub gdy chirurg mocno przytrzyma płytkę kostną pęsetą i zastosuje siłę ściskającą, plastikowa płytka kostna ulegnie uszkodzeniu i zarysowaniu zarówno w skali makro, jak i mikro/nano (Rysunek 4A, 2) .Aby sprawdzić, czy wytworzony LOIS jest w stanie wytrzymać te uszkodzenia podczas operacji plastycznej, wykonano nanoindentację w celu porównania twardości gołego podłoża z LOIS w skali mikro/nano w celu zbadania właściwości mechanicznych struktury mikro/nano. 4B).Schematyczny diagram pokazuje różne zachowanie się LOIS przy odkształceniu ze względu na obecność struktur mikro/nano.Na podstawie wyników nanoindentacji narysowano krzywą siła-przemieszczenie (rysunek 4C).Niebieski obraz przedstawia gołe podłoże, które wykazuje jedynie niewielkie odkształcenie, co widać po maksymalnej głębokości wcięcia wynoszącej 0,26 μm.Z drugiej strony stopniowy wzrost siły nanowcięcia i przemieszczenia obserwowany w LOIS (czerwona krzywa) może wykazywać oznaki pogorszenia właściwości mechanicznych, co skutkuje głębokością nanowcięcia wynoszącą 1,61 μm.Dzieje się tak dlatego, że mikro/nanostruktura obecna w LOIS zapewnia głębszą przestrzeń do rozwoju końcówki nanowgłębnika, dzięki czemu jego odkształcenie jest większe niż w przypadku gołego podłoża.Konsta-Gdoutos i in.(45) uważa, że ​​ze względu na obecność nanostruktur, nanowcięcia i mikro/nanochropowatość prowadzą do nieregularnych krzywych nanowcięć.Zacieniony obszar odpowiada nieregularnej krzywej odkształcenia przypisanej nanostrukturze, natomiast niezacieniony obszar przypisany jest mikrostrukturze.To odkształcenie może uszkodzić mikrostrukturę/nanostrukturę smaru trzymającego i negatywnie wpłynąć na jego działanie przeciwporostowe.Aby zbadać wpływ uszkodzeń na LOIS, odtworzono nieuniknione uszkodzenia mikro/nanostruktur w organizmie podczas operacji plastycznej.Stosując testy adhezji krwi i białek, można określić stabilność właściwości LOIS przeciw biofoulingowi po in vitro (Rysunek 4D).Seria obrazów optycznych pokazuje uszkodzenia, które wystąpiły w pobliżu otworów każdego podłoża.Przeprowadzono test przyczepności krwi, aby wykazać wpływ uszkodzeń mechanicznych na powłokę przeciwporostową (Rysunek 4E).Podobnie jak SHP, właściwości przeciwporostowe zanikają w wyniku uszkodzenia, a LOIS wykazuje doskonałe właściwości przeciwporostowe poprzez odpychanie krwi.Dzieje się tak dlatego, że ponieważ energia powierzchniowa jest napędzana przez działanie kapilarne pokrywające uszkodzony obszar, przepływ mikrostrukturalnego smaru przywraca właściwości przeciwporostowe (35).Tę samą tendencję zaobserwowano w teście adhezji białek z użyciem albuminy.W uszkodzonym obszarze powszechnie obserwuje się przyczepność białka do powierzchni SHP, a mierząc jej pokrycie powierzchni, można ją określić ilościowo jako połowę poziomu przyczepności gołego podłoża.Z drugiej strony LOIS zachował swoje właściwości przeciwporostowe, nie powodując adhezji (rysunek 4, F i G).Ponadto powierzchnia śruby jest często poddawana silnym obciążeniom mechanicznym, takim jak wiercenie, dlatego zbadaliśmy zdolność powłoki LOIS do zachowania nienaruszonego stanu na śrubie in vitro.Rysunek 4H przedstawia obrazy optyczne różnych śrub, w tym gołych, SHP i LOIS.Czerwony prostokąt reprezentuje obszar docelowy, w którym podczas implantacji kości występują silne naprężenia mechaniczne.Podobnie jak w przypadku testu adhezji białek płytki, mikroskop fluorescencyjny służy do obrazowania adhezji białek i pomiaru obszaru pokrycia w celu sprawdzenia integralności powłoki LOIS, nawet pod silnym naprężeniem mechanicznym (Rysunek 4, I i J).Śruby poddane obróbce LOIS wykazują doskonałe działanie przeciwporostowe i prawie żadne białko nie przylega do powierzchni.Z drugiej strony adhezję białek zaobserwowano w przypadku gołych śrub i śrub SHP, gdzie pokrycie powierzchni śrub SHP stanowiło jedną trzecią powierzchni nieosłoniętych śrub.Ponadto implant ortopedyczny stosowany do mocowania musi być wytrzymały mechanicznie, aby wytrzymać naprężenia działające na miejsce złamania, jak pokazano na rysunku 4K.W związku z tym przeprowadzono próbę zginania w celu określenia wpływu modyfikacji chemicznej na właściwości mechaniczne.Ponadto ma to na celu utrzymanie stałego naprężenia pochodzącego od implantu.Zastosuj pionową siłę mechaniczną, aż implant zostanie całkowicie złożony i uzyskana zostanie krzywa naprężenia-odkształcenia (ryc. 4L, 1).Porównano dwie właściwości, w tym moduł Younga i wytrzymałość na zginanie, pomiędzy podłożami gołymi i podłożami LOIS jako wskaźniki ich wytrzymałości mechanicznej (rysunek 4L, 2 i 3).Moduł Younga wskazuje zdolność materiału do wytrzymywania zmian mechanicznych.Moduł Younga każdego podłoża wynosi odpowiednio 41,48 ± 1,01 i 40,06 ± 0,96 GPa;zaobserwowana różnica wynosi około 3,4%.Ponadto podano, że wytrzymałość na zginanie, która określa wytrzymałość materiału, wynosi 102,34±1,51 GPa dla gołego podłoża i 96,99±0,86 GPa dla SHP.Gołe podłoże jest o około 5,3% wyższe.Niewielkie pogorszenie właściwości mechanicznych może być spowodowane efektem karbu.W efekcie karbu mikro/nanochropowatość może działać jak zbiór karbów, prowadząc do lokalnej koncentracji naprężeń i wpływając na właściwości mechaniczne implantu (46).Jednakże, biorąc pod uwagę fakt, że według doniesień sztywność ludzkiej kości korowej wynosi od 7,4 do 31,6 GPa, a zmierzony moduł LOIS jest większy od modułu ludzkiej kości korowej (47), LOIS jest wystarczający do podparcia złamania i jego całkowitego Modyfikacja powierzchni ma minimalny wpływ na właściwości mechaniczne.
(A) Schematyczny diagram (1) naprężenia mechanicznego wywieranego na implant ortopedyczny podczas operacji oraz (2) obraz optyczny uszkodzonego implantu ortopedycznego.(B) Schematyczny diagram pomiaru właściwości nanomechanicznych metodą nanoindentacji i LOIS na gołej powierzchni.(C) Krzywa siły przemieszczenia nanoindentacji nagiej powierzchni i LOIS.(D) Po eksperymentach in vitro należy wykonać symulację obrazów optycznych różnych typów płytek ortopedycznych (uszkodzony obszar zaznaczony jest czerwonym prostokątem) w celu symulacji naprężeń mechanicznych powstałych podczas operacji.(E) Test adhezji krwi i (F) test adhezji białek uszkodzonej grupy płytek ortopedycznych.(G) Zmierzyć pokrycie powierzchni białka przylegającego do płytki.(H) Obrazy optyczne różnych typów śrub ortopedycznych po eksperymencie in vitro.(I) Test przyczepności białek w celu zbadania integralności różnych powłok.(J) Zmierzyć pokrycie powierzchni białka przylegającego do śruby.(K) Ruch królika ma na celu wytworzenie stałego naprężenia w złamanej kości.(L) (1) Wyniki próby zginania oraz obrazy optyczne przed i po zginaniu.Różnica w (2) module Younga i (3) wytrzymałości na zginanie pomiędzy gołym implantem a SHP.Dane wyrażono jako średnią ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 i ****P<0,0001).Zdjęcie dzięki uprzejmości: Kyomin Chae, Uniwersytet Yonsei.
W sytuacjach klinicznych większość kontaktu bakterii z materiałami biologicznymi i miejscami rany pochodzi z dojrzałego biofilmu (48).Dlatego amerykańskie Centra Kontroli i Zapobiegania Chorobom szacują, że 65% wszystkich infekcji u ludzi ma związek z biofilmami (49).W tym przypadku konieczne jest zapewnienie projektu eksperymentu in vivo, który zapewni spójne tworzenie biofilmu na powierzchni implantu.Dlatego opracowaliśmy model złamania kości udowej królika, w którym implanty ortopedyczne inkubowano wstępnie w zawiesinie bakteryjnej, a następnie wszczepiano w kości udowe królika, aby zbadać właściwości przeciwporostowe LOIS in vivo.Ze względu na następujące trzy ważne fakty, infekcje bakteryjne są wywoływane raczej przez hodowlę wstępną niż bezpośrednie wstrzyknięcie zawiesiny bakteryjnej: (i) Układ odpornościowy królików jest z natury silniejszy niż u ludzi;dzięki temu możliwa jest iniekcja zawiesin bakteryjnych i bakterii planktonowych. Nie ma to wpływu na powstawanie biofilmów.(Ii) Bakterie planktonowe są bardziej wrażliwe na antybiotyki i antybiotyki są zwykle stosowane po operacji;wreszcie (iii) zawiesina bakterii planktonowych może być rozcieńczana płynami ustrojowymi zwierzęcia (50).Hodując implant w zawiesinie bakteryjnej przed implantacją, możemy dokładnie zbadać szkodliwy wpływ infekcji bakteryjnej i reakcji na ciało obce (FBR) na proces gojenia kości.Króliki uśmiercono 4 tygodnie po implantacji, ponieważ osteointegracja niezbędna dla procesu gojenia się kości zostanie zakończona w ciągu 4 tygodni.Następnie implanty usunięto królikom w celu dalszych badań.Rycina 5A przedstawia mechanizm proliferacji bakterii.Zainfekowany implant ortopedyczny wprowadza się do organizmu.W wyniku wstępnej inkubacji w zawiesinie bakteryjnej sześć z sześciu królików, którym wszczepiono nagie implanty, zostało zakażonych, podczas gdy żaden z królików, którym wszczepiono implanty traktowane LOIS, nie został zakażony.Infekcje bakteryjne przebiegają w trzech etapach, obejmujących wzrost, dojrzewanie i dyspersję (51).Najpierw przyczepione bakterie rozmnażają się i rosną na powierzchni, a następnie bakterie tworzą biofilm podczas wydalania polimeru zewnątrzkomórkowego (EPS), amyloidu i zewnątrzkomórkowego DNA.Biofilm nie tylko zakłóca przenikanie antybiotyków, ale także sprzyja gromadzeniu się enzymów rozkładających antybiotyki (takich jak β-laktamaza) (52).Wreszcie biofilm rozprzestrzenia dojrzałe bakterie do otaczających tkanek.Dlatego dochodzi do infekcji.Ponadto, gdy ciało obce dostanie się do organizmu, infekcja, która może wywołać silną odpowiedź immunologiczną, może spowodować ciężki stan zapalny, ból i obniżoną odporność.Rycina 5B przedstawia przegląd FBR spowodowanego wprowadzeniem implantu ortopedycznego, a nie odpowiedzi immunologicznej spowodowanej infekcją bakteryjną.Układ odpornościowy rozpoznaje wszczepiony implant jako ciało obce, a następnie powoduje reakcję komórek i tkanek, zamykając ciało obce (53).W początkach FBR na powierzchni implantów ortopedycznych tworzyła się matryca zaopatrzeniowa, co skutkowało adsorpcją fibrynogenu.Zaabsorbowany fibrynogen tworzy następnie bardzo gęstą sieć fibrynową, która sprzyja przyłączaniu leukocytów (54).Po utworzeniu sieci fibrynowej nastąpi ostry stan zapalny w wyniku nacieku neutrofili.Na tym etapie uwalniane są różne cytokiny, takie jak czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), interleukina-4 (IL-4) i IL-β, a monocyty zaczynają naciekać miejsce implantacji i różnicować się w komórki olbrzymie.Fag (41, 55, 56).Zmniejszenie FBR zawsze było wyzwaniem, ponieważ nadmierne FBR może powodować ostre i przewlekłe stany zapalne, które mogą prowadzić do śmiertelnych powikłań.W celu oceny wpływu infekcji bakteryjnych w tkankach otaczających goły implant i LOIS zastosowano barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) oraz trichromem Massona (MT).W przypadku królików, którym wszczepiono gołe podłoże, doszło do postępu poważnych infekcji bakteryjnych, a preparaty tkanek H&E wyraźnie wykazały ropnie i martwicę spowodowane stanem zapalnym.Z drugiej strony niezwykle silna powierzchnia przeciwporostowa LOIS hamuje adhezję bakterii, dzięki czemu nie wykazuje oznak infekcji i zmniejsza stan zapalny (Rysunek 5C).Wyniki barwienia MT wykazały tę samą tendencję.Jednakże barwienie MT wykazało również obrzęk u królików, którym wszczepiono LOIS, co wskazuje, że wkrótce nastąpi powrót do zdrowia (Figura 5D).W celu zbadania stopnia odpowiedzi immunologicznej przeprowadzono barwienie immunohistochemiczne (IHC) przy użyciu cytokin TNF-α i IL-6 związanych z odpowiedzią immunologiczną.Nagi implant negatywny, który nie był wystawiony na działanie bakterii, porównano z LOIS, który został wystawiony na działanie bakterii, ale niezakażony, w celu zbadania procesu gojenia przy braku infekcji bakteryjnej.Figura 5E przedstawia obraz optyczny szkiełka IHC wyrażającego TNF-α.Brązowy obszar przedstawia odpowiedź immunologiczną, co wskazuje, że odpowiedź immunologiczna w LOIS jest nieznacznie zmniejszona.Ponadto ekspresja IL-6 w LOIS była znacznie mniejsza niż ujemna ekspresja w sterylnej nagości (Figura 5F).Ekspresję cytokin określono ilościowo, mierząc obszar barwienia przeciwciał odpowiadający cytokinie (Figura 5G).W porównaniu z królikami narażonymi na negatywne implanty, poziomy ekspresji królików, którym wszczepiono LOIS były niższe, co wskazywało na znaczącą różnicę.Spadek ekspresji cytokin wskazuje, że długotrwałe, stabilne właściwości przeciwporostowe LOIS są związane nie tylko z hamowaniem infekcji bakteryjnych, ale także ze spadkiem FBR, który jest indukowany przez przyleganie makrofagów do podłoża (53, 57, 58).Dlatego zmniejszona odpowiedź immunologiczna wynikająca z właściwości LOIS polegających na unikaniu odporności może rozwiązać skutki uboczne po implantacji, takie jak nadmierna odpowiedź immunologiczna po operacji plastycznej.
(A) Schematyczny diagram mechanizmu tworzenia i rozprzestrzeniania się biofilmu na powierzchni zakażonego implantu ortopedycznego.eDNA, zewnątrzkomórkowy DNA.(B) Schematyczny diagram odpowiedzi immunologicznej po wszczepieniu implantu ortopedycznego.(C) barwienie H&E i (D) barwienie MT otaczających tkanek implantów ortopedycznych z gołym pozytywem i LOIS.IHC cytokin pochodzenia immunologicznego (E) TNF-α i (F) IL-6 to wybarwione obrazy królików nagich-ujemnych i królików z wszczepionym LOIS.(G) Kwantyfikacja ekspresji cytokin za pomocą pomiaru pokrycia obszaru (** P <0, 01).
Biokompatybilność LOIS i jego wpływ na proces gojenia kości zbadano in vivo za pomocą diagnostyki obrazowej [rentgen i mikrotomografia komputerowa (CT)] oraz osteoklastu IHC.Rycina 6A przedstawia proces gojenia się kości obejmujący trzy różne etapy: zapalenie, naprawę i przebudowę.Kiedy nastąpi złamanie, komórki zapalne i fibroblasty wnikną do złamanej kości i zaczną wrastać w tkankę naczyniową.W fazie naprawy wrastanie tkanki naczyniowej rozprzestrzenia się w pobliżu miejsca złamania.Tkanka naczyniowa dostarcza składników odżywczych do tworzenia nowej kości, zwanej kalusem.Ostatnim etapem procesu gojenia się kości jest etap przebudowy, w którym wielkość kalusa zostaje zmniejszona do wielkości prawidłowej kości za pomocą wzrostu poziomu aktywowanych osteoklastów (59).Przeprowadzono trójwymiarową (3D) rekonstrukcję miejsca złamania za pomocą tomografii komputerowej w celu obserwacji różnic w poziomie tworzenia kalusa w każdej grupie.Obserwuj przekrój kości udowej, aby sprawdzić grubość kalusa otaczającego złamaną kość (ryc. 6, B i C).Do badania miejsc złamań we wszystkich grupach co tydzień używano także promieni rentgenowskich, aby obserwować różne procesy regeneracji kości w każdej grupie (ryc. S9).Kalus i dojrzałe kości pokazano odpowiednio w kolorze niebieskim/zielonym i kości słoniowej.Większość tkanek miękkich jest filtrowana przy ustalonym progu.Nude pozytywny i SHP potwierdziły utworzenie niewielkiej ilości kalusa wokół miejsca złamania.Z drugiej strony odsłonięty negatyw LOIS i miejsce złamania są otoczone grubym kalusem.Obrazy mikro-CT wykazały, że tworzenie kalusa jest utrudnione przez infekcję bakteryjną i stan zapalny związany z infekcją.Dzieje się tak dlatego, że układ odpornościowy priorytetowo traktuje leczenie urazów septycznych spowodowanych zapaleniem związanym z infekcją, a nie regenerację kości (60).W celu obserwacji aktywności osteoklastów i resorpcji kości przeprowadzono barwienie IHC i fosfatazą kwaśną oporną na winian (TRAP) (ryc. 6D) (61).Tylko kilka aktywowanych osteoklastów wybarwionych na fioletowo stwierdzono w nagich wynikach pozytywnych i SHP.Z drugiej strony, w pobliżu nagich, dodatnich i dojrzałych kości LOIS zaobserwowano wiele aktywowanych osteoklastów.Zjawisko to wskazuje, że w obecności osteoklastów kalus wokół miejsca złamania ulega gwałtownemu procesowi przebudowy (62).Zmierzono objętość kości i obszar ekspresji osteoklastów w kalusie, aby porównać poziom tworzenia kalusa wokół miejsca złamania we wszystkich grupach, aby określić ilościowo wyniki skanu mikro-CT i IHC (ryc. 6E, 1 i 2).Zgodnie z oczekiwaniami, nagie negatywy i tworzenie kalusa w LOIS były znacznie wyższe niż w pozostałych grupach, co wskazuje, że nastąpiła dodatnia przebudowa kości (63).Rycina S10 przedstawia obraz optyczny miejsca operacji, wynik barwienia MT tkanki pobranej w pobliżu śruby oraz wynik barwienia TRAP uwypuklający połączenie śruby z kością.Na gołym podłożu zaobserwowano silne tworzenie się kalusa i zwłóknienia, natomiast implant traktowany LOIS wykazywał stosunkowo nieprzylegającą powierzchnię.Podobnie, w porównaniu z nagimi negatywami, u królików, którym wszczepiono LOIS, zaobserwowano mniejsze zwłóknienie, jak wskazano białymi strzałkami.Ponadto silny obrzęk (niebieska strzałka) można przypisać właściwościom LOIS polegającym na unikaniu odporności, zmniejszając w ten sposób ciężki stan zapalny.Nieprzywierająca powierzchnia wokół implantu i zmniejszone zwłóknienie sugerują, że proces usuwania jest łatwiejszy, co zwykle skutkuje innymi złamaniami lub stanami zapalnymi.Proces gojenia się kości po usunięciu śruby oceniano na podstawie aktywności osteoklastów na styku śruby z kością.Zarówno goła kość, jak i złącze implantu LOIS wchłonęły podobny poziom osteoklastów, co spowodowało dalsze gojenie kości, co wskazuje, że powłoka LOIS nie ma negatywnego wpływu na gojenie kości ani odpowiedź immunologiczną.W celu potwierdzenia, że ​​modyfikacja powierzchni LOIS nie zakłóca procesu gojenia kości, zastosowano badanie rentgenowskie w celu porównania gojenia kości królików z eksponowanymi jonami ujemnymi i 6 tygodniami implantacji LOIS (ryc. 6F).Wyniki wykazały, że w porównaniu z niezainfekowaną, nagą grupą dodatnią, LOIS wykazywał ten sam stopień gojenia kości i nie było wyraźnych oznak złamania (ciągła linia osteolizy) w obu grupach.
(A) Schematyczny diagram procesu gojenia się kości po złamaniu.(B) Różnica w stopniu tworzenia kalusa dla każdej grupy powierzchni oraz (C) obraz przekroju poprzecznego miejsca złamania.(D) Barwienie TRAP w celu uwidocznienia aktywności osteoklastów i resorpcji kości.W oparciu o aktywność TRAP, tworzenie zewnętrznego kalusa kości korowej analizowano ilościowo za pomocą (E) (1) mikro-CT i (2) aktywności osteoklastów.(F) 6 tygodni po implantacji zdjęcia rentgenowskie złamania kości odsłoniętego negatywu (zaznaczonego czerwonym prostokątem przerywanym) i LOIS (zaznaczonego niebieskim przerywanym prostokątem).Analizę statystyczną przeprowadzono metodą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA).*P <0,05.** P <0,01.
Krótko mówiąc, LOIS zapewnia nowy rodzaj strategii przeciwbakteryjnej i powłoki chroniącej przed infekcjami immunologicznymi dla implantów ortopedycznych.Konwencjonalne implanty ortopedyczne z funkcjonalizacją SHP wykazują krótkotrwałe właściwości przeciw biofoulingowi, ale nie są w stanie utrzymać swoich właściwości przez długi czas.Superhydrofobowość podłoża zatrzymuje pęcherzyki powietrza pomiędzy bakteriami a podłożem, tworząc w ten sposób kieszenie powietrzne, zapobiegając w ten sposób infekcji bakteryjnej.Jednakże, ze względu na dyfuzję powietrza, te kieszenie powietrzne można łatwo usunąć.Z drugiej strony LOIS dobrze udowodnił swoją zdolność do zapobiegania infekcjom związanym z biofilmem.Dlatego też, dzięki właściwościom zapobiegającym odrzuceniu warstwy smarnej wtryskiwanej na powierzchnię warstwowej mikro/nanostruktury, można zapobiegać stanom zapalnym związanym z infekcją.W celu optymalizacji warunków produkcji LOIS stosuje się różne metody charakteryzacji, w tym pomiary SEM, AFM, XPS i CA.Ponadto LOIS można również stosować do różnych materiałów biologicznych powszechnie stosowanych w ortopedycznym sprzęcie stabilizującym, takich jak PLGA, Ti, PE, POM i PPSU.Następnie LOIS przetestowano in vitro, aby udowodnić jego właściwości przeciwporostowe wobec bakterii i substancji biologicznych związanych z odpowiedzią immunologiczną.Wyniki pokazują, że ma on doskonałe działanie antybakteryjne i przeciwporostowe w porównaniu do gołego implantu.Ponadto LOIS wykazuje wytrzymałość mechaniczną nawet po zastosowaniu naprężeń mechanicznych, co jest nieuniknione w chirurgii plastycznej.Dzięki właściwościom samonaprawiającym się lubrykantu na powierzchni mikro/nanostruktury, LOIS skutecznie utrzymuje swoje właściwości przeciwporostowe.W celu zbadania biokompatybilności i właściwości antybakteryjnych LOIS in vivo, LOIS wszczepiano do kości udowej królika na 4 tygodnie.Nie zaobserwowano infekcji bakteryjnej u królików, którym wszczepiono LOIS.Ponadto zastosowanie IHC wykazało obniżony poziom lokalnej odpowiedzi immunologicznej, co wskazuje, że LOIS nie hamuje procesu gojenia kości.LOIS wykazuje doskonałe właściwości antybakteryjne i immunologiczne, a także udowodniono, że skutecznie zapobiega tworzeniu się biofilmu przed i podczas operacji ortopedycznych, szczególnie w syntezie kości.Wykorzystując model złamania kości udowej z zapaleniem szpiku kostnego królika, dogłębnie zbadano wpływ infekcji związanych z biofilmem na proces gojenia kości indukowany przez wstępnie inkubowane implanty.W przyszłych badaniach potrzebny jest nowy model in vivo do zbadania możliwych infekcji po implantacji, aby w pełni zrozumieć i zapobiegać infekcjom związanym z biofilmem podczas całego procesu gojenia.Ponadto osteoindukcja pozostaje nadal nierozwiązanym wyzwaniem w integracji z LOIS.Aby pokonać to wyzwanie, potrzebne są dalsze badania w celu połączenia selektywnej adhezji komórek osteoindukcyjnych lub medycyny regeneracyjnej z LOIS.Ogólnie rzecz biorąc, LOIS stanowi obiecującą powłokę implantów ortopedycznych, charakteryzującą się wytrzymałością mechaniczną i doskonałymi właściwościami przeciwporostowymi, co może zmniejszyć skutki uboczne ZMO i układu odpornościowego.
Umyć podłoże 304 SS o wymiarach 15 mm x 15 mm x 1 mm (Dong Kang M-Tech Co., Korea) w acetonie, EtOH i wodzie dejonizowanej przez 15 minut w celu usunięcia zanieczyszczeń.W celu utworzenia na powierzchni struktury na poziomie mikro/nano, oczyszczone podłoże zanurza się w roztworze HF o stężeniu 48% do 51% (DUKSAN Corp., Korea Południowa) w temperaturze 50°C.Czas trawienia waha się od 0 do 60 minut.Następnie wytrawione podłoże oczyszczono wodą dejonizowaną i umieszczono w 65% roztworze HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) w temperaturze 50°C na 30 minut, aby utworzyć na powierzchni warstwę pasywacyjną tlenku chromu.Po pasywacji podłoże przemywa się wodą dejonizowaną i suszy, uzyskując podłoże o warstwowej strukturze.Następnie podłoże poddano działaniu plazmy tlenowej (100 W, 3 minuty) i natychmiast zanurzono w roztworze 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Niemcy) w toluenie w temperaturze pokojowej na 12 godzin.Następnie podłoże pokryte POTS oczyszczono EtOH i wygrzewano w temperaturze 150°C przez 2 godziny, aby uzyskać gęsty POTS SAM.Po pokryciu SAM na podłożu utworzono warstwę smarną poprzez nałożenie smaru perfluoropolieterowego (Krytox 101; DuPont, USA) o objętości ładunkowej 20 µm/cm 2. Przed użyciem przefiltrować smar przez filtr 0,2 mikrona.Usuń nadmiar smaru, przechylając go pod kątem 45° na 15 minut.Tę samą procedurę produkcyjną zastosowano w przypadku implantów ortopedycznych wykonanych ze stali 304 SS (płytka blokująca i śruba blokująca korowa; Dong Kang M-Tech Co., Korea).Wszystkie implanty ortopedyczne są zaprojektowane tak, aby pasowały do ​​geometrii kości udowej królika.
Morfologię powierzchni podłoża i implantów ortopedycznych sprawdzono za pomocą emisji polowej SEM (Inspect F50, FEI, USA) i AFM (XE-100, Park Systems, Korea Południowa).Chropowatość powierzchni (Ra, Rq) mierzy się mnożąc pole powierzchni 20 µm przez 20 µm (n=4).Do analizy składu chemicznego powierzchni wykorzystano system XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japonia) wyposażony w źródło promieniowania rentgenowskiego Al Kα o wielkości plamki 100 µm2.Do pomiaru ciekłego CA i SA wykorzystano system pomiarowy CA wyposażony w kamerę do dynamicznego przechwytywania obrazu (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Korea Południowa).Do każdego pomiaru na powierzchni umieszcza się od 6 do 10 µl kropelek (woda dejonizowana, krew końska, EG, 30% etanol i HD) w celu pomiaru CA.Gdy kąt nachylenia podłoża rośnie z prędkością 2°/s (n = 4), SA mierzy się w momencie opadania kropli.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] i MRSA (ATCC 25923) zakupiono od ATCC (Manassas, Virginia, USA), a hodowlę podstawową utrzymywano w temperaturze -80°C.Przed użyciem zamrożoną kulturę inkubowano w bulionie sojowym rozmrożonym trypsyną (Komed, Korea) w temperaturze 37°C przez 18 godzin, a następnie dwukrotnie przenoszono w celu jej aktywacji.Po inkubacji hodowlę odwirowano przy 10 000 obr/min przez 10 minut w temperaturze 4°C i przemyto dwukrotnie roztworem PBS (pH 7,3).Odwirowaną hodowlę następnie hoduje się na płytkach z agarem z krwią (BAP).MRSA i Pseudomonas aeruginosa przygotowano przez noc i hodowano w bulionie Luria-Bertani.Stężenie Pseudomonas aeruginosa i MRSA w inokulum oznaczono ilościowo za pomocą CFU zawiesiny w seryjnych rozcieńczeniach na agarze.Następnie dostosuj stężenie bakterii do standardu 0,5 McFarlanda, co odpowiada 108 CFU/ml.Następnie rozcieńczyć roboczą zawiesinę bakteryjną 100 razy do 106 CFU/ml.Aby przetestować właściwości adhezji antybakteryjnej, przed użyciem podłoże sterylizowano w temperaturze 121°C przez 15 minut.Następnie substrat przeniesiono do 25 ml zawiesiny bakteryjnej i inkubowano w temperaturze 37°C z energicznym wytrząsaniem (200 obr./min.) przez 12 i 72 godziny.Po inkubacji każdy substrat wyjmowano z inkubatora i przemywano 3 razy PBS w celu usunięcia wszelkich bakterii pływających na powierzchni.W celu obserwacji biofilmu na podłożu, biofilm utrwalono metanolem i barwiono 1 ml oranżu krymidynowego przez 2 minuty.Następnie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego (BX51TR, Olympus, Japonia) wykonano zdjęcia wybarwionego biofilmu.W celu ilościowego określenia biofilmu na podłożu przyłączone komórki oddzielono od podłoża metodą wiru kulkowego, którą uznano za najodpowiedniejszą metodę usuwania przyczepionych bakterii (n = 4).Używając sterylnych kleszczyków, usuń substrat z pożywki wzrostowej i ostuknij płytkę dołkową, aby usunąć nadmiar płynu.Luźno przytwierdzone komórki usunięto przez dwukrotne przemycie sterylnym PBS.Każdy substrat następnie przeniesiono do sterylnej probówki testowej zawierającej 9 ml 0,1% białka ept soli fizjologicznej (PSW) i 2 g 20 do 25 sterylnych kulek szklanych (o średnicy 0,4 do 0,5 mm).Następnie wirowano przez 3 minuty, aby oddzielić komórki od próbki.Po wirowaniu zawiesinę seryjnie rozcieńczono 10-krotnie 0,1% PSW, a następnie 0,1 ml każdego rozcieńczenia zaszczepiono na BAP.Po 24 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, ręcznie zliczano CFU.
Do komórek wykorzystano mysie fibroblasty NIH/3T3 (CRL-1658; amerykański ATCC) i mysie makrofagi RAW 264.7 (TIB-71; amerykański ATCC).Użyj zmodyfikowanej pożywki Eagle firmy Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) do hodowli fibroblastów myszy i uzupełnij 10% surowicą cielęcą (S103-01, Welgene) i 1% penicyliną-streptomycyną (PS; LS202-02, Welgene (Welgene) ). Użyj DMEM do hodowli makrofagów myszy, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (S001-01, Welgene) i 1% PS. Umieścić substrat w sześciostudzienkowej płytce do hodowli komórkowej i zaszczepić komórki w ilości 105 komórek/cm2. Komórki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C i 5% CO2. W celu wybarwienia komórki utrwalono 4% paraformaldehydem na 20 minut i umieszczono w 0,5% Triton X Incubate na 5 minut w -100°C. Zanurzono substrat w 50 nM tetrametylorodaminy w temperaturze 37°C przez 30 minut. Po procesie inkubacji zastosować substrat z podłożem utrwalającym 4′,6-diamino-2-fenyloindolem (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD (n = 4 na komórkę). , fluoresceina, izotiocyjanian fluoresceiny-albumina (A9771, Sigma-Aldrich, Niemcy) i ludzkie osocze. Fibrynogen skoniugowany z Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, USA) rozpuszczono w PBS (10 mM, pH 7,4).Stężenia albuminy i fibrynogenu wynosiły odpowiednio 1 i 150 µg/ml.Po podłożu Przed zanurzeniem w roztworze białek należy je przepłukać PBS w celu nawodnienia powierzchni.Następnie zanurzyć wszystkie substraty w sześciostudzienkowej płytce zawierającej roztwór białka i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 i 90 minut.Po inkubacji substrat następnie usunięto z roztworu białka, delikatnie przemyto 3 razy PBS i utrwalono 4% paraformaldehydem (n = 4 dla każdego białka).W przypadku wapnia chlorek sodu (0,21 M) i fosforan potasu (3,77 mM) rozpuszczono w wodzie dejonizowanej.pH roztworu doprowadzono do 2,0 dodając roztwór chlorowodorku (1M).Następnie w roztworze rozpuszczono chlorek wapnia (5,62 mM).Dodając 1M tris(hydroksymetylo)-amino metanu, doprowadza się pH roztworu do 7,4.Wszystkie substraty zanurzyć w sześciostudzienkowej płytce wypełnionej 1,5× roztworem fosforanu wapnia i usunąć z roztworu po 30 minutach.Do barwienia 2 g czerwieni Alizarin S (CI 58005) Zmieszać ze 100 ml wody dejonizowanej.Następnie użyj 10% wodorotlenku amonu, aby ustawić pH na 4. Barwij podłoże roztworem czerwieni Alizarin Red przez 5 minut, a następnie strząśnij nadmiar barwnika i osusz.Po wytrząsaniu usunąć podłoże.Materiał odwadnia się, następnie zanurza w acetonie na 5 minut, następnie zanurza w roztworze aceton-ksylen (1:1) na 5 minut i na koniec przemywa ksylenem (n = 4).Stosowany jest mikroskop fluorescencyjny (Axio Imager) z obiektywami ×10 i ×20..A2m, Zeiss, Niemcy) obrazy wszystkich podłoży.Do ilościowego określenia danych dotyczących adhezji substancji biologicznych w każdej grupie czterech różnych obszarów obrazowania wykorzystano ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/).Konwertuj wszystkie obrazy na obrazy binarne ze stałymi progami w celu porównania podłoża.
Do monitorowania stabilności warstwy smarnej w PBS w trybie odbicia zastosowano mikroskop konfokalny Zeiss LSM 700.Próbkę szkła powlekanego SAM na bazie fluoru z wtryśniętą warstwą smarującą zanurzono w roztworze PBS i zbadano przy użyciu wytrząsarki orbitalnej (SHO-1D; Daihan Scientific, Korea Południowa) w warunkach łagodnego wytrząsania (120 obr./min.).Następnie należy pobrać próbkę i monitorować utratę smaru, mierząc utratę światła odbitego.Aby uzyskać obrazy fluorescencyjne w trybie odbicia, próbkę poddaje się działaniu lasera o długości fali 633 nm, a następnie zbiera, ponieważ światło zostanie odbite z powrotem od próbki.Próbki mierzono w odstępach czasu 0, 30, 60 i 120 godzin.
W celu określenia wpływu procesu modyfikacji powierzchni na właściwości nanomechaniczne implantów ortopedycznych do pomiaru nanoindenedionu wykorzystano nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) wyposażony w trójstronną piramidalną końcówkę diamentową Berkovicha.Obciążenie szczytowe wynosi 10 mN, a powierzchnia wynosi 100 μm x 100 μm.Dla wszystkich pomiarów czas ładowania i rozładowywania wynosi 10 s, a czas przetrzymywania pod szczytowym obciążeniem wgniatającym wynosi 2 s.Wykonuj pomiary z pięciu różnych lokalizacji i wyciągaj średnią.W celu oceny wytrzymałości mechanicznej pod obciążeniem przeprowadzono próbę zginania poprzecznego w trzech punktach przy użyciu uniwersalnej maszyny wytrzymałościowej (Instron 5966, Instron, USA).Podłoże ściska się ze stałą szybkością 10 N/s przy zwiększonym obciążeniu.Do obliczenia modułu sprężystości i maksymalnego naprężenia ściskającego wykorzystano program Bluehill Universal (n = 3).
W celu symulacji procesu eksploatacji i związanych z nim uszkodzeń mechanicznych powstałych w trakcie eksploatacji, przeprowadzono proces eksploatacji in vitro.Od straconych białych królików nowozelandzkich pobrano kości udowe.Kość udową oczyszczono i utrwalono w 4% paraformaldehydzie na 1 tydzień.Jak opisano w metodzie eksperymentu na zwierzętach, operowano chirurgicznie stałą kość udową.Po operacji implant ortopedyczny zanurzano we krwi (końskiej, KISAN, Korea) na 10 s w celu sprawdzenia, czy po zadaniu urazu mechanicznego wystąpiły zrosty krwi (n = 3).
W sumie 24 samce królików białych nowozelandzkich (waga od 3,0 do 3,5 kg, średni wiek 6 miesięcy) podzielono losowo na cztery grupy: nude-negatywna, nude-pozytywna, SHP i LOIS.Wszystkie procedury z udziałem zwierząt przeprowadzono zgodnie ze standardami etycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Wykorzystywania Zwierząt (zatwierdzony przez IACUC, KOREA-2017-0159).Implant ortopedyczny składa się z płytki blokującej z pięcioma otworami (długość 41 mm, szerokość 7 mm i grubość 2 mm) oraz korowych śrub blokujących (długość 12 mm, średnica 2,7 mm) do stabilizacji złamania.Z wyjątkiem płytek i śrub stosowanych w grupie goły-ujemny, wszystkie płytki i śruby inkubowano w zawiesinie MRSA (106 CFU/ml) przez 12 godzin.Grupę z nagim ujemnym wynikiem (n=6) leczono implantami z gołą powierzchnią bez ekspozycji na zawiesinę bakteryjną, jako kontrolę negatywną pod kątem infekcji.Grupę z nagim dodatnim wynikiem (n = 6) leczono implantem z gołą powierzchnią wystawioną na działanie bakterii jako pozytywną kontrolę infekcji.Grupę SHP (n = 6) leczono implantami SHP eksponowanymi na bakterie.Na koniec grupę LOIS leczono implantami LOIS eksponowanymi na bakterie (n = 6).Wszystkie zwierzęta trzymane są w klatce i mają zapewnioną dużą ilość pożywienia i wody.Przed operacją króliki głodzono przez 12 godzin.Zwierzęta znieczulono poprzez domięśniowe wstrzyknięcie ksylazyny (5 mg/kg) i dożylne wstrzyknięcie paklitakselu (3 mg/kg) w celu indukcji.Następnie należy podać 2% izofluranu i 50% do 70% tlenu medycznego (przepływ 2 l/min) przez układ oddechowy, aby utrzymać znieczulenie.Wszczepia się go poprzez bezpośredni dostęp do bocznej części kości udowej.Po usunięciu włosów i dezynfekcji skóry powidonem-jodem wykonano nacięcie o długości około 6 cm po zewnętrznej stronie lewej środkowej kości udowej.Otwierając szczelinę pomiędzy mięśniami pokrywającymi kość udową, kość udowa jest całkowicie odsłonięta.Umieść płytkę przed trzonem kości udowej i przymocuj ją czterema śrubami.Po zamocowaniu za pomocą brzeszczotu o grubości 1 mm sztucznie wykonaj pęknięcie w obszarze pomiędzy drugim i czwartym otworem.Pod koniec operacji ranę przemyto solą fizjologiczną i zamknięto szwami.Każdemu królikowi wstrzyknięto podskórnie enrofloksacynę (5 mg/kg) rozcieńczoną w jednej trzeciej solą fizjologiczną.U wszystkich zwierząt wykonano pooperacyjne zdjęcia rentgenowskie kości udowej (0, 7, 14, 21, 28 i 42 dni) w celu potwierdzenia osteotomii kości.Po głębokim znieczuleniu wszystkie zwierzęta uśmiercono dożylnym podaniem KCl (2 mmol/kg) w 28 i 42 dniu.Po wykonaniu kość udową skanowano za pomocą mikro-CT w celu obserwacji i porównania procesu gojenia się kości i tworzenia nowej kości w czterech grupach.
Po wykonaniu pobrano tkanki miękkie, które miały bezpośredni kontakt z implantami ortopedycznymi.Tkankę utrwalono w 10% obojętnej buforowanej formalinie przez noc, a następnie odwodniono w EtOH.Odwodnioną tkankę zatopiono w parafinie i pocięto na skrawki o grubości 40 µm przy użyciu mikrotomu (400CS; EXAKT, Niemcy).W celu uwidocznienia infekcji wykonano barwienie H&E i barwienie MT.W celu sprawdzenia odpowiedzi gospodarza wyciętą tkankę inkubowano z króliczym przeciwciałem pierwszorzędowym anty-TNF-α (AB6671, Abcam, USA) i króliczym anty-IL-6 (AB6672; Abcam, USA), a następnie traktowano chrzanem.Oksydaza.Nałożyć na skrawki system barwienia kompleksem awidyna-biotyna (ABC) zgodnie z instrukcją producenta.Aby produkt reakcji wyglądał na brązowy, we wszystkich częściach zastosowano 3,3-diaminobenzydynę.Do wizualizacji wszystkich przekrojów wykorzystano cyfrowy skaner slajdów (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Węgry), a co najmniej cztery podłoża w każdej grupie przeanalizowano za pomocą oprogramowania ImageJ.
Wszystkim zwierzętom po operacji i co tydzień wykonywano zdjęcia rentgenowskie w celu monitorowania gojenia się złamań (n=6 na grupę).Po wykonaniu wykonano mikro-CT o wysokiej rozdzielczości, aby obliczyć powstawanie kalusa wokół kości udowej po zagojeniu.Uzyskaną kość udową oczyszczono, utrwalono w 4% paraformaldehydzie na 3 dni i odwodniono w 75% etanolu.Odwodnione kości następnie skanowano za pomocą mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgia) w celu wygenerowania trójwymiarowych obrazów wokseli (2240 ​​x 2240 pikseli) próbki kości.Użyj filtra Al 1,0 mm, aby zredukować szum sygnału i zastosować wysoką rozdzielczość dla wszystkich skanów (E = 133 kVp, I = 60 μA, czas całkowania = 500 ms).Do wygenerowania objętości 3D zeskanowanej próbki z uzyskanej projekcji bocznej 2D wykorzystano oprogramowanie Nrecon (wersja 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgia).Do analizy zrekonstruowany obraz 3D dzieli się na kostki o wymiarach 10 mm × 10 mm × 10 mm w zależności od miejsca złamania.Oblicz kalus na zewnątrz kości korowej.Do cyfrowego przekierowania zeskanowanej objętości kości wykorzystano oprogramowanie DataViewer (wersja 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgia), a do analizy wykorzystano oprogramowanie CT-Analyzer (wersja 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgia).Względne współczynniki absorpcji promieniowania rentgenowskiego w dojrzałej kości i kalusie rozróżnia się na podstawie ich gęstości, a następnie określa się ilościowo objętość kalusa (n = 4).W celu potwierdzenia, że ​​biokompatybilność LOIS nie opóźnia procesu gojenia kości, wykonano dodatkowe badania rentgenowskie i mikro-CT u dwóch królików: w grupie naked-negatywnej i LOIS.Obie grupy stracono w 6 tygodniu.
Pobrano kości udowe zwierząt uśmierconych i utrwalono je w 4% paraformaldehydzie na 3 dni.Następnie implant ortopedyczny jest ostrożnie usuwany z kości udowej.Kość udową odwapniano przez 21 dni za pomocą 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Następnie odwapnioną kość udową zanurzono w EtOH w celu odwodnienia.Odwodnioną kość udową usunięto w ksylenie i zatopiono w parafinie.Następnie próbkę pocięto za pomocą automatycznego mikrotomu obrotowego (Leica RM2255, Leica Biosystems, Niemcy) o grubości 3 μm.W celu barwienia TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Niemcy) wycięte próbki odparafinowano, ponownie uwodniono i inkubowano w odczynniku TRAP w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.Obrazy uzyskano przy użyciu skanera slajdów (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Węgry) i określono ilościowo poprzez pomiar pokrycia powierzchni wybarwionego obszaru.W każdym eksperymencie co najmniej cztery substraty w każdej grupie analizowano za pomocą oprogramowania ImageJ.
Analizę istotności statystycznej przeprowadzono przy użyciu programu GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Do sprawdzenia różnic pomiędzy ocenianymi grupami wykorzystano test t dla niesparowanych grup i jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA).Poziom istotności przedstawiono na rysunku w następujący sposób: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 i ****P<0,0001;NS, bez znaczącej różnicy.
Materiały dodatkowe do tego artykułu można znaleźć na stronie http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Jest to artykuł o otwartym dostępie, rozpowszechniany na warunkach licencji Creative Commons Uznanie autorstwa-Użycie niekomercyjne, która umożliwia wykorzystanie, rozpowszechnianie i reprodukcję na dowolnym nośniku, o ile wykorzystanie nie ma na celu zysku komercyjnego i założeniem jest, że oryginał praca jest poprawna.Odniesienie.
Uwaga: Prosimy o podanie adresu e-mail tylko po to, aby osoba, którą polecisz stronie, wiedziała, że ​​chcesz, aby zobaczyła wiadomość e-mail i że wiadomość ta nie jest spamem.Nie będziemy przechwytywać żadnych adresów e-mail.
To pytanie służy do sprawdzenia, czy jesteś człowiekiem i zapobiegania automatycznemu przesyłaniu spamu.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Powłoki antybakteryjne i zabezpieczające implanty ortopedyczne mogą ograniczać infekcje i reakcje immunologiczne wywołane infekcjami.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Powłoki antybakteryjne i zabezpieczające implanty ortopedyczne mogą ograniczać infekcje i reakcje immunologiczne wywołane infekcjami.
©2021 Amerykańskie Stowarzyszenie Rozwoju Nauki.Wszelkie prawa zastrzeżone.AAAS jest partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.