Za pacijente koji se podvrgavaju operaciji ugradnje ortopedskih implantata, bakterijske infekcije i imunološki odgovori izazvani infekcijom uvijek su bili opasni po život.Konvencionalni biološki materijali osjetljivi su na biološku kontaminaciju, što uzrokuje prodor bakterija u ozlijeđeno područje i izazivanje postoperativne infekcije.Stoga postoji hitna potreba za razvojem antiinfekcijskih i imunoloških premaza za ortopedske implantate.Ovdje smo razvili naprednu tehnologiju modifikacije površine za ortopedske implantate pod nazivom Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), koja je inspirirana glatkom površinom vrčeva za biljke.LOIS ima dugotrajnu i jaku otpornost na različite tekućine i biološke tvari (uključujući stanice, proteine, kalcij i bakterije).Osim toga, potvrdili smo mehaničku otpornost na ogrebotine i silu pričvršćivanja simulirajući neizbježna oštećenja tijekom in vitro operacije.Model upalne frakture bedrene kosti zečje koštane srži korišten je za temeljito proučavanje antibiološke sposobnosti LOIS-a da se ljušti i da se bori protiv infekcija.Zamišljamo da je LOIS, koji ima svojstva protiv biološke obraštanja i mehaničku izdržljivost, korak naprijed u ortopedskoj kirurgiji bez infekcija.
Danas je zbog sveukupnog starenja uvelike porastao broj pacijenata koji boluju od ortopedskih bolesti (poput starijih prijeloma, degenerativnih bolesti zglobova i osteoporoze) (1, 2).Stoga medicinske ustanove pridaju veliku važnost ortopedskoj kirurgiji, uključujući ortopedske implantate od vijaka, pločica, čavala i umjetnih zglobova (3, 4).Međutim, objavljeno je da su tradicionalni ortopedski implantati osjetljivi na bakterijsku adheziju i stvaranje biofilma, što može uzrokovati infekciju kirurškog mjesta (SSI) nakon operacije (5, 6).Nakon što se biofilm formira na površini ortopedskog implantata, uklanjanje biofilma postaje izuzetno teško čak i uz korištenje velikih doza antibiotika.Stoga obično dovodi do teških postoperativnih infekcija (7, 8).Zbog gore navedenih problema, liječenje inficiranih implantata treba uključiti reoperaciju, uključujući uklanjanje svih implantata i okolnih tkiva;stoga će pacijent trpjeti jaku bol i neke rizike (9, 10).
Kako bi se riješili neki od ovih problema, razvijeni su ortopedski implantati s lijekom koji sprječavaju infekciju uklanjanjem bakterija pričvršćenih na površini (11, 12).Međutim, strategija još uvijek pokazuje nekoliko ograničenja.Zabilježeno je da je dugotrajna implantacija implantata koji izlučuju lijek uzrokovala oštećenje okolnih tkiva i izazvala upalu, što može dovesti do nekroze (13, 14).Osim toga, organska otapala koja mogu postojati nakon proizvodnog procesa ortopedskih implantata koji ispuštaju lijekove, a koja su strogo zabranjena od strane američke Uprave za hranu i lijekove, zahtijevaju dodatne korake pročišćavanja kako bi zadovoljili svoje standarde (15).Implantati s lijekom izazovni su za kontrolirano otpuštanje lijekova, a zbog ograničenog opterećenja lijekom dugotrajna primjena lijeka nije izvediva (16).
Još jedna uobičajena strategija je premazivanje implantata polimerom protiv obraštanja kako bi se spriječilo prianjanje biološke tvari i bakterija na površinu (17).Na primjer, zwitterionski polimeri privukli su pozornost zbog svojih neadhezivnih svojstava u kontaktu s proteinima plazme, stanicama i bakterijama.Međutim, ima neka ograničenja vezana uz dugotrajnu stabilnost i mehaničku izdržljivost, koja otežavaju njegovu praktičnu primjenu u ortopedskim implantatima, posebice zbog mehaničkog struganja tijekom kirurških zahvata (18, 19).Osim toga, zbog visoke biokompatibilnosti, nepostojanja potrebe za kirurškim zahvatom uklanjanja i svojstva čišćenja površine od korozije, korišteni su ortopedski implantati izrađeni od biorazgradivih materijala (20, 21).Tijekom korozije, kemijske veze između polimerne matrice se razgrađuju i odvajaju od površine, a adherenti čiste površinu.Međutim, antibiološko obraštanje površinskim čišćenjem učinkovito je u kratkom vremenskom razdoblju.Osim toga, većina materijala koji se apsorbiraju, uključujući kopolimer poli(mliječne kiseline i glikolne kiseline) (PLGA), polilaktičnu kiselinu (PLA) i legure na bazi magnezija bit će podvrgnuti neravnomjernoj biorazgradnji i eroziji u tijelu, što će negativno utjecati na mehaničku stabilnost.(dvadeset i dva).Osim toga, biorazgradivi dijelovi ploče pružaju mjesto za pričvršćivanje bakterija, što dugoročno povećava mogućnost infekcije.Ovaj rizik od mehaničke degradacije i infekcije ograničava praktičnu primjenu plastične kirurgije (23).
Superhidrofobne (SHP) površine koje oponašaju hijerarhijsku strukturu lotosovog lišća postale su potencijalno rješenje za površine protiv obraštanja (24, 25).Kada je površina SHP uronjena u tekućinu, mjehurići zraka bit će zarobljeni, stvarajući tako zračne džepove i sprječavajući prianjanje bakterija (26).Međutim, novije studije su pokazale da SHP površina ima nedostatke koji se odnose na mehaničku izdržljivost i dugotrajnu stabilnost, što otežava njezinu primjenu u medicinskim implantatima.Štoviše, zračni džepovi će se otopiti i izgubiti svojstva protiv obraštanja, što će rezultirati širim prianjanjem bakterija zbog velike površine SHP površine (27, 28).Nedavno su Aizenberg i njegovi kolege predstavili inovativnu metodu površinskog premaza protiv bioobraštanja razvijanjem glatke površine inspirirane biljkom Nepenthes (29, 30).Glatka površina pokazuje dugotrajnu stabilnost u hidrauličkim uvjetima, izrazito je otporna na biološke tekućine i ima svojstva samoobnavljanja.Međutim, ne postoji niti metoda za nanošenje premaza na medicinski implantat složenog oblika, niti je dokazano da podržava proces zacjeljivanja oštećenog tkiva nakon implantacije.
Ovdje predstavljamo podmazanu površinu ortopedskog implantata (LOIS), mikro/nanostrukturiranu površinu ortopedskog implantata i čvrsto spojenu s tankim slojem lubrikanta kako bismo spriječili da bude povezana s bakterijskim infekcijama plastične kirurgije, kao što je fiksacija prijeloma.Budući da struktura mikro/nano razine funkcionalizirana fluorom čvrsto fiksira mazivo na strukturu, razvijeni LOIS može u potpunosti odbiti adheziju raznih tekućina i dugo zadržati učinak protiv obraštanja.LOIS premazi mogu se nanositi na materijale različitih oblika namijenjene sintezi kosti.Izvrsna svojstva LOIS-a protiv biofilma protiv bakterija [Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus (MRSA) otpornih na meticilin] i bioloških tvari (stanice, proteini i kalcij) potvrđena su in vitro.Stopa adhezije ekstenzivnog prianjanja na podlogu manja je od 1%.Osim toga, čak i nakon mehaničkog stresa kao što je površinsko grebanje, samozacjeljivanje uzrokovano penetrirajućim mazivom pomaže u održavanju njegovih svojstava protiv obraštanja.Rezultati ispitivanja mehaničke izdržljivosti pokazuju da čak ni nakon strukturnih i kemijskih modifikacija ukupna čvrstoća neće biti značajno smanjena.Osim toga, proveden je in vitro eksperiment koji simulira mehanički stres u kirurškom okruženju kako bi se dokazalo da LOIS može izdržati različita mehanička stresa koji se javljaju tijekom plastične kirurgije.Konačno, upotrijebili smo in vivo model frakture bedrene kosti na zecu, koji je dokazao da LOIS ima vrhunska antibakterijska svojstva i biokompatibilnost.Radiološki i histološki rezultati potvrdili su da stabilno ponašanje lubrikanta i svojstva protiv biološkog obraštanja unutar 4 tjedna nakon implantacije mogu postići učinkovitu antiinfekciju i učinak imunološkog izlaska bez odgađanja procesa cijeljenja kosti.
Slika 1A prikazuje shematski dijagram razvijenog LOIS-a, koji je implantiran sa mikro/nano strukturama u model prijeloma bedrene kosti zeca kako bi se potvrdila njegova izvrsna svojstva protiv biološkog obraštanja i infekcije.Provodi se biomimetička metoda kako bi se simulirala površina vodene lončanice i spriječilo biološko obraštanje ugradnjom sloja maziva unutar mikro/nano strukture površine.Površina ubrizgana mazivom može minimizirati kontakt između bioloških tvari i površine.Stoga, zbog stvaranja stabilnih kemijskih veza na površini, ima izvrsnu učinkovitost protiv obraštanja i dugoročnu stabilnost.Kao rezultat toga, svojstva mazive površine protiv obraštanja omogućuju različite praktične primjene u biomedicinskim istraživanjima.Međutim, opsežna istraživanja o tome kako ova posebna površina međusobno djeluje u tijelu još nisu dovršena.Usporedbom LOIS-a s golim supstratima in vitro korištenjem albumina i bakterija biofilma, može se potvrditi neadhezivnost LOIS-a (Slika 1B).Osim toga, kotrljanjem kapljica vode na nagnutu golu podlogu i LOIS podlogu (Slika S1 i Film S1), može se pokazati učinak biološke kontaminacije.Kao što je prikazano na slici fluorescentnog mikroskopa, izloženi supstrat inkubiran u suspenziji proteina i bakterija pokazao je veliku količinu biološkog materijala zalijepljenog za površinu.Međutim, zbog svojih izvrsnih svojstava protiv biološkog obraštanja, LOIS gotovo da ne pokazuje nikakvu fluorescenciju.Kako bi se potvrdila njegova svojstva protiv obraštanja i infekcije, LOIS je primijenjen na površinu ortopedskih implantata za sintezu kosti (pločice i vijci) i postavljen u model prijeloma zeca.Prije implantacije, goli ortopedski implantat i LOIS su inkubirani u bakterijskoj suspenziji 12 sati.Predinkubacija osigurava stvaranje biofilma na površini izloženog implantata za usporedbu.Slika 1C prikazuje fotografiju mjesta prijeloma 4 tjedna nakon implantacije.S lijeve strane, zec s golim ortopedskim implantatom pokazao je jaku razinu upale zbog stvaranja biofilma na površini implantata.Suprotan rezultat primijećen je kod kunića kojima je implantiran LOIS, to jest, okolna tkiva LOIS-a nisu pokazivala ni znakove infekcije ni znakove upale.Osim toga, optička slika s lijeve strane pokazuje mjesto operacije kunića s izloženim implantatom, što pokazuje da na površini LOIS-a nisu pronađena višestruka ljepila prisutna na površini izloženog implantata.Ovo pokazuje da LOIS ima dugotrajnu stabilnost i ima sposobnost održavanja svojih antibioloških svojstava obraštanja i protiv prianjanja.
(A) Shematski dijagram LOIS-a i njegove implantacije u model prijeloma bedrene kosti zeca.(B) Slika proteina i bakterijskog biofilma dobivena fluorescentnom mikroskopom na goloj površini i LOIS supstratu.4 tjedna nakon implantacije, (C) fotografska slika mjesta prijeloma i (D) rendgenska slika (istaknuta crvenim pravokutnikom).Slika ljubaznošću: Kyomin Chae, Sveučilište Yonsei.
Sterilizirani, izloženi negativno implantirani kunići pokazali su normalan proces cijeljenja kosti bez ikakvih znakova upale ili infekcije.S druge strane, SHP implantati prethodno inkubirani u bakterijskoj suspenziji pokazuju upalu povezanu s infekcijom na okolnim tkivima.To se može pripisati njegovoj nesposobnosti da dugotrajno inhibira adheziju bakterija (Slika S2).Kako bi se dokazalo da LOIS ne utječe na proces cijeljenja, ali inhibira moguće infekcije povezane s implantacijom, uspoređeni su rendgenski snimci izložene pozitivne matrice i LOIS na mjestu prijeloma (Slika 1D).Rendgenska slika golog pozitivnog implantata pokazala je postojane linije osteolize, što ukazuje da kost nije potpuno zacijelila.To sugerira da bi proces oporavka kosti mogao biti uvelike odgođen zbog upale povezane s infekcijom.Naprotiv, pokazao je da su zečevi kojima je implantiran LOIS zacijelili i nisu pokazivali vidljivo mjesto prijeloma.
Kako bi se razvili medicinski implantati s dugotrajnom stabilnošću i funkcionalnošću (uključujući otpornost na bioobraštanje), uloženi su mnogi napori.Međutim, prisutnost različitih bioloških tvari i dinamika tkivne adhezije ograničava razvoj njihovih klinički pouzdanih metoda.Kako bismo prevladali te nedostatke, razvili smo mikro/nano slojevitu strukturu i kemijski modificiranu površinu, koja je optimizirana zbog velike kapilarne sile i kemijskog afiniteta kako bi se u najvećoj mjeri zadržalo najglađe mazivo.Slika 2A prikazuje cjelokupni proizvodni proces LOIS-a.Najprije pripremite podlogu od nehrđajućeg čelika (SS) 304 medicinske kvalitete.Drugo, mikro/nano struktura se formira na SS supstratu kemijskim jetkanjem pomoću otopine fluorovodične kiseline (HF).Kako bi se obnovila otpornost nehrđajućeg čelika na koroziju, otopina dušične kiseline (HNO3) (31) koristi se za obradu ugravirane podloge.Pasivacija povećava otpornost na koroziju SS podloge i značajno usporava proces korozije koji može smanjiti ukupnu učinkovitost LOIS-a.Zatim, formiranjem samosastavljenog monosloja (SAM) s 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktiltrietoksisilanom (POTS), površina se kemijski modificira kako bi se poboljšala kemijska interakcija između površine i glatkog maziva Affinity.Površinska modifikacija značajno smanjuje površinsku energiju izrađene mikro/nano strukturirane površine, koja odgovara površinskoj energiji glatkog maziva.To omogućuje da se mazivo potpuno navlaži, čime se formira stabilan sloj maziva na površini.Modificirana površina pokazuje povećanu hidrofobnost.Rezultati pokazuju da sklisko mazivo pokazuje stabilno ponašanje na LOIS zbog visokog kemijskog afiniteta i kapilarne sile uzrokovane mikro/nano strukturom (32, 33).Proučavane su optičke promjene na površini SS nakon površinske modifikacije i ubrizgavanja maziva.Mikro/nano slojevita struktura formirana na površini može uzrokovati vizualne promjene i potamniti površinu.Taj se fenomen pripisuje pojačanom učinku raspršenja svjetlosti na hrapavoj površini, što povećava difuznu refleksiju uzrokovanu mehanizmom zarobljavanja svjetlosti (34).Osim toga, nakon ubrizgavanja lubrikanta, LOIS postaje tamniji.Sloj za podmazivanje uzrokuje manju refleksiju svjetlosti od podloge, čime potamnjuje LOIS.Kako bi se optimizirala mikrostruktura/nanostruktura kako bi se pokazao najmanji kut klizanja (SA) za postizanje učinka protiv biološkog obraštanja, korištena je skenirajuća elektronska mikroskopija (SEM) i atomski parovi za izvođenje različitih vremena HF jetkanja (0, 3)., 15 i 60 minuta) Mikroskop sile (AFM) (Slika 2B).SEM i AFM slike pokazuju da je nakon kratkog vremena jetkanja (3 minute jetkanja), goli supstrat formirao nejednaku hrapavost u nanorazmjerima.Hrapavost površine mijenja se s vremenom jetkanja (Slika S3).Vremenski promjenjiva krivulja pokazuje da hrapavost površine nastavlja rasti i doseže vrhunac nakon 15 minuta jetkanja, a zatim se opaža samo blago smanjenje vrijednosti hrapavosti nakon 30 minuta jetkanja.U ovoj točki, hrapavost na nano razini je urezana, dok se hrapavost na mikro razini snažno razvija, čineći promjenu hrapavosti stabilnijom.Nakon jetkanja dulje od 30 minuta, opaža se daljnje povećanje hrapavosti, što je detaljno objašnjeno na sljedeći način: SS se sastoji od čelika, legiranog elementima uključujući željezo, krom, nikal, molibden i mnoge druge elemente.Među tim elementima, željezo, krom i molibden igraju važnu ulogu u stvaranju hrapavosti mikronske/nano skale na SS pomoću HF jetkanja.U ranim fazama korozije, željezo i krom uglavnom korodiraju jer molibden ima veću otpornost na koroziju od molibdena.Kako jetkanje napreduje, otopina za jetkanje doseže lokalno prezasićenje, stvarajući fluoride i okside uzrokovane jetkanjem.Fluorid i oksid se talože i na kraju ponovno talože na površini, stvarajući površinsku hrapavost u mikronskom/nano rasponu (31).Ova hrapavost na mikro/nano razini igra važnu ulogu u svojstvima samoiscjeljivanja LOIS-a.Dvostruka površina proizvodi sinergistički učinak, značajno povećavajući kapilarnu silu.Ovaj fenomen omogućuje mazivu da stabilno prodre u površinu i pridonosi svojstvima samozacjeljivanja (35).Stvaranje hrapavosti ovisi o vremenu jetkanja.Ispod 10 minuta jetkanja, površina sadrži samo hrapavost nanovelike razine, što nije dovoljno da zadrži dovoljno lubrikanta za otpornost na bioobraštanje (36).S druge strane, ako vrijeme jetkanja prijeđe 30 minuta, nestat će hrapavost nanomjerne veličine koja nastaje ponovnim taloženjem željeza i kroma, a ostat će samo hrapavost mikromjerne veličine zbog molibdena.Pretjerano nagrizana površina nema hrapavost nanomjerne veličine i gubi sinergistički učinak dvostupanjske hrapavosti, što negativno utječe na karakteristike samozacjeljivanja LOIS-a.SA mjerenja provedena su na podlogama s različitim vremenima jetkanja kako bi se dokazala učinkovitost protiv obraštanja.Odabrane su različite vrste tekućina na temelju viskoznosti i površinske energije, uključujući deioniziranu (DI) vodu, krv, etilen glikol (EG), etanol (EtOH) i heksadekan (HD) (Slika S4).Uzorak jetkanja koji varira u vremenu pokazuje da je za različite tekućine s različitim površinskim energijama i viskoznostima SA LOIS-a nakon 15 minuta jetkanja najniži.Stoga je LOIS optimiziran za graviranje 15 minuta kako bi se stvorila mikronska i nano hrapavost, što je prikladno za učinkovito održavanje trajnosti maziva i izvrsnih svojstava protiv obraštanja.
(A) Shematski dijagram procesa proizvodnje LOIS-a u četiri koraka.Umetak prikazuje SAM formiran na podlozi.(B) SEM i AFM slike, koje se koriste za optimizaciju mikro/nano strukture supstrata u različitim vremenima jetkanja.Spektri rendgenske fotoelektronske spektroskopije (XPS) (C) Cr2p i (D) F1s nakon površinske pasivizacije i SAM premaza.au, proizvoljna jedinica.(E) Reprezentativne slike kapljica vode na golim, ugraviranim, SHP i LOIS podlogama.(F) Mjerenje kontaktnog kuta (CA) i SA tekućina s različitim površinskim napetostima na SHP i LOIS.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD.
Zatim je, kako bi se potvrdila promjena kemijskih svojstava površine, korištena fotoelektronska spektroskopija X-zraka (XPS) za proučavanje promjene kemijskog sastava površine supstrata nakon svakog premazivanja površine.Slika 2C prikazuje rezultate XPS mjerenja HF jetkane površine i površine tretirane HNO3.Dva glavna vrha na 587,3 i 577,7 eV mogu se pripisati Cr-O vezi koja postoji u sloju krom oksida, što je glavna razlika u odnosu na HF ugraviranu površinu.To je uglavnom zbog potrošnje željeza i krom fluorida na površini pomoću HNO3.Jetkanje na bazi HNO3 omogućuje kromu stvaranje pasivizirajućeg oksidnog sloja na površini, što ugravirani SS ponovno čini otpornim na koroziju.Na slici 2D dobiveni su XPS spektri kako bi se potvrdilo da je silan na bazi fluorougljika nastao na površini nakon premaza SAM, koji ima izuzetno visoku sposobnost odbijanja tekućine čak i za EG, krv i EtOH.SAM premaz se dovršava reakcijom silanskih funkcionalnih skupina s hidroksilnim skupinama formiranim plazma obradom.Kao rezultat toga, primijećeno je značajno povećanje CF2 i CF3 vrhova.Energija vezanja između 286 i 296 eV ukazuje na to da je kemijska modifikacija uspješno dovršena prevlakom SAM.SHP pokazuje relativno velike CF2 (290,1 ​​eV) i CF3 (293,3 eV) vrhove, koji su uzrokovani silanom na bazi fluorougljika formiranim na površini.Slika 2E prikazuje reprezentativne optičke slike mjerenja kontaktnog kuta (CA) za različite skupine deionizirane vode u kontaktu s golom, ugraviranom, SHP i LOIS.Ove slike pokazuju da jetkana površina postaje hidrofilna zbog mikro/nano strukture formirane kemijskim jetkanjem tako da se deionizirana voda apsorbira u strukturu.Međutim, kada je podloga obložena SAM-om, podloga pokazuje jaku vodoodbojnost, tako da se formira površinski SHP, a kontaktna površina između vode i površine je mala.Konačno, uočeno je smanjenje CA u LOIS-u, što se može pripisati prodiranju lubrikanta u mikrostrukturu, čime se povećava kontaktna površina.Kako bi se dokazalo da površina ima izvrsnu sposobnost odbijanja tekućine i neljepljiva svojstva, LOIS je uspoređen s SHP supstratom mjerenjem CA i SA pomoću različitih tekućina (Slika 2F).Odabrane su različite vrste tekućina na temelju viskoznosti i površinske energije, uključujući deioniziranu vodu, krv, EG, EtOH i HD (Slika S4).Rezultati mjerenja CA pokazuju da kada CA teži HD, vrijednost smanjenja CA, gdje CA ima najnižu površinsku energiju.Osim toga, LOIS ukupnog CA je nizak.Međutim, SA mjerenje pokazuje potpuno drugačiji fenomen.Osim ionizirane vode, sve tekućine prianjaju na SHP podlogu bez klizanja.S druge strane, LOIS pokazuje vrlo nizak SA, gdje kada se sva tekućina nagne pod kutom manjim od 10° do 15°, sva tekućina će se otkotrljati.Ovo snažno pokazuje da je neljepljivost LOIS-a bolja nego kod SHP površine.Osim toga, LOIS premazi također se primjenjuju na različite vrste materijala, uključujući titan (Ti), polifenilsulfon (PPSU), polioksimetilen (POM), polieter eter keton (PEEK) i bioapsorbirajuće polimere (PLGA). Oni su implantabilni ortopedski materijali (slika S5)).Sekvencijalne slike kapljica na materijalu tretiranom LOIS-om pokazuju da su svojstva LOIS-a protiv bioobraštaja ista na svim podlogama.Osim toga, rezultati mjerenja CA i SA pokazuju da se neljepljiva svojstva LOIS-a mogu primijeniti na druge materijale.
Kako bi se potvrdila svojstva LOIS-a protiv obraštanja, različite vrste supstrata (uključujući gole, ugravirane, SHP i LOIS) inkubirane su s Pseudomonas aeruginosa i MRSA.Ove dvije bakterije odabrane su kao reprezentativne bolničke bakterije, koje mogu dovesti do stvaranja biofilma, što dovodi do SSI (37).Slika 3 (A i B) prikazuje slike fluorescentnog mikroskopa i rezultate mjerenja jedinice za stvaranje kolonije (CFU) supstrata inkubiranih u bakterijskoj suspenziji kratkoročno (12 sati), odnosno dugotrajno (72 sata).U kratkom vremenskom razdoblju, bakterije će formirati nakupine i porasti u veličini, prekrivajući se tvarima sličnim sluzi i sprječavajući njihovo uklanjanje.Međutim, tijekom 72-satne inkubacije, bakterije će sazrijeti i lako će se raspršiti kako bi formirale više kolonija ili nakupina.Stoga se može smatrati da je inkubacija od 72 sata dugotrajna i da je prikladno vrijeme inkubacije za stvaranje jakog biofilma na površini (38).U kratkom vremenskom razdoblju, urezana površina i površina SHP pokazale su bakterijsku adheziju, koja je smanjena za oko 25% do 50% u usporedbi s golom podlogom.Međutim, zbog svoje izvrsne učinkovitosti protiv obraštanja i stabilnosti, LOIS nije pokazao kratkoročno i dugoročno prianjanje bakterijskog biofilma.Shematski dijagram (Slika 3C) opisuje objašnjenje mehanizma antibiološkog onečišćenja otopine za jetkanje, SHP i LOIS.Pretpostavka je da će urezani supstrat s hidrofilnim svojstvima imati veću površinu od golog supstrata.Zbog toga će doći do većeg prianjanja bakterija na ugraviranu podlogu.Međutim, u usporedbi s golim supstratom, ugravirani supstrat ima znatno manje biofilma formiranog na površini.To je zato što se molekule vode čvrsto vežu za hidrofilnu površinu i djeluju kao lubrikant za vodu, te tako kratkoročno ometaju prianjanje bakterija (39).Međutim, sloj molekula vode je vrlo tanak i topiv u bakterijskim suspenzijama.Zbog toga molekularni sloj vode nestaje na dulje vrijeme, što dovodi do opsežnog prianjanja i proliferacije bakterija.Za SHP, zbog svojih svojstava kratkotrajnog nekvašenja, inhibira se prianjanje bakterija.Smanjena bakterijska adhezija može se pripisati zračnim džepovima zarobljenim u slojevitoj strukturi i nižoj površinskoj energiji, čime se smanjuje kontakt između bakterijske suspenzije i površine.Međutim, uočena je ekstenzivna bakterijska adhezija u SHP jer je dugo vremena izgubio svojstva protiv obraštanja.To je uglavnom zbog nestanka zračnih džepova zbog hidrostatskog tlaka i otapanja zraka u vodi.To je uglavnom zbog nestanka zračnih džepova zbog otapanja i slojevite strukture koja osigurava veću površinu za prianjanje (27, 40).Za razliku od ova dva supstrata koji imaju važan učinak na dugoročnu stabilnost, lubrikant za podmazivanje sadržan u LOIS-u ubrizgava se u mikro/nano strukturu i neće nestati čak ni dugoročno.Maziva ispunjena mikro/nano strukturama vrlo su stabilna i snažno se privlače na površinu zbog svog visokog kemijskog afiniteta, čime dugotrajno sprječavaju prianjanje bakterija.Slika S6 prikazuje refleksijsku konfokalnu mikroskopsku sliku supstrata natopljenog lubrikantom uronjenog u fiziološku otopinu puferiranu fosfatom (PBS).Kontinuirane slike pokazuju da čak i nakon 120 sati laganog potresanja (120 okretaja u minuti), sloj maziva na LOIS-u ostaje nepromijenjen, što ukazuje na dugoročnu stabilnost u uvjetima protoka.To je zbog visokog kemijskog afiniteta između SAM premaza na bazi fluora i maziva na bazi perfluorougljika, tako da se može formirati stabilan sloj maziva.Stoga se održava učinak protiv obraštanja.Osim toga, supstrat je testiran na reprezentativne proteine ​​(albumin i fibrinogen), koji se nalaze u plazmi, stanice usko povezane s imunološkom funkcijom (makrofagi i fibroblasti) i one povezane s stvaranjem kostiju.Sadržaj kalcija je vrlo visok.(Slika 3D, 1 i 2, i Slika S7) (41, 42).Uz to, slike fluorescentnog mikroskopa testa adhezije za fibrinogen, albumin i kalcij pokazale su različite karakteristike adhezije za svaku skupinu supstrata (Slika S8).Tijekom formiranja kosti, novostvorena kost i slojevi kalcija mogu okružiti ortopedski implantat, što ne samo da otežava uklanjanje, već također može uzrokovati neočekivanu štetu pacijentu tijekom procesa uklanjanja.Stoga su niske razine naslaga kalcija na koštanim pločama i vijcima korisne za ortopedske operacije koje zahtijevaju uklanjanje implantata.Na temelju kvantifikacije pričvršćenog područja na temelju intenziteta fluorescencije i broja stanica, potvrdili smo da LOIS pokazuje izvrsna svojstva protiv bioobraštanja za sve biološke tvari u usporedbi s drugim supstratima.Prema rezultatima in vitro eksperimenata, antibiološko onečišćenje LOIS može se primijeniti na ortopedske implantate, koji ne samo da mogu spriječiti infekcije uzrokovane bakterijama biofilma, već i smanjiti upalu uzrokovanu aktivnim imunološkim sustavom tijela.
(A) Slike fluorescentnog mikroskopa svake skupine (gole, urezane, SHP i LOIS) inkubirane u suspenziji Pseudomonas aeruginosa i MRSA 12 i 72 sata.(B) Broj adherentnih CFU Pseudomonas aeruginosa i MRSA na površini svake skupine.(C) Shematski dijagram antibiološkog mehanizma obraštanja kratkotrajnog i dugotrajnog jetkanja, SHP i LOIS.(D) (1) Broj fibroblasta zalijepljenih za svaki supstrat i fluorescentne mikroskopske slike stanica zalijepljenih za goli i LOIS.(2) Test adhezije imunološki povezanih proteina, albumina i kalcija uključenih u proces cijeljenja kosti (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 i **** P <0,0001).ns, nije bitno.
U slučaju neizbježnih koncentriranih naprezanja, mehanička trajnost uvijek je bila glavni izazov za primjenu antivegetativnih premaza.Tradicionalne metode gela protiv otpadnih voda temelje se na polimerima niske topivosti u vodi i krhkosti.Stoga su obično osjetljivi na mehanički stres u biomedicinskim primjenama.Stoga, mehanički izdržljivi premazi protiv obraštanja ostaju izazov za primjene kao što su ortopedski implantati (43, 44).Slika 4A(1) prikazuje dvije glavne vrste naprezanja primijenjenih na ortopedske implantate, uključujući grebanje (smično naprezanje) i kompresiju s optičkom slikom oštećenog implantata koju stvara pinceta.Na primjer, kada je vijak zategnut odvijačem ili kada kirurg čvrsto drži koštanu ploču pincetom i primjenjuje silu pritiska, plastična koštana ploča bit će oštećena i izgrebana i na makro i na mikro/nano skali (Slika 4A, 2) .Kako bi se testiralo može li proizvedeni LOIS izdržati ta oštećenja tijekom plastične kirurgije, izvedeno je nanoindentiranje kako bi se usporedila tvrdoća gole podloge i LOIS na mikro/nano skali kako bi se proučila mehanička svojstva mikro/nano strukture Utjecaj (Slika 4B).Shematski dijagram prikazuje različito deformacijsko ponašanje LOIS-a zbog prisutnosti mikro/nano struktura.Na temelju rezultata nanoutiskivanja nacrtana je krivulja sila-pomak (slika 4C).Plava slika predstavlja golu podlogu, koja pokazuje samo malu deformaciju, što se vidi po maksimalnoj dubini udubljenja od 0,26 μm.S druge strane, postupno povećanje sile nanoindentiranja i pomaka uočeno u LOIS (crvena krivulja) može pokazivati ​​znakove smanjenih mehaničkih svojstava, što rezultira dubinom nanoindentiranja od 1,61 μm.To je zato što mikro/nano struktura prisutna u LOIS-u pruža dublji prostor za napredovanje vrha nanoindentera, tako da je njegova deformacija veća od deformacije gole podloge.Konsta-Gdoutos i sur.(45) vjeruje da zbog prisutnosti nanostruktura nanoindentacija i mikro/nano hrapavost dovode do nepravilnih krivulja nanoindentacije.Osjenčano područje odgovara krivulji nepravilne deformacije koja se pripisuje nanostrukturi, dok se neosjenčano područje pripisuje mikrostrukturi.Ova deformacija može oštetiti mikrostrukturu/nanostrukturu maziva za držanje i negativno utjecati na njegovu učinkovitost protiv obraštanja.Kako bi se proučio utjecaj oštećenja na LOIS, neizbježna oštećenja mikro/nano struktura replicirana su u tijelu tijekom plastične operacije.Korištenjem testova adhezije krvi i proteina može se odrediti stabilnost svojstava LOIS-a protiv bioobraštaja nakon in vitro (slika 4D).Niz optičkih slika pokazuje oštećenja koja su nastala u blizini rupa svake podloge.Proveden je test adhezije krvi kako bi se pokazao učinak mehaničkog oštećenja na premaz protiv obraštanja (Slika 4E).Poput SHP-a, svojstva protiv obraštanja gube se zbog oštećenja, a LOIS pokazuje izvrsna svojstva protiv obraštanja jer odbija krv.To je zato što, budući da površinsku energiju pokreće kapilarno djelovanje koje prekriva oštećeno područje, protok u mikrostrukturiranom mazivom mazivu obnavlja svojstva protiv obraštanja (35).Isti trend primijećen je u testu adhezije proteina korištenjem albumina.U oštećenom području, adhezija proteina na površini SHP je široko opažena, a mjerenjem njegove pokrivenosti područja može se kvantificirati kao polovica razine adhezije gole podloge.S druge strane, LOIS je zadržao svoja svojstva protiv biološkog obraštanja bez izazivanja prianjanja (Slika 4, F i G).Osim toga, površina vijka često je izložena snažnom mehaničkom naprezanju, poput bušenja, pa smo proučavali sposobnost LOIS premaza da ostane netaknut na vijku in vitro.Slika 4H prikazuje optičke slike različitih vijaka, uključujući gole, SHP i LOIS.Crveni pravokutnik predstavlja ciljno područje gdje dolazi do snažnog mehaničkog naprezanja tijekom implantacije kosti.Slično testu adhezije proteina na ploči, fluorescentni mikroskop koristi se za prikaz adhezije proteina i mjerenje područja pokrivenosti kako bi se dokazao integritet LOIS premaza, čak i pod jakim mehaničkim opterećenjem (Slika 4, I i J).Vijci tretirani LOIS-om pokazuju izvrsnu učinkovitost protiv obraštanja i gotovo da nema proteina koji se lijepe na površinu.S druge strane, adhezija proteina uočena je kod golih vijaka i SHP vijaka, gdje je pokrivenost područja SHP vijaka bila jedna trećina površine golih vijaka.Osim toga, ortopedski implantat koji se koristi za fiksaciju mora biti mehanički jak kako bi izdržao stres koji se primjenjuje na mjesto prijeloma, kao što je prikazano na slici 4K.Stoga je provedeno ispitivanje savijanjem kako bi se odredio učinak kemijske modifikacije na mehanička svojstva.Osim toga, ovo se radi kako bi se održao fiksni stres od implantata.Primijenite okomitu mehaničku silu dok se implantat potpuno ne presavije i dok se ne dobije krivulja naprezanje-deformacija (Slika 4L, 1).Dva svojstva, uključujući Youngov modul i čvrstoću na savijanje, uspoređena su između golih i LOIS podloga kao pokazatelja njihove mehaničke čvrstoće (Slika 4L, 2 i 3).Youngov modul pokazuje sposobnost materijala da podnese mehaničke promjene.Youngov modul svake podloge je 41,48±1,01 odnosno 40,06±0,96 GPa;uočena razlika je oko 3,4%.Osim toga, objavljeno je da čvrstoća na savijanje, koja određuje žilavost materijala, iznosi 102,34±1,51 GPa za golu podlogu i 96,99±0,86 GPa za SHP.Goli supstrat je veći za otprilike 5,3%.Blago smanjenje mehaničkih svojstava može biti uzrokovano efektom zareza.U učinku zareza, mikro/nano hrapavost može djelovati kao skup zareza, što dovodi do lokalne koncentracije naprezanja i utječe na mehanička svojstva implantata (46).Međutim, na temelju činjenice da se navodi da je krutost ljudske kortikalne kosti između 7,4 i 31,6 GPa, a izmjereni LOIS modul premašuje onaj ljudske kortikalne kosti (47), LOIS je dovoljan da podrži prijelom i njegov ukupni površinska modifikacija minimalno utječe na mehanička svojstva.
(A) Shematski dijagram (1) mehaničkog naprezanja primijenjenog na ortopedski implantat tijekom operacije i (2) optičke slike oštećenog ortopedskog implantata.(B) Shematski dijagram mjerenja nano-mehaničkih svojstava nanoindentacijom i LOIS na goloj površini.(C) Krivulja sila-pomak nanoindentacije gole površine i LOIS.(D) Nakon pokusa in vitro, simulirajte optičke slike različitih tipova ortopedskih ploča (oštećeno područje istaknuto je crvenim pravokutnikom) kako biste simulirali mehanički stres uzrokovan tijekom operacije.(E) Test adhezije krvi i (F) test adhezije proteina skupine oštećene ortopedske ploče.(G) Izmjerite područje pokrivenosti proteina koji je prianjao na ploču.(H) Optičke slike različitih tipova ortopedskih vijaka nakon in vitro eksperimenta.(I) Test adhezije proteina za proučavanje cjelovitosti različitih premaza.(J) Izmjerite pokrivenost područja proteina koji je prianjao na vijak.(K) Kretanje zeca ima za cilj stvoriti fiksni stres na slomljenu kost.(L) (1) Rezultati ispitivanja savijanja i optičke slike prije i poslije savijanja.Razlika u (2) Youngovom modulu i (3) čvrstoći na savijanje između golog implantata i SHP.Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 i ****P<0,0001).Slika ljubaznošću: Kyomin Chae, Sveučilište Yonsei.
U kliničkim situacijama, većina bakterijskih kontakata s biološkim materijalima i mjestima rana dolazi od zrelih, zrelih biofilmova (48).Stoga američki Centar za kontrolu i prevenciju bolesti procjenjuje da je 65% svih ljudskih infekcija povezano s biofilmovima (49).U ovom slučaju, potrebno je osigurati in vivo eksperimentalni dizajn koji osigurava dosljedno stvaranje biofilma na površini implantata.Stoga smo razvili model prijeloma bedrene kosti zeca u kojem su ortopedski implantati prethodno inkubirani u bakterijskoj suspenziji, a zatim implantirani u bedrene kosti zeca kako bismo proučavali svojstva LOIS-a protiv obraštanja in vivo.Zbog sljedeće tri važne činjenice, bakterijske infekcije su inducirane pretkulturom, a ne izravnim ubrizgavanjem bakterijskih suspenzija: (i) Imunološki sustav kunića je prirodno jači od ljudskog;stoga je moguće injektiranje bakterijskih suspenzija i planktonskih bakterija. Nema utjecaja na stvaranje biofilma.(Ii) Planktonske bakterije su osjetljivije na antibiotike, a antibiotici se obično koriste nakon operacije;konačno, (iii) suspenzija planktonskih bakterija može se razrijediti tjelesnim tekućinama životinje (50).Pretkulturom implantata u bakterijskoj suspenziji prije implantacije možemo temeljito proučiti štetne učinke bakterijske infekcije i reakcije stranog tijela (FBR) na proces cijeljenja kosti.Kunići su žrtvovani 4 tjedna nakon implantacije, jer će oseointegracija neophodna za proces cijeljenja kosti biti dovršena unutar 4 tjedna.Zatim su implantati uklonjeni iz kunića za dalje studije.Slika 5A prikazuje mehanizam proliferacije bakterija.Zaraženi ortopedski implantat se unosi u tijelo.Kao rezultat predinkubacije u bakterijskoj suspenziji, šest od šest kunića kojima su implantirani goli implantati bili su zaraženi, dok nijedan od kunića kojima su implantirani implantati tretirani LOIS-om nije bio zaražen.Bakterijske infekcije odvijaju se u tri koraka, uključujući rast, sazrijevanje i širenje (51).Najprije se prilijepljene bakterije razmnožavaju i rastu na površini, a zatim bakterije stvaraju biofilm kada izlučuju izvanstanični polimer (EPS), amiloid i izvanstaničnu DNA.Biofilm ne samo da ometa prodor antibiotika, već također potiče nakupljanje enzima koji razgrađuju antibiotik (kao što je β-laktamaza) (52).Konačno, biofilm širi zrele bakterije u okolna tkiva.Stoga dolazi do infekcije.Osim toga, kada strano tijelo uđe u tijelo, infekcija koja može izazvati snažan imunološki odgovor može uzrokovati jaku upalu, bol i smanjenje imuniteta.Slika 5B daje pregled FBR-a uzrokovanog umetanjem ortopedskog implantata, a ne imunološkog odgovora uzrokovanog bakterijskom infekcijom.Imunološki sustav prepoznaje umetnuti implantat kao strano tijelo, a zatim uzrokuje reakciju stanica i tkiva da inkapsuliraju strano tijelo (53).U ranim danima FBR-a, na površini ortopedskih implantata formirana je opskrbna matrica, što je rezultiralo adsorpcijom fibrinogena.Adsorbirani fibrinogen zatim tvori vrlo gustu fibrinsku mrežu, koja potiče pričvršćivanje leukocita (54).Nakon što se formira fibrinska mreža, doći će do akutne upale zbog infiltracije neutrofila.U ovom koraku oslobađaju se različiti citokini kao što su faktor nekroze tumora-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) i IL-β, a monociti počinju infiltrirati mjesto implantacije i diferencirati se u divovske stanice.Fag (41, 55, 56).Smanjenje FBR-a uvijek je bio izazov jer prekomjerni FBR može izazvati akutnu i kroničnu upalu, što može dovesti do smrtonosnih komplikacija.Kako bi se procijenio utjecaj bakterijskih infekcija u tkivima koja okružuju goli implantat i LOIS, korišteno je bojanje hematoksilinom i eozinom (H&E) te Massonovim trikromom (MT).Kod kunića kojima su implantirani goli supstrati, ozbiljne bakterijske infekcije su napredovale, a H&E slajdovi tkiva jasno su pokazali apscese i nekroze uzrokovane upalom.S druge strane, iznimno jaka površina protiv obraštanja LOIS inhibira adheziju bakterija, tako da ne pokazuje znakove infekcije i smanjuje upalu (Slika 5C).Rezultati MT bojenja pokazali su isti trend.Međutim, MT bojenje također je pokazalo edem kod kunića kojima je implantiran LOIS, što ukazuje da će uskoro doći do oporavka (Slika 5D).Kako bi se proučio stupanj imunološkog odgovora, provedeno je imunohistokemijsko (IHC) bojenje pomoću citokina TNF-α i IL-6 povezanih s imunološkim odgovorom.Goli negativni implantat koji nije bio izložen bakterijama uspoređen je s LOIS-om koji je bio izložen bakterijama, ali nije zaražen kako bi se proučio proces zacjeljivanja u odsutnosti bakterijske infekcije.Slika 5E prikazuje optičku sliku IHC stakalca koji eksprimira TNF-α.Smeđe područje predstavlja imunološki odgovor, što ukazuje da je imunološki odgovor u LOIS-u malo smanjen.Osim toga, ekspresija IL-6 u LOIS-u bila je značajno manja od negativne ekspresije sterilnih golih (Slika 5F).Ekspresija citokina je kvantificirana mjerenjem površine obojene antitijela koja odgovara citokinu (Slika 5G).U usporedbi sa kunićima koji su bili izloženi negativnim implantatima, razine ekspresije kod kunića kojima je implantiran LOIS bile su niže, pokazujući značajnu razliku.Smanjenje ekspresije citokina ukazuje na to da dugoročna, stabilna svojstva LOIS-a protiv obraštanja nisu povezana samo s inhibicijom bakterijskih infekcija, već i sa smanjenjem FBR-a, koji je induciran prianjanjem makrofaga na supstrat (53, 57, 58).Stoga smanjeni imunološki odgovor zbog svojstava imunološke evazije LOIS-a može riješiti nuspojave nakon implantacije, kao što je pretjerani imunološki odgovor nakon plastične operacije.
(A) Shematski dijagram mehanizma stvaranja i širenja biofilma na površini inficiranog ortopedskog implantata.eDNA, izvanstanična DNA.(B) Shematski dijagram imunološkog odgovora nakon umetanja ortopedskog implantata.(C) H&E bojenje i (D) MT bojenje okolnih tkiva ortopedskih implantata s golim pozitivnim i LOIS.IHC imunološki povezanih citokina (E) TNF-α i (F) IL-6 obojene su slike golih negativnih kunića s implantiranim LOIS-om.(G) Kvantifikacija ekspresije citokina mjerenjem pokrivenosti područja (** P <0,01).
Biokompatibilnost LOIS-a i njegov učinak na proces cijeljenja kosti ispitani su in vivo pomoću dijagnostičke slike [rendgenske snimke i mikro-kompjutorizirana tomografija (CT)] i IHC osteoklasta.Slika 6A prikazuje proces cijeljenja kosti koji uključuje tri različite faze: upalu, popravak i remodeliranje.Kada dođe do prijeloma, upalne stanice i fibroblasti će prodrijeti u slomljenu kost i početi rasti u vaskularno tkivo.Tijekom faze popravka, urastanje vaskularnog tkiva širi se blizu mjesta prijeloma.Vaskularno tkivo osigurava hranjive tvari za stvaranje nove kosti, koja se naziva kalus.Završna faza procesa cijeljenja kosti je faza remodeliranja, u kojoj se veličina kalusa smanjuje na veličinu normalne kosti uz pomoć povećanja razine aktiviranih osteoklasta (59).Trodimenzionalna (3D) rekonstrukcija mjesta prijeloma provedena je pomoću mikro-CT skeniranja kako bi se uočile razlike u razini formiranja kalusa u svakoj skupini.Promatrajte poprečni presjek bedrene kosti kako biste uočili debljinu kalusa koji okružuje slomljenu kost (Slika 6, B i C).X-zrake su također korištene za ispitivanje mjesta prijeloma svih skupina svaki tjedan kako bi se promatrali različiti procesi regeneracije kosti u svakoj skupini (Slika S9).Kalus i zrele kosti prikazani su u plavoj/zelenoj boji i boji slonovače.Većina mekih tkiva se filtrira s unaprijed postavljenim pragom.Nude pozitivan i SHP potvrdili su stvaranje male količine kalusa oko mjesta prijeloma.S druge strane, izloženi negativ LOIS-a i mjesto prijeloma okruženi su debelim kalusom.Mikro-CT slike pokazale su da je stvaranje kalusa ometeno bakterijskom infekcijom i upalom povezanom s infekcijom.To je zato što imunološki sustav daje prioritet cijeljenju septičkih ozljeda uzrokovanih upalom povezanom s infekcijom, a ne oporavku kosti (60).IHC i bojenje kiselom fosfatazom otpornom na tartrat (TRAP) provedeno je da se promatra aktivnost osteoklasta i resorpcija kosti (Slika 6D) (61).Samo nekoliko aktiviranih osteoklasta obojenih ljubičasto nađeno je u golim pozitivima i SHP.S druge strane, mnogi aktivirani osteoklasti uočeni su u blizini golih pozitivnih i zrelih kostiju LOIS-a.Ovaj fenomen ukazuje da u prisutnosti osteoklasta, kalus oko mjesta prijeloma prolazi kroz nasilni proces remodeliranja (62).Volumen kosti i područje ekspresije osteoklasta kalusa izmjereni su kako bi se usporedila razina stvaranja kalusa oko mjesta prijeloma u svim skupinama, kako bi se kvantificirali rezultati mikro-CT skeniranja i IHC (Slika 6E, 1 i 2).Kao što se i očekivalo, goli negativi i stvaranje kalusa u LOIS-u bili su značajno veći nego u drugim skupinama, što ukazuje da je došlo do pozitivne pregradnje kosti (63).Slika S10 prikazuje optičku sliku mjesta kirurškog zahvata, rezultat bojenja MT tkiva sakupljenog u blizini vijka i rezultat bojenja TRAP koji ističe sučelje vijka i kosti.U goloj podlozi uočeno je snažno stvaranje kalusa i fibroze, dok je implantat tretiran LOIS-om pokazao relativno neadheriranu površinu.Slično tome, u usporedbi s golim negativima, uočena je manja fibroza kod kunića kojima je implantiran LOIS, kao što je naznačeno bijelim strelicama.Osim toga, čvrsti edem (plava strelica) može se pripisati svojstvima LOIS-a za izbjegavanje imunološkog sustava, čime se smanjuje teška upala.Neljepljiva površina oko implantata i smanjena fibroza sugeriraju da je proces uklanjanja lakši, što obično rezultira drugim prijelomima ili upalama.Proces cijeljenja kosti nakon uklanjanja vijka procijenjen je aktivnošću osteoklasta na spoju vijka i kosti.I gola kost i sučelje LOIS implantata apsorbirali su slične razine osteoklasta za daljnje cijeljenje kosti, što ukazuje da LOIS premaz nema negativan učinak na cijeljenje kosti ili imunološki odgovor.Kako bi se potvrdilo da modifikacija površine izvedena na LOIS-u ne ometa proces cijeljenja kostiju, korišten je rendgenski pregled za usporedbu cijeljenja kostiju kunića s izloženim negativnim ionima i 6 tjedana implantacije LOIS-a (Slika 6F).Rezultati su pokazali da je u usporedbi s neinficiranom golom pozitivnom grupom, LOIS pokazao isti stupanj zacjeljivanja kosti i nije bilo očitih znakova prijeloma (kontinuirana linija osteolize) u obje skupine.
(A) Shematski dijagram procesa cijeljenja kosti nakon prijeloma.(B) Razlika u stupnju formiranja kalusa svake površinske skupine i (C) slika presjeka mjesta prijeloma.(D) TRAP bojenje za vizualizaciju aktivnosti osteoklasta i resorpcije kosti.Na temelju aktivnosti TRAP-a, stvaranje vanjskog kalusa kortikalne kosti kvantitativno je analizirano pomoću (E) (1) mikro-CT i (2) aktivnosti osteoklasta.(F) 6 tjedana nakon implantacije, rendgenske slike slomljene kosti izloženog negativa (istaknuto crvenim isprekidanim pravokutnikom) i LOIS (naglašeno plavim isprekidanim pravokutnikom).Statistička analiza provedena je jednosmjernom analizom varijance (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Ukratko, LOIS pruža novu vrstu strategije antibakterijskih infekcija i premaz za imunološki otpor za ortopedske implantate.Konvencionalni ortopedski implantati s SHP funkcionalizacijom pokazuju kratkoročna svojstva protiv biološkog obraštanja, ali ne mogu zadržati svoja svojstva dugo vremena.Superhidrofobnost supstrata zadržava mjehuriće zraka između bakterija i supstrata, stvarajući tako zračne džepove, čime se sprječava bakterijska infekcija.Međutim, zbog difuzije zraka, ti se zračni džepovi lako uklanjaju.S druge strane, LOIS je dobro dokazao svoju sposobnost sprječavanja infekcija povezanih s biofilmom.Stoga, zbog svojstava protiv odbacivanja sloja lubrikanta ubrizganog u slojevitu površinu mikro/nano strukture, može se spriječiti upala povezana s infekcijom.Različite metode karakterizacije uključujući SEM, AFM, XPS i CA mjerenja koriste se za optimizaciju uvjeta proizvodnje LOIS-a.Osim toga, LOIS se također može primijeniti na različite biološke materijale koji se obično koriste u ortopedskoj opremi za fiksiranje, kao što su PLGA, Ti, PE, POM i PPSU.Zatim je LOIS testiran in vitro kako bi se dokazala njegova svojstva protiv bioobraštanja protiv bakterija i bioloških tvari povezanih s imunološkim odgovorom.Rezultati pokazuju da ima izvrsne antibakterijske učinke i učinke protiv biološkog obraštanja u usporedbi s golim implantatom.Osim toga, LOIS pokazuje mehaničku čvrstoću čak i nakon primjene mehaničkog naprezanja, što je neizbježno u plastičnoj kirurgiji.Zbog svojstava samozacjeljivanja maziva na površini mikro/nano strukture, LOIS je uspješno zadržao svoja antibiološka svojstva obraštanja.Kako bi se proučavala biokompatibilnost i antibakterijska svojstva LOIS-a in vivo, LOIS je implantiran u bedrenu kost kunića tijekom 4 tjedna.Nije primijećena bakterijska infekcija kod kunića kojima je implantiran LOIS.Uz to, uporaba IHC-a pokazala je smanjenu razinu lokalnog imunološkog odgovora, što ukazuje da LOIS ne inhibira proces cijeljenja kosti.LOIS pokazuje izvrsna antibakterijska i imunološka svojstva, a dokazano je da učinkovito sprječava stvaranje biofilma prije i tijekom ortopedskih operacija, posebno za sintezu kostiju.Korištenjem modela upalne frakture bedrene kosti zečje koštane srži, duboko je proučavan učinak infekcija povezanih s biofilmom na proces cijeljenja kosti izazvan prethodno inkubiranim implantatima.Kao buduća studija, potreban je novi in ​​vivo model za proučavanje mogućih infekcija nakon implantacije kako bi se u potpunosti razumjele i spriječile infekcije povezane s biofilmom tijekom cijelog procesa zacjeljivanja.Osim toga, osteoindukcija je još uvijek neriješen izazov u integraciji s LOIS-om.Potrebna su daljnja istraživanja za kombiniranje selektivne adhezije osteoinduktivnih stanica ili regenerativne medicine s LOIS-om kako bi se prevladao izazov.Sve u svemu, LOIS predstavlja obećavajuću prevlaku za ortopedske implantate s mehaničkom otpornošću i izvrsnim svojstvima protiv biološkog obraštanja, što može smanjiti SSI i imunološke nuspojave.
Isperite supstrat od 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS (Dong Kang M-Tech Co., Koreja) u acetonu, EtOH i DI vodi 15 minuta kako biste uklonili kontaminante.Kako bi se formirala mikro/nano struktura na površini, očišćeni supstrat se uranja u otopinu HF od 48% do 51% (DUKSAN Corp., Južna Koreja) na 50°C.Vrijeme jetkanja varira od 0 do 60 minuta.Zatim je ugravirani supstrat očišćen deioniziranom vodom i stavljen u otopinu od 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) na 50°C tijekom 30 minuta kako bi se formirao pasivacijski sloj krom oksida na površini.Nakon pasivizacije supstrat se ispere deioniziranom vodom i osuši kako bi se dobio supstrat slojevite strukture.Zatim je supstrat bio izložen kisikovoj plazmi (100 W, 3 minute) i odmah uronjen u otopinu od 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Njemačka) u toluenu na sobnoj temperaturi 12 sati.Zatim je supstrat obložen POTS očišćen EtOH i žaren na 150°C 2 sata da se dobije gusti POTS SAM.Nakon premazivanja SAM-om, na supstratu je formiran sloj lubrikanta primjenom perfluoropolieterskog lubrikanta (Krytox 101; DuPont, SAD) s volumenom punjenja od 20 μm/cm 2. Prije upotrebe lubrikant filtrirajte kroz filter od 0,2 mikrona.Uklonite višak maziva naginjanjem pod kutom od 45° 15 minuta.Isti proizvodni postupak korišten je za ortopedske implantate izrađene od 304 SS (zaključna ploča i kortikalni zaporni vijak; Dong Kang M-Tech Co., Koreja).Svi ortopedski implantati dizajnirani su tako da odgovaraju geometriji femura kunića.
Morfologija površine supstrata i ortopedskih implantata ispitana je SEM-om (Inspect F50, FEI, SAD) i AFM-om (XE-100, Park Systems, Južna Koreja).Hrapavost površine (Ra, Rq) mjeri se množenjem površine od 20 μm sa 20 μm (n=4).Za analizu kemijskog sastava površine korišten je XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japan) sustav opremljen Al Kα izvorom X-zraka s veličinom točke od 100 μm2.Sustav mjerenja CA opremljen dinamičkom kamerom za snimanje slike (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Južna Koreja) korišten je za mjerenje tekućeg CA i SA.Za svako mjerenje, 6 do 10 μl kapljica (deionizirana voda, konjska krv, EG, 30% etanol i HD) stavlja se na površinu za mjerenje CA.Kada se kut nagiba podloge povećava brzinom od 2°/s (n = 4), SA se mjeri kada kapljica padne.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] i MRSA (ATCC 25923) kupljeni su od ATCC (Manassas, Virginia, USA), a matična kultura je održavana na -80°C.Prije upotrebe, smrznuta kultura je inkubirana u sojinoj juhi odmrznutoj tripsinom (Komed, Koreja) na 37°C tijekom 18 sati, a zatim je dva puta prebačena da se aktivira.Nakon inkubacije, kultura je centrifugirana na 10.000 okretaja u minuti 10 minuta na 4°C i dva puta isprana otopinom PBS (pH 7,3).Centrifugirana kultura zatim se subkulturira na ploči s krvnim agarom (BAP).MRSA i Pseudomonas aeruginosa su pripremljeni preko noći i uzgojeni u Luria-Bertani bujonu.Koncentracija Pseudomonas aeruginosa i MRSA u inokulumu kvantitativno je određena CFU suspenzije u serijskim razrjeđenjima na agaru.Zatim podesite koncentraciju bakterija na 0,5 McFarland standarda, što je ekvivalentno 108 CFU/ml.Zatim razrijedite radnu bakterijsku suspenziju 100 puta do 106 CFU/ml.Kako bi se ispitala svojstva antibakterijske adhezije, supstrat je prije upotrebe steriliziran na 121°C 15 minuta.Supstrat je zatim prebačen u 25 ml bakterijske suspenzije i inkubiran na 37°C uz snažno mućkanje (200 okretaja u minuti) 12 i 72 sata.Nakon inkubacije, svaki je supstrat uklonjen iz inkubatora i ispran 3 puta s PBS-om kako bi se uklonile sve plutajuće bakterije na površini.Kako bi se promatrao biofilm na supstratu, biofilm je fiksiran metanolom i bojan s 1 ml krimidin narančaste 2 minute.Zatim je korišten fluorescentni mikroskop (BX51TR, Olympus, Japan) za snimanje slika obojenog biofilma.Kako bi se kvantificirao biofilm na supstratu, pričvršćene stanice su odvojene od supstrata bead vortex metodom, koja se smatra najprikladnijom metodom za uklanjanje pričvršćenih bakterija (n = 4).Koristeći sterilne pincete, uklonite supstrat iz medija za rast i dodirnite ploču s jažicom da uklonite višak tekućine.Labavo pričvršćene stanice uklonjene su ispiranjem dva puta sa sterilnim PBS-om.Svaki supstrat je zatim prebačen u sterilnu epruvetu koja je sadržavala 9 ml 0,1% proteinske fiziološke otopine (PSW) i 2 g od 20 do 25 sterilnih staklenih kuglica (0,4 do 0,5 mm u promjeru).Zatim je miješana 3 minute kako bi se stanice odvojile od uzorka.Nakon vorteksiranja, suspenzija je serijski razrijeđena 10 puta s 0,1% PSW, a zatim je 0,1 ml svakog razrjeđenja inokulirano na BAP.Nakon 24 sata inkubacije na 37°C, CFU je izbrojan ručno.
Za stanice su korišteni mišji fibroblasti NIH/3T3 (CRL-1658; američki ATCC) i mišji makrofagi RAW 264.7 (TIB-71; američki ATCC).Upotrijebite Dulbeccov modificirani Eagle medij (DMEM; LM001-05, Welgene, Koreja) za uzgoj mišjih fibroblasta i dopunite ga 10% telećim serumom (S103-01, Welgene) i 1% penicilin-streptomicinom (PS; LS202-02, Welgene (Welgene) ). Upotrijebite DMEM za uzgoj mišjih makrofaga, s dodatkom 10% fetalnog seruma goveda (S001-01, Welgene) i 1% PS, stavite supstrat u ploču sa šest jažica i inokulirajte stanice na 105 stanica/cm2. Stanice su inkubirane preko noći na 37°C i 5% CO2, stanice su fiksirane s 4% paraformaldehidom 20 minuta i stavljene u 0,5% Triton X Inkubirajte 5 minuta u -100°C na 37°C tijekom 30 minuta. Nakon procesa inkubacije, upotrijebite medij za fiksiranje 4′,6-diamino-2-fenilindola (H -1200, Vector Laboratories, UK) (n = 4 po ćeliji). , fluorescein, fluorescein izotiocijanat-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Njemačka) i ljudska plazma Alexa Fluor 488-konjugirani fibrinogen (F13191, Invitrogen, SAD) otopljen je u PBS (10 mM, pH 7,4).Koncentracije albumina bile su 1, a fibrinogena 150 μg/ml.Nakon supstrata Prije uranjanja u otopinu proteina, isperite ih PBS-om kako biste rehidrirali površinu.Zatim uronite sve supstrate u ploču sa šest jažica koja sadrži otopinu proteina i inkubirajte na 37°C 30 i 90 minuta.Nakon inkubacije, supstrat je zatim uklonjen iz otopine proteina, nježno ispran s PBS-om 3 puta i fiksiran s 4% paraformaldehidom (n = 4 za svaki protein).Za kalcij, natrijev klorid (0,21 M) i kalijev fosfat (3,77 mM) otopljen je u deioniziranoj vodi.pH otopine je podešen na 2,0 dodavanjem otopine hidroklorida (1M).Zatim je kalcijev klorid (5,62 mM) otopljen u otopini.Dodavanjem 1M tris(hidroksimetil)-amino metan podešava pH otopine na 7,4.Uronite sve supstrate u ploču sa šest jažica napunjenu 1,5 × otopinom kalcijevog fosfata i izvadite iz otopine nakon 30 minuta.Za bojenje, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) pomiješajte sa 100 ml deionizirane vode.Zatim upotrijebite 10% amonijev hidroksid da namjestite pH na 4. Obojite supstrat otopinom Alizarin crvenog 5 minuta, a zatim otresite višak boje i upijajte.Nakon procesa mućkanja uklonite podlogu.Materijal je dehidriran, zatim uronjen u aceton na 5 minuta, zatim uronjen u otopinu aceton-ksilen (1:1) na 5 minuta, i na kraju ispran ksilenom (n = 4).Koristi se fluorescentni mikroskop (Axio Imager) s objektivima ×10 i ×20..A2m, Zeiss, Njemačka) slike svih podloga.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) korišten je za kvantificiranje podataka o adheziji bioloških tvari na svakoj skupini od četiri različita područja snimanja.Pretvorite sve slike u binarne slike s fiksnim pragovima za usporedbu supstrata.
Konfokalni mikroskop Zeiss LSM 700 korišten je za praćenje stabilnosti sloja lubrikanta u PBS-u u načinu refleksije.Uzorak stakla obloženog SAM-om na bazi fluora s ubrizganim slojem za podmazivanje uronjen je u otopinu PBS-a i testiran pomoću orbitalne mućkalice (SHO-1D; Daihan Scientific, Južna Koreja) u uvjetima blagog mućkanja (120 okretaja u minuti).Zatim uzmite uzorak i pratite gubitak maziva mjerenjem gubitka reflektirane svjetlosti.Za dobivanje fluorescentnih slika u načinu refleksije, uzorak se izlaže laseru od 633 nm, a zatim se prikuplja, jer će se svjetlost reflektirati natrag od uzorka.Uzorci su mjereni u vremenskim intervalima od 0, 30, 60 i 120 sati.
Kako bi se utvrdio utjecaj procesa modifikacije površine na nanomehanička svojstva ortopedskih implantata, za mjerenje nanoindendiona korišten je nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, SAD) opremljen Berkovich dijamantnim vrhom trostrane piramide.Vršno opterećenje je 10 mN, a površina je 100μmx 100μm.Za sva mjerenja, vrijeme punjenja i pražnjenja je 10 s, a vrijeme držanja pod vršnim opterećenjem udubljenja je 2 s.Izvedite mjerenja s pet različitih mjesta i uzmite prosjek.Kako bi se ocijenila izvedba mehaničke čvrstoće pod opterećenjem, provedeno je poprečno ispitivanje savijanjem u tri točke pomoću univerzalnog ispitnog stroja (Instron 5966, Instron, SAD).Podloga se sabija konstantnom brzinom od 10 N/s s povećanim opterećenjem.Program Bluehill Universal (n = 3) korišten je za izračun modula savijanja i maksimalnog tlačnog naprezanja.
Kako bi se simulirao proces operacije i povezana mehanička oštećenja nastala tijekom operacije, proces operacije izveden je in vitro.Bedrene kosti su prikupljene od pogubljenih novozelandskih bijelih zečeva.Femur je očišćen i fiksiran u 4% paraformaldehidu 1 tjedan.Kao što je opisano u metodi pokusa na životinjama, fiksirana bedrena kost je kirurški operirana.Nakon operacije, ortopedski implantat je uronjen u krv (konjska krv, KISAN, Koreja) na 10 s kako bi se potvrdilo da li je došlo do priraslica krvi nakon nanošenja mehaničke ozljede (n = 3).
Ukupno 24 muška novozelandska bijela kunića (težina 3,0 do 3,5 kg, prosječna dob 6 mjeseci) nasumično su podijeljena u četiri skupine: goli negativni, goli pozitivni, SHP i LOIS.Svi postupci koji uključuju životinje provedeni su u skladu s etičkim standardima Odbora za institucionalnu skrb i korištenje životinja (odobren IACUC, KOREA-2017-0159).Ortopedski implantat sastoji se od pločice za zaključavanje s pet rupa (duljine 41 mm, širine 7 mm i debljine 2 mm) i kortikalnih vijaka za zaključavanje (duljine 12 mm, promjera 2,7 mm) za fiksaciju prijeloma.Osim onih pločica i vijaka korištenih u čisto negativnoj skupini, sve pločice i vijci su inkubirani u suspenziji MRSA (106 CFU/ml) 12 sati.Golo-negativna skupina (n=6) tretirana je implantatima s golom površinom bez izlaganja bakterijskoj suspenziji, kao negativna kontrola infekcije.Gola pozitivna skupina (n = 6) tretirana je s golom površinom implantata izloženog bakterijama kao pozitivnom kontrolom za infekciju.SHP skupina (n = 6) tretirana je bakterijama izloženim SHP implantatima.Konačno, LOIS skupina je liječena LOIS implantatima izloženim bakterijama (n = 6).Sve životinje su u kavezu, a osigurano im je dosta hrane i vode.Prije operacije, kunići su bili gladovani 12 sati.Životinje su anestezirane intramuskularnom injekcijom ksilazina (5 mg/kg) i intravenskom injekcijom paklitaksela (3 mg/kg) za indukciju.Nakon toga isporučite 2% izoflurana i 50% do 70% medicinskog kisika (brzina protoka 2 L/min) kroz dišni sustav za održavanje anestezije.Ugrađuje se izravnim pristupom u lateralnu bedrenu kost.Nakon uklanjanja dlačica i dezinfekcije kože povidon-jodom, s vanjske strane lijeve srednje bedrene kosti napravljen je rez u dužini od oko 6 cm.Otvaranjem razmaka između mišića koji pokrivaju bedrenu kost, bedrena kost postaje potpuno izložena.Postavite pločicu ispred dijafize bedrene kosti i pričvrstite je s četiri vijka.Nakon fiksacije, oštricom pile (debljine 1 mm) umjetno napravite prijelom u području između druge i četvrte rupe.Na kraju operacije rana je isprana fiziološkom otopinom i zatvorena šavovima.Svakom kuniću subkutano je ubrizgan enrofloksacin (5 mg/kg) razrijeđen do jedne trećine u fiziološkoj otopini.Postoperativne rendgenske snimke femura napravljene su kod svih životinja (0, 7, 14, 21, 28 i 42 dana) kako bi se potvrdila osteotomija kosti.Nakon duboke anestezije, sve životinje su usmrćene intravenskom primjenom KCl (2 mmol/kg) 28. i 42. dana.Nakon pogubljenja, bedrena kost je skenirana mikro-CT-om kako bi se promatrao i usporedio proces cijeljenja kosti i stvaranje nove kosti između četiriju skupina.
Nakon izvršenja sakupljena su meka tkiva koja su bila u izravnom kontaktu s ortopedskim implantatima.Tkivo je fiksirano u 10% neutralnom puferiranom formalinu preko noći i zatim dehidrirano u EtOH.Dehidrirano tkivo je ugrađeno u parafin i izrezano na debljinu od 40 μm pomoću mikrotoma (400CS; EXAKT, Njemačka).Kako bi se vizualizirala infekcija, provedeno je H&E bojenje i MT bojenje.Kako bi se provjerio odgovor domaćina, presječeno tkivo je inkubirano sa zečjim anti-TNF-α primarnim antitijelima (AB6671, Abcam, SAD) i zečjim anti-IL-6 (AB6672; Abcam, SAD), a zatim tretirano hrenom.Oksidaza.Nanesite sustav za bojenje kompleksa avidin-biotin (ABC) na rezove prema uputama proizvođača.Kako bi se pojavio kao smeđi produkt reakcije, 3,3-diaminobenzidin je korišten u svim dijelovima.Digitalni slajd skener (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Mađarska) korišten je za vizualizaciju svih rezova, a najmanje četiri supstrata u svakoj skupini analizirana su softverom ImageJ.
Rendgenske slike snimljene su svim životinjama nakon operacije i svaki tjedan kako bi se pratilo cijeljenje prijeloma (n=6 po skupini).Nakon smaknuća, mikro-CT visoke rezolucije korišten je za izračunavanje formiranja kalusa oko femura nakon zacjeljivanja.Dobivena bedrena kost je očišćena, fiksirana u 4% paraformaldehidu 3 dana i dehidrirana u 75% etanolu.Dehidrirane kosti su zatim skenirane pomoću mikro-CT-a (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgija) kako bi se generirale 3D voxel slike (2240×2240 piksela) uzorka kosti.Upotrijebite 1,0 mm Al filter za smanjenje šuma signala i primijenite visoku rezoluciju na sva skeniranja (E = 133 kVp, I = 60 μA, vrijeme integracije = 500 ms).Softver Nrecon (verzija 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgija) korišten je za generiranje 3D volumena skeniranog uzorka iz dobivene 2D bočne projekcije.Za analizu, 3D rekonstruirana slika podijeljena je na kocke 10mm×10mm×10mm prema mjestu prijeloma.Izračunajte kalus izvan kortikalne kosti.Za digitalno preusmjeravanje skeniranog volumena kosti korišten je softver DataViewer (verzija 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgija), a za analizu softver CT-Analyzer (verzija 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgija).Relativni koeficijenti apsorpcije rendgenskih zraka u zreloj kosti i kalusu razlikuju se po njihovoj gustoći, a zatim se kvantificira volumen kalusa (n = 4).Kako bi se potvrdilo da biokompatibilnost LOIS-a ne odgađa proces cijeljenja kostiju, provedena je dodatna rendgenska i mikro-CT analiza u dva kunića: goli negativni i LOIS skupina.Obje skupine su pogubljene u 6. tjednu.
Bedrene kosti žrtvovanih životinja su sakupljene i fiksirane u 4% paraformaldehidu 3 dana.Ortopedski implantat se zatim pažljivo uklanja iz bedrene kosti.Femur je dekalcificiran 21 dan korištenjem 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Zatim je dekalcificirana bedrena kost uronjena u EtOH da bi se dehidrirala.Dehidrirana bedrena kost je uklonjena u ksilenu i uklopljena u parafin.Zatim je uzorak izrezan automatskim rotirajućim mikrotomom (Leica RM2255, Leica Biosystems, Njemačka) debljine 3 μm.Za TRAP bojenje (F6760, Sigma-Aldrich, Njemačka), presječeni uzorci su deparafinizirani, rehidrirani i inkubirani u TRAP reagensu na 37°C tijekom 1 sata.Slike su dobivene pomoću skenera za slajdove (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Mađarska) i kvantificirane mjerenjem pokrivenosti područja obojenog područja.U svakom eksperimentu, najmanje četiri supstrata u svakoj skupini analizirana su softverom ImageJ.
Analiza statističke značajnosti provedena je pomoću programa GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., SAD).Nespareni t-test i jednosmjerna analiza varijance (ANOVA) korišteni su za testiranje razlika između evaluacijskih skupina.Razina značajnosti prikazana je na slici kako slijedi: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 i ****P<0,0001;NS, nema bitne razlike.
Za dodatne materijale za ovaj članak, molimo pogledajte http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Ovo je članak s otvorenim pristupom koji se distribuira pod uvjetima licence Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, koja dopušta korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, sve dok uporaba nije za komercijalnu dobit i ako je premisa da izvornik rad je ispravan.Referenca.
Napomena: Od vas tražimo samo da navedete adresu e-pošte kako bi osoba koju preporučite stranici znala da želite da vidi e-poštu i da e-pošta nije spam.Nećemo uhvatiti nijednu adresu e-pošte.
Ovo se pitanje koristi za provjeru jeste li ljudski posjetitelj i za sprječavanje automatskog slanja neželjene pošte.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Antibakterijski i imunološki zaštitni premazi ortopedskih implantata mogu smanjiti infekcije i imunološke reakcije uzrokovane infekcijama.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Antibakterijski i imunološki zaštitni premazi ortopedskih implantata mogu smanjiti infekcije i imunološke reakcije uzrokovane infekcijama.
©2021 Američka udruga za napredak znanosti.Sva prava pridržana.AAAS je partner HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.