Per i pazienti sottoposti a intervento di impianto ortopedico, le infezioni batteriche e le risposte immunitarie indotte dalle infezioni sono sempre stati rischi potenzialmente letali.I materiali biologici convenzionali sono suscettibili alla contaminazione biologica, che fa sì che i batteri invadano l’area lesa e causino infezioni postoperatorie.Pertanto, esiste un urgente bisogno di sviluppare rivestimenti anti-infezione e di fuga immunitaria per gli impianti ortopedici.Qui, abbiamo sviluppato una tecnologia avanzata di modifica della superficie per impianti ortopedici chiamata Superficie dell'impianto ortopedico lubrificato (LOIS), che si ispira alla superficie liscia delle brocche delle piante carnivore.LOIS ha una repellenza forte e duratura verso una varietà di liquidi e sostanze biologiche (comprese cellule, proteine, calcio e batteri).Inoltre, abbiamo confermato la resistenza meccanica ai graffi e la forza di fissaggio simulando l'inevitabile danno durante l'intervento chirurgico in vitro.Il modello di frattura femorale infiammatoria del midollo osseo di coniglio è stato utilizzato per studiare a fondo la capacità antibiologica di ridimensionamento e anti-infezione di LOIS.Prevediamo che LOIS, che ha proprietà anti-biofouling e durabilità meccanica, rappresenti un passo avanti nella chirurgia ortopedica senza infezioni.
Oggi, a causa dell'invecchiamento generale, il numero di pazienti affetti da malattie ortopediche (come fratture degli anziani, malattie degenerative delle articolazioni e osteoporosi) è notevolmente aumentato (1, 2).Pertanto, le istituzioni mediche attribuiscono grande importanza alla chirurgia ortopedica, compresi gli impianti ortopedici di viti, placche, chiodi e articolazioni artificiali (3, 4).Tuttavia, è stato segnalato che gli impianti ortopedici tradizionali sono suscettibili all’adesione batterica e alla formazione di biofilm, che possono causare infezioni del sito chirurgico (SSI) dopo l’intervento chirurgico (5, 6).Una volta formato il biofilm sulla superficie dell’impianto ortopedico, la rimozione del biofilm diventa estremamente difficile anche con l’utilizzo di grandi dosi di antibiotici.Pertanto, di solito porta a gravi infezioni postoperatorie (7, 8).A causa dei problemi di cui sopra, il trattamento degli impianti infetti dovrebbe includere un nuovo intervento, compresa la rimozione di tutti gli impianti e dei tessuti circostanti;pertanto, il paziente soffrirà un forte dolore e alcuni rischi (9, 10).
Per risolvere alcuni di questi problemi, sono stati sviluppati impianti ortopedici a rilascio di farmaci per prevenire le infezioni eliminando i batteri attaccati alla superficie (11, 12).Tuttavia, la strategia mostra ancora diversi limiti.È stato riportato che l'impianto a lungo termine di impianti a rilascio di farmaco ha causato danni ai tessuti circostanti e causato infiammazioni, che possono portare alla necrosi (13, 14).Inoltre, i solventi organici che possono esistere dopo il processo di produzione degli impianti ortopedici a rilascio di farmaci, che sono severamente proibiti dalla Food and Drug Administration statunitense, richiedono ulteriori passaggi di purificazione per soddisfare i suoi standard (15).Gli impianti a rilascio di farmaco rappresentano una sfida per il rilascio controllato dei farmaci e, a causa del loro carico limitato, l'applicazione a lungo termine del farmaco non è fattibile (16).
Un'altra strategia comune è quella di rivestire l'impianto con un polimero antivegetativo per impedire che materiale biologico e batteri aderiscano alla superficie (17).Ad esempio, i polimeri zwitterionici hanno attirato l’attenzione per le loro proprietà non adesive a contatto con proteine ​​plasmatiche, cellule e batteri.Tuttavia, presenta alcune limitazioni legate alla stabilità a lungo termine e alla durabilità meccanica, che ne ostacolano l’applicazione pratica negli impianti ortopedici, soprattutto a causa del raschiamento meccanico durante le procedure chirurgiche (18, 19).Inoltre, grazie alla sua elevata biocompatibilità, alla mancanza di necessità di interventi chirurgici di rimozione e alle proprietà di pulizia della superficie attraverso la corrosione, sono stati utilizzati impianti ortopedici realizzati con materiali biodegradabili (20, 21).Durante la corrosione, i legami chimici tra la matrice polimerica vengono rotti e staccati dalla superficie e gli aderenti puliscono la superficie.Tuttavia, le incrostazioni antibiologiche mediante la pulizia delle superfici sono efficaci in un breve periodo di tempo.Inoltre, la maggior parte dei materiali assorbibili, tra cui il poli(copolimero dell'acido lattico-acido glicolico) (PLGA), l'acido polilattico (PLA) e le leghe a base di magnesio, subiranno una biodegradazione ed erosione non uniforme nel corpo, che influirà negativamente sulla stabilità meccanica.(ventidue).Inoltre, i frammenti biodegradabili della piastra forniscono un luogo in cui i batteri possono attaccarsi, il che aumenta la possibilità di infezione a lungo termine.Questo rischio di degrado meccanico e infezione limita l’applicazione pratica della chirurgia plastica (23).
Le superfici superidrofobiche (SHP) che imitano la struttura gerarchica delle foglie di loto sono diventate una potenziale soluzione per le superfici antivegetative (24, 25).Quando la superficie dell'SHP è immersa nel liquido, le bolle d'aria verranno intrappolate, formando sacche d'aria e prevenendo l'adesione batterica (26).Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che la superficie SHP presenta degli svantaggi legati alla durabilità meccanica e alla stabilità a lungo termine, che ne ostacolano l’applicazione negli impianti medici.Inoltre, le sacche d'aria si dissolveranno e perderanno le loro proprietà antivegetative, determinando così un'adesione batterica più ampia a causa dell'ampia superficie della superficie SHP (27, 28).Recentemente, Aizenberg e colleghi hanno introdotto un metodo innovativo di rivestimento superficiale anti-biofouling sviluppando una superficie liscia ispirata alla pianta carnivora Nepenthes (29, 30).La superficie liscia mostra stabilità a lungo termine in condizioni idrauliche, è estremamente repellente ai liquidi biologici e ha proprietà autoriparanti.Tuttavia, non esiste un metodo per applicare un rivestimento a un impianto medico di forma complessa, né è dimostrato che supporti il ​​processo di guarigione del tessuto danneggiato dopo l’impianto.
Qui, introduciamo una superficie implantare ortopedica lubrificata (LOIS), una superficie implantare ortopedica micro/nanostrutturata e strettamente combinata con un sottile strato lubrificante per evitare che venga associata alla chirurgia plastica Infezioni batteriche, come la fissazione di fratture.Poiché la struttura a livello micro/nano funzionalizzata con fluoro fissa saldamente il lubrificante sulla struttura, il LOIS sviluppato può respingere completamente l'adesione di vari liquidi e mantenere le prestazioni antivegetative per lungo tempo.I rivestimenti LOIS possono essere applicati su materiali di varie forme destinati alla sintesi ossea.Le eccellenti proprietà anti-biofouling di LOIS contro i batteri del biofilm [Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus resistente alla meticillina (MRSA)] e le sostanze biologiche (cellule, proteine ​​e calcio) sono state confermate in vitro.Il tasso di adesione dell'adesione estesa al substrato è inferiore all'1%.Inoltre, anche dopo che si sono verificati stress meccanici come graffi sulla superficie, l'autoriparazione causata dal lubrificante penetrante aiuta a mantenere le sue proprietà antivegetative.I risultati dei test di durabilità meccanica mostrano che anche dopo la modifica strutturale e chimica, la resistenza totale non sarà ridotta in modo significativo.Inoltre, è stato effettuato un esperimento in vitro che simula lo stress meccanico nell’ambiente chirurgico per dimostrare che LOIS può resistere alle varie sollecitazioni meccaniche che si verificano durante la chirurgia plastica.Infine, abbiamo utilizzato un modello di frattura femorale in vivo basato su coniglio, che ha dimostrato che LOIS ha proprietà antibatteriche e biocompatibilità superiori.I risultati radiologici e istologici hanno confermato che il comportamento lubrificante stabile e le proprietà anti-biofouling entro 4 settimane dall'impianto possono ottenere efficaci prestazioni anti-infezione e di fuga immunitaria senza ritardare il processo di guarigione ossea.
La Figura 1A mostra un diagramma schematico del LOIS sviluppato, che è impiantato con strutture su micro/nanoscala nel modello di frattura femorale del coniglio per confermare le sue eccellenti proprietà anti-incrostazione biologica e anti-infezione.Viene utilizzato un metodo biomimetico per simulare la superficie di una pianta in vaso e per prevenire il biofouling incorporando uno strato lubrificante all'interno della micro/nanostruttura della superficie.La superficie iniettata con lubrificante può ridurre al minimo il contatto tra sostanze biologiche e superficie.Pertanto, grazie alla formazione di legami chimici stabili sulla superficie, ha eccellenti prestazioni antivegetative e stabilità a lungo termine.Di conseguenza, le proprietà anti-biofouling della superficie lubrificante consentono varie applicazioni pratiche nella ricerca biomedica.Tuttavia, non sono ancora state completate ricerche approfondite su come questa speciale superficie interagisce nel corpo.Confrontando LOIS con substrati nudi in vitro utilizzando albumina e batteri del biofilm, è possibile confermare la non adesività di LOIS (Figura 1B).Inoltre, facendo rotolare le gocce d'acqua sul substrato nudo inclinato e sul substrato LOIS (Figura S1 e Filmato S1), è possibile dimostrare le prestazioni di contaminazione biologica.Come mostrato nell'immagine al microscopio a fluorescenza, il substrato esposto incubato in una sospensione di proteine ​​e batteri mostrava una grande quantità di materiale biologico aderente alla superficie.Tuttavia, grazie alle sue eccellenti proprietà anti-biofouling, LOIS difficilmente mostra alcuna fluorescenza.Per confermare le sue proprietà anti-biofouling e anti-infezione, LOIS è stato applicato sulla superficie di impianti ortopedici per la sintesi ossea (placche e viti) e inserito in un modello di frattura di coniglio.Prima dell'impianto, l'impianto ortopedico nudo e il LOIS sono stati incubati in una sospensione batterica per 12 ore.La pre-incubazione garantisce la formazione di un biofilm sulla superficie dell'impianto esposto per il confronto.La Figura 1C mostra una foto del sito della frattura 4 settimane dopo l'impianto.A sinistra, un coniglio con un impianto ortopedico nudo presentava un grave livello di infiammazione dovuto alla formazione di un biofilm sulla superficie dell’impianto.Il risultato opposto è stato osservato nei conigli a cui era stato impiantato il LOIS, ovvero i tessuti circostanti il ​​LOIS non mostravano né segni di infezione né segni di infiammazione.Inoltre, l'immagine ottica a sinistra indica il sito chirurgico del coniglio con l'impianto esposto, indicando che sulla superficie del LOIS non sono stati trovati adesivi multipli presenti sulla superficie dell'impianto esposto.Ciò dimostra che LOIS ha stabilità a lungo termine e ha la capacità di mantenere le sue proprietà anti-incrostazione e anti-adesione.
(A) Diagramma schematico del LOIS e del suo impianto in un modello di frattura femorale di coniglio.(B) Immagine al microscopio a fluorescenza di biofilm proteico e batterico su superficie nuda e substrato LOIS.4 settimane dopo l'impianto, (C) un'immagine fotografica del sito della frattura e (D) un'immagine radiografica (evidenziata da un rettangolo rosso).Immagine gentilmente concessa: Kyomin Chae, Università di Yonsei.
I conigli sterilizzati ed esposti con impianto negativo hanno mostrato un normale processo di guarigione ossea senza alcun segno di infiammazione o infezione.D’altro canto, gli impianti SHP preincubati in una sospensione batterica presentano un’infiammazione correlata all’infezione sui tessuti circostanti.Ciò può essere attribuito alla sua incapacità di inibire l'adesione batterica per lungo tempo (Figura S2).Per dimostrare che la LOIS non influenza il processo di guarigione, ma inibisce possibili infezioni legate all'impianto, sono state confrontate le immagini a raggi X della matrice positiva esposta e la LOIS nel sito della frattura (Figura 1D).L'immagine radiografica dell'impianto nudo positivo mostrava linee di osteolisi persistenti, indicando che l'osso non era completamente guarito.Ciò suggerisce che il processo di recupero osseo potrebbe essere notevolmente ritardato a causa dell’infiammazione correlata all’infezione.Al contrario, ha dimostrato che i conigli impiantati con LOIS erano guariti e non mostravano alcun sito di frattura evidente.
Sono stati compiuti molti sforzi per sviluppare impianti medici con stabilità e funzionalità a lungo termine (compresa la resistenza al biofouling).Tuttavia, la presenza di varie sostanze biologiche e la dinamica dell'adesione dei tessuti limitano lo sviluppo di metodi clinicamente affidabili.Per superare queste carenze, abbiamo sviluppato una struttura micro/nanostratificata e una superficie chimicamente modificata, ottimizzata grazie all'elevata forza capillare e all'affinità chimica per mantenere il lubrificante più liscio nella massima misura.La Figura 2A mostra il processo di produzione complessivo di LOIS.Innanzitutto, preparare un substrato in acciaio inossidabile (SS) 304 di grado medico.In secondo luogo, la micro/nanostruttura viene formata sul substrato SS mediante attacco chimico utilizzando una soluzione di acido fluoridrico (HF).Per ripristinare la resistenza alla corrosione dell'SS, viene utilizzata una soluzione di acido nitrico (HNO3) (31) per trattare il substrato inciso.La passivazione migliora la resistenza alla corrosione del substrato SS e rallenta significativamente il processo di corrosione che può ridurre le prestazioni complessive del LOIS.Quindi, formando un monostrato autoassemblato (SAM) con 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroottiltrietossisilano (POTS), la superficie viene modificata chimicamente per migliorare l'interazione chimica tra la superficie e il lubrificante liscio Affinity.La modifica superficiale riduce significativamente l'energia superficiale della superficie strutturata su micro/nanoscala fabbricata, che corrisponde all'energia superficiale del lubrificante liscio.Ciò consente al lubrificante di essere completamente bagnato, formando così uno strato lubrificante stabile sulla superficie.La superficie modificata presenta una maggiore idrofobicità.I risultati mostrano che il lubrificante scivoloso mostra un comportamento stabile su LOIS a causa dell'elevata affinità chimica e della forza capillare causata dalla micro/nanostruttura (32, 33).Sono stati studiati i cambiamenti ottici sulla superficie dell'SS dopo la modifica della superficie e l'iniezione di lubrificante.La struttura micro/nanostratificata formata sulla superficie può provocare alterazioni visive e scurire la superficie.Questo fenomeno è attribuito al maggiore effetto di diffusione della luce sulla superficie ruvida, che aumenta la riflessione diffusa causata dal meccanismo di intrappolamento della luce (34).Inoltre, dopo l'iniezione del lubrificante, il LOIS diventa più scuro.Lo strato lubrificante fa sì che meno luce venga riflessa dal substrato, oscurando così il LOIS.Al fine di ottimizzare la microstruttura/nanostruttura per mostrare l'angolo di scorrimento (SA) più piccolo per ottenere prestazioni anti-biofouling, sono stati utilizzati la microscopia elettronica a scansione (SEM) e coppie atomiche per eseguire diversi tempi di attacco HF (0, 3)., 15 e 60 minuti) Microscopio a forza (AFM) (Figura 2B).Le immagini SEM e AFM mostrano che dopo un breve periodo di incisione (3 minuti di incisione), il substrato nudo ha formato una rugosità irregolare su scala nanometrica.La rugosità superficiale cambia con il tempo di incisione (Figura S3).La curva variabile nel tempo mostra che la rugosità superficiale continua ad aumentare e raggiunge un picco a 15 minuti di attacco, quindi si osserva solo una leggera diminuzione del valore di rugosità a 30 minuti di attacco.A questo punto, la rugosità a livello nanometrico viene incisa, mentre la rugosità a livello micro si sviluppa vigorosamente, rendendo il cambiamento di rugosità più stabile.Dopo un attacco di oltre 30 minuti si osserva un ulteriore aumento della rugosità che viene spiegato in dettaglio come segue: l'SS è composto da acciaio, legato con elementi tra cui ferro, cromo, nichel, molibdeno e molti altri elementi.Tra questi elementi, ferro, cromo e molibdeno svolgono un ruolo importante nella formazione di rugosità su scala micron/nano sulle SS mediante attacco HF.Nelle prime fasi della corrosione, ferro e cromo vengono corrosi principalmente perché il molibdeno ha una resistenza alla corrosione maggiore rispetto al molibdeno.Man mano che l'attacco procede, la soluzione di attacco raggiunge una sovrasaturazione locale, formando fluoruri e ossidi causati dall'attacco.Il fluoro e l'ossido precipitano e alla fine si ridepositano sulla superficie, formando una rugosità superficiale nell'ordine dei micron/nano (31).Questa rugosità a livello micro/nano gioca un ruolo importante nelle proprietà di auto-riparazione del LOIS.La superficie a doppia scala produce un effetto sinergico, aumentando notevolmente la forza capillare.Questo fenomeno consente al lubrificante di penetrare stabilmente nella superficie e contribuisce alle proprietà autoriparanti (35).La formazione della rugosità dipende dal tempo di attacco.Dopo 10 minuti di attacco, la superficie contiene solo rugosità su scala nanometrica, che non è sufficiente a trattenere abbastanza lubrificante per avere resistenza al biofouling (36).D'altra parte, se il tempo di incisione supera i 30 minuti, la rugosità su scala nanometrica formata dalla rideposizione di ferro e cromo scomparirà e rimarrà solo la rugosità su scala microscopica dovuta al molibdeno.La superficie sovraincisa è priva di ruvidità su scala nanometrica e perde l'effetto sinergico della ruvidità a due stadi, che influisce negativamente sulle caratteristiche di autoriparazione di LOIS.Le misurazioni SA sono state eseguite su substrati con tempi di attacco diversi per dimostrare le prestazioni antivegetative.Sono stati selezionati vari tipi di liquidi in base alla viscosità e all'energia superficiale, tra cui acqua deionizzata (DI), sangue, glicole etilenico (EG), etanolo (EtOH) ed esadecano (HD) (Figura S4).Il modello di attacco variabile nel tempo mostra che per vari liquidi con diverse energie superficiali e viscosità, la SA di LOIS dopo 15 minuti di attacco è la più bassa.Pertanto, LOIS è ottimizzato per incidere per 15 minuti per formare rugosità su scala micron e nanometrica, adatta a mantenere efficacemente la durabilità del lubrificante e le eccellenti proprietà antivegetative.
(A) Diagramma schematico del processo di produzione in quattro fasi di LOIS.L'inserto mostra il SAM formato sul substrato.(B) Immagini SEM e AFM, utilizzate per ottimizzare la micro/nanostruttura del substrato in diversi tempi di attacco.Spettri di spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) di (C) Cr2p e (D) F1 dopo passivazione superficiale e rivestimento SAM.au, unità arbitraria.(E) Immagini rappresentative di gocce d'acqua su substrati nudi, incisi, SHP e LOIS.(F) Misurazione dell'angolo di contatto (CA) e SA di liquidi con diverse tensioni superficiali su SHP e LOIS.I dati sono espressi come media ± DS.
Quindi, per confermare il cambiamento nelle proprietà chimiche della superficie, è stata utilizzata la spettroscopia fotoelettronica a raggi X (XPS) per studiare il cambiamento nella composizione chimica della superficie del substrato dopo ogni rivestimento superficiale.La Figura 2C mostra i risultati della misurazione XPS della superficie incisa con HF e della superficie trattata con HNO 3.I due picchi principali a 587,3 e 577,7 eV possono essere attribuiti al legame Cr-O esistente nello strato di ossido di cromo, che è la differenza principale rispetto alla superficie incisa con HF.Ciò è dovuto principalmente al consumo di fluoruro di ferro e cromo sulla superficie da parte di HNO3.L'attacco a base di HNO3 consente al cromo di formare uno strato di ossido passivante sulla superficie, che rende l'SS inciso nuovamente resistente alla corrosione.Nella Figura 2D, sono stati ottenuti spettri XPS per confermare che sulla superficie si è formato silano a base di fluorocarburi dopo il rivestimento SAM, che ha una repellenza ai liquidi estremamente elevata anche per EG, sangue ed EtOH.Il rivestimento SAM viene completato facendo reagire gruppi funzionali silanici con gruppi idrossilici formati mediante trattamento al plasma.Di conseguenza, è stato osservato un aumento significativo dei picchi CF2 e CF3.L'energia di legame compresa tra 286 e 296 eV indica che la modifica chimica è stata completata con successo dal rivestimento SAM.SHP mostra picchi CF2 (290,1 ​​eV) e CF3 (293,3 eV) relativamente ampi, causati dal silano a base di fluorocarburi formato sulla superficie.La Figura 2E mostra immagini ottiche rappresentative delle misurazioni dell'angolo di contatto (CA) per diversi gruppi di acqua deionizzata a contatto con acqua nuda, incisa, SHP e LOIS.Queste immagini mostrano che la superficie incisa diventa idrofila a causa della micro/nanostruttura formata dall'attacco chimico in modo che l'acqua deionizzata venga assorbita nella struttura.Tuttavia, quando il substrato è rivestito con SAM, il substrato mostra una forte idrorepellenza, quindi si forma una SHP superficiale e l'area di contatto tra l'acqua e la superficie è piccola.Infine, nel LOIS è stata osservata una diminuzione del CA, che può essere attribuita alla penetrazione del lubrificante nella microstruttura, aumentando così l'area di contatto.Per dimostrare che la superficie ha un'eccellente repellenza ai liquidi e proprietà non adesive, il LOIS è stato confrontato con il substrato SHP misurando CA e SA utilizzando vari liquidi (Figura 2F).Sono stati selezionati vari tipi di liquidi in base alla viscosità e all'energia superficiale, tra cui acqua deionizzata, sangue, EG, EtOH e HD (Figura S4).I risultati della misurazione CA mostrano che quando CA tende a HD, il valore di riduzione di CA, dove CA ha l'energia superficiale più bassa.Inoltre, la LOIS dell’AC complessiva è bassa.Tuttavia, la misurazione SA mostra un fenomeno completamente diverso.Ad eccezione dell'acqua ionizzata, tutti i liquidi aderiscono al substrato del piccolo idroelettrico senza scivolare via.D'altra parte, LOIS mostra un SA molto basso, dove quando tutto il liquido è inclinato di un angolo inferiore a 10°-15°, tutto il liquido rotolerà via.Ciò dimostra chiaramente che la non adesività del LOIS è migliore di quella della superficie SHP.Inoltre, i rivestimenti LOIS vengono applicati anche a vari tipi di materiali, tra cui titanio (Ti), polifenilsulfone (PPSU), poliossimetilene (POM), polietere etere chetone (PEEK) e polimeri bioassorbibili (PLGA). Sono materiali ortopedici impiantabili (Figura S5)).Le immagini sequenziali delle goccioline sul materiale trattato da LOIS mostrano che le proprietà anti-biofouling di LOIS sono le stesse su tutti i substrati.Inoltre, i risultati delle misurazioni di CA e SA mostrano che le proprietà non adesive di LOIS possono essere applicate ad altri materiali.
Per confermare le proprietà antivegetative di LOIS, vari tipi di substrati (compresi bare, acidati, SHP e LOIS) sono stati incubati con Pseudomonas aeruginosa e MRSA.Questi due batteri sono stati selezionati come batteri ospedalieri rappresentativi, che possono portare alla formazione di biofilm, che portano alle SSI (37).La Figura 3 (A e B) mostra le immagini al microscopio a fluorescenza e i risultati della misurazione dell'unità formante colonie (CFU) dei substrati incubati nella sospensione batterica rispettivamente per il breve termine (12 ore) e il lungo termine (72 ore).In un breve periodo di tempo, i batteri formeranno grappoli e aumenteranno di dimensioni, ricoprendosi di sostanze simili al muco e impedendone la rimozione.Tuttavia, durante l'incubazione di 72 ore, i batteri matureranno e diventeranno facili da disperdere per formare più colonie o grappoli.Pertanto, si può considerare che l'incubazione di 72 ore sia a lungo termine e sia il tempo di incubazione appropriato per formare un forte biofilm sulla superficie (38).In un breve periodo di tempo, la superficie mordenzata e la superficie dell'SHP hanno mostrato un'adesione batterica, che è stata ridotta dal 25% al ​​50% circa rispetto al substrato nudo.Tuttavia, grazie alle sue eccellenti prestazioni anti-biofouling e stabilità, LOIS non ha mostrato adesione al biofilm batterico a breve e lungo termine.Il diagramma schematico (Figura 3C) descrive la spiegazione del meccanismo di incrostazione antibiologica della soluzione di attacco, SHP e LOIS.Il presupposto è che il substrato inciso con proprietà idrofile avrà un'area superficiale maggiore rispetto al substrato nudo.Pertanto, si verificherà una maggiore adesione batterica sul substrato mordenzato.Tuttavia, rispetto al substrato nudo, il substrato mordenzato presenta una quantità significativamente inferiore di biofilm formato sulla superficie.Questo perché le molecole d'acqua si legano saldamente alla superficie idrofila e agiscono come un lubrificante per l'acqua, interferendo così con l'adesione dei batteri a breve termine (39).Tuttavia, lo strato di molecole d'acqua è molto sottile e solubile nelle sospensioni batteriche.Pertanto, lo strato molecolare dell'acqua scompare per lungo tempo, portando ad un'ampia adesione e proliferazione batterica.Nel caso del piccolo idroelettrico, grazie alle sue proprietà non bagnanti a breve termine, l'adesione batterica viene inibita.La ridotta adesione batterica può essere attribuita alle sacche d'aria intrappolate nella struttura stratificata e alla minore energia superficiale, riducendo così al minimo il contatto tra la sospensione batterica e la superficie.Tuttavia, è stata osservata un'estesa adesione batterica nel piccolo idroelettrico perché ha perso le sue proprietà antivegetative per lungo tempo.Ciò è dovuto principalmente alla scomparsa delle sacche d'aria dovute alla pressione idrostatica e alla dissoluzione dell'aria nell'acqua.Ciò è dovuto principalmente alla scomparsa delle sacche d'aria dovute alla dissoluzione e alla struttura a strati che fornisce una maggiore superficie di adesione (27, 40).A differenza di questi due substrati che hanno un effetto importante sulla stabilità a lungo termine, il lubrificante contenuto in LOIS viene iniettato nella micro/nanostruttura e non scomparirà nemmeno a lungo termine.I lubrificanti riempiti con micro/nanostrutture sono molto stabili e grazie alla loro elevata affinità chimica sono fortemente attratti dalla superficie, impedendo così a lungo l'adesione batterica.La Figura S6 mostra un'immagine al microscopio confocale a riflessione di un substrato infuso con lubrificante immerso in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).Immagini continue mostrano che anche dopo 120 ore di leggera agitazione (120 giri/min), lo strato lubrificante sul LOIS rimane invariato, indicando stabilità a lungo termine in condizioni di flusso.Ciò è dovuto all'elevata affinità chimica tra il rivestimento SAM a base di fluoro e il lubrificante a base di perfluorocarburo, in modo che possa formarsi uno strato lubrificante stabile.Pertanto, le prestazioni antivegetative vengono mantenute.Inoltre, il substrato è stato testato contro le proteine ​​rappresentative (albumina e fibrinogeno) presenti nel plasma, contro le cellule strettamente legate alla funzione immunitaria (macrofagi e fibroblasti) e contro quelle legate alla formazione ossea.Il contenuto di calcio è molto elevato.(Figura 3D, 1 e 2 e Figura S7) (41, 42).Inoltre, le immagini al microscopio a fluorescenza del test di adesione per fibrinogeno, albumina e calcio hanno mostrato diverse caratteristiche di adesione di ciascun gruppo di substrato (Figura S8).Durante la formazione dell'osso, strati ossei e di calcio neoformati possono circondare l'impianto ortopedico, il che non solo rende difficile la rimozione, ma può anche causare danni imprevisti al paziente durante il processo di rimozione.Pertanto, bassi livelli di depositi di calcio sulle placche ossee e sulle viti sono vantaggiosi per la chirurgia ortopedica che richiede la rimozione dell’impianto.Sulla base della quantificazione dell'area attaccata in base all'intensità della fluorescenza e al conteggio delle cellule, abbiamo confermato che LOIS mostra eccellenti proprietà anti-biofouling per tutte le sostanze biologiche rispetto ad altri substrati.Secondo i risultati degli esperimenti in vitro, il LOIS anti-biologico può essere applicato agli impianti ortopedici, che non solo possono inibire le infezioni causate dai batteri del biofilm, ma anche ridurre l'infiammazione causata dal sistema immunitario attivo del corpo.
(A) Immagini al microscopio a fluorescenza di ciascun gruppo (nudo, inciso, SHP e LOIS) incubate in sospensioni di Pseudomonas aeruginosa e MRSA per 12 e 72 ore.(B) Il numero di CFU aderenti di Pseudomonas aeruginosa e MRSA sulla superficie di ciascun gruppo.(C) Diagramma schematico del meccanismo di incrostazione antibiologica dell'attacco a breve e lungo termine, SHP e LOIS.(D) (1) Il numero di fibroblasti aderiti a ciascun substrato e le immagini al microscopio a fluorescenza delle cellule aderivano al nudo e al LOIS.(2) Test di adesione di proteine ​​immuno-correlate, albumina e calcio coinvolti nel processo di guarigione ossea (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 e **** P <0,0001).ns, non importante.
In caso di inevitabili sollecitazioni concentrate, la durabilità meccanica è sempre stata la sfida principale per l’applicazione delle vernici antivegetative.I tradizionali metodi di gel antidepurazione si basano su polimeri con bassa solubilità in acqua e fragilità.Pertanto, sono generalmente suscettibili allo stress meccanico nelle applicazioni biomediche.Pertanto, i rivestimenti antivegetativi meccanicamente durevoli rimangono una sfida per applicazioni come gli impianti ortopedici (43, 44).La Figura 4A(1) illustra i due principali tipi di stress applicati agli impianti ortopedici, inclusi il graffio (stress di taglio) e la compressione con l'immagine ottica dell'impianto danneggiato prodotta dal forcipe.Ad esempio, quando la vite viene serrata con un cacciavite o quando il chirurgo tiene saldamente la placca ossea con una pinzetta e applica una forza di compressione, la placca ossea in plastica verrà danneggiata e graffiata sia su scala macro che micro/nano (Figura 4A, 2).Per verificare se il LOIS prodotto può resistere a questi danni durante la chirurgia plastica, è stata eseguita la nanoindentazione per confrontare la durezza del substrato nudo e il LOIS su scala micro/nano per studiare le proprietà meccaniche dell'impatto della micro/nanostruttura (Figura 4B).Il diagramma schematico mostra il diverso comportamento deformativo del LOIS dovuto alla presenza di micro/nanostrutture.È stata tracciata una curva forza-spostamento in base ai risultati della nanoindentazione (Figura 4C).L'immagine blu rappresenta il substrato nudo, che mostra solo una leggera deformazione, come si vede dalla profondità di indentazione massima di 0,26 μm.D’altra parte, il graduale aumento della forza di nanoindentazione e dello spostamento osservato nel LOIS (curva rossa) può mostrare segni di proprietà meccaniche ridotte, risultando in una profondità di nanoindentazione di 1,61μm.Questo perché la micro/nanostruttura presente nel LOIS prevede uno spazio di avanzamento più profondo per la punta del nanoindentatore, quindi la sua deformazione è maggiore di quella del substrato nudo.Konsta-Gdoutos et al.(45) ritiene che, a causa della presenza di nanostrutture, la nanoindentazione e la micro/nanorugosità portino a curve di nanoindentazione irregolari.L'area ombreggiata corrisponde alla curva di deformazione irregolare attribuita alla nanostruttura, mentre l'area non ombreggiata è attribuita alla microstruttura.Questa deformazione può danneggiare la microstruttura/nanostruttura del lubrificante di tenuta e influire negativamente sulle sue prestazioni antivegetative.Per studiare l’impatto del danno sul LOIS, il danno inevitabile alle micro/nanostrutture è stato replicato nel corpo durante la chirurgia plastica.Utilizzando test di adesione del sangue e delle proteine, è possibile determinare la stabilità delle proprietà anti-biofouling di LOIS dopo in vitro (Figura 4D).Una serie di immagini ottiche mostra il danno che si è verificato in prossimità dei fori di ciascun substrato.È stato eseguito un test di adesione del sangue per dimostrare l'effetto del danno meccanico sul rivestimento anti-biofouling (Figura 4E).Come SHP, le proprietà antivegetative vengono perse a causa dei danni e LOIS mostra eccellenti proprietà antivegetative respingendo il sangue.Questo perché, poiché l'energia superficiale è guidata dall'azione capillare che copre l'area danneggiata, il flusso nel lubrificante microstrutturato ripristina le proprietà antivegetative (35).La stessa tendenza è stata osservata nel test di adesione proteica utilizzando l'albumina.Nell'area danneggiata, l'adesione delle proteine ​​sulla superficie del SHP è ampiamente osservata e, misurando la sua copertura dell'area, può essere quantificata come la metà del livello di adesione del substrato nudo.D'altra parte, LOIS ha mantenuto le sue proprietà anti-biofouling senza causare adesione (Figura 4, F e G).Inoltre la superficie della vite è spesso sottoposta a forti stress meccanici, come la perforazione, per questo abbiamo studiato la capacità del rivestimento LOIS di rimanere intatto sulla vite in vitro.La Figura 4H mostra immagini ottiche di diverse viti, comprese quelle nude, SHP e LOIS.Il rettangolo rosso rappresenta l'area target in cui si verifica un forte stress meccanico durante l'impianto osseo.Similmente al test di adesione proteica della piastra, viene utilizzato un microscopio a fluorescenza per visualizzare l'adesione proteica e misurare l'area di copertura per dimostrare l'integrità del rivestimento LOIS, anche sotto forte stress meccanico (Figura 4, I e J).Le viti trattate con LOIS mostrano eccellenti prestazioni antivegetative e quasi nessuna proteina aderisce alla superficie.D’altro canto, l’adesione proteica è stata osservata nelle viti nude e nelle viti SHP, dove la copertura dell’area delle viti SHP era un terzo di quella delle viti nude.Inoltre, l'impianto ortopedico utilizzato per il fissaggio deve essere meccanicamente resistente per resistere allo stress applicato al sito della frattura, come mostrato nella Figura 4K.Pertanto, è stato eseguito un test di flessione per determinare l'effetto della modifica chimica sulle proprietà meccaniche.Inoltre, questo viene fatto per mantenere lo stress fisso dell'impianto.Applicare la forza meccanica verticale fino a quando l'impianto non è completamente piegato e si ottiene una curva sforzo-deformazione (Figura 4L, 1).Due proprietà, tra cui il modulo di Young e la resistenza alla flessione, sono state confrontate tra substrati nudi e LOIS come indicatori della loro resistenza meccanica (Figura 4L, 2 e 3).Il modulo di Young indica la capacità di un materiale di resistere a cambiamenti meccanici.Il modulo di Young di ciascun substrato è rispettivamente 41,48±1,01 e 40,06±0,96 GPa;la differenza osservata è di circa il 3,4%.Inoltre, è stato riportato che la resistenza alla flessione, che determina la tenacità del materiale, è 102,34±1,51 GPa per il substrato nudo e 96,99±0,86 GPa per SHP.Il substrato nudo è più alto di circa il 5,3%.La leggera diminuzione delle proprietà meccaniche può essere causata dall'effetto intaglio.Nell'effetto notch, la micro/nano rugosità può agire come un insieme di intagli, portando alla concentrazione locale dello stress e influenzando le proprietà meccaniche dell'impianto (46).Tuttavia, sulla base del fatto che la rigidità dell'osso corticale umano è compresa tra 7,4 e 31,6 GPa e che il modulo LOIS misurato supera quello dell'osso corticale umano (47), il LOIS è sufficiente a supportare la frattura e il suo complesso. le proprietà meccaniche sono minimamente influenzate dalla modificazione della superficie.
(A) Diagramma schematico di (1) lo stress meccanico applicato all'impianto ortopedico durante l'operazione e (2) l'immagine ottica dell'impianto ortopedico danneggiato.(B) Diagramma schematico della misurazione delle proprietà nanomeccaniche mediante nanoindentazione e LOIS sulla superficie nuda.(C) Curva di spostamento della forza di nanoindentazione della superficie nuda e LOIS.(D) Dopo gli esperimenti in vitro, simulare le immagini ottiche di diversi tipi di piastre ortopediche (l'area danneggiata è evidenziata con un rettangolo rosso) per simulare lo stress meccanico causato durante l'operazione.(E) Test di adesione del sangue e (F) test di adesione delle proteine ​​del gruppo di piastre ortopediche danneggiate.(G) Misurare la copertura dell'area della proteina aderente alla piastra.(H) Immagini ottiche di diversi tipi di viti ortopediche dopo l'esperimento in vitro.(I) Test di adesione proteica per studiare l'integrità di diversi rivestimenti.(J) Misurare la copertura dell'area della proteina aderente alla vite.(K) Il movimento del coniglio ha lo scopo di generare uno stress fisso sull'osso fratturato.(L) (1) Risultati del test di piegatura e immagini ottiche prima e dopo la piegatura.La differenza nel (2) modulo di Young e (3) resistenza alla flessione tra impianto nudo e SHP.I dati sono espressi come media ± DS (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 e ****P<0,0001).Immagine gentilmente concessa: Kyomin Chae, Università di Yonsei.
In situazioni cliniche, la maggior parte del contatto batterico con materiali biologici e siti di ferita proviene da biofilm maturi e maturi (48).Pertanto, i Centri statunitensi per il controllo e la prevenzione delle malattie stimano che il 65% di tutte le infezioni umane siano legate ai biofilm (49).In questo caso, è necessario fornire un disegno sperimentale in vivo che fornisca una formazione coerente di biofilm sulla superficie dell'impianto.Pertanto, abbiamo sviluppato un modello di frattura femorale di coniglio in cui gli impianti ortopedici sono stati pre-incubati in una sospensione batterica e quindi impiantati nei femori di coniglio per studiare le proprietà antivegetative del LOIS in vivo.A causa dei seguenti tre fattori importanti, le infezioni batteriche sono indotte dalla pre-coltura piuttosto che dall'iniezione diretta di sospensioni batteriche: (i) Il sistema immunitario dei conigli è naturalmente più forte di quello degli esseri umani;è quindi possibile l'iniezione di sospensioni batteriche e batteri planctonici. Non ha alcun effetto sulla formazione di biofilm.(Ii) I batteri planctonici sono più sensibili agli antibiotici e gli antibiotici vengono solitamente utilizzati dopo l'intervento chirurgico;infine, (iii) la sospensione di batteri planctonici può essere diluita nei fluidi corporei dell'animale (50).Pre-coltivando l'impianto in una sospensione batterica prima dell'impianto, possiamo studiare a fondo gli effetti dannosi dell'infezione batterica e della reazione da corpo estraneo (FBR) sul processo di guarigione ossea.I conigli sono stati sacrificati 4 settimane dopo l'impianto, poiché l'osteointegrazione essenziale per il processo di guarigione dell'osso sarà completata entro 4 settimane.Quindi, gli impianti sono stati rimossi dai conigli per studi successivi.La Figura 5A mostra il meccanismo di proliferazione dei batteri.L'impianto ortopedico infetto viene introdotto nel corpo.Come risultato della pre-incubazione in sospensione batterica, sei dei sei conigli a cui erano stati impiantati impianti nudi erano infetti, mentre nessuno dei conigli a cui erano stati impiantati impianti trattati con LOIS era infetto.Le infezioni batteriche procedono in tre fasi, tra cui crescita, maturazione e dispersione (51).Innanzitutto, i batteri attaccati si riproducono e crescono sulla superficie, quindi i batteri formano un biofilm quando espellono il polimero extracellulare (EPS), l'amiloide e il DNA extracellulare.Il biofilm non solo interferisce con la penetrazione degli antibiotici, ma promuove anche l’accumulo di enzimi che degradano gli antibiotici (come la β-lattamasi) (52).Infine, il biofilm diffonde i batteri maturi nei tessuti circostanti.Pertanto, si verifica l'infezione.Inoltre, quando un corpo estraneo entra nel corpo, un’infezione che può causare una forte risposta immunitaria può causare grave infiammazione, dolore e diminuzione dell’immunità.La Figura 5B fornisce una panoramica dell'FBR causato dall'inserimento di un impianto ortopedico, piuttosto che della risposta immunitaria causata da un'infezione batterica.Il sistema immunitario riconosce l'impianto inserito come un corpo estraneo e quindi fa reagire le cellule e i tessuti per incapsulare il corpo estraneo (53).Agli albori della FBR, sulla superficie degli impianti ortopedici si formava una matrice di approvvigionamento che provocava l'adsorbimento del fibrinogeno.Il fibrinogeno adsorbito forma quindi una rete di fibrina altamente densa, che favorisce l'adesione dei leucociti (54).Una volta formata la rete di fibrina, si verificherà un'infiammazione acuta dovuta all'infiltrazione di neutrofili.In questa fase, vengono rilasciate una varietà di citochine come il fattore di necrosi tumorale α (TNF-α), l’interleuchina-4 (IL-4) e IL-β e i monociti iniziano a infiltrarsi nel sito di impianto e a differenziarsi in cellule giganti.Fago (41, 55, 56).Ridurre l’FBR è sempre stata una sfida perché un FBR eccessivo può causare infiammazioni acute e croniche, che possono portare a complicazioni fatali.Per valutare l’impatto delle infezioni batteriche nei tessuti circostanti l’impianto nudo e il LOIS, sono state utilizzate la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e tricromica di Masson (MT).Per i conigli impiantati con substrati nudi, gravi infezioni batteriche sono progredite e i vetrini di tessuto H&E hanno mostrato chiaramente ascessi e necrosi causati dall'infiammazione.D'altra parte, la superficie LOIS anti-biofouling estremamente forte inibisce l'adesione batterica, quindi non mostra segni di infezione e riduce l'infiammazione (Figura 5C).I risultati della colorazione MT hanno mostrato la stessa tendenza.Tuttavia, la colorazione MT ha mostrato anche edema nei conigli impiantati con LOIS, indicando che sta per verificarsi il recupero (Figura 5D).Per studiare il grado di risposta immunitaria, è stata eseguita la colorazione immunoistochimica (IHC) utilizzando le citochine TNF-α e IL-6 correlate alla risposta immunitaria.Un impianto nudo negativo non esposto ai batteri è stato confrontato con un LOIS esposto ai batteri ma non infetto per studiare il processo di guarigione in assenza di infezione batterica.La Figura 5E mostra un'immagine ottica di un vetrino IHC che esprime TNF-α.L'area marrone rappresenta la risposta immunitaria, indicando che la risposta immunitaria nella LOIS è leggermente ridotta.Inoltre, l'espressione di IL-6 nel LOIS era significativamente inferiore all'espressione negativa del nudo sterile (Figura 5F).L'espressione della citochina è stata quantificata misurando l'area di colorazione dell'anticorpo corrispondente alla citochina (Figura 5G).Rispetto ai conigli esposti agli impianti negativi, i livelli di espressione dei conigli impiantati con LOIS erano inferiori, mostrando una differenza significativa.La diminuzione dell’espressione delle citochine indica che le proprietà anti-incrostazione stabili a lungo termine del LOIS non sono solo legate all’inibizione delle infezioni batteriche, ma anche alla diminuzione dell’FBR, che è indotto dai macrofagi che aderiscono al substrato (53, 57, 58).Pertanto, la ridotta risposta immunitaria dovuta alle proprietà di evasione immunitaria del LOIS può risolvere gli effetti collaterali dopo l’impianto, come un’eccessiva risposta immunitaria dopo la chirurgia plastica.
(A) Un diagramma schematico del meccanismo di formazione del biofilm e diffusione sulla superficie di un impianto ortopedico infetto.eDNA, DNA extracellulare.(B) Diagramma schematico della risposta immunitaria dopo l'inserimento dell'impianto ortopedico.(C) Colorazione H&E e (D) Colorazione MT dei tessuti circostanti degli impianti ortopedici con positivo nudo e LOIS.L'IHC delle citochine immuno-correlate (E) TNF-α e (F) IL-6 sono immagini colorate di conigli nudi negativi e impiantati con LOIS.(G) Quantificazione dell'espressione di citochine mediante misurazione della copertura dell'area (** P <0,01).
La biocompatibilità del LOIS e il suo effetto sul processo di guarigione ossea sono stati esaminati in vivo utilizzando l'imaging diagnostico [raggi X e tomografia microcomputerizzata (CT)] e l'IHC degli osteoclasti.La Figura 6A mostra il processo di guarigione ossea che coinvolge tre diverse fasi: infiammazione, riparazione e rimodellamento.Quando si verifica una frattura, le cellule infiammatorie e i fibroblasti penetrano nell’osso fratturato e iniziano a crescere nel tessuto vascolare.Durante la fase di riparazione, la crescita di tessuto vascolare si diffonde vicino al sito della frattura.Il tessuto vascolare fornisce i nutrienti per la formazione di nuovo osso, chiamato callo.La fase finale del processo di guarigione ossea è la fase di rimodellamento, in cui la dimensione del callo viene ridotta alla dimensione dell'osso normale con l'aiuto di un aumento del livello di osteoclasti attivati ​​(59).La ricostruzione tridimensionale (3D) del sito della frattura è stata eseguita utilizzando scansioni micro-CT per osservare le differenze nel livello di formazione del callo in ciascun gruppo.Osservare la sezione trasversale del femore per osservare lo spessore del callo che circonda l'osso fratturato (Figura 6, B e C).I raggi X sono stati utilizzati anche per esaminare ogni settimana i siti di frattura di tutti i gruppi per osservare i diversi processi di rigenerazione ossea in ciascun gruppo (Figura S9).Il callo e le ossa mature sono mostrati rispettivamente in blu/verde e avorio.La maggior parte dei tessuti molli vengono filtrati con una soglia preimpostata.Il nudo positivo e l'SHP hanno confermato la formazione di una piccola quantità di callo attorno al sito della frattura.D'altra parte, il negativo esposto di LOIS e il sito della frattura sono circondati da uno spesso callo.Le immagini micro-CT hanno mostrato che la formazione del callo era ostacolata dall’infezione batterica e dall’infiammazione correlata all’infezione.Questo perché il sistema immunitario dà priorità alla guarigione delle lesioni settiche causate dall’infiammazione correlata all’infezione, piuttosto che al recupero osseo (60).Sono state eseguite la colorazione IHC e fosfatasi acida resistente al tartrato (TRAP) per osservare l'attività degli osteoclasti e il riassorbimento osseo (Figura 6D) (61).Solo pochi osteoclasti attivati ​​colorati di viola sono stati trovati nei positivi nudi e nell'SHP.D'altra parte, molti osteoclasti attivati ​​sono stati osservati vicino alle ossa nude positive e mature di LOIS.Questo fenomeno indica che, in presenza di osteoclasti, il callo attorno alla sede della frattura sta subendo un violento processo di rimodellamento (62).Sono stati misurati il ​​volume osseo e l'area di espressione degli osteoclasti del callo per confrontare il livello di formazione del callo attorno al sito di frattura in tutti i gruppi, in modo da quantificare la scansione micro-CT e i risultati IHC (Figura 6E, 1 e 2).Come previsto, i negativi nudi e la formazione di callo nel LOIS erano significativamente più alti rispetto agli altri gruppi, indicando che si era verificato un rimodellamento osseo positivo (63).La Figura S10 mostra l'immagine ottica del sito chirurgico, il risultato della colorazione MT del tessuto raccolto vicino alla vite e il risultato della colorazione TRAP che evidenzia l'interfaccia vite-osso.Nel substrato nudo è stata osservata una forte formazione di callo e fibrosi, mentre l'impianto trattato con LOIS mostrava una superficie relativamente non aderente.Allo stesso modo, rispetto ai negativi nudi, è stata osservata una fibrosi inferiore nei conigli impiantati con LOIS, come indicato dalle frecce bianche.Inoltre, l’edema solido (freccia blu) può essere attribuito alle proprietà di evasione immunitaria del LOIS, riducendo così l’infiammazione grave.La superficie antiaderente attorno all’impianto e la fibrosi ridotta suggeriscono che il processo di rimozione è più semplice, il che di solito provoca altre fratture o infiammazioni.Il processo di guarigione dell’osso dopo la rimozione della vite è stato valutato mediante l’attività degli osteoclasti sull’interfaccia vite-osso.Sia l’osso nudo che l’interfaccia dell’impianto LOIS hanno assorbito livelli simili di osteoclasti per favorire l’ulteriore guarigione ossea, indicando che il rivestimento LOIS non ha alcun effetto negativo sulla guarigione ossea o sulla risposta immunitaria.Per confermare che la modifica superficiale eseguita sul LOIS non interferisce con il processo di guarigione ossea, è stato utilizzato l'esame a raggi X per confrontare la guarigione ossea dei conigli con ioni negativi esposti e 6 settimane di impianto LOIS (Figura 6F).I risultati hanno mostrato che, rispetto al gruppo nudo positivo non infetto, il LOIS ha mostrato lo stesso grado di guarigione ossea e non vi erano segni evidenti di frattura (linea continua di osteolisi) in entrambi i gruppi.
(A) Diagramma schematico del processo di guarigione ossea dopo la frattura.(B) La differenza nel grado di formazione del callo di ciascun gruppo di superficie e (C) l'immagine in sezione trasversale del sito di frattura.(D) Colorazione TRAP per visualizzare l'attività degli osteoclasti e il riassorbimento osseo.Sulla base dell'attività TRAP, la formazione del callo esterno dell'osso corticale è stata analizzata quantitativamente mediante (E) (1) micro-CT e (2) attività degli osteoclasti.(F) 6 settimane dopo l'impianto, immagini a raggi X dell'osso fratturato del negativo esposto (evidenziato dal rettangolo tratteggiato rosso) e LOIS (evidenziato dal rettangolo tratteggiato blu).L'analisi statistica è stata eseguita mediante analisi della varianza a una via (ANOVA).*P<0,05.** P<0,01.
In breve, LOIS fornisce un nuovo tipo di strategia antibatterica contro le infezioni e un rivestimento immunitario per gli impianti ortopedici.Gli impianti ortopedici convenzionali con funzionalizzazione SHP mostrano proprietà anti-biofouling a breve termine, ma non possono mantenere le loro proprietà per lungo tempo.La superidrofobicità del substrato intrappola le bolle d'aria tra i batteri e il substrato, formando così sacche d'aria e prevenendo così l'infezione batterica.Tuttavia, a causa della diffusione dell’aria, queste sacche d’aria vengono facilmente rimosse.D’altro canto, LOIS ha ben dimostrato la sua capacità di prevenire le infezioni legate al biofilm.Pertanto, grazie alle proprietà anti-rigetto dello strato lubrificante iniettato nella superficie a micro/nanostruttura stratificata, è possibile prevenire l'infiammazione correlata alle infezioni.Vari metodi di caratterizzazione, tra cui misurazioni SEM, AFM, XPS e CA, vengono utilizzati per ottimizzare le condizioni di produzione LOIS.Inoltre, LOIS può essere applicato anche a vari materiali biologici comunemente utilizzati nelle apparecchiature di fissaggio ortopedico, come PLGA, Ti, PE, POM e PPSU.Successivamente, LOIS è stato testato in vitro per dimostrare le sue proprietà anti-biofouling contro batteri e sostanze biologiche legate alla risposta immunitaria.I risultati mostrano che ha eccellenti effetti antibatterici e anti-biofouling rispetto all’impianto nudo.Inoltre, LOIS mostra resistenza meccanica anche dopo aver applicato stress meccanici, cosa inevitabile nella chirurgia plastica.Grazie alle proprietà autoriparanti del lubrificante sulla superficie della micro/nanostruttura, LOIS ha mantenuto con successo le sue proprietà anti-biologiche incrostanti.Per studiare la biocompatibilità e le proprietà antibatteriche del LOIS in vivo, il LOIS è stato impiantato nel femore di coniglio per 4 settimane.Non è stata osservata alcuna infezione batterica nei conigli a cui è stato impiantato LOIS.Inoltre, l’uso dell’IHC ha dimostrato un livello ridotto di risposta immunitaria locale, indicando che LOIS non inibisce il processo di guarigione ossea.LOIS presenta eccellenti proprietà antibatteriche e di evasione immunitaria ed è stato dimostrato che previene efficacemente la formazione di biofilm prima e durante la chirurgia ortopedica, in particolare per la sintesi ossea.Utilizzando un modello di frattura femorale infiammatoria del midollo osseo di coniglio, è stato studiato approfonditamente l'effetto delle infezioni correlate al biofilm sul processo di guarigione ossea indotto dagli impianti pre-incubati.Come studio futuro, è necessario un nuovo modello in vivo per studiare le possibili infezioni dopo l’impianto per comprendere appieno e prevenire le infezioni legate al biofilm durante l’intero processo di guarigione.Inoltre, l’osteoinduzione rappresenta ancora una sfida irrisolta nell’integrazione con LOIS.Sono necessarie ulteriori ricerche per combinare l’adesione selettiva delle cellule osteoinduttive o la medicina rigenerativa con LOIS per superare la sfida.Nel complesso, LOIS rappresenta un promettente rivestimento per impianti ortopedici con robustezza meccanica ed eccellenti proprietà anti-biofouling, che possono ridurre le SSI e gli effetti collaterali sul sistema immunitario.
Lavare il substrato 304 SS da 15 mm x 15 mm x 1 mm (Dong Kang M-Tech Co., Corea) in acetone, EtOH e acqua DI per 15 minuti per rimuovere i contaminanti.Per formare una struttura a livello micro/nano sulla superficie, il substrato pulito viene immerso in una soluzione di HF dal 48% al 51% (DUKSAN Corp., Corea del Sud) a 50°C.Il tempo di attacco varia da 0 a 60 minuti.Quindi, il substrato mordenzato è stato pulito con acqua deionizzata e posto in una soluzione al 65% di HNO3 (Corea DUKSAN Corp.) a 50°C per 30 minuti per formare uno strato di passivazione di ossido di cromo sulla superficie.Dopo la passivazione, il substrato viene lavato con acqua deionizzata ed essiccato per ottenere un substrato con struttura a strati.Successivamente, il substrato è stato esposto al plasma di ossigeno (100 W, 3 minuti) e immediatamente immerso in una soluzione di POTS 8,88 mM (Sigma-Aldrich, Germania) in toluene a temperatura ambiente per 12 ore.Quindi, il substrato rivestito con POTS è stato pulito con EtOH e ricotto a 150°C per 2 ore per ottenere un denso SAM POTS.Dopo il rivestimento SAM, sul substrato è stato formato uno strato lubrificante applicando un lubrificante perfluoropolietere (Krytox 101; DuPont, USA) con un volume di carico di 20 μm/cm 2. Prima dell'uso, filtrare il lubrificante attraverso un filtro da 0,2 micron.Rimuovere il lubrificante in eccesso inclinando con un angolo di 45° per 15 minuti.La stessa procedura di produzione è stata utilizzata per gli impianti ortopedici realizzati in 304 SS (piastra di bloccaggio e vite di bloccaggio corticale; Dong Kang M-Tech Co., Corea).Tutti gli impianti ortopedici sono progettati per adattarsi alla geometria del femore del coniglio.
La morfologia superficiale del substrato e degli impianti ortopedici è stata ispezionata mediante emissione di campo SEM (Inspect F50, FEI, USA) e AFM (XE-100, Park Systems, Corea del Sud).La rugosità superficiale (Ra, Rq) viene misurata moltiplicando l'area di 20 μm per 20 μm (n=4).Per analizzare la composizione chimica della superficie è stato utilizzato un sistema XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Giappone) dotato di una sorgente di raggi X Al Kα con una dimensione dello spot di 100μm2.Per misurare CA e SA liquidi è stato utilizzato un sistema di misurazione CA dotato di una fotocamera per l'acquisizione dinamica di immagini (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Corea del Sud).Per ogni misurazione, vengono posizionati sulla superficie da 6 a 10 μl di goccioline (acqua deionizzata, sangue di cavallo, EG, etanolo al 30% e HD) per misurare la CA.Quando l'angolo di inclinazione del substrato aumenta ad una velocità di 2°/s (n = 4), la SA viene misurata quando la gocciolina cade.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] e MRSA (ATCC 25923) sono stati acquistati da ATCC (Manassas, Virginia, USA) e la coltura stock è stata mantenuta a -80°C.Prima dell'uso, la coltura congelata è stata incubata in brodo di soia scongelato con trypsin (Komed, Corea) a 37°C per 18 ore e quindi trasferita due volte per attivarla.Dopo l'incubazione, la coltura è stata centrifugata a 10.000 giri al minuto per 10 minuti a 4°C e lavata due volte con una soluzione PBS (pH 7,3).La coltura centrifugata viene quindi sottoposta a subcoltura su piastre di agar sangue (BAP).MRSA e Pseudomonas aeruginosa sono stati preparati durante la notte e coltivati ​​in brodo Luria-Bertani.La concentrazione di Pseudomonas aeruginosa e MRSA nell'inoculo è stata determinata quantitativamente dalle CFU della sospensione in diluizioni seriali su agar.Quindi, regolare la concentrazione batterica allo standard McFarland 0,5, che equivale a 108 CFU/ml.Quindi diluire la sospensione batterica di lavoro 100 volte a 106 CFU/ml.Per testare le proprietà di adesione antibatterica, il substrato è stato sterilizzato a 121°C per 15 minuti prima dell'uso.Il substrato è stato quindi trasferito in 25 ml di sospensione batterica e incubato a 37°C con vigorosa agitazione (200 giri al minuto) per 12 e 72 ore.Dopo l'incubazione, ciascun substrato è stato rimosso dall'incubatore e lavato 3 volte con PBS per rimuovere eventuali batteri galleggianti sulla superficie.Per osservare il biofilm sul substrato, il biofilm è stato fissato con metanolo e colorato con 1 ml di arancio crimidina per 2 minuti.Quindi è stato utilizzato un microscopio a fluorescenza (BX51TR, Olympus, Giappone) per scattare foto del biofilm colorato.Per quantificare il biofilm sul substrato, le cellule attaccate sono state separate dal substrato mediante il metodo del vortice, considerato il metodo più adatto per rimuovere i batteri attaccati (n = 4).Utilizzando una pinza sterile, rimuovere il substrato dal mezzo di crescita e toccare la piastra del pozzetto per rimuovere il liquido in eccesso.Le cellule attaccate liberamente sono state rimosse lavando due volte con PBS sterile.Ciascun substrato è stato quindi trasferito in una provetta sterile contenente 9 ml di soluzione salina proteica ept allo 0,1% (PSW) e 2 g di 20-25 sferette di vetro sterili (da 0,4 a 0,5 mm di diametro).È stato quindi agitato su vortex per 3 minuti per staccare le cellule dal campione.Dopo l'agitazione nel vortex, la sospensione è stata diluita in serie 10 volte con PSW allo 0,1% e quindi 0,1 ml di ciascuna diluizione sono stati inoculati su BAP.Dopo 24 ore di incubazione a 37°C, le CFU sono state contate manualmente.
Per le cellule sono stati utilizzati fibroblasti di topo NIH/3T3 (CRL-1658; ATCC americano) e macrofagi di topo RAW 264.7 (TIB-71; ATCC americano).Utilizzare il terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Corea) per coltivare fibroblasti di topo e integrare con siero di vitello al 10% (S103-01, Welgene) e penicillina-streptomicina all'1% (PS; LS202-02, Welgene (Welgene ). Utilizzare DMEM per coltivare macrofagi di topo, integrati con siero bovino fetale al 10% (S001-01, Welgene) e PS all'1%. Posizionare il substrato in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti e inoculare le cellule a 105 cellule/cm2. Le cellule sono state incubate per una notte a 37°C e al 5% di CO2. Per la colorazione cellulare, le cellule sono state fissate con paraformaldeide al 4% per 20 minuti e poste in Triton X allo 0,5%. Incubare per 5 minuti in -100 a 37°C per 30 minuti. Dopo il processo di incubazione, utilizzare il substrato con il mezzo di fissazione VECTASHIELD (n = 4 per cellula). , fluoresceina, isotiocianato-albumina di fluoresceina (A9771, Sigma-Aldrich, Germania) e plasma umano. Il fibrinogeno coniugato con Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, USA) è stato sciolto in PBS (10 mM, pH 7,4).Le concentrazioni di albumina e fibrinogeno erano rispettivamente di 1 e 150 μg/ml.Dopo il substrato Prima di immergerli nella soluzione proteica, sciacquarli con PBS per reidratare la superficie.Quindi immergere tutti i substrati in una piastra da sei pozzetti contenente la soluzione proteica e incubare a 37°C per 30 e 90 minuti.Dopo l'incubazione, il substrato è stato quindi rimosso dalla soluzione proteica, lavato delicatamente con PBS 3 volte e fissato con paraformaldeide al 4% (n = 4 per ciascuna proteina).Per il calcio, cloruro di sodio (0,21 M) e fosfato di potassio (3,77 mM) sono stati sciolti in acqua deionizzata.Il pH della soluzione è stato regolato a 2,0 aggiungendo una soluzione di cloridrato (1M).Quindi il cloruro di calcio (5,62 mM) è stato sciolto nella soluzione.Aggiungendo 1 M di tris(idrossimetil)-ammino metano si regola il pH della soluzione a 7,4.Immergere tutti i substrati in una piastra a sei pozzetti riempita con una soluzione di fosfato di calcio 1,5× e rimuoverli dalla soluzione dopo 30 minuti.Per la colorazione, 2 g di Alizarin Red S (CI 58005) Mescolare con 100 ml di acqua deionizzata.Quindi, utilizzare idrossido di ammonio al 10% per regolare il pH su 4. Tingere il substrato con una soluzione di rosso alizarina per 5 minuti, quindi scrollare di dosso il colorante in eccesso e asciugare.Dopo il processo di agitazione, rimuovere il substrato.Il materiale viene disidratato, quindi immerso in acetone per 5 minuti, quindi immerso in una soluzione acetone-xilene (1:1) per 5 minuti, ed infine lavato con xilene (n = 4).Viene utilizzato il microscopio a fluorescenza (Axio Imager) con lenti obiettivo ×10 e ×20..A2m, Zeiss, Germania) esegue l'immagine di tutti i substrati.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) è stato utilizzato per quantificare i dati di adesione delle sostanze biologiche su ciascun gruppo di quattro diverse aree di imaging.Converti tutte le immagini in immagini binarie con soglie fisse per il confronto del substrato.
Per monitorare la stabilità dello strato lubrificante nel PBS in modalità riflessione è stato utilizzato un microscopio confocale Zeiss LSM 700.Il campione di vetro rivestito con SAM a base di fluoro con uno strato lubrificante iniettato è stato immerso in una soluzione PBS e testato utilizzando un agitatore orbitale (SHO-1D; Daihan Scientific, Corea del Sud) in condizioni di blanda agitazione (120 giri/min).Quindi prelevare il campione e monitorare la perdita di lubrificante misurando la perdita di luce riflessa.Per acquisire immagini in fluorescenza in modalità riflessione, il campione viene esposto a un laser da 633 nm e quindi raccolto, poiché la luce verrà riflessa dal campione.I campioni sono stati misurati a intervalli di tempo di 0, 30, 60 e 120 ore.
Al fine di determinare l'influenza del processo di modificazione della superficie sulle proprietà nanomeccaniche degli impianti ortopedici, è stato utilizzato un nanoindentatore (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) dotato di una punta di diamante Berkovich a forma di piramide a tre lati per misurare il nanoindenedione.Il carico di picco è 10 mN e l'area è 100μmx 100μm.Per tutte le misurazioni, il tempo di carico e scarico è di 10 s e il tempo di mantenimento sotto carico di rientro di picco è di 2 s.Prendi le misurazioni da cinque posizioni diverse e calcola la media.Per valutare le prestazioni di resistenza meccanica sotto carico, è stata eseguita una prova di flessione trasversale a tre punti utilizzando una macchina di prova universale (Instron 5966, Instron, USA).Il substrato viene compresso ad una velocità costante di 10 N/s con un carico maggiore.Il programma software Bluehill Universal (n = 3) è stato utilizzato per calcolare il modulo di flessione e la massima sollecitazione di compressione.
Per simulare il processo operativo e il relativo danno meccanico causato durante l'operazione, il processo operativo è stato eseguito in vitro.I femori sono stati raccolti dai conigli bianchi neozelandesi giustiziati.Il femore è stato pulito e fissato in paraformaldeide al 4% per 1 settimana.Come descritto nel metodo dell'esperimento sugli animali, il femore fisso è stato operato chirurgicamente.Dopo l'operazione, l'impianto ortopedico è stato immerso nel sangue (sangue di cavallo, KISAN, Corea) per 10 secondi per confermare se si sono verificate aderenze del sangue dopo l'applicazione della lesione meccanica (n = 3).
Un totale di 24 conigli bianchi maschi neozelandesi (peso da 3,0 a 3,5 kg, età media 6 mesi) sono stati divisi casualmente in quattro gruppi: nudi negativi, nudi positivi, SHP e LOIS.Tutte le procedure che coinvolgono animali sono state eseguite in conformità con gli standard etici del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (approvato IACUC, KOREA-2017-0159).L'impianto ortopedico è costituito da una placca di bloccaggio con cinque fori (lunghezza 41 mm, larghezza 7 mm e spessore 2 mm) e viti di bloccaggio corticale (lunghezza 12 mm, diametro 2,7 mm) per la fissazione della frattura.Ad eccezione delle piastre e delle viti utilizzate nel gruppo bare-negative, tutte le piastre e le viti sono state incubate in sospensione di MRSA (106 CFU/ml) per 12 ore.Il gruppo nudo-negativo (n=6) è stato trattato con impianti a superficie nuda senza esposizione alla sospensione batterica, come controllo negativo per l'infezione.Il gruppo nudo positivo (n = 6) è stato trattato con un impianto a superficie nuda esposto ai batteri come controllo positivo per l'infezione.Il gruppo SHP (n = 6) è stato trattato con impianti SHP esposti ai batteri.Infine, il gruppo LOIS è stato trattato con impianti LOIS esposti ai batteri (n = 6).Tutti gli animali sono tenuti in gabbia e viene fornito loro molto cibo e acqua.Prima dell’operazione i conigli sono stati tenuti a digiuno per 12 ore.Gli animali sono stati anestetizzati mediante iniezione intramuscolare di xilazina (5 mg/kg) e iniezione endovenosa di paclitaxel (3 mg/kg) per l'induzione.Successivamente, fornire il 2% di isoflurano e il 50% al 70% di ossigeno medico (portata di flusso 2 L/min) attraverso il sistema respiratorio per mantenere l'anestesia.Viene impiantato attraverso un approccio diretto al femore laterale.Dopo la depilazione e la disinfezione della pelle con iodio povidone, è stata praticata un'incisione lunga circa 6 cm sulla parte esterna del femore medio sinistro.Aprendo lo spazio tra i muscoli che ricoprono il femore, il femore è completamente esposto.Posizionare la placca davanti alla diafisi femorale e fissarla con quattro viti.Dopo il fissaggio, utilizzare una lama da sega (spessore 1 mm) per creare artificialmente una frattura nell'area tra il secondo e il quarto foro.Al termine dell'intervento la ferita è stata lavata con soluzione salina e suturata.Ad ogni coniglio è stata iniettata per via sottocutanea enrofloxacina (5 mg/kg) diluita per un terzo in soluzione salina.Le radiografie postoperatorie del femore sono state eseguite in tutti gli animali (0, 7, 14, 21, 28 e 42 giorni) per confermare l'osteotomia dell'osso.Dopo l'anestesia profonda, tutti gli animali sono stati uccisi con KCl per via endovenosa (2 mmol/kg) a 28 e 42 giorni.Dopo l'esecuzione, il femore è stato scansionato mediante micro-CT per osservare e confrontare il processo di guarigione ossea e la formazione di nuovo osso tra i quattro gruppi.
Dopo l'esecuzione sono stati prelevati i tessuti molli che erano a diretto contatto con gli impianti ortopedici.Il tessuto è stato fissato in formalina tamponata neutra al 10% durante la notte e quindi disidratato in EtOH.Il tessuto disidratato è stato incluso in paraffina e sezionato ad uno spessore di 40 μm utilizzando un microtomo (400CS; EXAKT, Germania).Per visualizzare l'infezione, sono state eseguite la colorazione H&E e la colorazione MT.Per verificare la risposta dell'ospite, il tessuto sezionato è stato incubato con anticorpo primario anti-TNF-α di coniglio (AB6671, Abcam, USA) e anti-IL-6 di coniglio (AB6672; Abcam, USA), e quindi trattato con rafano.Ossidasi.Applicare il sistema di colorazione del complesso avidina-biotina (ABC) alle sezioni secondo le istruzioni del produttore.Per apparire come prodotto di reazione marrone, è stata utilizzata 3,3-diaminobenzidina in tutte le parti.Uno scanner per diapositive digitali (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungheria) è stato utilizzato per visualizzare tutte le sezioni e almeno quattro substrati in ciascun gruppo sono stati analizzati dal software ImageJ.
Sono state acquisite immagini radiografiche in tutti gli animali dopo l'intervento chirurgico e ogni settimana per monitorare la guarigione della frattura (n = 6 per gruppo).Dopo l'esecuzione, è stata utilizzata una micro-TC ad alta risoluzione per calcolare la formazione del callo attorno al femore dopo la guarigione.Il femore ottenuto è stato pulito, fissato in paraformaldeide al 4% per 3 giorni e disidratato in etanolo al 75%.Le ossa disidratate sono state quindi scansionate utilizzando la micro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgio) per generare immagini voxel 3D (2240×2240 pixel) del campione osseo.Utilizzare il filtro Al da 1,0 mm per ridurre il rumore del segnale e applicare un'alta risoluzione a tutte le scansioni (E = 133 kVp, I = 60 μA, tempo di integrazione = 500 ms).Il software Nrecon (versione 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgio) è stato utilizzato per generare un volume 3D del campione scansionato dalla proiezione laterale 2D acquisita.Per l'analisi, l'immagine ricostruita in 3D viene divisa in cubi di 10 mm×10 mm×10 mm in base al sito della frattura.Calcolare il callo esterno all'osso corticale.Il software DataViewer (versione 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgio) è stato utilizzato per reindirizzare digitalmente il volume osseo scansionato e il software CT-Analyzer (versione 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgio) è stato utilizzato per l'analisi.I relativi coefficienti di assorbimento dei raggi X nell'osso maturo e nel callo vengono distinti in base alla loro densità, quindi viene quantificato il volume del callo (n = 4).Per confermare che la biocompatibilità di LOIS non ritarda il processo di guarigione ossea, sono state eseguite ulteriori analisi a raggi X e micro-CT in due conigli: i gruppi nudo-negativo e LOIS.Entrambi i gruppi sono stati giustiziati nella sesta settimana.
I femori degli animali sacrificati sono stati raccolti e fissati in paraformaldeide al 4% per 3 giorni.L'impianto ortopedico viene quindi rimosso con attenzione dal femore.Il femore è stato decalcificato per 21 giorni utilizzando EDTA 0,5 M (EC-900, National Diagnostics Corporation).Quindi il femore decalcificato è stato immerso in EtOH per renderlo disidratato.Il femore disidratato è stato rimosso in xilene e incorporato in paraffina.Successivamente il campione è stato affettato con un microtomo rotativo automatico (Leica RM2255, Leica Biosystems, Germania) con uno spessore di 3 μm.Per la colorazione TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Germania), i campioni sezionati sono stati deparaffinati, reidratati e incubati nel reagente TRAP a 37°C per 1 ora.Le immagini sono state acquisite utilizzando uno scanner per diapositive (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungheria) e quantificate misurando la copertura dell'area macchiata.In ciascun esperimento, almeno quattro substrati in ciascun gruppo sono stati analizzati dal software ImageJ.
L'analisi della significatività statistica è stata eseguita utilizzando GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Per testare le differenze tra i gruppi di valutazione sono stati utilizzati il ​​t-test per dati non appaiati e l’analisi della varianza unidirezionale (ANOVA).Il livello di significatività è indicato nella figura come segue: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 e ****P<0,0001;NS, nessuna differenza significativa.
Per materiali supplementari per questo articolo, consultare http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
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I rivestimenti antibatterici e immunitari degli impianti ortopedici possono ridurre le infezioni e le risposte immunitarie causate dalle infezioni.
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