آرتھوپیڈک امپلانٹ سرجری سے گزرنے والے مریضوں کے لیے، بیکٹیریل انفیکشن اور انفیکشن سے متاثر مدافعتی ردعمل ہمیشہ جان لیوا خطرات رہے ہیں۔روایتی حیاتیاتی مواد حیاتیاتی آلودگی کے لیے حساس ہوتے ہیں، جس کی وجہ سے بیکٹیریا زخمی جگہ پر حملہ آور ہوتے ہیں اور آپریشن کے بعد انفیکشن کا سبب بنتے ہیں۔لہذا، آرتھوپیڈک امپلانٹس کے لئے اینٹی انفیکشن اور مدافعتی فرار کوٹنگز تیار کرنے کی فوری ضرورت ہے۔یہاں، ہم نے آرتھوپیڈک امپلانٹس کے لیے سطح میں تبدیلی کی ایک جدید ٹیکنالوجی تیار کی ہے جسے Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS) کہا جاتا ہے، جو گھڑے کے پودوں کے گھڑے کی ہموار سطح سے متاثر ہے۔LOIS میں مختلف قسم کے مائعات اور حیاتیاتی مادوں (بشمول خلیات، پروٹین، کیلشیم اور بیکٹیریا) کے لیے دیرپا اور مضبوط مائع ریپیلنسی ہے۔اس کے علاوہ، ہم نے ان وٹرو سرجری کے دوران ناگزیر نقصان کی نقالی کرتے ہوئے خروںچ اور فکسنگ فورس کے خلاف مکینیکل پائیداری کی تصدیق کی۔خرگوش بون میرو کی سوزش والی فیمورل فریکچر ماڈل کو LOIS کی اینٹی بائیولوجیکل اسکیلنگ اور اینٹی انفیکشن کی صلاحیت کا اچھی طرح سے مطالعہ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ہم تصور کرتے ہیں کہ LOIS، جس میں اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات اور مکینیکل استحکام ہے، انفیکشن سے پاک آرتھوپیڈک سرجری میں ایک قدم آگے ہے۔
آج، مجموعی طور پر عمر رسیدہ ہونے کی وجہ سے، آرتھوپیڈک امراض میں مبتلا مریضوں کی تعداد (جیسے بزرگوں کے فریکچر، جوڑوں کی تنزلی کی بیماریاں، اور آسٹیوپوروسس) میں بہت اضافہ ہوا ہے (1، 2)۔لہذا، طبی ادارے آرتھوپیڈک سرجری کو بہت اہمیت دیتے ہیں، بشمول پیچ، پلیٹ، ناخن اور مصنوعی جوڑوں کے آرتھوپیڈک امپلانٹس (3، 4).تاہم، روایتی آرتھوپیڈک امپلانٹس کو بیکٹیریل آسنجن اور بائیوفیلم کی تشکیل کے لئے حساس ہونے کی اطلاع دی گئی ہے، جو سرجری کے بعد سرجیکل سائٹ انفیکشن (SSI) کا سبب بن سکتی ہے (5، 6).آرتھوپیڈک امپلانٹ کی سطح پر بائیو فلم بننے کے بعد، بائیو فلم کو ہٹانا انتہائی مشکل ہو جاتا ہے حتیٰ کہ اینٹی بائیوٹکس کی بڑی مقدار کے استعمال کے باوجود۔لہذا، یہ عام طور پر شدید postoperative کی انفیکشن کی طرف جاتا ہے (7، 8).مندرجہ بالا مسائل کی وجہ سے، متاثرہ امپلانٹس کے علاج میں دوبارہ آپریشن شامل ہونا چاہیے، بشمول تمام امپلانٹس اور ارد گرد کے ٹشوز کو ہٹانا؛لہذا، مریض کو شدید درد اور کچھ خطرات کا سامنا کرنا پڑے گا (9، 10).
ان میں سے کچھ مسائل کو حل کرنے کے لئے، سطح سے منسلک بیکٹیریا کو ختم کرنے کے ذریعے انفیکشن کو روکنے کے لئے منشیات سے متعلق آرتھوپیڈک امپلانٹس تیار کیے گئے ہیں (11، 12).تاہم، حکمت عملی اب بھی کئی حدود کو ظاہر کرتی ہے۔یہ اطلاع دی گئی ہے کہ منشیات کے ایلوٹنگ امپلانٹس کے طویل مدتی امپلانٹ نے ارد گرد کے ؤتکوں کو نقصان پہنچایا ہے اور سوزش کی وجہ سے ہے، جو نیکروسس (13، 14) کی قیادت کر سکتی ہے.اس کے علاوہ، آرگینک سالوینٹس جو ڈرگ ایلوٹنگ آرتھوپیڈک امپلانٹس کی تیاری کے عمل کے بعد موجود ہو سکتے ہیں، جن پر امریکی فوڈ اینڈ ڈرگ ایڈمنسٹریشن کی طرف سے سختی سے ممانعت ہے، اس کے معیارات پر پورا اترنے کے لیے اضافی طہارت کے اقدامات کی ضرورت ہوتی ہے (15)۔ڈرگ ایلوٹنگ امپلانٹس دوائیوں کی کنٹرول شدہ ریلیز کے لیے چیلنجنگ ہیں، اور ان کی محدود ادویات کی لوڈنگ کی وجہ سے، دوا کا طویل مدتی اطلاق ممکن نہیں ہے (16)۔
ایک اور عام حکمت عملی یہ ہے کہ امپلانٹ کو اینٹی فولنگ پولیمر کے ساتھ کوٹ کیا جائے تاکہ حیاتیاتی مادے اور بیکٹیریا کو سطح پر لگنے سے روکا جا سکے (17)۔مثال کے طور پر، zwitterionic پولیمر اپنی غیر چپکنے والی خصوصیات کی وجہ سے توجہ مبذول کرتے ہیں جب پلازما پروٹین، خلیات اور بیکٹیریا کے ساتھ رابطے میں ہوتے ہیں۔تاہم، اس میں طویل مدتی استحکام اور مکینیکل استحکام سے متعلق کچھ حدود ہیں، جو آرتھوپیڈک امپلانٹس میں اس کے عملی استعمال میں رکاوٹ ہیں، خاص طور پر جراحی کے طریقہ کار کے دوران مکینیکل سکریپنگ کی وجہ سے (18، 19)۔اس کے علاوہ، اس کی اعلی حیاتیاتی مطابقت، ہٹانے کی سرجری کی ضرورت کی کمی، اور سنکنرن کے ذریعے سطح کی صفائی کی خصوصیات کی وجہ سے، بایوڈیگریڈیبل مواد سے بنے آرتھوپیڈک امپلانٹس استعمال کیے گئے ہیں (20، 21)۔سنکنرن کے دوران، پولیمر میٹرکس کے درمیان کیمیائی بانڈ ٹوٹ جاتے ہیں اور سطح سے الگ ہوجاتے ہیں، اور پیروکار سطح کو صاف کرتے ہیں۔تاہم، سطح کی صفائی سے اینٹی بائیولوجیکل فاؤلنگ بہت کم وقت میں موثر ہے۔اس کے علاوہ، زیادہ تر جذب ہونے والے مواد بشمول پولی (لییکٹک ایسڈ-گلائیکولک ایسڈ کوپولیمر) (PLGA)، پولی لیکٹک ایسڈ (PLA) اور میگنیشیم پر مبنی مرکبات جسم میں غیر مساوی بائیو ڈی گریڈیشن اور کٹاؤ سے گزریں گے، جو میکانکی استحکام کو منفی طور پر متاثر کرے گا۔(بائیس).اس کے علاوہ، بایوڈیگریڈیبل پلیٹ کے ٹکڑے بیکٹیریا کو منسلک ہونے کی جگہ فراہم کرتے ہیں، جو طویل عرصے میں انفیکشن کے امکانات کو بڑھاتا ہے۔مکینیکل انحطاط اور انفیکشن کا یہ خطرہ پلاسٹک سرجری کے عملی اطلاق کو محدود کرتا ہے (23)۔
سپر ہائیڈرو فوبک (SHP) سطحیں جو کمل کے پتوں کی درجہ بندی کی ساخت کی نقل کرتی ہیں اینٹی فاؤلنگ سطحوں کے لئے ایک ممکنہ حل بن گئی ہیں (24, 25)۔جب SHP سطح مائع میں ڈوبی جاتی ہے، تو ہوا کے بلبلے پھنس جائیں گے، اس طرح ہوا کی جیبیں بنیں گی اور بیکٹیریل آسنجن کو روکیں گے (26)۔تاہم، حالیہ مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ SHP کی سطح میں میکانیکی استحکام اور طویل مدتی استحکام سے متعلق نقصانات ہیں، جو طبی امپلانٹس میں اس کے استعمال میں رکاوٹ ہیں۔مزید یہ کہ، ہوا کی جیبیں تحلیل ہو جائیں گی اور اپنی اینٹی فاؤلنگ خصوصیات سے محروم ہو جائیں گی، اس طرح ایس ایچ پی کی سطح کے بڑے رقبے کی وجہ سے وسیع بیکٹیریل چپکنے کا نتیجہ ہوتا ہے (27, 28)۔حال ہی میں، ایزن برگ اور ساتھیوں نے نیپینتھس پچر پلانٹ (29، 30) سے متاثر ایک ہموار سطح تیار کرکے اینٹی بائیوفولنگ سطح کوٹنگ کا ایک جدید طریقہ متعارف کرایا۔ہموار سطح ہائیڈرولک حالات میں طویل مدتی استحکام کو ظاہر کرتی ہے، حیاتیاتی مائعات کے لیے انتہائی مائع ہے، اور خود مرمت کی خصوصیات رکھتی ہے۔تاہم، پیچیدہ شکل کے میڈیکل امپلانٹ پر کوٹنگ لگانے کا نہ تو کوئی طریقہ ہے، اور نہ ہی یہ ثابت ہوتا ہے کہ امپلانٹیشن کے بعد خراب ٹشوز کی شفا یابی کے عمل میں مدد ملتی ہے۔
یہاں، ہم ایک چکنا ہوا آرتھوپیڈک امپلانٹ سطح (LOIS) متعارف کراتے ہیں، ایک مائیکرو/نینو سٹرکچرڈ آرتھوپیڈک امپلانٹ سطح اور اسے پلاسٹک سرجری کے بیکٹیریل انفیکشنز، جیسے فریکچر فکسشن سے منسلک ہونے سے روکنے کے لیے ایک پتلی چکنا کرنے والی پرت کے ساتھ مضبوطی سے جوڑ دیا جاتا ہے۔چونکہ فلورین فنکشنلائزڈ مائیکرو/نینو لیول کا ڈھانچہ ساخت پر چکنا کرنے والے کو مضبوطی سے ٹھیک کرتا ہے، اس لیے تیار شدہ LOIS مختلف مائعات کے چپکنے کو مکمل طور پر پیچھے ہٹا سکتا ہے اور طویل عرصے تک اینٹی فاؤلنگ کارکردگی کو برقرار رکھ سکتا ہے۔LOIS کوٹنگز کو ہڈیوں کی ترکیب کے لیے مختلف اشکال کے مواد پر لگایا جا سکتا ہے۔وٹرو میں بائیوفیلم بیکٹیریا [سیوڈوموناس ایروگینوسا اور میتھیسلن مزاحم Staphylococcus aureus (MRSA)] اور حیاتیاتی مادوں (خلیات، پروٹین اور کیلشیم) کے خلاف LOIS کی بہترین اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات کی تصدیق کی گئی ہے۔سبسٹریٹ میں وسیع آسنجن کی آسنجن کی شرح 1٪ سے کم ہے۔اس کے علاوہ، سطح پر کھرچنے جیسے مکینیکل تناؤ کے بعد بھی، گھسنے والے چکنا کرنے والے کی وجہ سے خود کو ٹھیک کرنا اس کی اینٹی فاؤلنگ خصوصیات کو برقرار رکھنے میں مدد کرتا ہے۔مکینیکل پائیداری ٹیسٹ کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ساختی اور کیمیائی ترمیم کے بعد بھی کل طاقت میں نمایاں کمی نہیں ہوگی۔اس کے علاوہ، ایک ان وٹرو تجربہ جو جراحی کے ماحول میں مکینیکل تناؤ کی نقالی کرتا ہے یہ ثابت کرنے کے لیے کیا گیا کہ LOIS پلاسٹک سرجری کے دوران ہونے والے مختلف مکینیکل دباؤ کا مقابلہ کر سکتا ہے۔آخر میں، ہم نے ویوو فیمورل فریکچر ماڈل میں خرگوش پر مبنی ایک استعمال کیا، جس نے ثابت کیا کہ LOIS میں اعلیٰ اینٹی بیکٹیریل خصوصیات اور بائیو مطابقت ہے۔ریڈیولاجیکل اور ہسٹولوجیکل نتائج نے اس بات کی تصدیق کی کہ امپلانٹیشن کے بعد 4 ہفتوں کے اندر مستحکم چکنا کرنے والے رویے اور اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل میں تاخیر کیے بغیر مؤثر انسداد انفیکشن اور مدافعتی کارکردگی کو حاصل کر سکتی ہیں۔
شکل 1A ترقی یافتہ LOIS کا اسکیمیٹک خاکہ دکھاتا ہے، جسے خرگوش فیمورل فریکچر ماڈل میں مائکرو/نینو اسکیل ڈھانچے کے ساتھ لگایا جاتا ہے تاکہ اس کی بہترین اینٹی بائیولوجیکل فاؤلنگ اور اینٹی انفیکشن خصوصیات کی تصدیق کی جاسکے۔پانی کے برتن کے پلانٹ کی سطح کی نقالی کرنے کے لیے، اور سطح کے مائیکرو/نینو ڈھانچے کے اندر چکنا کرنے والی تہہ کو شامل کر کے بائیوفاؤلنگ کو روکنے کے لیے ایک بایومیمیٹک طریقہ استعمال کیا جاتا ہے۔سنےہک کے ساتھ انجکشن کی سطح حیاتیاتی مادوں اور سطح کے درمیان رابطے کو کم کر سکتی ہے۔لہذا، سطح پر مستحکم کیمیائی بانڈز کی تشکیل کی وجہ سے، اس میں بہترین اینٹی فولنگ کارکردگی اور طویل مدتی استحکام ہے.نتیجے کے طور پر، چکنا کرنے والی سطح کی اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات بائیو میڈیکل ریسرچ میں مختلف عملی استعمال کی اجازت دیتی ہیں۔تاہم، یہ خاص سطح جسم میں کیسے تعامل کرتی ہے اس بارے میں وسیع تحقیق ابھی تک مکمل نہیں ہو سکی ہے۔البومین اور بائیو فلم بیکٹیریا کا استعمال کرتے ہوئے وٹرو میں ننگے سبسٹریٹس کے ساتھ LOIS کا موازنہ کرنے سے، LOIS کی عدم چپکنے کی تصدیق کی جا سکتی ہے (شکل 1B)۔اس کے علاوہ، مائل ننگے سبسٹریٹ اور LOIS سبسٹریٹ (فگر S1 اور Movie S1) پر پانی کی بوندوں کو رول کر کے، حیاتیاتی آلودگی کی کارکردگی کا مظاہرہ کیا جا سکتا ہے۔جیسا کہ فلوروسینس مائیکروسکوپ امیج میں دکھایا گیا ہے، پروٹین اور بیکٹیریا کی معطلی میں موجود بے نقاب سبسٹریٹ نے سطح پر موجود حیاتیاتی مواد کی ایک بڑی مقدار کو ظاہر کیا۔تاہم، اپنی بہترین اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات کی وجہ سے، LOIS شاید ہی کوئی فلوروسینس دکھاتا ہے۔اس کی اینٹی بائیوفولنگ اور اینٹی انفیکشن خصوصیات کی تصدیق کرنے کے لیے، LOIS کو ہڈیوں کی ترکیب (پلیٹ اور پیچ) کے لیے آرتھوپیڈک امپلانٹس کی سطح پر لگایا گیا اور اسے خرگوش کے فریکچر ماڈل میں رکھا گیا۔امپلانٹیشن سے پہلے، ننگے آرتھوپیڈک امپلانٹ اور LOIS کو 12 گھنٹے کے لیے بیکٹیریل سسپنشن میں لگایا گیا تھا۔پری انکیوبیشن اس بات کو یقینی بناتی ہے کہ مقابلے کے لیے بے نقاب امپلانٹ کی سطح پر ایک بائیو فلم بنتی ہے۔شکل 1C امپلانٹیشن کے 4 ہفتے بعد فریکچر سائٹ کی تصویر دکھاتا ہے۔بائیں طرف، ایک ننگے آرتھوپیڈک امپلانٹ کے ساتھ ایک خرگوش نے امپلانٹ کی سطح پر بائیو فلم کی تشکیل کی وجہ سے سوزش کی شدید سطح کو ظاہر کیا۔الٹا نتیجہ LOIS کے ساتھ لگائے گئے خرگوشوں میں دیکھا گیا، یعنی LOIS کے آس پاس کے ٹشوز میں نہ تو انفیکشن کی علامات دکھائی دیتی ہیں اور نہ ہی سوزش کی علامات۔اس کے علاوہ، بائیں جانب نظری تصویر بے نقاب امپلانٹ کے ساتھ خرگوش کی سرجیکل سائٹ کی نشاندہی کرتی ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ LOIS کی سطح پر بے نقاب امپلانٹ کی سطح پر موجود کوئی بھی متعدد چپکنے والی چیزیں نہیں پائی گئیں۔اس سے ظاہر ہوتا ہے کہ LOIS میں طویل مدتی استحکام ہے اور اس میں اینٹی بائیولوجیکل فولنگ اور اینٹی چپکنے والی خصوصیات کو برقرار رکھنے کی صلاحیت ہے۔
(A) LOIS کا اسکیمیٹک ڈایاگرام اور خرگوش کے فیمورل فریکچر ماڈل میں اس کی پیوند کاری۔(B) ننگی سطح اور LOIS سبسٹریٹ پر پروٹین اور بیکٹیریل بائیو فلم کی فلوروسینس مائکروسکوپی امیج۔امپلانٹیشن کے 4 ہفتے بعد، (C) فریکچر سائٹ کی فوٹو گرافی کی تصویر اور (D) ایک ایکس رے تصویر (سرخ مستطیل سے نمایاں)۔تصویر بشکریہ: Kyomin Chae، Yonsei یونیورسٹی۔
جراثیم سے پاک، بے نقاب منفی طور پر لگائے گئے خرگوش میں سوزش یا انفیکشن کی علامات کے بغیر ہڈیوں کے ٹھیک ہونے کا ایک عام عمل دکھایا گیا۔دوسری طرف، بیکٹیریل سسپنشن میں پہلے سے لگائے گئے SHP امپلانٹس ارد گرد کے ٹشوز پر انفیکشن سے متعلق سوزش کو ظاہر کرتے ہیں۔یہ طویل عرصے تک بیکٹیریل آسنجن کو روکنے میں ناکام ہونے کی وجہ سے منسوب کیا جا سکتا ہے (شکل S2)۔یہ ثابت کرنے کے لیے کہ LOIS شفا یابی کے عمل کو متاثر نہیں کرتا، لیکن امپلانٹیشن سے متعلق ممکنہ انفیکشن کو روکتا ہے، فریکچر سائٹ پر بے نقاب مثبت میٹرکس اور LOIS کی ایکس رے تصاویر کا موازنہ کیا گیا (شکل 1D)۔ننگے مثبت امپلانٹ کی ایکس رے امیج میں مستقل آسٹیولیسس لائنیں دکھائی دیتی ہیں، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ ہڈی مکمل طور پر ٹھیک نہیں ہوئی تھی۔اس سے پتہ چلتا ہے کہ انفیکشن سے متعلق سوزش کی وجہ سے ہڈیوں کی بحالی کے عمل میں بہت تاخیر ہو سکتی ہے۔اس کے برعکس، اس نے ظاہر کیا کہ LOIS کے ساتھ لگائے گئے خرگوش ٹھیک ہو گئے تھے اور انہوں نے فریکچر کی کوئی واضح جگہ نہیں دکھائی تھی۔
طویل مدتی استحکام اور فعالیت کے ساتھ طبی امپلانٹس تیار کرنے کے لیے (بشمول بائیوفولنگ کے خلاف مزاحمت)، بہت سی کوششیں کی گئی ہیں۔تاہم، مختلف حیاتیاتی مادوں کی موجودگی اور بافتوں کے آسنجن کی حرکیات ان کے طبی اعتبار سے قابل اعتماد طریقوں کی نشوونما کو محدود کرتی ہیں۔ان کوتاہیوں پر قابو پانے کے لیے، ہم نے ایک مائیکرو/نینو لیئرڈ ڈھانچہ اور کیمیاوی طور پر تبدیل شدہ سطح تیار کی ہے، جو کہ زیادہ کیپلیری قوت اور کیمیائی وابستگی کی وجہ سے بہترین ہے تاکہ چکنا کرنے والے کو سب سے زیادہ حد تک برقرار رکھا جا سکے۔شکل 2A LOIS کے مجموعی مینوفیکچرنگ کے عمل کو ظاہر کرتا ہے۔سب سے پہلے، میڈیکل گریڈ سٹینلیس سٹیل (SS) 304 سبسٹریٹ تیار کریں۔دوم، مائیکرو/نینو ڈھانچہ ایس ایس سبسٹریٹ پر ہائیڈرو فلورک ایسڈ (HF) محلول کا استعمال کرتے ہوئے کیمیکل اینچنگ کے ذریعے بنتا ہے۔SS کی سنکنرن مزاحمت کو بحال کرنے کے لیے، ایک نائٹرک ایسڈ (HNO3) محلول (31) کو اینچڈ سبسٹریٹ پر کارروائی کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔Passivation SS سبسٹریٹ کی سنکنرن مزاحمت کو بڑھاتا ہے اور سنکنرن کے عمل کو نمایاں طور پر سست کر دیتا ہے جو LOIS کی مجموعی کارکردگی کو کم کر سکتا ہے۔پھر، 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane (POTS) کے ساتھ ایک خود ساختہ monolayer (SAM) بنا کر، سطح اور ہموار چکنا کرنے والے مادے کے درمیان کیمیائی تعامل کو بہتر بنانے کے لیے سطح کو کیمیائی طور پر تبدیل کیا جاتا ہے۔سطح کی تبدیلی سے من گھڑت مائیکرو/نینو اسکیل ساخت کی سطح کی توانائی کو نمایاں طور پر کم کیا جاتا ہے، جو ہموار چکنا کرنے والے کی سطحی توانائی سے میل کھاتا ہے۔یہ چکنا کرنے والے کو مکمل طور پر گیلا ہونے دیتا ہے، اس طرح سطح پر ایک مستحکم چکنا کرنے والی پرت بن جاتی ہے۔ترمیم شدہ سطح ہائیڈروفوبیسیٹی کو بڑھاتی ہے۔نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ پھسلنے والا چکنا کرنے والا LOIS پر مستحکم رویے کی نمائش کرتا ہے کیونکہ مائیکرو/نینو ڈھانچے (32, 33) کی وجہ سے زیادہ کیمیائی وابستگی اور کیپلیری قوت ہوتی ہے۔سطح میں ترمیم اور چکنا کرنے والے انجیکشن کے بعد ایس ایس کی سطح پر نظری تبدیلیوں کا مطالعہ کیا گیا۔سطح پر بننے والا مائیکرو/نینو پرتوں والا ڈھانچہ بصری تبدیلیوں کا سبب بن سکتا ہے اور سطح کو سیاہ کر سکتا ہے۔اس رجحان کو کھردری سطح پر روشنی کے بڑھے ہوئے اثر سے منسوب کیا جاتا ہے، جو روشنی کو پھنسانے کے طریقہ کار کی وجہ سے پھیلنے والے انعکاس کو بڑھاتا ہے (34)۔اس کے علاوہ، چکنا کرنے والا انجکشن لگانے کے بعد، LOIS گہرا ہو جاتا ہے۔چکنا کرنے والی تہہ کی وجہ سے سبسٹریٹ سے کم روشنی منعکس ہوتی ہے، اس طرح LOIS کو سیاہ ہو جاتا ہے۔اینٹی بائیوفولنگ کارکردگی کو حاصل کرنے کے لیے سب سے چھوٹا سلائیڈنگ اینگل (SA) دکھانے کے لیے مائکرو اسٹرکچر/نانو اسٹرکچر کو بہتر بنانے کے لیے، اسکیننگ الیکٹران مائیکروسکوپی (SEM) اور ایٹم جوڑے مختلف HF اینچنگ اوقات (0، 3) انجام دینے کے لیے استعمال کیے گئے۔، 15 اور 60 منٹ) فورس مائکروسکوپ (AFM) (شکل 2B)۔SEM اور AFM امیجز سے پتہ چلتا ہے کہ اینچنگ کے تھوڑے وقت کے بعد (3 منٹ کی اینچنگ)، ننگے سبسٹریٹ نے ناہموار نینو اسکیل کھردرا پن پیدا کر دیا ہے۔اینچنگ کے وقت کے ساتھ سطح کا کھردرا پن بدل جاتا ہے (شکل S3)۔وقت کے مختلف ہونے والے وکر سے پتہ چلتا ہے کہ سطح کا کھردرا پن مسلسل بڑھتا رہتا ہے اور 15 منٹ تک اینچنگ کے وقت اپنی چوٹی تک پہنچ جاتا ہے، اور پھر 30 منٹ تک کھردری کی قدر میں معمولی کمی دیکھی جاتی ہے۔اس مقام پر، نینو سطح کا کھردرا پن دور ہو جاتا ہے، جبکہ مائیکرو لیول کا کھردرا پن بھرپور طریقے سے تیار ہوتا ہے، جس سے کھردرا پن زیادہ مستحکم ہوتا ہے۔30 منٹ سے زیادہ تک اینچنگ کے بعد، کھردرا پن میں مزید اضافہ دیکھا گیا، جس کی تفصیل اس طرح بیان کی گئی ہے: SS فولاد پر مشتمل ہے، جس میں لوہے، کرومیم، نکل، مولیبڈینم اور بہت سے دیگر عناصر شامل ہیں۔ان عناصر میں سے، آئرن، کرومیم اور مولیبڈینم HF ایچنگ کے ذریعے SS پر مائکرون/نینو اسکیل کی کھردری بنانے میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔سنکنرن کے ابتدائی مراحل میں، آئرن اور کرومیم بنیادی طور پر زنگ آلود ہوتے ہیں کیونکہ مولبڈینم میں سنکنرن مزاحمت مولیبڈینم سے زیادہ ہوتی ہے۔جیسے جیسے اینچنگ آگے بڑھتی ہے، اینچنگ کا محلول مقامی حد سے زیادہ سیرابی تک پہنچ جاتا ہے، جو اینچنگ کی وجہ سے فلورائیڈز اور آکسائیڈز بناتا ہے۔فلورائیڈ اور آکسائیڈ تیزی سے سطح پر جمع ہو جاتے ہیں، جس سے مائیکرون/نینو رینج (31) میں سطح کی کھردری بنتی ہے۔یہ مائیکرو/نینو سطح کی کھردری LOIS کی خود شفا بخش خصوصیات میں اہم کردار ادا کرتی ہے۔دوہری پیمانے کی سطح ایک ہم آہنگی کا اثر پیدا کرتی ہے، جس سے کیپلیری قوت میں بہت اضافہ ہوتا ہے۔یہ رجحان چکنا کرنے والے کو سطح میں مستحکم طور پر گھسنے کی اجازت دیتا ہے اور خود شفا بخش خصوصیات میں حصہ ڈالتا ہے (35)۔کھردری کی تشکیل اینچنگ کے وقت پر منحصر ہے۔اینچنگ کے 10 منٹ کے تحت، سطح میں صرف نینو پیمانے پر کھردرا پن ہوتا ہے، جو کہ بایو فولنگ ریزسٹنس (36) کے لیے کافی چکنا کرنے والے مادے کو رکھنے کے لیے کافی نہیں ہے۔دوسری طرف، اگر اینچنگ کا وقت 30 منٹ سے زیادہ ہو جائے تو، لوہے اور کرومیم کے دوبارہ جمع ہونے سے بننے والی نینو اسکیل کھردری ختم ہو جائے گی، اور مولیبڈینم کی وجہ سے صرف مائیکرو پیمانہ کھردرا پن باقی رہے گا۔ضرورت سے زیادہ کھردری سطح میں نینو پیمانے پر کھردرا پن نہیں ہوتا ہے اور یہ دو مراحل کی کھردری کے ہم آہنگی کے اثر کو کھو دیتی ہے، جو LOIS کی خود شفا یابی کی خصوصیات کو منفی طور پر متاثر کرتی ہے۔اینٹی فاؤلنگ کارکردگی کو ثابت کرنے کے لیے مختلف اینچنگ اوقات کے ساتھ سبسٹریٹس پر SA پیمائش کی گئی۔مختلف قسم کے مائعات کا انتخاب viscosity اور سطحی توانائی کی بنیاد پر کیا گیا تھا، بشمول deionized (DI) پانی، خون، ethylene glycol (EG)، ایتھنول (EtOH) اور ہیکساڈیکین (HD) (Figure S4)۔وقت کے لحاظ سے مختلف اینچنگ پیٹرن سے پتہ چلتا ہے کہ مختلف سطح کی توانائیوں اور چپکنے والی مختلف مائعات کے لیے، اینچنگ کے 15 منٹ کے بعد LOIS کا SA سب سے کم ہے۔لہٰذا، LOIS کو 15 منٹ تک کھینچنے کے لیے مائیکرون اور نینو پیمانے پر کھردرا پن بنانے کے لیے موزوں بنایا گیا ہے، جو چکنا کرنے والے کی پائیداری کو مؤثر طریقے سے برقرار رکھنے کے لیے موزوں ہے اور بہترین اینٹی فاؤلنگ خصوصیات ہیں۔
(A) LOIS کے چار قدمی مینوفیکچرنگ کے عمل کا اسکیمیٹک خاکہ۔انسیٹ سبسٹریٹ پر بنائے گئے SAM کو دکھاتا ہے۔(B) SEM اور AFM امیجز، مختلف اینچنگ اوقات کے تحت سبسٹریٹ کے مائیکرو/نینو ڈھانچے کو بہتر بنانے کے لیے استعمال ہوتی ہیں۔ایکس رے فوٹو الیکٹران اسپیکٹروسکوپی (XPS) سپیکٹرا (C) Cr2p اور (D) F1s سطح کے گزرنے اور SAM کوٹنگ کے بعد۔au، صوابدیدی یونٹ۔(E) ننگے، اینچڈ، SHP اور LOIS سبسٹریٹس پر پانی کی بوندوں کی نمائندہ تصاویر۔(F) SHP اور LOIS پر مختلف سطح کے تناؤ کے ساتھ مائعات کا رابطہ زاویہ (CA) اور SA پیمائش۔ڈیٹا کو اوسط ± SD کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔
پھر، سطح کی کیمیائی خصوصیات میں تبدیلی کی تصدیق کرنے کے لیے، ہر سطح کی کوٹنگ کے بعد سبسٹریٹ کی سطح کی کیمیائی ساخت میں تبدیلی کا مطالعہ کرنے کے لیے ایکس رے فوٹو الیکٹران سپیکٹروسکوپی (XPS) کا استعمال کیا گیا۔شکل 2C HF ایچڈ سطح اور HNO 3 ٹریٹڈ سطح کے XPS پیمائش کے نتائج دکھاتا ہے۔587.3 اور 577.7 eV کی دو اہم چوٹیوں کو کرومیم آکسائیڈ کی تہہ میں موجود Cr-O بانڈ سے منسوب کیا جا سکتا ہے، جو HF ایچڈ سطح سے بنیادی فرق ہے۔یہ بنیادی طور پر HNO3 کے ذریعہ سطح پر آئرن اور کرومیم فلورائیڈ کی کھپت کی وجہ سے ہے۔HNO3 پر مبنی اینچنگ کرومیم کو سطح پر ایک غیر فعال آکسائڈ کی تہہ بنانے کی اجازت دیتی ہے، جو اینچڈ ایس ایس کو دوبارہ سنکنرن کے خلاف مزاحم بناتی ہے۔شکل 2D میں، XPS سپیکٹرا اس بات کی تصدیق کے لیے حاصل کیا گیا کہ فلورو کاربن پر مبنی سائلین SAM کوٹنگ کے بعد سطح پر بنی تھی، جس میں EG، خون اور EtOH کے لیے بھی انتہائی زیادہ مائع ریپیلنسی ہے۔SAM کوٹنگ پلازما ٹریٹمنٹ کے ذریعے بننے والے ہائیڈروکسیل گروپس کے ساتھ سائلین فنکشنل گروپس کے رد عمل سے مکمل ہوتی ہے۔نتیجے کے طور پر، CF2 اور CF3 چوٹیوں میں نمایاں اضافہ دیکھا گیا۔286 اور 296 eV کے درمیان بائنڈنگ انرجی اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ SAM کوٹنگ کے ذریعے کیمیائی ترمیم کامیابی سے مکمل ہو گئی ہے۔SHP نسبتاً بڑی CF2 (290.1 ​​eV) اور CF3 (293.3 eV) چوٹیوں کو دکھاتا ہے، جو سطح پر بننے والے فلورو کاربن پر مبنی سائلین کی وجہ سے ہوتے ہیں۔شکل 2E ننگے، اینچڈ، SHP، اور LOIS کے ساتھ رابطے میں ڈیونائزڈ پانی کے مختلف گروپوں کے لیے رابطہ زاویہ (CA) پیمائش کی نمائندہ نظری تصاویر دکھاتا ہے۔یہ تصاویر ظاہر کرتی ہیں کہ کیمیکل اینچنگ کے ذریعے بننے والے مائکرو/نینو ڈھانچے کی وجہ سے کھدائی ہوئی سطح ہائیڈرو فیلک بن جاتی ہے تاکہ ڈیونائزڈ پانی ساخت میں جذب ہو جائے۔تاہم، جب سبسٹریٹ کو SAM کے ساتھ لیپت کیا جاتا ہے، تو سبسٹریٹ مضبوط پانی سے بچنے کی صلاحیت کو ظاہر کرتا ہے، اس لیے ایک سطحی SHP بنتی ہے اور پانی اور سطح کے درمیان رابطہ کا علاقہ چھوٹا ہوتا ہے۔آخر میں، LOIS میں CA میں کمی دیکھی گئی، جس کی وجہ مائیکرو سٹرکچر میں چکنا کرنے والے مادے کی رسائی سے منسوب کیا جا سکتا ہے، اس طرح رابطے کے علاقے میں اضافہ ہوتا ہے۔یہ ثابت کرنے کے لیے کہ سطح میں بہترین مائع ریپیلنسی اور غیر چپکنے والی خصوصیات ہیں، مختلف مائعات (شکل 2F) کا استعمال کرتے ہوئے CA اور SA کی پیمائش کرکے LOIS کا موازنہ SHP سبسٹریٹ سے کیا گیا۔مختلف قسم کے مائعات کا انتخاب viscosity اور سطحی توانائی کی بنیاد پر کیا گیا، بشمول deionized water، blood، EG، EtOH اور HD (Figure S4)۔CA پیمائش کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ جب CA کا رجحان HD کی طرف ہوتا ہے تو CA کی کمی کی قدر، جہاں CA کی سطح کی توانائی سب سے کم ہوتی ہے۔اس کے علاوہ، مجموعی طور پر CA کا LOIS کم ہے۔تاہم، SA کی پیمائش بالکل مختلف رجحان کو ظاہر کرتی ہے۔سوائے آئنائزڈ پانی کے، تمام مائعات بغیر پھسلے SHP سبسٹریٹ پر قائم رہتے ہیں۔دوسری طرف، LOIS ایک بہت کم SA دکھاتا ہے، جہاں جب تمام مائع کو 10° سے 15° سے کم زاویہ پر جھکا دیا جاتا ہے، تو تمام مائع رول آف ہو جاتا ہے۔یہ سختی سے ظاہر کرتا ہے کہ LOIS کی غیر چپکنے والی SHP سطح سے بہتر ہے۔اس کے علاوہ، LOIS کوٹنگز مختلف قسم کے مواد پر بھی لگائی جاتی ہیں، جن میں ٹائٹینیم (Ti)، پولیفینیل سلفون (PPSU)، پولی آکسیمیتھیلین (POM)، پولیتھر ایتھر کیٹون (PEEK) اور بائیو ایبسوربل پولیمر (PLGA) شامل ہیں، یہ امپلانٹیبل آرتھوپیڈک مواد ہیں (شکل) S5))۔LOIS کے ذریعہ علاج کیے گئے مواد پر بوندوں کی ترتیب وار تصاویر سے پتہ چلتا ہے کہ LOIS کی اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات تمام ذیلی جگہوں پر ایک جیسی ہیں۔اس کے علاوہ، CA اور SA کی پیمائش کے نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ LOIS کی غیر چپکنے والی خصوصیات کو دوسرے مواد پر لاگو کیا جا سکتا ہے۔
LOIS کی اینٹی فاؤلنگ خصوصیات کی تصدیق کرنے کے لیے، مختلف قسم کے سبسٹریٹس (بشمول ننگے، اینچڈ، ایس ایچ پی اور ایل او آئی ایس) کو سیوڈموناس ایروگینوسا اور ایم آر ایس اے کے ساتھ انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ان دو بیکٹیریا کو نمائندہ ہسپتال کے بیکٹیریا کے طور پر منتخب کیا گیا تھا، جو بائیوفیلمز کی تشکیل کا باعث بن سکتا ہے، جس سے ایس ایس آئی (37) ہوتا ہے۔شکل 3 (A اور B) بالترتیب مختصر مدت (12 گھنٹے) اور طویل مدتی (72 گھنٹے) کے لئے بیکٹیریل معطلی میں انکیوبیٹڈ سبسٹریٹس کے فلوروسینس مائکروسکوپ امیجز اور کالونی بنانے والے یونٹ (CFU) کی پیمائش کے نتائج دکھاتا ہے۔تھوڑے ہی عرصے میں، بیکٹیریا کلسٹر بنیں گے اور سائز میں بڑھیں گے، اپنے آپ کو بلغم جیسے مادوں سے ڈھانپیں گے اور ان کے اخراج کو روکیں گے۔تاہم، 72 گھنٹے کے انکیوبیشن کے دوران، بیکٹیریا پختہ ہو جائیں گے اور مزید کالونیاں یا کلسٹرز بنانے کے لیے منتشر ہو جائیں گے۔لہذا، اس پر غور کیا جا سکتا ہے کہ 72 گھنٹے کا انکیوبیشن طویل مدتی ہے اور سطح پر ایک مضبوط بائیو فلم بنانے کے لیے مناسب انکیوبیشن وقت ہے (38)۔تھوڑے ہی عرصے میں، کھدی ہوئی سطح اور SHP کی سطح نے بیکٹیریل چپکنے کی نمائش کی، جو ننگے سبسٹریٹ کے مقابلے میں تقریباً 25% سے 50% تک کم ہو گئی۔تاہم، اس کی بہترین اینٹی بائیوفولنگ کارکردگی اور استحکام کی وجہ سے، LOIS نے مختصر اور طویل مدت میں بیکٹیریل بایوفلم آسنجن نہیں دکھایا۔اسکیمیٹک خاکہ (شکل 3C) اینچنگ سلوشن، SHP اور LOIS کے اینٹی بائیولوجیکل فولنگ میکانزم کی وضاحت کو بیان کرتا ہے۔مفروضہ یہ ہے کہ ہائیڈرو فیلک خصوصیات کے ساتھ اینچڈ سبسٹریٹ کی سطح کا رقبہ ننگے سبسٹریٹ سے زیادہ ہوگا۔لہذا، اینچڈ سبسٹریٹ پر زیادہ بیکٹیریل آسنجن واقع ہوگا۔تاہم، ننگے سبسٹریٹ کے مقابلے میں، اینچڈ سبسٹریٹ کی سطح پر نمایاں طور پر کم بائیو فلم بنتی ہے۔اس کی وجہ یہ ہے کہ پانی کے مالیکیولز ہائیڈرو فیلک سطح سے مضبوطی سے جڑے ہوتے ہیں اور پانی کے لیے چکنا کرنے والے کے طور پر کام کرتے ہیں، اس طرح مختصر مدت میں بیکٹیریا کے چپکنے میں مداخلت کرتے ہیں (39)۔تاہم، پانی کے مالیکیولز کی تہہ بہت پتلی اور بیکٹیریل سسپینشنز میں گھلنشیل ہوتی ہے۔لہذا، پانی کی سالماتی تہہ طویل عرصے تک غائب ہو جاتی ہے، جس کی وجہ سے بڑے پیمانے پر بیکٹیریل آسنجن اور پھیلاؤ ہوتا ہے۔SHP کے لیے، اس کی قلیل مدتی غیر گیلا ہونے والی خصوصیات کی وجہ سے، بیکٹیریل آسنجن کو روکا جاتا ہے۔کم بیکٹیریل آسنجن کو تہہ دار ڈھانچے اور نچلی سطح کی توانائی میں پھنسے ہوا کی جیبوں سے منسوب کیا جا سکتا ہے، اس طرح بیکٹیریل معطلی اور سطح کے درمیان رابطے کو کم سے کم کیا جا سکتا ہے۔تاہم، SHP میں وسیع پیمانے پر بیکٹیریل آسنجن کا مشاہدہ کیا گیا تھا کیونکہ اس نے طویل عرصے تک اپنی اینٹی فاؤلنگ خصوصیات کھو دی تھیں۔یہ بنیادی طور پر ہائیڈروسٹیٹک دباؤ اور پانی میں ہوا کے تحلیل ہونے کی وجہ سے ہوا کی جیبوں کے غائب ہونے کی وجہ سے ہے۔یہ بنیادی طور پر تحلیل کی وجہ سے ہوا کی جیبوں کے غائب ہونے کی وجہ سے ہے اور تہہ دار ڈھانچہ جو آسنجن کے لئے ایک بڑا سطحی علاقہ فراہم کرتا ہے (27، 40)۔ان دو ذیلی ذخیروں کے برعکس جو طویل مدتی استحکام پر اہم اثر ڈالتے ہیں، LOIS میں موجود چکنا کرنے والے چکنا کرنے والے کو مائیکرو/نینو ڈھانچے میں داخل کیا جاتا ہے اور طویل مدت میں بھی غائب نہیں ہوتا ہے۔مائیکرو/نینو ڈھانچے سے بھرے چکنا کرنے والے مادے بہت مستحکم ہوتے ہیں اور اپنی اعلیٰ کیمیائی وابستگی کی وجہ سے سطح کی طرف مضبوطی سے اپنی طرف متوجہ ہوتے ہیں، اس طرح طویل عرصے تک بیکٹیریل آسنجن کو روکتے ہیں۔شکل S6 فاسفیٹ بفرڈ نمکین (PBS) میں ڈوبی ہوئی چکنا کرنے والے سبسٹریٹ کی عکاسی کنفوکل مائکروسکوپ کی تصویر دکھاتی ہے۔مسلسل تصاویر سے پتہ چلتا ہے کہ ہلکی ہلکی ہلکی ہلکی ہلکی ہلکی 120 گھنٹے کے بعد بھی (120 rpm)، LOIS پر چکنا کرنے والی پرت میں کوئی تبدیلی نہیں ہوتی، جو بہاؤ کے حالات میں طویل مدتی استحکام کی نشاندہی کرتی ہے۔یہ فلورین پر مبنی SAM کوٹنگ اور پرفلووروکاربن پر مبنی چکنا کرنے والے کے درمیان اعلی کیمیائی وابستگی کی وجہ سے ہے، تاکہ ایک مستحکم چکنا کرنے والی تہہ بن سکے۔لہذا، مخالف fouling کارکردگی کو برقرار رکھا ہے.اس کے علاوہ، سبسٹریٹ کا تجربہ نمائندہ پروٹین (البومین اور فائبرنوجن) کے خلاف کیا گیا، جو پلازما میں ہیں، خلیات کا مدافعتی فعل (میکروفیجز اور فائبرو بلاسٹس) سے قریبی تعلق ہے، اور جو ہڈیوں کی تشکیل سے متعلق ہیں۔کیلشیم کا مواد بہت زیادہ ہے۔(شکل 3D، 1 اور 2، اور شکل S7) (41، 42)۔اس کے علاوہ، فائبرنوجن، البومین اور کیلشیم کے لیے آسنجن ٹیسٹ کی فلوروسینس مائکروسکوپ امیجز نے ہر سبسٹریٹ گروپ (فگر S8) کی مختلف آسنجن خصوصیات کو ظاہر کیا۔ہڈیوں کی تشکیل کے دوران، نئی بنی ہوئی ہڈی اور کیلشیم کی تہیں آرتھوپیڈک امپلانٹ کو گھیر سکتی ہیں، جس سے نہ صرف ہٹانا مشکل ہو جاتا ہے، بلکہ ہٹانے کے عمل کے دوران مریض کو غیر متوقع نقصان بھی پہنچ سکتا ہے۔لہذا، ہڈیوں کی پلیٹوں اور پیچوں پر کیلشیم کے ذخائر کی کم سطح آرتھوپیڈک سرجری کے لیے فائدہ مند ہے جس کے لیے امپلانٹ ہٹانے کی ضرورت ہوتی ہے۔فلوروسینس کی شدت اور سیل کی گنتی کی بنیاد پر منسلک علاقے کی مقدار کی بنیاد پر، ہم نے تصدیق کی کہ LOIS دیگر سبسٹریٹس کے مقابلے میں تمام حیاتیاتی مادوں کے لیے بہترین اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات دکھاتا ہے۔ان وٹرو تجربات کے نتائج کے مطابق، اینٹی بائیولوجیکل فاؤلنگ LOIS کو آرتھوپیڈک امپلانٹس پر لگایا جا سکتا ہے، جو نہ صرف بائیوفلم بیکٹیریا کی وجہ سے ہونے والے انفیکشن کو روک سکتا ہے بلکہ جسم کے فعال مدافعتی نظام کی وجہ سے ہونے والی سوزش کو بھی کم کر سکتا ہے۔
(A) 12 اور 72 گھنٹے کے لیے Pseudomonas aeruginosa اور MRSA معطلی میں انکیوبیٹڈ ہر گروپ (ننگے، اینچڈ، SHP اور LOIS) کی فلوروسینس مائکروسکوپ کی تصاویر۔(B) ہر گروپ کی سطح پر Pseudomonas aeruginosa اور MRSA کے پیروکار CFU کی تعداد۔(C) شارٹ ٹرم اور لانگ ٹرم اینچنگ، SHP اور LOIS کے اینٹی بائیولوجیکل فولنگ میکانزم کا اسکیمیٹک خاکہ۔(D) (1) ننگے اور LOIS پر قائم خلیوں کی ہر سبسٹریٹ اور فلوروسینس مائکروسکوپ امیجز کے ساتھ منسلک فبرو بلوسٹس کی تعداد۔(2) ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل میں شامل مدافعتی پروٹینز، البومن اور کیلشیم کا آسنجن ٹیسٹ (* P <0.05، ** P <0.01، *** P <0.001 اور **** P <0.0001)۔ns، اہم نہیں.
ناگزیر مرتکز دباؤ کی صورت میں، میکانکی پائیداری ہمیشہ سے ہی اینٹی فولنگ کوٹنگز کے اطلاق کے لیے ایک اہم چیلنج رہا ہے۔سیوریج مخالف جیل کے روایتی طریقے کم پانی میں حل پذیری اور نزاکت کے ساتھ پولیمر پر مبنی ہیں۔لہذا، وہ عام طور پر بائیو میڈیکل ایپلی کیشنز میں مکینیکل تناؤ کے لیے حساس ہوتے ہیں۔لہذا، میکانی طور پر پائیدار اینٹی فولنگ کوٹنگز آرتھوپیڈک امپلانٹس (43، 44) جیسی ایپلی کیشنز کے لیے ایک چیلنج بنی ہوئی ہیں۔شکل 4A(1) آرتھوپیڈک امپلانٹس پر لگائے جانے والے تناؤ کی دو اہم اقسام کو ظاہر کرتا ہے، بشمول فورپس کے ذریعہ تیار کردہ خراب امپلانٹ کی آپٹیکل امیج کے ساتھ سکریچنگ (شیئر اسٹریس) اور کمپریشن۔مثال کے طور پر، جب سکرو کو سکریو ڈرایور سے سخت کیا جاتا ہے، یا جب سرجن ہڈیوں کی پلیٹ کو چمٹی سے مضبوطی سے پکڑتا ہے اور دبانے والی طاقت کا اطلاق کرتا ہے، تو پلاسٹک کی ہڈی کی پلیٹ کو نقصان پہنچے گا اور میکرو اور مائیکرو/نینو اسکیلز دونوں پر کھرچ جائے گی (شکل 4A، 2)یہ جانچنے کے لیے کہ آیا تیار کردہ LOIS پلاسٹک سرجری کے دوران ان نقصانات کو برداشت کر سکتا ہے، ننگے سبسٹریٹ کی سختی اور مائیکرو/نینو سکیل پر LOIS کا موازنہ کرنے کے لیے نینو انڈینٹیشن کی گئی تاکہ مائیکرو/نینو ڈھانچے کے اثر کی مکینیکل خصوصیات کا مطالعہ کیا جا سکے۔ 4B)۔اسکیمیٹک خاکہ مائیکرو/نینو ڈھانچے کی موجودگی کی وجہ سے LOIS کے مختلف اخترتی رویے کو ظاہر کرتا ہے۔نینو انڈینٹیشن (شکل 4C) کے نتائج کی بنیاد پر ایک زبردستی نقل مکانی کا وکر تیار کیا گیا تھا۔نیلی تصویر ننگے سبسٹریٹ کی نمائندگی کرتی ہے، جو صرف معمولی اخترتی کو ظاہر کرتی ہے، جیسا کہ 0.26-μm کی زیادہ سے زیادہ انڈینٹیشن گہرائی سے دیکھا گیا ہے۔دوسری طرف، LOIS (سرخ وکر) میں مشاہدہ کردہ نینو انڈینٹیشن فورس اور نقل مکانی میں بتدریج اضافہ مکینیکل خصوصیات میں کمی کی علامات ظاہر کر سکتا ہے، جس کے نتیجے میں نینو انڈینٹیشن کی گہرائی 1.61μm ہوتی ہے۔اس کی وجہ یہ ہے کہ LOIS میں موجود مائیکرو/نینو ڈھانچہ نینو انڈینٹر کے سرے کے لیے ایک گہری ترقی کی جگہ فراہم کرتا ہے، اس لیے اس کی اخترتی ننگی سبسٹریٹ سے زیادہ ہے۔Konsta-Gdoutos et al.(45) کا خیال ہے کہ نینو سٹرکچرز کی موجودگی کی وجہ سے، نینو انڈینٹیشن اور مائیکرو/نینو کھردری بے قاعدہ نینو انڈینٹیشن منحنی خطوط کا باعث بنتی ہے۔سایہ دار علاقہ نینو اسٹرکچر سے منسوب فاسد اخترتی وکر کے مساوی ہے، جبکہ غیر سایہ دار علاقہ مائکرو اسٹرکچر سے منسوب ہے۔یہ اخترتی ہولڈنگ لبریکینٹ کے مائیکرو اسٹرکچر/نانو اسٹرکچر کو نقصان پہنچا سکتی ہے اور اس کی اینٹی فاؤلنگ کارکردگی کو منفی طور پر متاثر کر سکتی ہے۔LOIS پر ہونے والے نقصان کے اثرات کا مطالعہ کرنے کے لیے، پلاسٹک سرجری کے دوران جسم میں مائیکرو/نینو ڈھانچے کو ناگزیر نقصان پہنچایا گیا۔خون اور پروٹین کے آسنجن ٹیسٹوں کا استعمال کرتے ہوئے، ان وٹرو کے بعد LOIS کی اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات کے استحکام کا تعین کیا جا سکتا ہے (شکل 4D)۔آپٹیکل امیجز کا ایک سلسلہ اس نقصان کو ظاہر کرتا ہے جو ہر سبسٹریٹ کے سوراخوں کے قریب ہوا ہے۔اینٹی بائیوفولنگ کوٹنگ (شکل 4E) پر مکینیکل نقصان کے اثر کو ظاہر کرنے کے لئے ایک خون کی آسنجن ٹیسٹ کیا گیا تھا۔SHP کی طرح، نقصان کی وجہ سے اینٹی فاؤلنگ خصوصیات ختم ہو جاتی ہیں، اور LOIS خون کو دور کر کے بہترین اینٹی فاؤلنگ خصوصیات کو ظاہر کرتا ہے۔اس کی وجہ یہ ہے کہ، کیونکہ سطح کی توانائی کیپلیری ایکشن کے ذریعے چلتی ہے جو کہ تباہ شدہ علاقے کو ڈھانپتی ہے، لہٰذا مائیکرو اسٹرکچرڈ چکنا کرنے والے چکنا کرنے والے میں بہاؤ اینٹی فاؤلنگ خصوصیات کو بحال کرتا ہے (35)۔البومین کا استعمال کرتے ہوئے پروٹین آسنجن ٹیسٹ میں بھی یہی رجحان دیکھا گیا۔تباہ شدہ علاقے میں، SHP کی سطح پر پروٹین کی چپکنے کا وسیع پیمانے پر مشاہدہ کیا جاتا ہے، اور اس کے رقبے کی کوریج کی پیمائش کرکے، اسے ننگے سبسٹریٹ کی چپکنے والی سطح کے نصف کے طور پر درست کیا جا سکتا ہے۔دوسری طرف، LOIS نے اپنی اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات کو بغیر کسی آسنجن کے برقرار رکھا (شکل 4، F اور G)۔اس کے علاوہ، سکرو کی سطح اکثر مضبوط مکینیکل دباؤ کا شکار ہوتی ہے، جیسے ڈرلنگ، اس لیے ہم نے وٹرو میں سکرو پر برقرار رہنے کے لیے LOIS کوٹنگ کی صلاحیت کا مطالعہ کیا۔شکل 4H مختلف پیچ کی آپٹیکل تصاویر دکھاتا ہے، بشمول ننگے، SHP اور LOIS۔سرخ مستطیل ہدف والے حصے کی نمائندگی کرتا ہے جہاں ہڈیوں کی پیوند کاری کے دوران مضبوط میکانکی تناؤ ہوتا ہے۔پلیٹ کے پروٹین آسنجن ٹیسٹ کی طرح، ایک فلوروسینس مائیکروسکوپ کا استعمال پروٹین کے آسنجن کی تصویر بنانے اور LOIS کوٹنگ کی سالمیت کو ثابت کرنے کے لیے کوریج ایریا کی پیمائش کرنے کے لیے کیا جاتا ہے، یہاں تک کہ سخت مکینیکل دباؤ (شکل 4، I اور J)۔LOIS سے علاج شدہ پیچ بہترین اینٹی فاؤلنگ کارکردگی کا مظاہرہ کرتے ہیں، اور تقریباً کوئی پروٹین سطح پر نہیں لگاتا۔دوسری طرف، ننگے پیچ اور ایس ایچ پی پیچ میں پروٹین کی آسنجن کا مشاہدہ کیا گیا، جہاں ایس ایچ پی سکرو کی ایریا کوریج ننگے پیچ کی ایک تہائی تھی۔اس کے علاوہ، فکسیشن کے لیے استعمال ہونے والا آرتھوپیڈک امپلانٹ میکانکی طور پر مضبوط ہونا چاہیے تاکہ فریکچر سائٹ پر لگنے والے تناؤ کو برداشت کر سکے، جیسا کہ شکل 4K میں دکھایا گیا ہے۔لہذا، میکانی خصوصیات پر کیمیائی ترمیم کے اثر کا تعین کرنے کے لیے موڑنے والا ٹیسٹ کیا گیا۔اس کے علاوہ، یہ امپلانٹ سے مقررہ تناؤ کو برقرار رکھنے کے لیے کیا جاتا ہے۔عمودی مکینیکل قوت کا اطلاق کریں جب تک کہ امپلانٹ مکمل طور پر فولڈ نہ ہو جائے اور تناؤ کا گھماؤ حاصل نہ ہو جائے (شکل 4L، 1)۔دو خصوصیات بشمول ینگ کے ماڈیولس اور لچکدار طاقت کا موازنہ ننگے اور LOIS سبسٹریٹس کے درمیان ان کی مکینیکل طاقت کے اشارے کے طور پر کیا گیا تھا (شکل 4L، 2 اور 3)۔ینگ کا ماڈیولس کسی مادے کی میکانکی تبدیلیوں کو برداشت کرنے کی صلاحیت کی نشاندہی کرتا ہے۔ہر سبسٹریٹ کا ینگ کا ماڈیولس بالترتیب 41.48±1.01 اور 40.06±0.96 GPa ہے۔مشاہدہ فرق تقریباً 3.4 فیصد ہے۔اس کے علاوہ، یہ اطلاع دی جاتی ہے کہ موڑنے کی طاقت، جو مواد کی سختی کا تعین کرتی ہے، ننگے سبسٹریٹ کے لیے 102.34±1.51 GPa اور SHP کے لیے 96.99±0.86 GPa ہے۔ننگی سبسٹریٹ تقریباً 5.3 فیصد زیادہ ہے۔مکینیکل خصوصیات میں معمولی کمی نشان اثر کی وجہ سے ہوسکتی ہے۔نشان اثر میں، مائیکرو/نینو کھردرا پن نشانوں کے ایک سیٹ کے طور پر کام کر سکتا ہے، جس سے مقامی تناؤ کا ارتکاز ہوتا ہے اور امپلانٹ کی میکانکی خصوصیات متاثر ہوتی ہیں (46)۔تاہم، اس حقیقت کی بنیاد پر کہ انسانی کورٹیکل ہڈی کی سختی 7.4 اور 31.6 GPa کے درمیان بتائی گئی ہے، اور ماپا گیا LOIS ماڈیولس انسانی cortical bone (47) سے زیادہ ہے، LOIS فریکچر کو سہارا دینے کے لیے کافی ہے۔ مکینیکل خصوصیات سطح کی تبدیلی سے کم سے کم متاثر ہوتی ہیں۔
(A) (1) آپریشن کے دوران آرتھوپیڈک امپلانٹ پر لاگو مکینیکل تناؤ، اور (2) خراب شدہ آرتھوپیڈک امپلانٹ کی آپٹیکل امیج کا اسکیمیٹک خاکہ۔(B) ننگی سطح پر نینو انڈینٹیشن اور LOIS کے ذریعہ نینو مکینیکل خصوصیات کی پیمائش کا اسکیمیٹک خاکہ۔(C) ننگی سطح اور LOIS کا نینو انڈینٹیشن فورس-منتقلی وکر۔(D) ان وٹرو تجربات کے بعد، مختلف قسم کے آرتھوپیڈک پلیٹوں کی آپٹیکل امیجز (خراب جگہ کو سرخ مستطیل کے ساتھ نمایاں کیا گیا ہے) کو آپریشن کے دوران پیدا ہونے والے مکینیکل تناؤ کی نقالی بنائیں۔(E) خون کی آسنجن ٹیسٹ اور (F) خراب آرتھوپیڈک پلیٹ گروپ کا پروٹین آسنجن ٹیسٹ۔(G) پلیٹ میں لگے ہوئے پروٹین کے علاقے کی کوریج کی پیمائش کریں۔(H) ان وٹرو تجربے کے بعد آرتھوپیڈک پیچ کی مختلف اقسام کی آپٹیکل تصاویر۔(I) مختلف کوٹنگز کی سالمیت کا مطالعہ کرنے کے لیے پروٹین آسنجن ٹیسٹ۔(J) سکرو سے منسلک پروٹین کے علاقے کی کوریج کی پیمائش کریں۔(K) خرگوش کی حرکت کا مقصد ٹوٹی ہوئی ہڈی پر ایک مستقل دباؤ پیدا کرنا ہے۔(L) (1) موڑنے سے پہلے اور بعد میں ٹیسٹ کے نتائج اور آپٹیکل امیجز کو موڑیں۔(2) ینگز ماڈیولس اور (3) ننگے امپلانٹ اور ایس ایچ پی کے درمیان موڑنے کی طاقت میں فرق۔ڈیٹا کو اوسط ± SD (*P <0.05، **P <0.01، ***P <0.001 اور ****P <0.0001) کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔تصویر بشکریہ: Kyomin Chae، Yonsei یونیورسٹی۔
طبی حالات میں، حیاتیاتی مواد اور زخم کی جگہوں کے ساتھ زیادہ تر بیکٹیریا کا رابطہ بالغ، بالغ بایوفلمز (48) سے آتا ہے۔لہذا، بیماریوں کے کنٹرول اور روک تھام کے لئے امریکی مراکز کا تخمینہ ہے کہ تمام انسانی انفیکشنز میں سے 65٪ بائیو فلموں سے متعلق ہیں (49)۔اس صورت میں، ایک ان ویوو تجرباتی ڈیزائن فراہم کرنا ضروری ہے جو امپلانٹ کی سطح پر بایوفلم کی مستقل تشکیل فراہم کرتا ہے۔لہذا، ہم نے خرگوش کے فیمورل فریکچر کا ایک ماڈل تیار کیا جس میں آرتھوپیڈک امپلانٹس کو بیکٹیریل سسپنشن میں پہلے سے لگایا گیا تھا اور پھر خرگوش کے فیمر میں لگایا گیا تھا تاکہ Vivo میں LOIS کی اینٹی فاؤلنگ خصوصیات کا مطالعہ کیا جا سکے۔مندرجہ ذیل تین اہم حقائق کی وجہ سے، بیکٹیریل انفیکشنز بیکٹیریل سسپینشن کے براہ راست انجیکشن کے بجائے پری کلچر کی وجہ سے ہوتے ہیں: (i) خرگوش کا مدافعتی نظام قدرتی طور پر انسانوں سے زیادہ مضبوط ہوتا ہے۔لہذا، بیکٹیریل سسپنشن اور پلانکٹونک بیکٹیریا کا انجیکشن ممکن ہے اس کا بائیو فلموں کی تشکیل پر کوئی اثر نہیں ہوتا ہے۔(Ii) پلانکٹونک بیکٹیریا اینٹی بایوٹک کے لیے زیادہ حساس ہوتے ہیں، اور اینٹی بایوٹک عام طور پر سرجری کے بعد استعمال کی جاتی ہیں۔آخر میں، (iii) پلانکٹونک بیکٹیریا کی معطلی کو جانور کے جسمانی رطوبتوں سے پتلا کیا جا سکتا ہے (50)۔امپلانٹیشن سے پہلے بیکٹیریل سسپنشن میں امپلانٹ کو پہلے سے کلچر کرنے سے، ہم بیکٹریا کے انفیکشن اور غیر ملکی جسم کے رد عمل (FBR) کے ہڈیوں کے ٹھیک ہونے کے عمل پر ہونے والے نقصان دہ اثرات کا اچھی طرح سے مطالعہ کر سکتے ہیں۔خرگوشوں کو امپلانٹیشن کے 4 ہفتے بعد قربان کیا گیا، کیونکہ ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل کے لیے ضروری osseointegration 4 ہفتوں کے اندر مکمل ہو جائے گا۔اس کے بعد، امپلانٹس کو خرگوشوں سے بہاو کے مطالعے کے لیے ہٹا دیا گیا۔شکل 5A بیکٹیریا کے پھیلاؤ کے طریقہ کار کو ظاہر کرتا ہے۔متاثرہ آرتھوپیڈک امپلانٹ جسم میں متعارف کرایا جاتا ہے۔بیکٹیریل سسپنشن میں پری انکیوبیشن کے نتیجے میں، ننگے امپلانٹس کے ساتھ لگائے گئے چھ خرگوشوں میں سے چھ متاثر ہوئے، جبکہ LOIS کے علاج شدہ امپلانٹس کے ساتھ لگائے گئے خرگوشوں میں سے کوئی بھی متاثر نہیں ہوا۔بیکٹیریل انفیکشن تین مراحل میں آگے بڑھتے ہیں، بشمول نمو، پختگی اور بازی (51)۔سب سے پہلے، منسلک بیکٹیریا دوبارہ پیدا ہوتے ہیں اور سطح پر بڑھتے ہیں، اور پھر جب بیکٹیریا ایکسٹرا سیلولر پولیمر (ای پی ایس)، امائلائڈ اور ایکسٹرا سیلولر ڈی این اے کو خارج کرتے ہیں تو وہ بائیو فلم بناتے ہیں۔بائیوفیلم نہ صرف اینٹی بائیوٹک کے داخلے میں مداخلت کرتا ہے بلکہ اینٹی بائیوٹک کو کم کرنے والے انزائمز (جیسے β-lactamase) (52) کے جمع ہونے کو بھی فروغ دیتا ہے۔آخر میں، بائیو فلم بالغ بیکٹیریا کو ارد گرد کے ٹشوز میں پھیلا دیتی ہے۔لہذا، انفیکشن ہوتا ہے.اس کے علاوہ، جب کوئی غیر ملکی جسم جسم میں داخل ہوتا ہے تو، ایک انفیکشن جو مضبوط مدافعتی ردعمل کا سبب بن سکتا ہے، شدید سوزش، درد، اور قوت مدافعت میں کمی کا سبب بن سکتا ہے۔شکل 5B بیکٹیریل انفیکشن کی وجہ سے مدافعتی ردعمل کی بجائے آرتھوپیڈک امپلانٹ کے اندراج کی وجہ سے ہونے والے ایف بی آر کا ایک جائزہ فراہم کرتا ہے۔مدافعتی نظام داخل شدہ امپلانٹ کو غیر ملکی جسم کے طور پر تسلیم کرتا ہے، اور پھر خلیات اور ؤتکوں کو غیر ملکی جسم کو سمیٹنے کے لیے رد عمل کا سبب بنتا ہے (53)۔ایف بی آر کے ابتدائی دنوں میں، آرتھوپیڈک امپلانٹس کی سطح پر ایک سپلائی میٹرکس بنتا تھا، جس کے نتیجے میں فائبرنوجن جذب ہوتا تھا۔جذب شدہ فائبرنوجن پھر ایک انتہائی گھنے فائبرن نیٹ ورک بناتا ہے، جو لیوکوائٹس (54) کے اٹیچمنٹ کو فروغ دیتا ہے۔ایک بار جب فائبرن نیٹ ورک بن جاتا ہے، نیوٹروفیلز کی دراندازی کی وجہ سے شدید سوزش ہوتی ہے۔اس مرحلے میں، مختلف قسم کی سائٹوکائنز جیسے ٹیومر نیکروسس فیکٹر-α (TNF-α)، interleukin-4 (IL-4) اور IL-β جاری ہوتے ہیں، اور مونوکیٹس امپلانٹیشن سائٹ میں گھسنا شروع کر دیتے ہیں اور دیوہیکل خلیوں میں فرق کرنا شروع کر دیتے ہیں۔فیج (41، 55، 56)۔ایف بی آر کو کم کرنا ہمیشہ ایک چیلنج رہا ہے کیونکہ ضرورت سے زیادہ ایف بی آر شدید اور دائمی سوزش کا سبب بن سکتا ہے، جو مہلک پیچیدگیوں کا باعث بن سکتا ہے۔ننگے امپلانٹ اور LOIS کے ارد گرد کے ؤتکوں میں بیکٹیریل انفیکشن کے اثرات کا اندازہ لگانے کے لیے، ہیماتوکسیلین اور eosin (H&E) اور میسن ٹرائیکروم (MT) سٹیننگ کا استعمال کیا گیا۔ننگے سبسٹریٹس کے ساتھ لگائے گئے خرگوشوں کے لیے، شدید بیکٹیریل انفیکشن میں اضافہ ہوا، اور H&E ٹشو سلائیڈز نے واضح طور پر سوزش کی وجہ سے پھوڑے اور نیکروسس کو ظاہر کیا۔دوسری طرف، انتہائی مضبوط اینٹی بائیوفولنگ سطح LOIS بیکٹیریل آسنجن کو روکتی ہے، اس لیے یہ انفیکشن کی کوئی علامت نہیں دکھاتا اور سوزش کو کم کرتا ہے (شکل 5C)۔ایم ٹی سٹیننگ کے نتائج نے بھی یہی رجحان ظاہر کیا۔تاہم، ایم ٹی سٹیننگ نے LOIS کے ساتھ لگائے گئے خرگوشوں میں بھی ورم ظاہر کیا، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ بحالی ہونے والی ہے (شکل 5D)۔مدافعتی ردعمل کی ڈگری کا مطالعہ کرنے کے لیے، مدافعتی ردعمل سے متعلق سائٹوکائنز TNF-α اور IL-6 کا استعمال کرتے ہوئے امیونو ہسٹو کیمیکل (IHC) سٹیننگ کی گئی تھی۔ایک برہنہ منفی امپلانٹ جو بیکٹیریا کے سامنے نہیں آیا تھا اس کا موازنہ ایک LOIS سے کیا گیا جو بیکٹیریا کے سامنے تھا لیکن بیکٹیریل انفیکشن کی عدم موجودگی میں شفا یابی کے عمل کا مطالعہ کرنے کے لئے متاثر نہیں ہوا تھا۔شکل 5E IHC سلائیڈ کی ایک نظری تصویر دکھاتا ہے جو TNF-α کا اظہار کرتا ہے۔بھورا علاقہ مدافعتی ردعمل کی نمائندگی کرتا ہے، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ LOIS میں مدافعتی ردعمل قدرے کم ہو گیا ہے۔اس کے علاوہ، LOIS میں IL-6 کا اظہار جراثیم سے پاک ننگے (شکل 5F) کے منفی اظہار سے نمایاں طور پر کم تھا۔سائٹوکائن کے اظہار کی مقدار سائٹوکائن (شکل 5G) کے مطابق اینٹی باڈی داغ کے علاقے کی پیمائش کرکے کی گئی۔منفی امپلانٹس کے سامنے آنے والے خرگوشوں کے مقابلے میں، LOIS کے ساتھ لگائے گئے خرگوش کے اظہار کی سطح کم تھی، جو ایک معنی خیز فرق کو ظاہر کرتی ہے۔سائٹوکائن ایکسپریشن میں کمی اس بات کی نشاندہی کرتی ہے کہ LOIS کی طویل مدتی، مستحکم اینٹی فاؤلنگ خصوصیات کا تعلق نہ صرف بیکٹیریل انفیکشن کی روک تھام سے ہے، بلکہ FBR کی کمی سے بھی ہے، جو کہ سبسٹریٹ (53، 53) کے ساتھ منسلک میکروفیجز کی وجہ سے پیدا ہوتا ہے۔ 57، 58)۔لہذا، LOIS کی مدافعتی چوری کی خصوصیات کی وجہ سے کم مدافعتی ردعمل امپلانٹیشن کے بعد ضمنی اثرات کو حل کر سکتا ہے، جیسے پلاسٹک سرجری کے بعد ضرورت سے زیادہ مدافعتی ردعمل۔
(A) متاثرہ آرتھوپیڈک امپلانٹ کی سطح پر بائیو فلم کی تشکیل اور پھیلنے کے طریقہ کار کا ایک اسکیمیٹک خاکہ۔ای ڈی این اے، ایکسٹرا سیلولر ڈی این اے۔(B) آرتھوپیڈک امپلانٹ داخل کرنے کے بعد مدافعتی ردعمل کا اسکیمیٹک خاکہ۔(C) H&E سٹیننگ اور (D) ننگے مثبت اور LOIS کے ساتھ آرتھوپیڈک امپلانٹس کے ارد گرد کے ٹشوز کا MT سٹیننگ۔مدافعتی سے متعلق سائٹوکائنز (E) TNF-α اور (F) IL-6 کا IHC ننگے منفی اور LOIS سے لگائے گئے خرگوشوں کی داغدار تصاویر ہیں۔(G) ایریا کوریج پیمائش (** P <0.01) کے ذریعہ سائٹوکائن اظہار کی مقدار۔
LOIS کی حیاتیاتی مطابقت اور ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل پر اس کے اثرات کو Vivo میں تشخیصی امیجنگ [ایکس رے اور مائیکرو کمپیوٹیڈ ٹوموگرافی (CT)] اور osteoclast IHC کا استعمال کرتے ہوئے جانچا گیا۔شکل 6A ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل کو دکھاتا ہے جس میں تین مختلف مراحل شامل ہیں: سوزش، مرمت، اور دوبارہ تشکیل دینا۔جب فریکچر ہوتا ہے تو، سوزش کے خلیات اور فائبرو بلاسٹس ٹوٹی ہوئی ہڈی میں گھس جاتے ہیں اور عروقی ٹشو میں بڑھنے لگتے ہیں۔مرمت کے مرحلے کے دوران، عروقی بافتوں کی افزائش فریکچر سائٹ کے قریب پھیل جاتی ہے۔عروقی ٹشو نئی ہڈی کی تشکیل کے لیے غذائی اجزاء فراہم کرتا ہے جسے کالس کہتے ہیں۔ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل کا آخری مرحلہ دوبارہ تشکیل دینے کا مرحلہ ہے، جس میں کالس کا سائز فعال آسٹیو کلاسٹس (59) کی سطح میں اضافے کی مدد سے عام ہڈی کے سائز تک کم کر دیا جاتا ہے۔فریکچر سائٹ کی سہ جہتی (3D) تعمیر نو ہر گروپ میں کالس کی تشکیل کی سطح میں فرق کا مشاہدہ کرنے کے لیے مائیکرو سی ٹی اسکینز کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ٹوٹی ہوئی ہڈی کے ارد گرد کالس کی موٹائی کا مشاہدہ کرنے کے لیے فیمر کے کراس سیکشن کا مشاہدہ کریں (شکل 6، بی اور سی)۔ہر گروپ میں ہڈیوں کی تخلیق نو کے مختلف عمل کا مشاہدہ کرنے کے لیے ہر ہفتے تمام گروپوں کے فریکچر سائٹس کا معائنہ کرنے کے لیے ایکس رے بھی استعمال کیے جاتے تھے (شکل S9)۔کالس اور پختہ ہڈیوں کو بالترتیب نیلے/سبز اور ہاتھی دانت میں دکھایا گیا ہے۔زیادہ تر نرم بافتوں کو پہلے سے طے شدہ حد کے ساتھ فلٹر کیا جاتا ہے۔نیوڈ پازیٹو اور ایس ایچ پی نے فریکچر سائٹ کے ارد گرد تھوڑی مقدار میں کالس بننے کی تصدیق کی۔دوسری طرف، LOIS کا بے نقاب منفی اور فریکچر سائٹ موٹی کالس سے گھری ہوئی ہے۔مائیکرو-CT تصاویر سے پتہ چلتا ہے کہ کالس کی تشکیل میں بیکٹیریل انفیکشن اور انفیکشن سے متعلق سوزش کی وجہ سے رکاوٹ تھی۔اس کی وجہ یہ ہے کہ مدافعتی نظام ہڈیوں کی بحالی کے بجائے انفیکشن سے متعلق سوزش کی وجہ سے سیپٹک زخموں کے علاج کو ترجیح دیتا ہے (60)۔آسٹیوکلاسٹ سرگرمی اور ہڈیوں کی ریزورپشن (شکل 6D) (61) کا مشاہدہ کرنے کے لئے IHC اور ٹارٹریٹ مزاحم ایسڈ فاسفیٹیس (TRAP) کے داغ لگائے گئے تھے۔ننگے مثبت اور SHP میں صرف چند ایکٹیویٹڈ آسٹیو کلاسٹس داغدار جامنی پائے گئے۔دوسری طرف، LOIS کی ننگی مثبت اور پختہ ہڈیوں کے قریب بہت سے فعال آسٹیو کلاسٹس دیکھے گئے۔یہ رجحان اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ اوسٹیو کلاسٹس کی موجودگی میں، فریکچر سائٹ کے ارد گرد کالس ایک پرتشدد دوبارہ تشکیل دینے کے عمل سے گزر رہا ہے (62)۔کالس کے ہڈیوں کے حجم اور آسٹیو کلاس ایکسپریشن ایریا کو تمام گروپوں میں فریکچر سائٹ کے ارد گرد کالس کی تشکیل کی سطح کا موازنہ کرنے کے لیے ماپا گیا تھا، تاکہ مائیکرو-سی ٹی اسکین اور IHC کے نتائج (شکل 6E، 1 اور 2) کا اندازہ لگایا جا سکے۔جیسا کہ توقع کی گئی ہے، LOIS میں ننگے منفی اور کالس کی تشکیل دوسرے گروپوں کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ تھی، جس سے ظاہر ہوتا ہے کہ ہڈیوں کی دوبارہ تشکیل مثبت ہوئی ہے (63)۔شکل S10 سرجیکل سائٹ کی آپٹیکل امیج، سکرو کے قریب جمع ہونے والے ٹشو کا MT سٹیننگ نتیجہ، اور TRAP سٹیننگ کا نتیجہ سکرو بون انٹرفیس کو نمایاں کرتا ہے۔ننگے سبسٹریٹ میں، مضبوط کالس اور فبروسس کی تشکیل دیکھی گئی، جب کہ LOIS کے ذریعے علاج شدہ امپلانٹ نے نسبتاً غیر منسلک سطح کو دکھایا۔اسی طرح، ننگے منفیوں کے مقابلے میں، LOIS کے ساتھ لگائے گئے خرگوشوں میں کم فبروسس کا مشاہدہ کیا گیا، جیسا کہ سفید تیروں سے ظاہر ہوتا ہے۔اس کے علاوہ، مضبوط ورم (نیلے تیر) کو LOIS کی مدافعتی چوری کی خصوصیات سے منسوب کیا جا سکتا ہے، اس طرح شدید سوزش کو کم کیا جا سکتا ہے۔امپلانٹ کے ارد گرد نان اسٹک سطح اور کم فائبروسس بتاتے ہیں کہ ہٹانے کا عمل آسان ہے، جس کے نتیجے میں عام طور پر دوسرے فریکچر یا سوزش ہوتی ہے۔سکرو ہٹانے کے بعد ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل کا اندازہ اسکرو بون انٹرفیس میں آسٹیو کلاس سرگرمی سے کیا گیا۔ننگی ہڈی اور LOIS امپلانٹ انٹرفیس دونوں ہڈیوں کی مزید شفا یابی کے لیے osteoclasts کی یکساں سطح کو جذب کرتے ہیں، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ LOIS کوٹنگ کا ہڈیوں کی شفا یابی یا مدافعتی ردعمل پر کوئی منفی اثر نہیں ہے۔اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ LOIS پر کی گئی سطح کی تبدیلی ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل میں مداخلت نہیں کرتی، ایکس رے امتحان کا استعمال خرگوش کی ہڈیوں کی شفا یابی کا بے نقاب منفی آئنوں اور LOIS امپلانٹیشن کے 6 ہفتوں کے ساتھ موازنہ کرنے کے لیے کیا گیا تھا (شکل 6F)۔نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ غیر متاثرہ عریاں مثبت گروپ کے مقابلے میں، LOIS نے ہڈیوں کی شفا یابی کی ایک ہی ڈگری ظاہر کی، اور دونوں گروپوں میں فریکچر (مسلسل آسٹیولیسس لائن) کی کوئی واضح علامات نہیں تھیں۔
(A) فریکچر کے بعد ہڈیوں کے ٹھیک ہونے کے عمل کا اسکیمیٹک خاکہ۔(B) ہر سطحی گروپ کی کالس کی تشکیل کی ڈگری اور (C) فریکچر سائٹ کی کراس سیکشنل امیج میں فرق۔(D) آسٹیو کلاس کی سرگرمی اور ہڈیوں کی بحالی کو دیکھنے کے لیے TRAP کا داغ۔TRAP سرگرمی کی بنیاد پر، کارٹیکل ہڈی کے بیرونی کالس کی تشکیل کا مقداری تجزیہ کیا گیا (E) (1) مائکرو سی ٹی اور (2) آسٹیو کلاس سرگرمی۔(F) امپلانٹیشن کے 6 ہفتے بعد، بے نقاب منفی (سرخ ڈیشڈ مستطیل سے نمایاں کردہ) اور LOIS (نیلے ڈیشڈ مستطیل سے نمایاں کردہ) کی ٹوٹی ہوئی ہڈی کی ایکس رے تصاویر۔شماریاتی تجزیہ یکطرفہ تغیرات (ANOVA) کے ذریعے کیا گیا۔* پی <0.05۔** پی <0.01۔
مختصراً، LOIS آرتھوپیڈک امپلانٹس کے لیے ایک نئی قسم کی اینٹی بیکٹیریل انفیکشن حکمت عملی اور مدافعتی فرار کی کوٹنگ فراہم کرتا ہے۔SHP فنکشنلائزیشن کے ساتھ روایتی آرتھوپیڈک امپلانٹس قلیل مدتی اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات کی نمائش کرتے ہیں، لیکن اپنی خصوصیات کو زیادہ دیر تک برقرار نہیں رکھ سکتے۔سبسٹریٹ کی سپر ہائیڈرو فوبیسٹی بیکٹیریا اور سبسٹریٹ کے درمیان ہوا کے بلبلوں کو پھنساتی ہے، اس طرح ہوا کی جیبیں بنتی ہیں، اس طرح بیکٹیریل انفیکشن کو روکتا ہے۔تاہم، ہوا کے پھیلاؤ کی وجہ سے، یہ ہوا کی جیبیں آسانی سے ہٹا دی جاتی ہیں۔دوسری طرف، LOIS نے بائیو فلم سے متعلق انفیکشن کو روکنے کی اپنی صلاحیت کو اچھی طرح سے ثابت کیا ہے۔لہٰذا، پرتوں والی مائیکرو/نینو ساخت کی سطح میں داخل ہونے والی چکنا کرنے والی پرت کی اینٹی ریجیکشن خصوصیات کی وجہ سے، انفیکشن سے متعلق سوزش کو روکا جا سکتا ہے۔LOIS مینوفیکچرنگ کے حالات کو بہتر بنانے کے لیے SEM، AFM، XPS اور CA پیمائش سمیت خصوصیات کے مختلف طریقے استعمال کیے جاتے ہیں۔اس کے علاوہ، LOIS کو مختلف حیاتیاتی مواد پر بھی لاگو کیا جا سکتا ہے جو عام طور پر آرتھوپیڈک فکسیشن آلات میں استعمال ہوتے ہیں، جیسے PLGA، Ti، PE، POM اور PPSU۔اس کے بعد، LOIS کو وٹرو میں ٹیسٹ کیا گیا تاکہ اس کی اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات کو بیکٹیریا اور مدافعتی ردعمل سے متعلق حیاتیاتی مادوں کے خلاف ثابت کیا جا سکے۔نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ ننگے امپلانٹ کے مقابلے میں اس میں بہترین اینٹی بیکٹیریل اور اینٹی بائیوفولنگ اثرات ہیں۔اس کے علاوہ، LOIS مکینیکل دباؤ کو لاگو کرنے کے بعد بھی میکانی طاقت دکھاتا ہے، جو پلاسٹک سرجری میں ناگزیر ہے۔مائیکرو/نینو ڈھانچے کی سطح پر چکنا کرنے والے کی خود شفا بخش خصوصیات کی وجہ سے، LOIS نے کامیابی کے ساتھ اپنی اینٹی بائیولوجیکل فولنگ خصوصیات کو برقرار رکھا۔Vivo میں LOIS کی حیاتیاتی مطابقت اور اینٹی بیکٹیریل خصوصیات کا مطالعہ کرنے کے لیے، LOIS کو خرگوش کے فیمر میں 4 ہفتوں کے لیے لگایا گیا تھا۔LOIS کے ساتھ لگائے گئے خرگوشوں میں کوئی بیکٹیریل انفیکشن نہیں دیکھا گیا۔اس کے علاوہ، IHC کے استعمال نے مقامی مدافعتی ردعمل کی کم سطح کا مظاہرہ کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ LOIS ہڈیوں کے ٹھیک ہونے کے عمل کو نہیں روکتا۔LOIS بہترین اینٹی بیکٹیریل اور مدافعتی چوری کی خصوصیات کی نمائش کرتا ہے، اور یہ ثابت ہوا ہے کہ وہ آرتھوپیڈک سرجری سے پہلے اور اس کے دوران بایوفلم کی تشکیل کو مؤثر طریقے سے روکتا ہے، خاص طور پر ہڈیوں کی ترکیب کے لیے۔خرگوش بون میرو کی سوزش والی فیمورل فریکچر ماڈل کا استعمال کرتے ہوئے، پہلے سے انکیوبیٹڈ امپلانٹس کی وجہ سے ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل پر بائیو فلم سے متعلق انفیکشن کے اثر کا گہرا مطالعہ کیا گیا۔مستقبل کے مطالعے کے طور پر، ایمپلانٹیشن کے بعد ممکنہ انفیکشنز کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک نئے ان ویوو ماڈل کی ضرورت ہے تاکہ شفا یابی کے پورے عمل کے دوران بائیو فلم سے متعلق انفیکشن کو مکمل طور پر سمجھا جا سکے۔اس کے علاوہ، LOIS کے ساتھ انضمام میں osteoinduction اب بھی ایک حل طلب چیلنج ہے۔چیلنج پر قابو پانے کے لیے osteoinductive خلیات کے منتخب چپکنے یا LOIS کے ساتھ دوبارہ پیدا ہونے والی دوائیوں کو جوڑنے کے لیے مزید تحقیق کی ضرورت ہے۔مجموعی طور پر، LOIS میکانکی مضبوطی اور بہترین اینٹی بائیوفولنگ خصوصیات کے ساتھ ایک امید افزا آرتھوپیڈک امپلانٹ کوٹنگ کی نمائندگی کرتا ہے، جو SSI اور مدافعتی ضمنی اثرات کو کم کر سکتا ہے۔
آلودگی کو دور کرنے کے لیے 15mm x 15mm x 1mm 304 SS سبسٹریٹ (Dong Kang M-Tech Co., Korea) کو ایسٹون، EtOH اور DI پانی میں 15 منٹ تک دھوئے۔سطح پر مائیکرو/نینو سطح کا ڈھانچہ بنانے کے لیے، صاف کیے گئے سبسٹریٹ کو 48% سے 51% HF محلول (DUKSAN Corp.، South Korea) میں 50°C پر ڈبو دیا جاتا ہے۔اینچنگ کا وقت 0 سے 60 منٹ تک مختلف ہوتا ہے۔اس کے بعد، اینچ شدہ سبسٹریٹ کو ڈیونائزڈ پانی سے صاف کیا گیا اور سطح پر ایک کرومیم آکسائیڈ پاسیویشن پرت بنانے کے لیے 30 منٹ کے لیے 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) کے محلول میں 50°C پر رکھا گیا۔غیر فعال ہونے کے بعد، سبسٹریٹ کو ڈیونائزڈ پانی سے دھویا جاتا ہے اور پرتوں والی ساخت کے ساتھ سبسٹریٹ حاصل کرنے کے لیے خشک کیا جاتا ہے۔اس کے بعد، سبسٹریٹ کو آکسیجن پلازما (100 W، 3 منٹ) کے سامنے لایا گیا، اور اسے فوری طور پر 8.88 mM POTS (Sigma-Aldrich، Germany) کے محلول میں کمرے کے درجہ حرارت پر 12 گھنٹے تک ڈبو دیا گیا۔اس کے بعد، POTS کے ساتھ لیپت سبسٹریٹ کو EtOH کے ساتھ صاف کیا گیا، اور گھنے POTS SAM حاصل کرنے کے لیے 2 گھنٹے کے لیے 150°C پر اینیل کیا گیا۔SAM کوٹنگ کے بعد، 20 μm/cm 2 کے لوڈنگ والیوم کے ساتھ ایک perfluoropolyether lubricant (Krytox 101; DuPont, USA) لگا کر سبسٹریٹ پر چکنا کرنے والی تہہ بنائی گئی۔ استعمال سے پہلے، چکنا کرنے والے کو 0.2 مائکرون فلٹر کے ذریعے فلٹر کریں۔15 منٹ کے لیے 45 ° زاویہ پر جھک کر اضافی چکنا کرنے والے مادے کو ہٹا دیں۔304 SS (لاکنگ پلیٹ اور کارٹیکل لاکنگ سکرو؛ Dong Kang M-Tech Co., Korea) سے بنے آرتھوپیڈک امپلانٹس کے لیے وہی مینوفیکچرنگ طریقہ کار استعمال کیا گیا تھا۔تمام آرتھوپیڈک امپلانٹس خرگوش کے فیمر کی جیومیٹری کے مطابق بنائے گئے ہیں۔
سبسٹریٹ اور آرتھوپیڈک امپلانٹس کی سطحی شکل کا معائنہ فیلڈ ایمیشن SEM (Inspect F50, FEI, USA) اور AFM (XE-100, Park Systems, South Korea) کے ذریعے کیا گیا۔سطح کی کھردری (Ra, Rq) کی پیمائش 20 μm کے رقبے کو 20 μm (n=4) سے ضرب دے کر کی جاتی ہے۔سطح کی کیمیائی ساخت کا تجزیہ کرنے کے لیے ایک XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japan) سسٹم استعمال کیا گیا تھا جس کا اسپاٹ سائز 100μm2 کے ساتھ Al Kα ایکس رے سورس سے لیس تھا۔مائع CA اور SA کی پیمائش کے لیے متحرک امیج کیپچر کیمرے (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​South Korea) سے لیس CA پیمائش کا نظام استعمال کیا گیا تھا۔ہر پیمائش کے لیے، CA کی پیمائش کے لیے 6 سے 10 μl قطرے (ڈیونائزڈ پانی، گھوڑے کا خون، EG، 30% ایتھنول، اور HD) سطح پر رکھے جاتے ہیں۔جب سبسٹریٹ کا جھکاؤ کا زاویہ 2°/s (n = 4) کی رفتار سے بڑھتا ہے، جب قطرہ گرتا ہے تو SA کی پیمائش کی جاتی ہے۔
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] اور MRSA (ATCC 25923) ATCC (ماناساس، ورجینیا، USA) سے خریدے گئے تھے، اور اسٹاک کلچر کو -80°C پر برقرار رکھا گیا تھا۔استعمال کرنے سے پہلے، منجمد کلچر کو ٹرپسن پگھلا ہوا سویا بین شوربہ (کومڈ، کوریا) میں 37 ڈگری سینٹی گریڈ پر 18 گھنٹے تک انکیوبیٹ کیا گیا اور پھر اسے چالو کرنے کے لیے دو بار منتقل کیا گیا۔انکیوبیشن کے بعد، کلچر کو 10،000 rpm پر 10 منٹ کے لیے 4°C پر سینٹرفیوج کیا گیا اور PBS (pH 7.3) محلول سے دو بار دھویا گیا۔سینٹرفیوجڈ کلچر پھر بلڈ آگر پلیٹوں (BAP) پر ذیلی ثقافت کی جاتی ہے۔MRSA اور Pseudomonas aeruginosa راتوں رات تیار کیے گئے اور لوریہ برٹانی شوربے میں کلچر کیے گئے۔انوکولم میں Pseudomonas aeruginosa اور MRSA کا ارتکاز مقداری طور پر Agar پر سیریل dilutions میں معطلی کے CFU کے ذریعے طے کیا گیا تھا۔اس کے بعد، بیکٹیریل ارتکاز کو 0.5 میکفارلینڈ کے معیار پر ایڈجسٹ کریں، جو کہ 108 CFU/ml کے برابر ہے۔پھر کام کرنے والے بیکٹیریل سسپنشن کو 100 بار 106 CFU/ml تک پتلا کریں۔اینٹی بیکٹیریل آسنجن خصوصیات کو جانچنے کے لیے، سبسٹریٹ کو استعمال سے پہلے 15 منٹ کے لیے 121 ° C پر جراثیم سے پاک کیا گیا تھا۔اس کے بعد سبسٹریٹ کو 25 ملی لیٹر بیکٹیریل سسپنشن میں منتقل کیا گیا اور 12 اور 72 گھنٹے تک زوردار ہلانے (200 rpm) کے ساتھ 37 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا۔انکیوبیشن کے بعد، ہر سبسٹریٹ کو انکیوبیٹر سے ہٹا دیا گیا اور سطح پر تیرتے بیکٹیریا کو دور کرنے کے لیے پی بی ایس کے ساتھ 3 بار دھویا گیا۔سبسٹریٹ پر بائیو فلم کا مشاہدہ کرنے کے لیے، بائیو فلم کو میتھانول کے ساتھ فکس کیا گیا تھا اور 1 ملی لیٹر کریمڈین اورنج سے 2 منٹ تک داغ دیا گیا تھا۔پھر ایک فلوروسینس مائکروسکوپ (BX51TR، اولمپس، جاپان) کو داغدار بائیو فلم کی تصاویر لینے کے لیے استعمال کیا گیا۔سبسٹریٹ پر بائیو فلم کی مقدار درست کرنے کے لیے، منسلک خلیات کو بیڈ وورٹیکس طریقہ سے سبسٹریٹ سے الگ کیا گیا تھا، جو منسلک بیکٹیریا (n = 4) کو ہٹانے کے لیے سب سے موزوں طریقہ سمجھا جاتا تھا۔جراثیم سے پاک فورپس کا استعمال کرتے ہوئے، سبسٹریٹ کو گروتھ میڈیم سے ہٹائیں اور اضافی مائع کو ہٹانے کے لیے اچھی پلیٹ کو تھپتھپائیں۔ڈھیلے سے منسلک خلیوں کو جراثیم سے پاک پی بی ایس کے ساتھ دو بار دھو کر ہٹا دیا گیا تھا۔اس کے بعد ہر سبسٹریٹ کو جراثیم سے پاک ٹیسٹ ٹیوب میں منتقل کیا گیا جس میں 9 ملی لیٹر 0.1 فیصد پروٹین ای پی ٹی سیلائن (PSW) اور 2 جی 20 سے 25 جراثیم سے پاک شیشے کے موتیوں (قطر میں 0.4 سے 0.5 ملی میٹر) شامل تھے۔اس کے بعد خلیوں کو نمونے سے الگ کرنے کے لیے اسے 3 منٹ تک گھمایا گیا۔بھنور ڈالنے کے بعد، معطلی کو 0.1% PSW کے ساتھ 10 گنا سیریلی طور پر پتلا کیا گیا، اور پھر BAP پر ہر ڈائلیشن کا 0.1 ملی لیٹر ٹیکہ لگایا گیا۔37 ° C پر 24 گھنٹے انکیوبیشن کے بعد، CFU کو دستی طور پر شمار کیا گیا۔
خلیوں کے لیے، ماؤس فائبرو بلاسٹس NIH/3T3 (CRL-1658؛ امریکن ATCC) اور ماؤس میکروفیجز RAW 264.7 (TIB-71؛ امریکن ATCC) استعمال کیے گئے تھے۔Dulbecco کے ترمیم شدہ ایگل میڈیم (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) کو ماؤس فائبرو بلاسٹس کو کلچر کرنے کے لیے استعمال کریں اور 10% بچھڑے کے سیرم (S103-01, Welgene) اور 1% penicillin-streptomycin (PS; LS202-Welgene) کے ساتھ سپلیمنٹ کریں۔ 10% فیٹل بووائن سیرم (S001-01، ویلجین) اور 1% PS کے ساتھ ماؤس میکروفیج کو کلچر کرنے کے لیے DMEM کا استعمال کریں، اور سیلز کو 105 سیلز/cm2 پر ٹیکہ لگائیں۔ خلیوں کو 37 ° C اور 5% CO2 پر 20 منٹ کے لئے طے کیا گیا تھا اور 50nM tetraminethr میں سبسٹریٹ کو 5 منٹ کے لئے 0.5% Paraformaldehyde کے ساتھ رکھا گیا تھا۔ انکیوبیشن کے عمل کے بعد 37°C پر 4′,6-diamino-2-phenylindole (H-1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD فکسیشن میڈیم (n = 4 فی سیل) کے ساتھ استعمال کریں۔ , fluorescein, fluorescein isothiocyanate-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Germany) اور انسانی پلازما The Alexa Fluor 488-conjugated fibrinogen (F13191, Invitrogen, USA) PBS میں تحلیل ہو گیا تھا (10 mM. p.4)۔البومین اور فائبرنوجن کی تعداد بالترتیب 1 اور 150 μg/ml تھی۔سبسٹریٹ کے بعد پروٹین کے محلول میں ڈوبنے سے پہلے، سطح کو دوبارہ ہائیڈریٹ کرنے کے لیے انہیں PBS سے دھولیں۔پھر تمام سبسٹریٹس کو چھ کنویں والی پلیٹ میں ڈبو دیں جس میں پروٹین کا محلول موجود ہو اور 37°C پر 30 اور 90 منٹ تک انکیوبیٹ کریں۔انکیوبیشن کے بعد، سبسٹریٹ کو پھر پروٹین کے محلول سے ہٹا دیا گیا، PBS کے ساتھ 3 بار آہستہ سے دھویا گیا، اور 4% paraformaldehyde (ہر پروٹین کے لیے n = 4) کے ساتھ فکس کیا گیا۔کیلشیم کے لیے، سوڈیم کلورائیڈ (0.21 ایم) اور پوٹاشیم فاسفیٹ (3.77 ایم ایم) ) ڈیونائزڈ پانی میں تحلیل کیا گیا تھا۔حل کے پی ایچ کو ہائیڈروکلورائڈ محلول (1M) شامل کرکے 2.0 میں ایڈجسٹ کیا گیا۔پھر کیلشیم کلورائد (5.62 ایم ایم) کو محلول میں تحلیل کر دیا گیا۔1M tris(hydroxymethyl)-امینو میتھین کو شامل کرکے محلول کی pH کو 7.4 پر ایڈجسٹ کرتا ہے۔1.5× کیلشیم فاسفیٹ محلول سے بھری ہوئی چھ کنویں پلیٹ میں تمام ذیلی ذخائر ڈبو دیں اور 30 ​​منٹ کے بعد محلول سے نکال دیں۔داغ لگانے کے لیے، 2 جی ایلیزارین ریڈ ایس (CI 58005) 100 ملی لیٹر ڈیونائزڈ پانی کے ساتھ ملائیں۔اس کے بعد، pH کو 4 میں ایڈجسٹ کرنے کے لیے 10% امونیم ہائیڈرو آکسائیڈ استعمال کریں۔ ایلیزارین ریڈ محلول سے سبسٹریٹ کو 5 منٹ تک رنگیں، اور پھر اضافی رنگ اور دھبے کو ہلائیں۔ہلانے کے عمل کے بعد، سبسٹریٹ کو ہٹا دیں۔مواد کو پانی کی کمی ہوتی ہے، پھر ایسٹون میں 5 منٹ تک ڈبو دیا جاتا ہے، پھر ایسٹون-زائلین (1:1) محلول میں 5 منٹ تک ڈبو دیا جاتا ہے، اور آخر میں زائلین (n = 4) سے دھویا جاتا ہے۔×10 اور ×20 آبجیکٹیو لینز کے ساتھ فلوروسینس مائیکروسکوپ (Axio Imager) استعمال کیا جاتا ہے۔.A2m، Zeiss، Germany) تمام ذیلی جگہوں کی تصاویر۔ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) چار مختلف امیجنگ علاقوں کے ہر گروپ پر حیاتیاتی مادوں کے آسنجن ڈیٹا کی مقدار درست کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔سبسٹریٹ موازنہ کے لیے تمام تصاویر کو مقررہ حد کے ساتھ بائنری امیجز میں تبدیل کریں۔
ایک Zeiss LSM 700 confocal مائکروسکوپ PBS میں ریفلیکشن موڈ میں چکنا کرنے والی پرت کے استحکام کی نگرانی کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔انجکشن شدہ چکنا کرنے والی پرت کے ساتھ فلورین پر مبنی SAM لیپت شیشے کے نمونے کو PBS محلول میں ڈبو دیا گیا تھا، اور ہلکے ہلنے والے حالات (120 rpm) کے تحت مداری شیکر (SHO-1D؛ Daihan سائنٹیفک، جنوبی کوریا) کا استعمال کرتے ہوئے ٹیسٹ کیا گیا تھا۔پھر نمونہ لیں اور منعکس روشنی کے نقصان کی پیمائش کرکے چکنا کرنے والے کے نقصان کی نگرانی کریں۔عکاسی موڈ میں فلوروسینس امیجز حاصل کرنے کے لیے، نمونے کو 633 nm لیزر کے سامنے لایا جاتا ہے اور پھر جمع کیا جاتا ہے، کیونکہ روشنی نمونے سے واپس منعکس ہوتی ہے۔نمونوں کی پیمائش 0، 30، 60 اور 120 گھنٹے کے وقفوں سے کی گئی۔
آرتھوپیڈک امپلانٹس کی نینو مکینیکل خصوصیات پر سطح کی تبدیلی کے عمل کے اثر و رسوخ کا تعین کرنے کے لیے، ایک نینو انڈینٹر (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) تین رخی اہرام کے سائز کے برکووچ ہیرے کی نوک سے لیس نینو انڈینڈیون کی پیمائش کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔چوٹی کا بوجھ 10 mN ہے اور رقبہ 100μmx 100μm ہے۔تمام پیمائشوں کے لیے، لوڈنگ اور ان لوڈنگ کا وقت 10 سیکنڈ ہے، اور چوٹی انڈینٹیشن بوجھ کے تحت انعقاد کا وقت 2 سیکنڈ ہے۔پانچ مختلف مقامات سے پیمائش لیں اور اوسط لیں۔بوجھ کے تحت مکینیکل طاقت کی کارکردگی کا جائزہ لینے کے لیے، ایک یونیورسل ٹیسٹنگ مشین (انسٹرون 5966، انسٹرون، USA) کا استعمال کرتے ہوئے ایک ٹرانسورس تھری پوائنٹ موڑنے والا ٹیسٹ کیا گیا۔سبسٹریٹ کو 10 N/s کی مستقل شرح سے زیادہ بوجھ کے ساتھ کمپریس کیا جاتا ہے۔بلیو ہیل یونیورسل سافٹ ویئر پروگرام (n = 3) لچکدار ماڈیولس اور زیادہ سے زیادہ کمپریسیو تناؤ کا حساب لگانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔
آپریشن کے عمل اور آپریشن کے دوران ہونے والے متعلقہ مکینیکل نقصان کو نقل کرنے کے لیے، آپریشن کے عمل کو وٹرو میں انجام دیا گیا۔پھانسی پانے والے نیوزی لینڈ کے سفید خرگوش سے فیمر جمع کیے گئے تھے۔فیمر کو 1 ہفتہ کے لئے 4٪ پیرافارمیلڈہائڈ میں صاف اور طے کیا گیا تھا۔جیسا کہ جانوروں کے تجربے کے طریقہ کار میں بیان کیا گیا ہے، فکسڈ فیمر کا آپریشن جراحی سے کیا گیا تھا۔آپریشن کے بعد، آرتھوپیڈک امپلانٹ کو خون (گھوڑے کا خون، KISAN، Korea) میں 10 سیکنڈ تک ڈبو دیا گیا تاکہ اس بات کی تصدیق کی جا سکے کہ آیا مکینیکل چوٹ لگنے کے بعد خون میں چپکنے کا عمل ہوا ہے (n = 3)۔
نیوزی لینڈ کے کل 24 نر سفید خرگوش (وزن 3.0 سے 3.5 کلوگرام، اوسط عمر 6 ماہ) کو تصادفی طور پر چار گروپوں میں تقسیم کیا گیا تھا: عریاں منفی، عریاں مثبت، SHP اور LOIS۔جانوروں سے متعلق تمام طریقہ کار ادارہ جاتی جانوروں کی دیکھ بھال اور استعمال کمیٹی (IACUC منظور شدہ، KOREA-2017-0159) کے اخلاقی معیارات کے مطابق انجام دیے گئے تھے۔آرتھوپیڈک امپلانٹ فریکچر فکسشن کے لیے پانچ سوراخوں (لمبائی 41 ملی میٹر، چوڑائی 7 ملی میٹر اور موٹائی 2 ملی میٹر) اور کارٹیکل لاکنگ اسکرو (لمبائی 12 ملی میٹر، قطر 2.7 ملی میٹر) کے ساتھ ایک لاکنگ پلیٹ پر مشتمل ہوتا ہے۔ننگے منفی گروپ میں استعمال ہونے والی پلیٹوں اور پیچ کے علاوہ، تمام پلیٹیں اور پیچ MRSA معطلی (106 CFU/ml) میں 12 گھنٹے تک لگائے گئے تھے۔ننگے-منفی گروپ (n = 6) کا علاج بیکٹیریل معطلی کی نمائش کے بغیر، انفیکشن کے منفی کنٹرول کے طور پر، ننگی سطح کے امپلانٹس کے ساتھ کیا گیا تھا۔ننگے مثبت گروپ (n = 6) کا علاج ایک ننگی سطح کے امپلانٹ کے ساتھ کیا گیا تھا جو بیکٹیریا کے سامنے تھا کیونکہ انفیکشن کے مثبت کنٹرول کے طور پر۔SHP گروپ (n = 6) کا علاج بیکٹیریا سے بے نقاب SHP امپلانٹس کے ساتھ کیا گیا تھا۔آخر میں، LOIS گروپ کا علاج بیکٹیریل بے نقاب LOIS امپلانٹس (n = 6) کے ساتھ کیا گیا۔تمام جانوروں کو پنجرے میں رکھا جاتا ہے، اور بہت زیادہ خوراک اور پانی مہیا کیا جاتا ہے۔آپریشن سے پہلے خرگوش کو 12 گھنٹے کا روزہ رکھا گیا تھا۔جانوروں کو شامل کرنے کے لیے xylazine (5mg/kg) کے intramuscular انجیکشن اور paclitaxel (3mg/kg) کے نس میں انجیکشن کے ذریعے بے ہوشی کی گئی۔اس کے بعد، 2% isoflurane اور 50% سے 70% طبی آکسیجن (بہاؤ کی شرح 2 L/min) نظام تنفس کے ذریعے اینستھیزیا کو برقرار رکھنے کے لیے فراہم کریں۔یہ پس منظر کے فیمر تک براہ راست نقطہ نظر کے ذریعے لگایا جاتا ہے۔بالوں کو ہٹانے اور جلد کی پوویڈون آئوڈین ڈس انفیکشن کے بعد، بائیں درمیانی فیمر کے باہر تقریباً 6 سینٹی میٹر لمبا ایک چیرا بنایا گیا۔فیمر کو ڈھانپنے والے پٹھوں کے درمیان خلا کو کھولنے سے، فیمر مکمل طور پر بے نقاب ہوجاتا ہے۔پلیٹ کو فیمورل شافٹ کے سامنے رکھیں اور اسے چار پیچ سے ٹھیک کریں۔ٹھیک کرنے کے بعد، دوسرے سوراخ اور چوتھے سوراخ کے درمیان والے حصے میں مصنوعی طور پر فریکچر بنانے کے لیے آری بلیڈ (1 ملی میٹر موٹی) کا استعمال کریں۔آپریشن کے اختتام پر زخم کو نمکین سے دھویا گیا اور سیون سے بند کر دیا گیا۔ہر خرگوش کو اینروفلوکساسین (5 ملی گرام/کلوگرام) ایک تہائی نمکین کے ساتھ ذیلی طور پر انجکشن لگایا گیا تھا۔ہڈی کے اوسٹیوٹومی کی تصدیق کے لیے فیمر کے پوسٹ آپریٹو ایکس رے تمام جانوروں (0، 7، 14، 21، 28، اور 42 دن) میں لیے گئے تھے۔گہری اینستھیزیا کے بعد، تمام جانوروں کو 28 اور 42 دنوں میں نس کے ذریعے KCl (2 mmol/kg) کے ذریعے ہلاک کیا گیا۔پھانسی کے بعد، ہڈیوں کی شفا یابی کے عمل اور چار گروپوں کے درمیان ہڈیوں کی نئی تشکیل کا مشاہدہ اور موازنہ کرنے کے لیے فیمر کو مائیکرو-CT کے ذریعے اسکین کیا گیا۔
پھانسی کے بعد، نرم ٹشوز جو آرتھوپیڈک امپلانٹس کے ساتھ براہ راست رابطے میں تھے جمع کیے گئے تھے.ٹشو کو راتوں رات 10٪ غیر جانبدار بفرڈ فارملین میں طے کیا گیا اور پھر EtOH میں پانی کی کمی کردی گئی۔پانی کی کمی والے ٹشو کو پیرافین میں سرایت کیا گیا تھا اور مائکروٹوم (400CS؛ EXAKT، جرمنی) کا استعمال کرتے ہوئے 40 μm کی موٹائی پر سیکشن کیا گیا تھا۔انفیکشن کو دیکھنے کے لیے، H&E سٹیننگ اور MT سٹیننگ کی گئی تھی۔میزبان کے ردعمل کو چیک کرنے کے لیے، سیکشن والے ٹشو کو خرگوش اینٹی TNF-α پرائمری اینٹی باڈی (AB6671، Abcam، USA) اور خرگوش اینٹی IL-6 (AB6672؛ Abcam، USA) سے لگایا گیا اور پھر ہارسریڈش کے ساتھ علاج کیا گیا۔آکسیڈیز۔مینوفیکچرر کی ہدایات کے مطابق سیکشنز پر avidin-biotin کمپلیکس (ABC) سٹیننگ سسٹم لگائیں۔براؤن ری ایکشن پروڈکٹ کے طور پر ظاہر ہونے کے لیے، 3,3-diaminobenzidine تمام حصوں میں استعمال کیا گیا تھا۔ایک ڈیجیٹل سلائیڈ سکینر (پینورامک 250 فلیش III، 3DHISTECH، Hungary) تمام سلائسوں کو دیکھنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور امیج جے سافٹ ویئر کے ذریعے ہر گروپ میں کم از کم چار سبسٹریٹس کا تجزیہ کیا گیا تھا۔
ایکس رے کی تصاویر سرجری کے بعد تمام جانوروں میں لی گئی تھیں اور ہر ہفتے فریکچر کی شفا یابی کی نگرانی کے لیے (n=6 فی گروپ)۔پھانسی کے بعد، ٹھیک ہونے کے بعد فیمر کے گرد کالس کی تشکیل کا حساب لگانے کے لیے ہائی ریزولوشن مائیکرو سی ٹی کا استعمال کیا گیا۔حاصل شدہ فیمر کو صاف کیا گیا، 3 دن کے لیے 4% paraformaldehyde میں طے کیا گیا، اور 75% ایتھنول میں پانی کی کمی کی گئی۔اس کے بعد ہڈیوں کے نمونے کی 3D ووکسیل امیجز (2240×2240 پکسلز) بنانے کے لیے مائیکرو سی ٹی (اسکائی اسکین 1173، بروک مائیکرو-سی ٹی، کینڈی، بیلجیئم) کے ذریعے پانی کی کمی کی ہڈیوں کو اسکین کیا گیا۔سگنل شور کو کم کرنے کے لیے 1.0 ملی میٹر ال فلٹر استعمال کریں اور تمام اسکینز پر ہائی ریزولوشن لگائیں (E = 133 kVp، I = 60 μA، انضمام کا وقت = 500 ms)۔Nrecon سافٹ ویئر (ورژن 1.6.9.8، Bruker microCT، Kontich، Belgium) کو حاصل شدہ 2D لیٹرل پروجیکشن سے اسکین شدہ نمونے کا 3D حجم پیدا کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔تجزیہ کے لیے، 3D دوبارہ تعمیر شدہ تصویر کو فریکچر سائٹ کے مطابق 10mm×10mm×10mm کیوبز میں تقسیم کیا گیا ہے۔کارٹیکل ہڈی کے باہر کالس کا حساب لگائیں۔ڈیٹا ویوور (ورژن 1.5.1.2؛ بروکر مائیکرو سی ٹی، کونٹیچ، بیلجیم) سافٹ ویئر کو اسکین شدہ ہڈی کے حجم کو ڈیجیٹل طور پر ری ڈائریکٹ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا، اور تجزیہ کے لیے CT-Analyser (ورژن 1.14.4.1؛ Bruker microCT، Kontich، Belgium) سافٹ ویئر استعمال کیا گیا تھا۔بالغ ہڈیوں اور کالس میں متعلقہ ایکس رے جذب کرنے والے گتانکوں کو ان کی کثافت سے ممتاز کیا جاتا ہے، اور پھر کالس کا حجم درست کیا جاتا ہے (n = 4)۔اس بات کی تصدیق کرنے کے لیے کہ LOIS کی حیاتیاتی مطابقت ہڈیوں کے ٹھیک ہونے کے عمل میں تاخیر نہیں کرتی، اضافی ایکسرے اور مائیکرو-CT تجزیہ دو خرگوشوں میں کیا گیا: ننگے-منفی اور LOIS گروپس۔دونوں گروہوں کو چھٹے ہفتے میں پھانسی دی گئی۔
قربانی کے جانوروں کے فیمر کو اکٹھا کیا گیا اور 3 دن کے لیے 4% paraformaldehyde میں رکھا گیا۔پھر آرتھوپیڈک امپلانٹ کو فیمر سے احتیاط سے ہٹا دیا جاتا ہے۔فیمر کو 21 دنوں کے لیے 0.5 M EDTA (EC-900، National Diagnostics Corporation) کا استعمال کرتے ہوئے ختم کیا گیا۔پھر decalcified فیمر کو EtOH میں ڈبو دیا گیا تاکہ اسے پانی کی کمی ہو جائے۔پانی کی کمی والی فیمر کو زائلین میں ہٹا دیا گیا تھا اور پیرافین میں سرایت کیا گیا تھا۔پھر نمونے کو ایک خودکار روٹری مائیکروٹوم (Leica RM2255، Leica Biosystems، Germany) کے ساتھ 3 μm کی موٹائی کے ساتھ کاٹا گیا۔TRAP سٹیننگ (F6760، سگما-الڈرچ، جرمنی) کے لیے، سیکشن شدہ نمونوں کو 1 گھنٹے کے لیے 37 ° C پر TRAP ریجنٹ میں ڈیپرافینائز، ری ہائیڈریٹ اور انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔سلائیڈ اسکینر (پینورامک 250 فلیش III، 3DHISTECH، Hungary) کا استعمال کرتے ہوئے تصاویر حاصل کی گئیں اور داغ والے علاقے کی کوریج کی پیمائش کرکے مقدار درست کی گئی۔ہر تجربے میں، امیج جے سافٹ ویئر کے ذریعہ ہر گروپ میں کم از کم چار سبسٹریٹس کا تجزیہ کیا گیا۔
گراف پیڈ پرزم (گراف پیڈ سافٹ ویئر انکارپوریٹڈ، USA) کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی اہمیت کا تجزیہ کیا گیا۔تشخیصی گروپوں کے درمیان فرق کو جانچنے کے لیے غیر جوڑا ٹی ٹیسٹ اور تغیر کا یک طرفہ تجزیہ (ANOVA) استعمال کیا گیا۔اہمیت کی سطح کو مندرجہ ذیل شکل میں دکھایا گیا ہے: *P <0.05، **P <0.01، ***P <0.001 اور ****P <0.0001؛NS، کوئی خاص فرق نہیں۔
اس مضمون کے ضمنی مواد کے لیے، براہ کرم دیکھیں http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
یہ تخلیقی العام انتساب-غیر تجارتی لائسنس کی شرائط کے تحت تقسیم کیا گیا ایک کھلا رسائی مضمون ہے، جو کسی بھی میڈیم میں استعمال، تقسیم اور تولید کی اجازت دیتا ہے، جب تک کہ استعمال تجارتی فائدے کے لیے نہ ہو اور بنیاد یہ ہے کہ اصل کام درست ہےحوالہ۔
نوٹ: ہم آپ سے صرف ایک ای میل ایڈریس فراہم کرنے کو کہتے ہیں تاکہ آپ جس شخص کو صفحہ پر تجویز کرتے ہیں اسے معلوم ہو کہ آپ چاہتے ہیں کہ وہ ای میل دیکھیں اور یہ کہ ای میل سپیم نہیں ہے۔ہم کسی بھی ای میل ایڈریس پر قبضہ نہیں کریں گے۔
یہ سوال یہ جانچنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے کہ آیا آپ انسانی وزیٹر ہیں اور خودکار اسپام جمع آوری کو روکنے کے لیے۔
چو کیونگ من، اوہ ینگ جنگ، پارک جون جون، لی جن ہیوک، کم ہیون چیول، لی کیونگ مون، لی چانگ کیو، لی یون ٹیک، لی سن-اک، جیونگ موروئی
آرتھوپیڈک امپلانٹس کی اینٹی بیکٹیریل اور مدافعتی فرار کی کوٹنگز انفیکشنز اور انفیکشن کی وجہ سے ہونے والے مدافعتی ردعمل کو کم کر سکتی ہیں۔
چو کیونگ من، اوہ ینگ جنگ، پارک جون جون، لی جن ہیوک، کم ہیون چیول، لی کیونگ مون، لی چانگ کیو، لی یون ٹیک، لی سن-اک، جیونگ موروئی
آرتھوپیڈک امپلانٹس کی اینٹی بیکٹیریل اور مدافعتی فرار کی کوٹنگز انفیکشنز اور انفیکشن کی وجہ سے ہونے والے مدافعتی ردعمل کو کم کر سکتی ہیں۔
©2021 امریکن ایسوسی ایشن فار دی ایڈوانسمنٹ آف سائنس۔جملہ حقوق محفوظ ہیں.AAAS HINARI، AGORA، OARE، CHORUS، CLOCKSS، CrossRef اور COUNTER کا پارٹنر ہے۔سائنس ایڈوانسز ISSN 2375-2548۔