Potilaille, joille tehdään ortopedinen implanttileikkaus, bakteeri-infektiot ja infektioiden aiheuttamat immuunivasteet ovat aina olleet hengenvaarallisia riskejä.Perinteiset biologiset materiaalit ovat alttiita biologiselle kontaminaatiolle, mikä saa bakteerit tunkeutumaan loukkaantuneelle alueelle ja aiheuttamaan postoperatiivisen infektion.Siksi on kiireellisesti kehitettävä infektio- ja immuunivastepinnoitteita ortopedisille implanteille.Täällä olemme kehittäneet edistyneen pinnanmuokkausteknologian ortopedisille implanteille, nimeltään Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), joka on saanut inspiraationsa kannukasvien kannujen sileästä pinnasta.LOIS:lla on pitkäkestoinen ja vahva nestehylkivyys erilaisille nesteille ja biologisille aineille (mukaan lukien solut, proteiinit, kalsium ja bakteerit).Lisäksi vahvistimme mekaanisen kestävyyden naarmuja vastaan ​​ja kiinnitysvoiman simuloimalla väistämättömiä vaurioita in vitro -leikkauksen aikana.Kanin luuytimen tulehduksellisen reisiluun murtuman mallia käytettiin tutkimaan perusteellisesti LOIS:n antibiologista hilseilyä ja infektiokykyä.Näemme, että LOIS, jolla on antibiofouling-ominaisuudet ja mekaaninen kestävyys, on askel eteenpäin infektiovapaassa ortopedisessa kirurgiassa.
Nykyään yleisen ikääntymisen vuoksi ortopedisista sairauksista (kuten vanhusten murtumia, rappeuttavia nivelsairauksia ja osteoporoosia) kärsivien potilaiden määrä on lisääntynyt huomattavasti (1, 2).Siksi lääketieteelliset laitokset pitävät erittäin tärkeänä ortopedista kirurgiaa, mukaan lukien ruuvien, levyjen, naulojen ja tekonivelten ortopediset implantit (3, 4).Perinteisten ortopedisten implanttien on kuitenkin raportoitu olevan alttiita bakteerien tarttumiselle ja biofilmin muodostumiselle, mikä voi aiheuttaa kirurgisen paikan infektion (SSI) leikkauksen jälkeen (5, 6).Kun biokalvo on muodostunut ortopedisen implantin pinnalle, biofilmin poistaminen tulee erittäin vaikeaksi jopa suuria antibioottiannoksia käytettäessä.Siksi se johtaa yleensä vakaviin postoperatiivisiin infektioihin (7, 8).Edellä mainituista ongelmista johtuen infektoituneiden implanttien hoitoon tulisi sisältyä uusintaleikkaus, mukaan lukien kaikkien implanttien ja ympäröivien kudosten poistaminen;siksi potilas kärsii voimakkaasta kipusta ja riskeistä (9, 10).
Joidenkin näistä ongelmista ratkaisemiseksi on kehitetty lääkkeitä eluoivia ortopedisia implantteja, jotka estävät infektioita poistamalla pintaan kiinnittyneet bakteerit (11, 12).Strategialla on kuitenkin edelleen useita rajoituksia.Lääkkeitä eluoituvien implanttien pitkäaikaisen implantoinnin on raportoitu aiheuttaneen vaurioita ympäröiville kudoksille ja tulehdusta, joka voi johtaa nekroosiin (13, 14).Lisäksi orgaaniset liuottimet, joita saattaa esiintyä lääkkeitä eluoivien ortopedisten implanttien valmistusprosessin jälkeen ja jotka Yhdysvaltain elintarvike- ja lääkevirasto on ehdottomasti kieltänyt, vaativat lisäpuhdistusvaiheita täyttääkseen sen standardit (15).Lääkkeitä eluoivat implantit ovat haastavia lääkkeiden kontrolloidulle vapautumiselle, ja niiden rajallisen lääkekuormituksen vuoksi lääkkeen pitkäaikainen käyttö ei ole mahdollista (16).
Toinen yleinen strategia on päällystää implantti kiinnittymisenestopolymeerillä biologisten aineiden ja bakteerien kiinnittymisen estämiseksi pintaan (17).Esimerkiksi kahtaisioniset polymeerit ovat herättäneet huomiota niiden tarttumattomien ominaisuuksien vuoksi, kun ne ovat kosketuksissa plasmaproteiinien, solujen ja bakteerien kanssa.Sillä on kuitenkin joitain rajoituksia, jotka liittyvät pitkäaikaiseen vakauteen ja mekaaniseen kestävyyteen, mikä haittaa sen käytännön käyttöä ortopedisissa implanteissa, erityisesti kirurgisten toimenpiteiden aikana tapahtuvan mekaanisen raapimisen vuoksi (18, 19).Lisäksi biohajoavista materiaaleista valmistettuja ortopedisia implantteja on käytetty korkean bioyhteensopivuuden, poistoleikkauksen tarpeettomuuden ja pintapuhdistusominaisuuksien vuoksi korroosion kautta (20, 21).Korroosion aikana polymeerimatriisin väliset kemialliset sidokset hajoavat ja irtoavat pinnasta, ja tartuntaaineet puhdistavat pinnan.Antibiologinen likaantuminen pintapuhdistuksella on kuitenkin tehokasta lyhyessä ajassa.Lisäksi useimmat imeytyvät materiaalit, mukaan lukien poly(maitohappo-glykolihappokopolymeeri) (PLGA), polymaitohappo (PLA) ja magnesiumpohjaiset seokset, käyvät läpi epätasaisesti biohajoamisen ja eroosion kehossa, mikä vaikuttaa negatiivisesti mekaaniseen stabiilisuuteen.(kaksikymmentäkaksi).Lisäksi biohajoavat levyfragmentit tarjoavat bakteereille kiinnittymispaikan, mikä lisää pitkällä aikavälillä tartunnan mahdollisuutta.Tämä mekaanisen hajoamisen ja infektion riski rajoittaa plastiikkakirurgian käytännön soveltamista (23).
Superhydrofobisista (SHP) pinnoista, jotka jäljittelevät lootuksenlehtien hierarkkista rakennetta, on tullut mahdollinen ratkaisu antifouling-pinnoille (24, 25).Kun SHP:n pinta upotetaan nesteeseen, ilmakuplat jäävät loukkuun, mikä muodostaa ilmataskuja ja estää bakteerien tarttumisen (26).Viimeaikaiset tutkimukset ovat kuitenkin osoittaneet, että SHP-pinnalla on haittoja, jotka liittyvät mekaaniseen kestävyyteen ja pitkäaikaiseen vakauteen, mikä estää sen käytön lääketieteellisissä implanteissa.Lisäksi ilmataskut liukenevat ja menettävät kiinnittymisenestoominaisuuksiensa, mikä johtaa laajempaan bakteerien tarttumiseen SHP-pinnan suuren pinta-alan ansiosta (27, 28).Äskettäin Aizenberg ja kollegat esittelivät innovatiivisen menetelmän biofouling-pintojen pinnoittamiseksi kehittämällä sileän pinnan, joka on saanut inspiraationsa Nepenthesin kannukasvista (29, 30).Sileä pinta on pitkäkestoinen hydraulisissa olosuhteissa, erittäin nestehylkivä biologisia nesteitä vastaan ​​ja sillä on itsekorjautuvia ominaisuuksia.Ei kuitenkaan ole olemassa menetelmää pinnoitteen levittämiseksi monimutkaisen muotoiseen lääketieteelliseen implanttiin, eikä sen ole todistettu tukevan vaurioituneen kudoksen paranemisprosessia implantoinnin jälkeen.
Tässä esittelemme voidellun ortopedisen implanttipinnan (LOIS), mikro-/nanorakenteisen ortopedisen implanttipinnan ja tiiviisti yhdistettynä ohueen voiteluainekerrokseen, jotta se ei liity plastiikkakirurgiaan. Bakteeriinfektiot, kuten murtumien kiinnitys.Koska fluorifunktionalisoitu mikro/nanotason rakenne kiinnittää voiteluaineen tiukasti rakenteeseen, kehitetty LOIS voi hylätä täysin erilaisten nesteiden tarttumisen ja säilyttää likaantumisenestokyvyn pitkään.LOIS-pinnoitteita voidaan levittää erimuotoisille luusynteesiin tarkoitetuille materiaaleille.LOIS:n erinomaiset biolikaantumisenestoominaisuudet biofilmibakteereja [Pseudomonas aeruginosa ja metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus (MRSA)] ja biologisia aineita (solut, proteiinit ja kalsium) vastaan ​​on vahvistettu in vitro.Laajan tarttuvuuden tarttuvuus alustaan ​​on alle 1 %.Lisäksi jopa mekaanisen rasituksen, kuten pinnan naarmuuntumisen, jälkeen tunkeutuvan voiteluaineen aiheuttama itsestään paraneminen auttaa säilyttämään sen anti-fouling-ominaisuudet.Mekaanisen kestävyyden testitulokset osoittavat, että kokonaislujuus ei laske merkittävästi edes rakenteellisten ja kemiallisten muutosten jälkeen.Lisäksi suoritettiin in vitro -koe, joka simuloi leikkausympäristön mekaanista rasitusta, jotta todistettiin, että LOIS kestää erilaisia ​​plastiikkakirurgian aikana ilmeneviä mekaanisia rasituksia.Lopuksi käytimme kaniiniin perustuvaa in vivo reisiluun murtumamallia, joka osoitti, että LOIS:lla on erinomaiset antibakteeriset ominaisuudet ja biologinen yhteensopivuus.Radiologiset ja histologiset tulokset vahvistivat, että vakaa voiteluainekäyttäytyminen ja antibiofouling-ominaisuudet 4 viikon sisällä implantoinnista voivat saavuttaa tehokkaan infektiontorjunta- ja immuunivasteen toiminnan ilman, että luun paranemisprosessi hidastuu.
Kuvio 1A esittää kaavion kehitetystä LOIS:sta, johon on istutettu mikro/nano-mittakaavaisia ​​rakenteita kanin reisiluun murtumamallissa sen erinomaisten anti-biologisten likaantumisen ja infektioiden vastaisten ominaisuuksien vahvistamiseksi.Suoritetaan biomimeettinen menetelmä vesiruukkukasvin pinnan simuloimiseksi ja biologisen likaantumisen estämiseksi sisällyttämällä voiteluainekerros pinnan mikro/nanorakenteeseen.Voiteluaineella ruiskutettu pinta voi minimoida biologisten aineiden ja pinnan välisen kosketuksen.Siksi pinnalla olevien stabiilien kemiallisten sidosten muodostumisen ansiosta sillä on erinomainen likaantumisenestokyky ja pitkäaikainen stabiilisuus.Tämän seurauksena voitelupinnan antibiofouling-ominaisuudet mahdollistavat erilaisia ​​käytännön sovelluksia biolääketieteellisessä tutkimuksessa.Laajaa tutkimusta tämän erityisen pinnan vuorovaikutuksesta kehossa ei kuitenkaan ole vielä saatu päätökseen.Vertaamalla LOIS:a paljaisiin substraatteihin in vitro käyttämällä albumiinia ja biofilmibakteereja, LOIS:n tarttumattomuus voidaan varmistaa (kuva 1B).Lisäksi kaltevalla paljaalla alustalla ja LOIS-substraatilla olevat vesipisarat (kuva S1 ja elokuva S1) voidaan osoittaa biologisen kontaminaatiokyvyn osoittamiseksi.Kuten fluoresenssimikroskoopin kuvasta näkyy, proteiini- ja bakteerisuspensiossa inkuboitu paljastettu substraatti osoitti suuren määrän biologista materiaalia tarttuvan pintaan.Erinomaisten biofouling-ominaisuuksiensa ansiosta LOIS ei kuitenkaan näytä juuri lainkaan fluoresenssia.LOIS:a kiinnitettiin luusynteesiä varten tarkoitettujen ortopedisten implanttien pinnalle (levyt ja ruuvit) ja asetettiin kanin murtumamalliin sen biofouling- ja anti-infektioominaisuuksien vahvistamiseksi.Ennen implantointia paljaa ortopedinen implantti ja LOIS inkuboitiin bakteerisuspensiossa 12 tuntia.Esi-inkubaatio varmistaa, että paljastetun implantin pinnalle muodostuu biofilmi vertailua varten.Kuva 1C esittää valokuvan murtumakohdasta 4 viikkoa implantoinnin jälkeen.Vasemmalla kani, jolla oli paljain ortopedinen implantti, osoitti vakavaa tulehdusta, joka johtui biokalvon muodostumisesta implantin pinnalle.Kaneissa, joille oli istutettu LOIS, havaittiin päinvastainen tulos, eli LOIS:a ympäröivissä kudoksissa ei havaittu merkkejä infektiosta eikä tulehduksesta.Lisäksi vasemmalla oleva optinen kuva osoittaa kanin leikkauskohdan, jolla on paljastettu implantti, mikä osoittaa, että paljastuneen implantin pinnalla ei löytynyt useita liima-aineita LOIS:n pinnasta.Tämä osoittaa, että LOIS:lla on pitkäaikainen stabiilisuus ja se pystyy säilyttämään anti-biologisen likaantumisen ja kiinnittymisen esto-ominaisuudet.
(A) Kaaviokaavio LOIS:sta ja sen implantaatiosta kanin reisiluun murtumamallissa.(B) Fluoresenssimikroskopiakuva proteiinista ja bakteeribiofilmistä paljaalla pinnalla ja LOIS-substraatilla.4 viikkoa implantoinnin jälkeen (C) valokuvakuva murtumakohdasta ja (D) röntgenkuva (korostettu punaisella suorakulmiolla).Kuva: Kyomin Chae, Yonsei University.
Steriloidut, altistetut negatiivisesti istutetut kanit osoittivat normaalia luun paranemisprosessia ilman tulehduksen tai infektion merkkejä.Toisaalta SHP-istutteet, jotka on esi-inkuboitu bakteerisuspensiossa, osoittavat infektioon liittyvää tulehdusta ympäröivissä kudoksissa.Tämä voidaan johtua sen kyvyttömyydestä estää bakteerien tarttumista pitkään (kuva S2).Sen osoittamiseksi, että LOIS ei vaikuta paranemisprosessiin, mutta estää mahdollisia implantaatioon liittyviä infektioita, verrattiin röntgenkuvia paljastuneesta positiivisesta matriisista ja LOIS:sta murtumakohdassa (kuva 1D).Paljaan positiivisen implantin röntgenkuvassa näkyi pysyviä osteolyysiviivoja, mikä osoitti, että luu ei ollut täysin parantunut.Tämä viittaa siihen, että luun palautumisprosessi voi viivästyä huomattavasti infektioon liittyvän tulehduksen vuoksi.Päinvastoin, se osoitti, että kanit, joihin oli istutettu LOIS, olivat parantuneet, eikä niissä näkynyt mitään ilmeistä murtumakohtaa.
Lääketieteellisten implanttien kehittämiseksi, joilla on pitkäaikainen vakaus ja toimintakyky (mukaan lukien biofouling-kestävyys), on tehty monia ponnisteluja.Erilaisten biologisten aineiden läsnäolo ja kudosadheesion dynamiikka rajoittavat kuitenkin niiden kliinisesti luotettavien menetelmien kehittämistä.Näiden puutteiden voittamiseksi olemme kehittäneet mikro/nanokerroksisen rakenteen ja kemiallisesti modifioidun pinnan, joka on optimoitu suuren kapillaarivoiman ja kemiallisen affiniteetin ansiosta pitämään mahdollisimman tasaisen voiteluaineen.Kuva 2A esittää LOIS:n kokonaisvalmistusprosessia.Valmistele ensin lääketieteellistä ruostumatonta terästä (SS) 304 oleva alusta.Toiseksi mikro/nanorakenne muodostetaan SS-substraatille kemiallisella etsauksella käyttämällä fluorivetyhappoliuosta (HF).SS:n korroosionkestävyyden palauttamiseksi syövytetyn alustan käsittelyyn käytetään typpihappoliuosta (HNO3) (31).Passivointi parantaa SS-substraatin korroosionkestävyyttä ja hidastaa merkittävästi korroosioprosessia, mikä voi heikentää LOIS:n yleistä suorituskykyä.Sitten muodostamalla itsekokoontuva yksikerroksinen (SAM) 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorioktyylitrietoksisilaanin (POTS) kanssa pintaa modifioidaan kemiallisesti parantamaan pinnan ja sileän voiteluaineen affiniteetin välistä kemiallista vuorovaikutusta.Pintamodifikaatio vähentää merkittävästi valmistetun mikro/nano-mittakaavaisen strukturoidun pinnan pintaenergiaa, mikä vastaa sileän voiteluaineen pintaenergiaa.Tämä mahdollistaa voiteluaineen täydellisen kastumisen, jolloin pintaan muodostuu vakaa voiteluainekerros.Modifioidulla pinnalla on parantunut hydrofobisuus.Tulokset osoittavat, että liukas voiteluaine käyttäytyy vakaasti LOIS:ssa mikro/nanorakenteen aiheuttaman korkean kemiallisen affiniteetin ja kapillaarivoiman vuoksi (32, 33).Optisia muutoksia SS:n pinnalla pinnan modifioinnin ja voiteluaineen ruiskutuksen jälkeen tutkittiin.Pintaan muodostuva mikro/nanokerrosrakenne voi aiheuttaa visuaalisia muutoksia ja tummentaa pintaa.Tämä ilmiö johtuu parannetusta valonsirontavaikutuksesta karkealla pinnalla, mikä lisää valonpysäytysmekanismin (34) aiheuttamaa hajaheijastusta.Lisäksi voiteluaineen ruiskutuksen jälkeen LOIS tummenee.Voitelukerros saa vähemmän valoa heijastumaan alustasta, mikä tummentaa LOIS:a.Mikrorakenteen/nanorakenteen optimoimiseksi näyttämään pienin liukukulma (SA) biofouling-suorituskyvyn saavuttamiseksi, pyyhkäisyelektronimikroskooppia (SEM) ja atomipareja käytettiin suorittamaan erilaisia ​​HF-etsausaikoja (0, 3)., 15 ja 60 minuuttia) Force Microscope (AFM) (kuva 2B).SEM- ja AFM-kuvat osoittavat, että lyhyen etsauksen (3 minuutin etsauksen) jälkeen paljaalle alustalle on muodostunut epätasainen nanomittakaavainen karheus.Pinnan karheus muuttuu etsausajan mukana (kuva S3).Ajassa muuttuva käyrä osoittaa, että pinnan karheus jatkaa kasvuaan ja saavuttaa huippunsa 15 minuutin etsauksen jälkeen, ja sitten havaitaan vain vähäinen karheusarvon lasku 30 minuutin syövytyksen jälkeen.Tässä vaiheessa nanotason karheus etsautuu pois, kun taas mikrotason karheus kehittyy voimakkaasti, mikä tekee karheuden muutoksesta vakaamman.Yli 30 minuutin etsauksen jälkeen havaitaan edelleen karheuden lisääntymistä, mikä selitetään yksityiskohtaisesti seuraavasti: SS koostuu teräksestä, johon on seostettu alkuaineita, kuten rautaa, kromia, nikkeliä, molybdeeniä ja monia muita alkuaineita.Näistä alkuaineista raudalla, kromilla ja molybdeenillä on tärkeä rooli mikroni/nanomittakaavan karheuden muodostamisessa SS:ssä HF-etsauksella.Korroosion alkuvaiheessa rauta ja kromi syöpyvät pääasiassa, koska molybdeenillä on korkeampi korroosionkestävyys kuin molybdeenillä.Syövytyksen edetessä etsausliuos saavuttaa paikallisen ylikyllästyksen muodostaen syövytyksen aiheuttamia fluorideja ja oksideja.Fluori ja oksidi saostuvat ja saostuvat lopulta uudelleen pinnalle muodostaen pinnan karheutta mikroni/nano-alueella (31).Tällä mikro/nanotason karheudella on tärkeä rooli LOIS:n itsekorjautumisominaisuuksissa.Kaksimittainen pinta tuottaa synergistisen vaikutuksen, mikä lisää huomattavasti kapillaarivoimaa.Tämä ilmiö mahdollistaa voiteluaineen tunkeutumisen pintaan vakaasti ja edistää itseparantumisominaisuuksia (35).Karheuden muodostuminen riippuu syövytysajasta.Alle 10 minuutin etsauksen aikana pinnassa on vain nanomittakaavan karheutta, joka ei riitä pitämään sisällään tarpeeksi voiteluainetta biofouling-kestävyyden saavuttamiseksi (36).Toisaalta, jos etsausaika ylittää 30 minuuttia, raudan ja kromin uudelleensaostumisesta muodostuva nanomittakaavainen karheus katoaa ja molybdeenin takia jää jäljelle vain mikromittakaavainen karheus.Ylisyövytetyltä pinnalta puuttuu nanomittakaavan karheus ja se menettää kaksivaiheisen karheuden synergistisen vaikutuksen, mikä vaikuttaa negatiivisesti LOIS:n itsekorjautuviin ominaisuuksiin.SA-mittaukset suoritettiin substraateille, joilla oli erilaiset syövytysajat, jotta voidaan osoittaa kiinnittymisenestokyky.Erilaisia ​​nesteitä valittiin viskositeetin ja pintaenergian perusteella, mukaan lukien deionisoitu (DI) vesi, veri, etyleeniglykoli (EG), etanoli (EtOH) ja heksadekaani (HD) (kuva S4).Ajassa muuttuva etsauskuvio osoittaa, että erilaisilla nesteillä, joilla on erilaiset pintaenergiat ja viskositeetit, LOIS:n SA on alhaisin 15 minuutin etsauksen jälkeen.Siksi LOIS on optimoitu syövyttämään 15 minuuttia mikroni- ja nanomittakaavan karheuden muodostamiseksi, mikä sopii tehokkaasti säilyttämään voiteluaineen kestävyyden ja erinomaiset likaantumisenesto-ominaisuudet.
(A) Kaaviokaavio LOIS:n nelivaiheisesta valmistusprosessista.Upote näyttää substraatille muodostuneen SAM:n.(B) SEM- ja AFM-kuvat, joita käytetään substraatin mikro-/nanorakenteen optimointiin eri etsausaikoina.(C) Cr2p:n ja (D) F1:n röntgenfotoelektronispektroskopia (XPS) -spektrit pinnan passivoinnin ja SAM-pinnoituksen jälkeen.au, mielivaltainen yksikkö.(E) Edustavia kuvia vesipisaroista paljailla, syövytetyillä, SHP- ja LOIS-substraateilla.(F) Kosketuskulman (CA) ja SA:n mittaus nesteiden, joiden pintajännitys on erilainen, SHP:llä ja LOIS:lla.Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD.
Sitten pinnan kemiallisten ominaisuuksien muutoksen vahvistamiseksi tutkittiin röntgenfotoelektronispektroskopiaa (XPS) substraatin pinnan kemiallisen koostumuksen muutosta jokaisen pintapinnoitteen jälkeen.Kuvassa 2C on esitetty HF-syövytetyn pinnan ja HNO 3 -käsitellyn pinnan XPS-mittaustulokset.Kaksi päähuippua arvoilla 587,3 ja 577,7 eV voidaan johtua kromioksidikerroksen Cr-O-sidoksesta, joka on tärkein ero HF-etsatusta pinnasta.Tämä johtuu pääasiassa HNO3:n pinnalla olevan raudan ja kromifluoridin kulutuksesta.HNO3-pohjainen syövytys mahdollistaa kromin muodostaman passivoivan oksidikerroksen pinnalle, mikä tekee syövytystä SS:stä jälleen korroosionkestävän.Kuvassa 2D saatiin XPS-spektrit vahvistamaan, että SAM-pinnoitteen jälkeen pinnalle muodostui fluorihiilipohjaista silaania, jolla on erittäin korkea nestehylkivyys jopa EG:lle, verelle ja EtOH:lle.SAM-pinnoite viimeistellään saattamalla silaanifunktionaaliset ryhmät reagoimaan plasmakäsittelyllä muodostuneiden hydroksyyliryhmien kanssa.Tämän seurauksena havaittiin merkittävä kasvu CF2- ja CF3-piikkeissä.Sitoutumisenergia välillä 286-296 eV osoittaa, että SAM-pinnoite on saattanut kemiallisen modifikoinnin onnistuneesti loppuun.SHP:llä on suhteellisen suuret CF2 (290,1′eV) ja CF3 (293,3 eV) piikit, jotka johtuvat pinnalle muodostuneesta fluorihiilipohjaisesta silaanista.Kuva 2E esittää edustavia optisia kuvia kosketuskulman (CA) mittauksista eri deionisoidun veden ryhmille kosketuksessa paljaan, syövytetyn, SHP:n ja LOIS:n kanssa.Nämä kuvat osoittavat, että syövytetty pinta muuttuu hydrofiiliseksi kemiallisella syövytyksellä muodostetun mikro/nanorakenteen ansiosta, jolloin deionisoitu vesi imeytyy rakenteeseen.Kuitenkin, kun alusta päällystetään SAM:lla, alustalla on vahva vettä hylkivä, joten pintaan muodostuu SHP ja veden ja pinnan välinen kosketuspinta-ala on pieni.Lopuksi CA:n lasku havaittiin LOIS:ssa, mikä johtuu voiteluaineen tunkeutumisesta mikrorakenteeseen, mikä lisäsi kosketusaluetta.Sen osoittamiseksi, että pinnalla on erinomaiset nestettä hylkivät ja tarttumattomat ominaisuudet, LOIS-arvoa verrattiin SHP-substraattiin mittaamalla CA ja SA käyttämällä erilaisia ​​nesteitä (kuva 2F).Erilaisia ​​nesteitä valittiin viskositeetin ja pintaenergian perusteella, mukaan lukien deionisoitu vesi, veri, EG, EtOH ja HD (kuva S4).CA:n mittaustulokset osoittavat, että kun CA pyrkii HD:hen, CA:n vähennysarvo, jossa CA:lla on pienin pintaenergia.Lisäksi koko CA:n LOIS on alhainen.SA-mittaus osoittaa kuitenkin täysin toisenlaisen ilmiön.Ionisoitua vettä lukuun ottamatta kaikki nesteet kiinnittyvät SHP-substraattiin liukumatta pois.Toisaalta LOIS näyttää erittäin alhaisen SA:n, jossa kun kaikki neste on kallistettu alle 10° - 15° kulmaan, kaikki neste rullaa pois.Tämä osoittaa vahvasti, että LOIS:n tarttumattomuus on parempi kuin SHP-pinnan.Lisäksi LOIS-pinnoitteita levitetään myös erilaisille materiaaleille, mukaan lukien titaani (Ti), polyfenyylisulfoni (PPSU), polyoksimetyleeni (POM), polyeetteriketoni (PEEK) ja bioabsorboituvat polymeerit (PLGA). Ne ovat implantoitavia ortopedisia materiaaleja (kuva). S5)).Peräkkäiset kuvat pisaroista LOIS:lla käsitellyllä materiaalilla osoittavat, että LOIS:n biofouling-ominaisuudet ovat samat kaikilla substraateilla.Lisäksi CA:n ja SA:n mittaustulokset osoittavat, että LOIS:n ei-tarttuvia ominaisuuksia voidaan soveltaa muihin materiaaleihin.
LOIS:n kiinnittymisenesto-ominaisuuksien vahvistamiseksi erityyppisiä substraatteja (mukaan lukien paljas, syövytetty, SHP ja LOIS) inkuboitiin Pseudomonas aeruginosan ja MRSA:n kanssa.Nämä kaksi bakteeria valittiin edustaviksi sairaalabakteeriksi, jotka voivat johtaa biofilmien muodostumiseen, mikä johtaa SSI:hen (37).Kuvio 3 (A ja B) esittää fluoresenssimikroskooppikuvia ja pesäkkeitä muodostavan yksikön (CFU) mittaustuloksia substraateista, joita on inkuboitu bakteerisuspensiossa lyhytaikaisesti (12 tuntia) ja pitkäkestoisesti (72 tuntia).Lyhyessä ajassa bakteerit muodostavat klustereita ja kasvavat kooltaan peittäen itsensä liman kaltaisilla aineilla ja estäen niiden poistumisen.Kuitenkin 72 tunnin inkubaation aikana bakteerit kypsyvät ja niistä tulee helposti leviäviä muodostaen lisää pesäkkeitä tai klustereita.Siksi voidaan katsoa, ​​että 72 tunnin inkubointi on pitkäkestoista ja sopiva inkubaatioaika vahvan biokalvon muodostamiseksi pinnalle (38).Lyhyessä ajassa syövytetyssä pinnassa ja SHP:n pinnassa ilmeni bakteeritartuntaa, joka väheni noin 25-50 % paljaaseen substraattiin verrattuna.Erinomaisen biofouling-suorituskykynsä ja stabiilisuutensa ansiosta LOIS ei kuitenkaan osoittanut bakteerien biokalvon tarttumista lyhyellä ja pitkällä aikavälillä.Kaaviokaavio (kuva 3C) kuvaa etsausliuoksen, SHP:n ja LOIS:n, antibiologisen likaantumisen mekanismin selityksen.Oletuksena on, että syövytetyllä alustalla, jolla on hydrofiilisiä ominaisuuksia, on suurempi pinta-ala kuin paljaalla alustalla.Siksi syövytetylle alustalle tapahtuu enemmän bakteerien tarttumista.Kuitenkin verrattuna paljaaseen substraattiin syövytetyn alustan pinnalle muodostuu huomattavasti vähemmän biofilmiä.Tämä johtuu siitä, että vesimolekyylit sitoutuvat lujasti hydrofiiliseen pintaan ja toimivat veden voiteluaineena, mikä häiritsee bakteerien kiinnittymistä lyhyellä aikavälillä (39).Vesimolekyylien kerros on kuitenkin hyvin ohut ja liukenee bakteerisuspensioihin.Siksi vesimolekyylikerros katoaa pitkäksi aikaa, mikä johtaa laajaan bakteerien tarttumiseen ja lisääntymiseen.SHP:ssä bakteerien tarttuminen estyy sen lyhytaikaisten kostumattomien ominaisuuksien vuoksi.Vähentynyt bakteeriadheesio voi johtua kerrosrakenteeseen jääneistä ilmataskuista ja alhaisemmasta pintaenergiasta, mikä minimoi bakteerisuspension ja pinnan välisen kosketuksen.SHP:ssä havaittiin kuitenkin laajaa bakteerien tarttumista, koska se menetti kiinnittymisenestoominaisuuksiensa pitkään.Tämä johtuu pääasiassa ilmataskujen katoamisesta hydrostaattisen paineen vuoksi ja ilman liukenemisesta veteen.Tämä johtuu pääasiassa ilmataskujen häviämisestä liukenemisen seurauksena ja kerrosrakenteesta, joka tarjoaa suuremman pinta-alan tarttumiselle (27, 40).Toisin kuin näillä kahdella substraatilla, joilla on tärkeä vaikutus pitkäaikaiseen vakauteen, LOIS:n sisältämä voiteluaine ruiskutetaan mikro/nanorakenteeseen, eikä se katoa edes pitkällä aikavälillä.Mikro/nanorakenteilla täytetyt voiteluaineet ovat erittäin stabiileja ja ne vetäytyvät voimakkaasti pintaan korkean kemiallisen affiniteetin ansiosta, mikä estää bakteerien tarttumisen pitkäksi aikaa.Kuva S6 esittää heijastuskonfokaalimikroskooppikuvaa voiteluainetta sisältävästä substraatista, joka on upotettu fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS).Jatkuvat kuvat osoittavat, että jopa 120 tunnin kevyen ravistelun (120 rpm) jälkeen LOIS:n voiteluainekerros pysyy muuttumattomana, mikä osoittaa pitkän aikavälin vakauden virtausolosuhteissa.Tämä johtuu fluoripohjaisen SAM-pinnoitteen ja perfluorihiilipohjaisen voiteluaineen välisestä korkeasta kemiallisesta affiniteetista, jotta voidaan muodostaa vakaa voiteluainekerros.Siksi kiinnittymisenestokyky säilyy.Lisäksi substraattia testattiin edustavia proteiineja (albumiini ja fibrinogeeni) vastaan, joita on plasmassa, immuunitoimintaan läheisesti liittyviä soluja (makrofagit ja fibroblastit) ja luun muodostukseen liittyviä proteiineja.Kalsiumpitoisuus on erittäin korkea.(Kuva 3D, 1 ja 2 ja kuva S7) (41, 42).Lisäksi fibrinogeenin, albumiinin ja kalsiumin tarttumistestin fluoresenssimikroskooppikuvat osoittivat erilaisia ​​adheesio-ominaisuuksia kussakin substraattiryhmässä (kuva S8).Luunmuodostuksen aikana vasta muodostuneet luu- ja kalsiumkerrokset voivat ympäröidä ortopedistä implanttia, mikä ei ainoastaan ​​vaikeuta poistamista, vaan voi myös aiheuttaa odottamattomia vahinkoja potilaalle poistoprosessin aikana.Siksi alhainen kalsiumkertymä luulevyissä ja ruuveissa on hyödyllinen ortopedisessa leikkauksessa, joka vaatii implantin poistoa.Kiinnittyneen alueen kvantifioinnin perusteella fluoresenssin intensiteetin ja solumäärän perusteella vahvistimme, että LOIS:lla on erinomaiset biofouling-ominaisuudet kaikille biologisille aineille verrattuna muihin substraatteihin.In vitro -kokeiden tulosten mukaan antibiologista likaantumista estävää LOIS:a voidaan soveltaa ortopedisiin implantteihin, jotka eivät ainoastaan ​​estä biofilmibakteerien aiheuttamia infektioita, vaan myös vähentävät kehon aktiivisen immuunijärjestelmän aiheuttamaa tulehdusta.
(A) Fluoresenssimikroskooppikuvat kustakin ryhmästä (alaston, syövytetty, SHP ja LOIS), joita inkuboitiin Pseudomonas aeruginosa- ja MRSA-suspensioissa 12 ja 72 tunnin ajan.(B) Pseudomonas aeruginosan ja MRSA:n kiinnittyneiden CFU:iden lukumäärä kunkin ryhmän pinnalla.(C) Kaaviokaavio lyhyt- ja pitkäaikaisen syövytyksen, SHP:n ja LOIS:n, anti-biologisesta likaantumismekanismista.(D) (1) Kuhunkin substraattiin kiinnittyneiden fibroblastien lukumäärä ja fluoresenssimikroskooppikuvat soluista, jotka ovat kiinnittyneet paljaalle ja LOIS:lle.(2) Luun paranemisprosessiin osallistuvien immuunijärjestelmään liittyvien proteiinien, albumiinin ja kalsiumin tarttumistesti (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ja **** P <0,0001).ns, ei ole tärkeää.
Väistämättömien keskittyneiden jännitysten tapauksessa mekaaninen kestävyys on aina ollut suurin haaste kiinnittymisenestopinnoitteiden levittämisessä.Perinteiset jätevedenpoistogeelimenetelmät perustuvat polymeereihin, joiden vesiliukoisuus ja hauraus on heikosti.Siksi ne ovat yleensä herkkiä mekaaniselle rasitukselle biolääketieteellisissä sovelluksissa.Siksi mekaanisesti kestävät kiinnittymisenestopinnoitteet ovat edelleen haaste sovelluksissa, kuten ortopedisissa implanteissa (43, 44).Kuva 4A(1) esittää ortopedisiin implantteihin kohdistetun jännityksen kahta päätyyppiä, mukaan lukien naarmuuntumisen (leikkausjännitys) ja puristuksen pihtien tuottaman vaurioituneen implantin optisen kuvan kanssa.Esimerkiksi kun ruuvia kiristetään ruuvimeisselillä tai kun kirurgi pitää luulevyä tiukasti kiinni pinseteillä ja käyttää puristusvoimaa, muovinen luulevy vaurioituu ja naarmuuntuu sekä makro- että mikro-/nanovaa'alla (kuva 4A, 2) .Sen testaamiseksi, kestääkö valmistettu LOIS näitä plastiikkakirurgian aiheuttamia vaurioita, suoritettiin nanoindentaatio, jossa verrattiin paljaan alustan ja LOIS:n kovuutta mikro/nano-asteikolla mikro/nanorakenteen mekaanisten ominaisuuksien tutkimiseksi Impact (kuva) 4B).Kaaviokaavio näyttää LOIS:n erilaisen muodonmuutoskäyttäytymisen mikro-/nanorakenteiden läsnäolon vuoksi.Voima-siirtymäkäyrä piirrettiin nanoindentation tulosten perusteella (kuva 4C).Sininen kuva edustaa paljaaa alustaa, joka osoittaa vain vähäistä muodonmuutosta, kuten suurin sisennyssyvyys 0,26 μm osoittaa.Toisaalta LOIS:ssa (punainen käyrä) havaittu nanoindentaatiovoiman ja siirtymän asteittainen lisääntyminen voi osoittaa merkkejä heikentyneestä mekaanisista ominaisuuksista, mikä johtaa 1,61 μm:n nanoindentaatiosyvyyteen.Tämä johtuu siitä, että LOIS:ssa oleva mikro/nanorakenne tarjoaa syvemmän etenemistilan nanoindenterin kärjelle, joten sen muodonmuutos on suurempi kuin paljaalla alustalla.Konsta-Gdoutos et ai.(45) uskoo, että nanorakenteiden läsnäolon vuoksi nanosisännys ja mikro/nanokarheus johtavat epäsäännöllisiin nanoindentaatiokäyriin.Varjostettu alue vastaa epäsäännöllistä muodonmuutoskäyrää, joka johtuu nanorakenteesta, kun taas ei-varjostettu alue johtuu mikrorakenteesta.Tämä muodonmuutos voi vahingoittaa pitovoiteluaineen mikrorakennetta/nanorakennetta ja vaikuttaa negatiivisesti sen kiinnittymisenestokykyyn.Vahingon vaikutuksen LOIS:iin tutkimiseksi mikro-/nanorakenteiden väistämätön vaurio replikoitui kehossa plastiikkakirurgian aikana.Veri- ja proteiiniadheesiotestejä käyttämällä voidaan määrittää LOIS:n biofouling-ominaisuuksien stabiilisuus in vitro -testin jälkeen (kuva 4D).Optisten kuvien sarja näyttää vauriot, jotka tapahtuivat kunkin substraatin reikien lähellä.Veren tarttuvuustesti suoritettiin osoittamaan mekaanisten vaurioiden vaikutus biofouling-pinnoitteeseen (kuva 4E).Kuten SHP:n, kiinnittymisenesto-ominaisuudet menetetään vaurioiden vuoksi, ja LOIS:lla on erinomaiset kiinnittymisenesto-ominaisuudet hylkiessään verta.Tämä johtuu siitä, että koska pintaenergiaa ohjaa vaurioituneen alueen peittävä kapillaaritoiminta, mikrorakenteisen voiteluaineen virtaus palauttaa likaantumisenesto-ominaisuudet (35).Sama suuntaus havaittiin proteiinin adheesiotestissä albumiinilla.Vaurioituneella alueella proteiinin adheesiota SHP:n pinnalle havaitaan laajalti, ja sen alueen peittävyyttä mittaamalla se voidaan kvantifioida puoleksi paljaan alustan adheesiotasosta.Toisaalta LOIS säilytti biofouling-ominaisuuksiensa aiheuttamatta tarttumista (kuva 4, F ja G).Lisäksi ruuvin pintaan kohdistuu usein voimakasta mekaanista rasitusta, kuten porausta, joten tutkimme LOIS-pinnoitteen kykyä pysyä ehjänä ruuvilla in vitro.Kuva 4H esittää optisia kuvia eri ruuveista, mukaan lukien paljas, SHP ja LOIS.Punainen suorakulmio edustaa kohdealuetta, jossa esiintyy voimakasta mekaanista rasitusta luun istutuksen aikana.Samoin kuin levyn proteiiniadheesiotestissä, fluoresenssimikroskooppia käytetään kuvaamaan proteiinin adheesio ja mittaamaan peittoalue LOIS-pinnoitteen eheyden osoittamiseksi jopa voimakkaassa mekaanisessa rasituksessa (Kuva 4, I ja J).LOIS-käsitellyillä ruuveilla on erinomainen kiinnittymisenestokyky, eivätkä proteiinit tartu pintaan lähes ollenkaan.Toisaalta proteiinin adheesiota havaittiin paljaissa ruuveissa ja SHP-ruuveissa, joissa SHP-ruuvien pinta-ala oli kolmasosa paljaiden ruuvien pinta-alasta.Lisäksi kiinnitykseen käytettävän ortopedisen implantin tulee olla mekaanisesti vahva kestääkseen murtumakohtaan kohdistuvan rasituksen, kuten kuvassa 4K näkyy.Siksi suoritettiin taivutuskoe kemiallisen muuntamisen vaikutuksen määrittämiseksi mekaanisiin ominaisuuksiin.Lisäksi tämä tehdään implantista aiheutuvan kiinteän jännityksen ylläpitämiseksi.Käytä pystysuoraa mekaanista voimaa, kunnes implantti on täysin taittunut ja saadaan jännitys-venymäkäyrä (kuva 4L, 1).Kahta ominaisuutta, mukaan lukien Youngin moduuli ja taivutuslujuus, verrattiin paljaiden ja LOIS-alustojen välillä niiden mekaanisen lujuuden indikaattoreina (kuva 4L, 2 ja 3).Youngin moduuli osoittaa materiaalin kyvyn kestää mekaanisia muutoksia.Kunkin substraatin Youngin moduuli on 41,48±1,01 ja 40,06±0,96 GPa, vastaavasti;havaittu ero on noin 3,4 %.Lisäksi kerrotaan, että taivutuslujuus, joka määrää materiaalin sitkeyden, on paljaalla alustalla 102,34±1,51 GPa ja SHP:llä 96,99±0,86 GPa.Paljas alusta on noin 5,3 % korkeampi.Pieni mekaanisten ominaisuuksien heikkeneminen voi johtua lovivaikutuksesta.Lovivaikutuksessa mikro/nanokarheus voi toimia lovien sarjana, mikä johtaa paikalliseen jännityskeskittymään ja vaikuttaa implantin mekaanisiin ominaisuuksiin (46).Kuitenkin sen tosiasian perusteella, että ihmisen aivokuoren luun jäykkyyden on raportoitu olevan välillä 7,4 - 31,6 GPa ja mitattu LOIS-moduuli ylittää ihmisen aivokuoren luun jäykkyyden (47), LOIS on riittävä tukemaan murtumaa ja sen kokonaismurtumaa. Pintamuutos vaikuttaa minimaalisesti mekaanisiin ominaisuuksiin.
(A) Kaaviokaavio (1) ortopediseen implanttiin kohdistuvasta mekaanisesta rasituksesta leikkauksen aikana ja (2) vaurioituneen ortopedisen implantin optisesta kuvasta.(B) Kaaviokuva nanomekaanisten ominaisuuksien mittauksesta nanoindentaatiolla ja LOIS:lla paljaalla pinnalla.(C) Nanoindentation voima-siirtymäkäyrä paljaalla pinnalla ja LOIS.(D) Simuloi in vitro -kokeiden jälkeen eri tyyppisten ortopedisten levyjen optisia kuvia (vaurioalue on korostettu punaisella suorakulmiolla) simuloidaksesi leikkauksen aikana aiheutuvaa mekaanista rasitusta.(E) Veren tarttumistesti ja (F) vaurioituneen ortopedisen levyryhmän proteiiniadheesiotesti.(G) Mittaa levyyn kiinnittyneen proteiinin peittoalue.(H) Optiset kuvat erityyppisistä ortopedisista ruuveista in vitro -kokeen jälkeen.(I) Proteiinin tarttumistesti eri pinnoitteiden eheyden tutkimiseksi.(J) Mittaa ruuviin kiinnittyneen proteiinin alueen peitto.(K) Kanin liikkeen tarkoituksena on synnyttää kiinteä rasitus murtuneeseen luuhun.(L) (1) Taivutustestitulokset ja optiset kuvat ennen ja jälkeen taivutuksen.Ero (2) Youngin moduulissa ja (3) taivutuslujuudessa paljaan implantin ja SHP:n välillä.Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 ja ****P<0,0001).Kuva: Kyomin Chae, Yonsei University.
Kliinisissä tilanteissa suurin osa bakteerikontakteista biologisten materiaalien ja haavakohtien kanssa tulee kypsistä, kypsistä biofilmeistä (48).Siksi Yhdysvaltain tautien valvonta- ja ehkäisykeskukset arvioivat, että 65 % kaikista ihmisen infektioista liittyy biofilmeihin (49).Tässä tapauksessa on välttämätöntä tarjota in vivo -kokeellinen suunnittelu, joka tarjoaa johdonmukaisen biofilmin muodostumisen implantin pinnalle.Siksi kehitimme kanin reisiluun murtuman mallin, jossa ortopedisia implantteja esi-inkuboitiin bakteerisuspensiossa ja sitten istutettiin kanin reisiluun tutkiaksemme LOIS:n kiinnittymisenestoominaisuuksia in vivo.Seuraavista kolmesta tärkeästä seikasta johtuen bakteeri-infektiot saadaan aikaan esiviljelyllä eikä bakteerisuspensioiden suoralla injektiolla: (i) Kanien immuunijärjestelmä on luonnollisesti vahvempi kuin ihmisten;siksi bakteerisuspensioiden ja planktonbakteerien injektointi on mahdollista Sillä ei ole vaikutusta biofilmien muodostumiseen.(Ii) Planktonbakteerit ovat herkempiä antibiooteille, ja antibiootteja käytetään yleensä leikkauksen jälkeen;lopuksi (iii) planktonbakteerisuspensio voidaan laimentaa eläimen ruumiinnesteillä (50).Esiviljelmällä implanttia bakteerisuspensiossa ennen istutusta voimme tutkia perusteellisesti bakteeri-infektion ja vieraskappalereaktion (FBR) haitallisia vaikutuksia luun paranemisprosessiin.Kanit lopetettiin 4 viikkoa implantoinnin jälkeen, koska luun paranemisprosessin kannalta välttämätön osseointegraatio saatetaan päätökseen 4 viikossa.Sitten implantit poistettiin kaneista jatkotutkimuksia varten.Kuvio 5A esittää bakteerien lisääntymismekanismia.Infektoitunut ortopedinen implantti viedään kehoon.Bakteerisuspensiossa suoritetun esi-inkuboinnin seurauksena kuusi kuudesta paljailla implanteilla istutetusta kanista infektoitui, kun taas yksikään kaneista, joihin oli istutettu LOIS-käsitellyt implantit, ei ollut infektoitunut.Bakteeriinfektiot etenevät kolmessa vaiheessa, mukaan lukien kasvu, kypsyminen ja leviäminen (51).Ensin kiinnittyneet bakteerit lisääntyvät ja kasvavat pinnalla, ja sitten bakteerit muodostavat biofilmin, kun ne erittävät solunulkoista polymeeriä (EPS), amyloidia ja solunulkoista DNA:ta.Biofilmi ei vain häiritse antibioottien tunkeutumista, vaan myös edistää antibiootteja hajottavien entsyymien (kuten β-laktamaasin) kertymistä (52).Lopuksi biofilmi levittää kypsät bakteerit ympäröiviin kudoksiin.Siksi infektio tapahtuu.Lisäksi, kun vieras esine pääsee kehoon, infektio, joka voi aiheuttaa voimakkaan immuunivasteen, voi aiheuttaa vakavaa tulehdusta, kipua ja heikentynyttä vastustuskykyä.Kuvio 5B tarjoaa yleiskuvan ortopedisen implantin asettamisen aiheuttamasta FBR:stä bakteeri-infektion aiheuttaman immuunivasteen sijaan.Immuunijärjestelmä tunnistaa asetetun implantin vieraana kappaleena ja saa sitten solut ja kudokset reagoimaan vieraan kappaleen kapseloimiseksi (53).FBR:n alkuaikoina ortopedisten implanttien pinnalle muodostui syöttömatriisi, joka johti fibrinogeenin adsorptioon.Adsorboitunut fibrinogeeni muodostaa sitten erittäin tiheän fibriiniverkoston, joka edistää leukosyyttien kiinnittymistä (54).Kun fibriiniverkko on muodostunut, ilmenee akuuttia tulehdusta neutrofiilien tunkeutumisen vuoksi.Tässä vaiheessa vapautuu erilaisia ​​sytokiinejä, kuten tuumorinekroositekijä-a (TNF-a), interleukiini-4 (IL-4) ja IL-β, ja monosyytit alkavat tunkeutua implantaatiokohtaan ja erilaistua jättimäisiksi soluiksi.Phage (41, 55, 56).FBR:n vähentäminen on aina ollut haaste, koska liiallinen FBR voi aiheuttaa akuutin ja kroonisen tulehduksen, joka voi johtaa kuolemaan johtaviin komplikaatioihin.Bakteeri-infektioiden vaikutuksen arvioimiseksi paljaan implantin ja LOIS:n ympärillä olevissa kudoksissa käytettiin hematoksyliini- ja eosiinivärjäystä (H&E) sekä Massonin trikromivärjäystä (MT).Kaneilla, joille oli istutettu paljaat substraatit, vakavat bakteeri-infektiot etenivät, ja H&E-kudoslevyt osoittivat selvästi tulehduksen aiheuttamia paiseita ja nekroosia.Toisaalta erittäin vahva antibiofouling-pinta LOIS estää bakteerien tarttumista, joten se ei osoita infektion merkkejä ja vähentää tulehdusta (kuva 5C).MT-värjäyksen tulokset osoittivat saman suuntauksen.MT-värjäys osoitti kuitenkin myös turvotusta kaneissa, joille oli istutettu LOIS, mikä osoitti, että toipuminen on alkamassa (kuvio 5D).Immuunivasteen asteen tutkimiseksi suoritettiin immunohistokemiallinen (IHC) värjäys käyttämällä immuunivasteeseen liittyviä sytokiinejä TNF-a ja IL-6.Paljasta negatiivista implanttia, joka ei ollut alttiina bakteereille, verrattiin LOIS:iin, joka oli alttiina bakteereille, mutta ei infektoitunut, jotta tutkittiin paranemisprosessia bakteeri-infektion puuttuessa.Kuvio 5E esittää optista kuvaa IHC-diasta, joka ilmentää TNF-a:aa.Ruskea alue edustaa immuunivastetta, mikä osoittaa, että immuunivaste LOIS:ssa on hieman heikentynyt.Lisäksi IL-6:n ilmentyminen LOIS:ssa oli merkittävästi pienempi kuin steriilin alaston negatiivinen ilmentyminen (kuvio 5F).Sytokiinin ilmentyminen kvantifioitiin mittaamalla sytokiinia vastaavan vasta-ainevärjäytymisen pinta-ala (kuvio 5G).Verrattuna negatiivisille implanteille altistettuihin kaneihin, LOIS:lla istutettujen kanien ilmentymistasot olivat alhaisemmat, mikä osoittaa merkittävää eroa.Sytokiinien ilmentymisen väheneminen osoittaa, että LOIS:n pitkäaikaiset, vakaat anti-fouling-ominaisuudet eivät liity pelkästään bakteeri-infektioiden estämiseen, vaan myös FBR:n vähenemiseen, jonka aiheuttavat substraattiin kiinnittyneet makrofagit (53, 57, 58).Siksi LOIS:n immuunivasteominaisuuksista johtuva heikentynyt immuunivaste voi ratkaista implantaation jälkeiset sivuvaikutukset, kuten liiallisen immuunivasteen plastiikkakirurgian jälkeen.
(A) Kaavamainen kaavio biofilmin muodostumisen ja leviämisen mekanismista tartunnan saaneen ortopedisen implantin pinnalle.eDNA, solunulkoinen DNA.(B) Kaaviokuva immuunivasteesta ortopedisen implantin asettamisen jälkeen.(C) Ortopedisten implanttien ympäröivien kudosten H&E-värjäys ja (D) MT-värjäys paljaalla positiivisella ja LOIS-arvolla.Immuuniin liittyvien sytokiinien (E) TNF-a ja (F) IL-6 IHC ovat värjättyjä kuvia alasti negatiivisista ja LOIS-istutetuista kaneista.(G) Sytokiinien ilmentymisen kvantifiointi alueen peittomittauksella (** P <0,01).
LOIS:n biologista yhteensopivuutta ja sen vaikutusta luun paranemisprosessiin tutkittiin in vivo käyttämällä diagnostista kuvantamista [röntgen- ja mikrotietokonetomografiaa (CT)] ja osteoklasti-IHC:tä.Kuva 6A esittää luun paranemisprosessia, joka sisältää kolme eri vaihetta: tulehdus, korjaus ja uudelleenmuodostumisen.Kun murtuma tapahtuu, tulehdussolut ja fibroblastit tunkeutuvat murtuneeseen luuhun ja alkavat kasvaa verisuonikudokseksi.Korjausvaiheessa verisuonikudoksen sisäänkasvu leviää lähelle murtumakohtaa.Verisuonikudos tarjoaa ravinteita uuden luun, jota kutsutaan kalluksi, muodostumiseen.Luun paranemisprosessin viimeinen vaihe on uusiutumisvaihe, jossa kallus pienennetään normaalin luun kokoon aktivoituneiden osteoklastien tason nousun avulla (59).Murtumakohdan kolmiulotteinen (3D) rekonstruktio suoritettiin käyttämällä mikro-CT-skannauksia, jotta havaittiin eroja kallusmuodostuksen tasossa kussakin ryhmässä.Tarkkaile reisiluun poikkileikkausta ja tarkkaile murtumaa luuta ympäröivän kallustuksen paksuutta (kuva 6, B ja C).Röntgensäteitä käytettiin myös kaikkien ryhmien murtumakohtien tutkimiseen joka viikko, jotta havaittiin kunkin ryhmän erilaiset luun regeneraatioprosessit (kuva S9).Kallus ja kypsät luut näkyvät sinisenä/vihreänä ja norsunluun värinä.Useimmat pehmytkudokset suodatetaan pois esiasetetulla kynnysarvolla.Nudepositiivinen ja SHP vahvistivat pienen määrän kallusin muodostumista murtumakohdan ympärille.Toisaalta paljastunutta LOIS:n negatiivia ja murtumakohtaa ympäröi paksu kallus.Mikro-CT-kuvat osoittivat, että kalluseksen muodostumista esti bakteeri-infektio ja infektioon liittyvä tulehdus.Tämä johtuu siitä, että immuunijärjestelmä asettaa etusijalle infektioon liittyvän tulehduksen aiheuttamien septisten vammojen paranemisen luun palautumisen sijaan (60).IHC- ja tartraattiresistentti happofosfataasi (TRAP) -värjäys suoritettiin osteoklastien aktiivisuuden ja luun resorption tarkkailemiseksi (kuvio 6D) (61).Vain muutama aktivoitunut, violetiksi värjätty osteoklasti löydettiin paljaista positiivisista ja SHP:stä.Toisaalta monia aktivoituneita osteoklasteja havaittiin lähellä LOIS:n paljaita positiivisia ja kypsiä luita.Tämä ilmiö osoittaa, että osteoklastien läsnä ollessa murtumakohtaa ympäröivä kallus käy läpi väkivaltaista uudelleenmuotoiluprosessia (62).Kalluksen luun tilavuus ja osteoklastien ilmentymisalue mitattiin, jotta verrattiin kallusmuodostuksen tasoa murtumakohdan ympärillä kaikissa ryhmissä mikro-CT-skannauksen ja IHC-tulosten kvantifioimiseksi (kuva 6E, 1 ja 2).Kuten odotettiin, paljaat negatiivit ja kalluksen muodostuminen LOIS:ssa olivat merkittävästi korkeammat kuin muissa ryhmissä, mikä osoitti, että luun uudelleenmuodostumista tapahtui (63).Kuvassa S10 näkyy leikkauskohdan optinen kuva, ruuvin läheltä kerätyn kudoksen MT-värjäystulos ja TRAP-värjäystulos, joka korostaa ruuvin ja luun rajapintaa.Paljaalla alustalla havaittiin voimakasta kallus- ja fibroosin muodostumista, kun taas LOIS-käsitellyssä implantissa oli suhteellisen tarttumaton pinta.Samoin paljaisiin negatiivisiin verrattuna havaittiin pienempi fibroosi kaneissa, joille oli istutettu LOIS, kuten valkoiset nuolet osoittavat.Lisäksi luja turvotus (sininen nuoli) voidaan katsoa johtuvan LOIS:n immuunivasteen ominaisuuksista, mikä vähentää vakavaa tulehdusta.Tarttumaton pinta implantin ympärillä ja vähentynyt fibroosi viittaavat siihen, että poistoprosessi on helpompi, mikä yleensä johtaa muihin murtumiin tai tulehduksiin.Luun paranemisprosessi ruuvin poistamisen jälkeen arvioitiin osteoklastien aktiivisuudella ruuvin ja luun rajapinnassa.Sekä paljas luu että LOIS-implanttirajapinta absorboivat samanlaisia ​​osteoklasteja luun paranemisen edistämiseksi, mikä osoittaa, että LOIS-pinnoitteella ei ole negatiivista vaikutusta luun paranemiseen tai immuunivasteeseen.Sen varmistamiseksi, että LOIS:lle suoritettu pinnan modifikaatio ei häiritse luun paranemisprosessia, röntgentutkimusta käytettiin verrattaessa kanien luun paranemista altistuneiden negatiivisten ionien ja 6 viikon LOIS-istuttamisen kanssa (kuva 6F).Tulokset osoittivat, että verrattuna infektoitumattomaan nude-positiiviseen ryhmään, LOIS osoitti samanasteista luun paranemista, eikä molemmissa ryhmissä ollut ilmeisiä murtuman merkkejä (jatkuva osteolyysiviiva).
(A) Kaavio luun paranemisprosessista murtuman jälkeen.(B) ero kunkin pintaryhmän kallusmuodostuksen asteessa ja (C) murtumakohdan poikkileikkauskuva.(D) TRAP-värjäys osteoklastien toiminnan ja luun resorption visualisoimiseksi.TRAP-aktiivisuuden perusteella aivokuoren luun ulkoisen kalluksen muodostuminen analysoitiin kvantitatiivisesti (E) (1) mikro-CT:llä ja (2) osteoklastiaktiivisuudella.(F) 6 viikkoa implantaation jälkeen röntgenkuvat paljastetun negatiivin murtuneesta luusta (korostettu punaisella katkoviivalla) ja LOIS:sta (korostettu sinisellä katkoviivalla).Tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntaisella varianssianalyysillä (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Lyhyesti sanottuna LOIS tarjoaa uudentyyppisen antibakteerisen infektiostrategian ja immuunivapaapinnoitteen ortopedisille implanteille.Perinteisillä ortopedisilla implanteilla, joissa on SHP-funktionalisointi, on lyhytaikaisia ​​biofouling-ominaisuuksia, mutta ne eivät voi säilyttää ominaisuuksiaan pitkään.Substraatin superhydrofobisuus vangitsee ilmakuplat bakteerien ja substraatin väliin, muodostaen siten ilmataskuja, mikä estää bakteeri-infektion.Ilman diffuusion ansiosta nämä ilmataskut on kuitenkin helppo poistaa.Toisaalta LOIS on osoittanut hyvin kykynsä estää biofilmiin liittyviä infektioita.Siksi kerrostetun mikro/nanorakenteen pintaan ruiskutetun voiteluainekerroksen hylkimistä ehkäisevien ominaisuuksien ansiosta infektioon liittyvä tulehdus voidaan estää.LOIS-valmistusolosuhteiden optimointiin käytetään erilaisia ​​karakterisointimenetelmiä, kuten SEM-, AFM-, XPS- ja CA-mittauksia.Lisäksi LOIS:ia voidaan soveltaa myös erilaisiin biologisiin materiaaleihin, joita käytetään yleisesti ortopedisissa kiinnityslaitteissa, kuten PLGA, Ti, PE, POM ja PPSU.Sitten LOIS testattiin in vitro sen osoittamiseksi, että se estää biofouling-ominaisuudet bakteereja ja immuunivasteeseen liittyviä biologisia aineita vastaan.Tulokset osoittavat, että sillä on erinomaiset antibakteeriset ja biofouling-vaikutukset verrattuna paljaaseen implanttiin.Lisäksi LOIS osoittaa mekaanista lujuutta myös mekaanisen rasituksen jälkeen, mikä on väistämätöntä plastiikkakirurgiassa.Mikro/nanorakenteen pinnalla olevan voiteluaineen itsekorjautuvien ominaisuuksien ansiosta LOIS säilytti onnistuneesti antibiologiset likaantumisominaisuudet.LOIS:n bioyhteensopivuuden ja antibakteeristen ominaisuuksien tutkimiseksi in vivo LOIS istutettiin kanin reisiluun 4 viikon ajaksi.Bakteeri-infektiota ei havaittu kaneissa, joille oli istutettu LOIS.Lisäksi IHC:n käyttö osoitti paikallisen immuunivasteen alentuneen tason, mikä osoittaa, että LOIS ei estä luun paranemisprosessia.LOIS:lla on erinomaiset antibakteeriset ja immuunivasteominaisuudet, ja sen on todistettu estävän tehokkaasti biofilmin muodostumista ennen ortopedista leikkausta ja sen aikana, erityisesti luusynteesiä varten.Kanin luuytimen tulehduksellisen reisiluun murtuman mallia käyttämällä tutkittiin syvällisesti biofilmiin liittyvien infektioiden vaikutusta esi-inkuboitujen implanttien indusoimaan luun paranemisprosessiin.Tulevaisuuden tutkimuksena tarvitaan uusi in vivo -malli mahdollisten infektioiden tutkimiseksi implantoinnin jälkeen, jotta voidaan täysin ymmärtää ja estää biofilmiin liittyviä infektioita koko paranemisprosessin ajan.Lisäksi osteoinduktio on edelleen ratkaisematon haaste LOIS-integraatiossa.Lisätutkimusta tarvitaan osteoinduktiivisten solujen selektiivisen adheesion tai regeneratiivisen lääketieteen yhdistämiseksi LOIS:iin haasteen voittamiseksi.Kaiken kaikkiaan LOIS edustaa lupaavaa ortopedistä implanttipinnoitetta, jolla on mekaaninen kestävyys ja erinomaiset biofouling-ominaisuudet, jotka voivat vähentää SSI- ja immuunisivuvaikutuksia.
Pese 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS -substraatti (Dong Kang M-Tech Co., Korea) asetonissa, EtOH:ssa ja DI-vedessä 15 minuutin ajan epäpuhtauksien poistamiseksi.Mikro/nanotason rakenteen muodostamiseksi pinnalle puhdistettu substraatti upotetaan 48-51 % HF-liuokseen (DUKSAN Corp., Etelä-Korea) 50°C:ssa.Syövytysaika vaihtelee 0 - 60 minuuttia.Sitten syövytetty substraatti puhdistettiin deionisoidulla vedellä ja asetettiin 65-prosenttiseen HNO3-liuokseen (Korea DUKSAN Corp.) 50 °C:seen 30 minuutiksi kromioksidipassivoivan kerroksen muodostamiseksi pinnalle.Passivoimisen jälkeen substraatti pestään deionisoidulla vedellä ja kuivataan, jolloin saadaan kerrosrakenteinen substraatti.Seuraavaksi substraatti altistettiin happiplasmalle (100 W, 3 minuuttia) ja upotettiin välittömästi liuokseen, jossa oli 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Saksa) tolueenissa huoneenlämpötilassa 12 tunniksi.Sitten POTS:lla päällystetty substraatti puhdistettiin EtOH:lla ja lämpökäsiteltiin 150 °C:ssa 2 tuntia, jolloin saatiin tiheä POTS SAM.SAM-pinnoituksen jälkeen alustalle muodostettiin voiteluainekerros levittämällä perfluoripolyeetterivoiteluainetta (Krytox 101; DuPont, USA), jonka lataustilavuus oli 20 μm/cm 2. Ennen käyttöä voiteluaine suodatetaan 0,2 mikronin suodattimen läpi.Poista ylimääräinen voiteluaine kallistamalla 45° kulmassa 15 minuutin ajan.Samaa valmistusmenetelmää käytettiin 304 SS:stä (lukituslevy ja kortikaalinen lukitusruuvi; Dong Kang M-Tech Co., Korea) valmistettuihin ortopedisiin implantteihin.Kaikki ortopediset implantit on suunniteltu sopimaan kanin reisiluun geometriaan.
Substraatin ja ortopedisten implanttien pinnan morfologia tarkastettiin kenttäemissio SEM:llä (Inspect F50, FEI, USA) ja AFM:llä (XE-100, Park Systems, Etelä-Korea).Pinnan karheus (Ra, Rq) mitataan kertomalla 20 μm:n pinta-ala 20 μm:llä (n=4).Pinnan kemiallisen koostumuksen analysointiin käytettiin XPS-järjestelmää (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japani), joka oli varustettu Al Kα -röntgenlähteellä, jonka pistekoko oli 100 μm2.Nestemäisen CA:n ja SA:n mittaamiseen käytettiin CA-mittausjärjestelmää, joka oli varustettu dynaamisella kuvanottokameralla (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Etelä-Korea).Jokaista mittausta varten pinnalle asetetaan 6–10 μl pisaroita (deionisoitu vesi, hevosen veri, EG, 30 % etanoli ja HD) CA:n mittaamiseksi.Kun alustan kaltevuuskulma kasvaa nopeudella 2°/s (n = 4), SA mitataan pisaran putoaessa.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] ja MRSA (ATCC 25923) ostettiin ATCC:ltä (Manassas, Virginia, USA), ja kantaviljelmää pidettiin -80 °C:ssa.Ennen käyttöä pakastettua viljelmää inkuboitiin trypsiinillä sulatetussa soijaliemessä (Komed, Korea) 37 °C:ssa 18 tuntia ja siirrettiin sitten kahdesti sen aktivoimiseksi.Inkuboinnin jälkeen viljelmää sentrifugoitiin nopeudella 10 000 rpm 10 minuuttia 4 °C:ssa ja pestiin kahdesti PBS-liuoksella (pH 7,3).Sentrifugoitu viljelmä jatkoviljellään sitten veri-agar-maljoilla (BAP).MRSA ja Pseudomonas aeruginosa valmistettiin yön yli ja viljeltiin Luria-Bertani-liemessä.Pseudomonas aeruginosan ja MRSA:n pitoisuus ymppissä määritettiin kvantitatiivisesti suspension CFU:n avulla sarjalaimennoksissa agarilla.Säädä sitten bakteeripitoisuus 0,5 McFarland-standardiin, joka vastaa 108 CFU/ml.Laimenna sitten toimiva bakteerisuspensio 100 kertaa pitoisuuteen 106 CFU/ml.Antibakteeristen tarttumisominaisuuksien testaamiseksi substraattia steriloitiin 121 °C:ssa 15 minuuttia ennen käyttöä.Substraatti siirrettiin sitten 25 ml:aan bakteerisuspensiota ja inkuboitiin 37 °C:ssa voimakkaasti ravistellen (200 rpm) 12 ja 72 tuntia.Inkuboinnin jälkeen jokainen substraatti poistettiin inkubaattorista ja pestiin 3 kertaa PBS:llä pinnalla olevien kelluvien bakteerien poistamiseksi.Biofilmin havaitsemiseksi substraatilla biofilmi kiinnitettiin metanolilla ja värjättiin 1 ml:lla krimidiinioranssia 2 minuutin ajan.Sitten fluoresenssimikroskoopilla (BX51TR, Olympus, Japani) otettiin kuvia värjäytyneestä biofilmistä.Substraatilla olevan biofilmin kvantifioimiseksi kiinnittyneet solut erotettiin substraatista helmipyörremenetelmällä, jota pidettiin sopivimpana menetelmänä kiinnittyneiden bakteerien poistamiseksi (n = 4).Poista substraatti kasvualustasta steriileillä pihdeillä ja napauta kuoppalevyä poistaaksesi ylimääräinen neste.Löysästi kiinnittyneet solut poistettiin pesemällä kahdesti steriilillä PBS:llä.Jokainen substraatti siirrettiin sitten steriiliin koeputkeen, joka sisälsi 9 ml 0,1-prosenttista proteiini-ept-suolaliuosta (PSW) ja 2 g 20-25 steriiliä lasihelmeä (halkaisijaltaan 0,4-0,5 mm).Sitten sitä vorteksoitiin 3 minuuttia solujen irrottamiseksi näytteestä.Vorteksoimisen jälkeen suspensio sarjalaimennettiin 10-kertaisesti 0,1-prosenttisella PSW:llä ja sitten 0,1 ml kutakin laimennusta ympättiin BAP:lla.24 tunnin 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen CFU laskettiin manuaalisesti.
Soluille käytettiin hiiren fibroblasteja NIH/3T3 (CRL-1658; amerikkalainen ATCC) ja hiiren makrofageja RAW 264.7 (TIB-71; amerikkalainen ATCC).Käytä Dulbeccon modifioitua Eagle-elatusainetta (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) hiiren fibroblastien viljelemiseen ja lisää 10 % vasikan seerumia (S103-01, Welgene) ja 1 % penisilliini-streptomysiiniä (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene). ) Käytä hiiren makrofagien viljelemiseen DMEM:ää, jota on täydennetty 10 %:lla naudan sikiön seerumilla (S001-01, Welgene) ja 1 % PS:llä. Aseta substraatti kuuden kuopan soluviljelylevylle ja siirrosta solut 105 solua/cm2. Soluja inkuboitiin yön yli 37 °C:ssa ja 5 % C02:ssa Solujen värjäystä varten solut kiinnitettiin 4-prosenttisella paraformaldehydillä 20 minuutiksi ja asetettiin 0,5-prosenttiseen Triton X Incubate -liuokseen -100 °C:ssa. Upota substraatti 50 nM tetrametyylirodamiiniin 37 °C:ssa 30 minuuttia, käytä substraattia 4',6-diamino-2-fenyyli-indolin kanssa (H-1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD-kiinnityselatusaine (n = 4 per solu). , fluoreseiini, fluoreseiini-isotiosyanaattialbumiini (A9771, Sigma-Aldrich, Saksa) ja ihmisen plasma Alexa Fluor 488 -konjugoitu fibrinogeeni (F13191, Invitrogen, USA) liuotettiin PBS:ään (10 mM, pH 7,4).Albumiinin ja fibrinogeenin pitoisuudet olivat 1 ja 150 μg/ml, vastaavasti.Substraatin jälkeen Ennen proteiiniliuokseen upottamista huuhtele ne PBS:llä pinnan kosteuttamiseksi.Upota sitten kaikki substraatit kuusikuoppaiselle levylle, joka sisältää proteiiniliuoksen, ja inkuboi 37 °C:ssa 30 ja 90 minuuttia.Inkuboinnin jälkeen substraatti poistettiin sitten proteiiniliuoksesta, pestiin varovasti PBS:llä 3 kertaa ja kiinnitettiin 4 % paraformaldehydillä (n = 4 kullekin proteiinille).Kalsiumille natriumkloridi (0,21 M) ja kaliumfosfaatti (3,77 mM) liuotettiin deionisoituun veteen.Liuoksen pH säädettiin arvoon 2,0 lisäämällä hydrokloridiliuosta (1 M).Sitten kalsiumkloridia (5,62 mM) liuotettiin liuokseen.Lisäämällä 1 M tris(hydroksimetyyli)aminoa metaani säätää liuoksen pH:n arvoon 7,4.Upota kaikki substraatit kuusikuoppaiseen levyyn, joka on täytetty 1,5-kertaisella kalsiumfosfaattiliuoksella, ja poista liuoksesta 30 minuutin kuluttua.Värjäämiseen 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Sekoita 100 ml:aan deionisoitua vettä.Säädä sitten pH 4:ään 10-prosenttisella ammoniumhydroksidilla. Värjää substraattia Alizarin Red -liuoksella 5 minuutin ajan, ravista sitten ylimääräinen väriaine ja pyyhi.Irrota alusta ravistuksen jälkeen.Materiaali dehydratoidaan, sitten upotetaan asetoniin 5 minuutiksi, sitten upotetaan asetoni-ksyleeni-liuokseen (1:1) 5 minuutiksi ja lopuksi pestään ksyleenillä (n = 4).Käytetään fluoresenssimikroskooppia (Axio Imager), jossa on ×10 ja ×20 objektiivilinssit..A2m, Zeiss, Saksa) kuvaa kaikki substraatit.ImageJ/FIJI:tä (https://imagej.nih.gov/ij/) käytettiin kvantifioimaan biologisten aineiden tarttuvuustiedot jokaisessa neljän eri kuvantamisalueen ryhmässä.Muunna kaikki kuvat binäärikuviksi, joissa on kiinteät kynnysarvot substraattien vertailua varten.
Zeiss LSM 700 konfokaalimikroskooppia käytettiin PBS:n voiteluainekerroksen stabiilisuuden tarkkailuun heijastustilassa.Fluoripohjainen SAM-pinnoitettu lasinäyte, jossa oli injektoitu voiteluainekerros, upotettiin PBS-liuokseen ja testattiin käyttämällä orbitaaliravistelijaa (SHO-1D; Daihan Scientific, Etelä-Korea) miedoissa ravisteluolosuhteissa (120 rpm).Ota sitten näyte ja seuraa voiteluaineen häviämistä mittaamalla heijastuneen valon häviö.Fluoresenssikuvien saamiseksi heijastustilassa näyte altistetaan 633 nm:n laserille ja kerätään sitten, koska valo heijastuu takaisin näytteestä.Näytteet mitattiin 0, 30, 60 ja 120 tunnin välein.
Pintamodifikaatioprosessin vaikutuksen määrittämiseksi ortopedisten implanttien nanomekaanisiin ominaisuuksiin käytettiin nanoindenedionin mittaamiseen nanoindenteriä (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA), joka oli varustettu kolmisivuisella pyramidin muotoisella Berkovich-timanttikärjellä.Huippukuorma on 10 mN ja pinta-ala 100 μm x 100 μm.Kaikissa mittauksissa lastaus- ja purkuaika on 10 s ja pitoaika huippukuormituksen alla on 2 s.Ota mittauksia viidestä eri paikasta ja ota keskiarvo.Mekaanisen lujuuden arvioimiseksi kuormitettuna suoritettiin poikittaissuuntainen kolmen pisteen taivutuskoe yleisellä testauskoneella (Instron 5966, Instron, USA).Substraattia puristetaan kokoon vakionopeudella 10 N/s lisääntyneellä kuormalla.Taivutuskertoimen ja suurimman puristusjännityksen laskemiseen käytettiin Bluehill Universal -ohjelmistoa (n = 3).
Leikkausprosessin ja siihen liittyvien leikkauksen aikana syntyneiden mekaanisten vaurioiden simuloimiseksi leikkausprosessi suoritettiin in vitro.Reisiluut kerättiin teloitetuilta Uuden-Seelannin valkoisilta kaneilta.Reisi puhdistettiin ja kiinnitettiin 4 % paraformaldehydissä 1 viikon ajan.Kuten eläinkoemenetelmässä on kuvattu, kiinteä reisiluu leikattiin kirurgisesti.Leikkauksen jälkeen ortopedinen implantti upotettiin vereen (hevosen veri, KISAN, Korea) 10 sekunniksi sen varmistamiseksi, esiintyikö veren tarttumista mekaanisen vaurion jälkeen (n = 3).
Yhteensä 24 urospuolista valkoista Uuden-Seelannin kania (paino 3,0-3,5 kg, keski-ikä 6 kuukautta) jaettiin satunnaisesti neljään ryhmään: nude negatiivinen, nude positiivinen, SHP ja LOIS.Kaikki eläimiä koskevat toimenpiteet suoritettiin Institutional Animal Care and Use Committeen (IACUC-hyväksytty, KOREA-2017-0159) eettisten standardien mukaisesti.Ortopedinen implantti koostuu lukituslevystä, jossa on viisi reikää (pituus 41 mm, leveys 7 mm ja paksuus 2 mm) ja aivokuoren lukitusruuveista (pituus 12 mm, halkaisija 2,7 mm) murtuman kiinnitystä varten.Lukuun ottamatta niitä levyjä ja ruuveja, joita käytettiin paljain negatiivisessa ryhmässä, kaikkia levyjä ja ruuveja inkuboitiin MRSA-suspensiossa (106 CFU/ml) 12 tunnin ajan.Paljaa-negatiivinen ryhmä (n = 6) käsiteltiin paljaalla pinnalla olevilla implanteilla altistamatta bakteerisuspensiolle negatiivisena kontrollina infektiolle.Paljas positiivinen ryhmä (n = 6) käsiteltiin paljaalla pinnalla olevalla implantilla, joka altistui bakteereille positiivisena kontrollina infektiolle.SHP-ryhmää (n = 6) käsiteltiin bakteereille altistuneilla SHP-implanteilla.Lopuksi LOIS-ryhmää käsiteltiin bakteereille altistetuilla LOIS-implanteilla (n = 6).Kaikki eläimet pidetään häkissä, ja niille tarjotaan runsaasti ruokaa ja vettä.Ennen leikkausta kaneja paastottiin 12 tuntia.Eläimet nukutettiin intramuskulaarisella ksylatsiiniinjektiolla (5 mg/kg) ja suonensisäisellä paklitakselin injektiolla (3 mg/kg) induktiota varten.Sen jälkeen anna 2 % isofluraania ja 50 % - 70 % lääketieteellistä happea (virtausnopeus 2 l/min) hengityselinten läpi anestesian ylläpitämiseksi.Se implantoidaan suoran lähestymisen kautta lateraaliseen reisiluun.Karvanpoiston ja ihon povidoni-jodidesinfioinnin jälkeen tehtiin noin 6 cm pitkä viilto vasemman keskireiluun ulkopuolelle.Avaamalla reisiluuta peittävien lihasten välinen rako, reisiluu paljastuu kokonaan.Aseta levy reisivarren eteen ja kiinnitä se neljällä ruuvilla.Kiinnityksen jälkeen käytä sahanterää (1 mm paksu) luodaksesi keinotekoisesti murtuma toisen ja neljännen reiän väliselle alueelle.Leikkauksen lopussa haava pestiin suolaliuoksella ja suljettiin ompeleilla.Kuhunkin kaniin injektoitiin ihonalaisesti enrofloksasiinia (5 mg/kg), joka oli laimennettu kolmasosaan suolaliuoksella.Kaikista eläimistä (0, 7, 14, 21, 28 ja 42 päivää) otettiin leikkauksen jälkeiset röntgenkuvat luun osteotomian vahvistamiseksi.Syvän anestesian jälkeen kaikki eläimet tapettiin suonensisäisellä KCl:lla (2 mmol/kg) 28 ja 42 päivänä.Suorituksen jälkeen reisiluu skannattiin mikro-CT:llä luun paranemisprosessin ja uuden luun muodostumisen tarkkailemiseksi ja vertaamiseksi neljän ryhmän välillä.
Suorituksen jälkeen pehmytkudokset, jotka olivat suorassa kosketuksessa ortopedisten implanttien kanssa, kerättiin.Kudos kiinnitettiin 10-prosenttisessa neutraalissa puskuroidussa formaliinissa yön yli ja dehydratoitiin sitten EtOH:ssa.Dehydratoitu kudos upotettiin parafiiniin ja leikattiin 40 μm:n paksuuteen käyttämällä mikrotomia (400CS; EXAKT, Saksa).Infektion visualisoimiseksi suoritettiin H&E-värjäys ja MT-värjäys.Isännän vasteen tarkistamiseksi leikattua kudosta inkuboitiin kanin primaarisen anti-TNF-a-vasta-aineen (AB6671, Abcam, USA) ja kanin anti-IL-6:n (AB6672; Abcam, USA) kanssa ja käsiteltiin sitten piparjuurella.Oksidaasi.Levitä leikkeihin avidiini-biotiinikompleksi (ABC) -värjäysjärjestelmä valmistajan ohjeiden mukaisesti.Jotta se näyttäisi ruskeana reaktiotuotteena, 3,3-diaminobentsidiiniä käytettiin kaikissa osissa.Kaikkien viipaleiden visualisointiin käytettiin digitaalista diaskanneria (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Unkari), ja vähintään neljä substraattia kussakin ryhmässä analysoitiin ImageJ-ohjelmistolla.
Kaikista eläimistä otettiin röntgenkuvat leikkauksen jälkeen ja joka viikko murtumien paranemisen seuraamiseksi (n = 6 ryhmää kohti).Suorituksen jälkeen korkean resoluution mikro-CT:tä käytettiin laskemaan kallusin muodostuminen reisiluun ympärille paranemisen jälkeen.Saatu reisiluu puhdistettiin, kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 3 päivän ajan ja kuivattiin 75-prosenttisessa etanolissa.Kuivatut luut skannattiin sitten käyttämällä mikro-CT:tä (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgia) 3D-vokselikuvien (2240 ​​× 2240 pikseliä) luomiseksi luunäytteestä.Käytä 1,0 mm:n Al-suodatinta signaalikohinan vähentämiseen ja käytä korkeaa resoluutiota kaikissa skannauksissa (E = 133 kVp, I = 60 μA, integrointiaika = 500 ms).Nrecon-ohjelmistoa (versio 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgia) käytettiin luomaan skannatun näytteen 3D-tilavuus hankitusta 2D-sivuprojektiosta.Analysointia varten 3D-rekonstruoitu kuva jaetaan 10mm × 10mm × 10mm kuutioihin murtumiskohdan mukaan.Laske kallus kortikaalisen luun ulkopuolella.Skannatun luutilavuuden digitaaliseen uudelleenohjaukseen käytettiin DataViewer (versio 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgia) ohjelmistoa ja analysointiin CT-Analyzer (versio 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgia) ohjelmistoa.Suhteelliset röntgensäteilyn absorptiokertoimet kypsässä luussa ja kalluksessa erotetaan niiden tiheydestä, ja sitten kalluksen tilavuus määritetään (n = 4).Sen varmistamiseksi, että LOIS:n biologinen yhteensopivuus ei hidasta luun paranemisprosessia, suoritettiin ylimääräinen röntgen- ja mikro-CT-analyysi kahdelle kanille: alasti-negatiiviselle ja LOIS-ryhmälle.Molemmat ryhmät teloitettiin 6. viikolla.
Lopetettujen eläinten reisiluut kerättiin ja kiinnitettiin 4-prosenttisessa paraformaldehydissä 3 päivän ajan.Ortopedinen implantti poistetaan sitten varovasti reisiluusta.Reisiluun kalkki poistettiin 21 päivän ajan käyttämällä 0,5 M EDTA:ta (EC-900, National Diagnostics Corporation).Sitten kalkinpoistettu reisiluu upotettiin EtOH:iin, jotta se kuivattiin.Kuivattu reisiluu poistettiin ksyleeniin ja upotettiin parafiiniin.Sitten näyte viipaloitiin automaattisella pyörivällä mikrotomilla (Leica RM2255, Leica Biosystems, Saksa), jonka paksuus oli 3 μm.TRAP-värjäystä varten (F6760, Sigma-Aldrich, Saksa) leikatuista näytteistä parafiini poistettiin, hydratoitiin uudelleen ja inkuboitiin TRAP-reagenssissa 37 °C:ssa 1 tunti.Kuvat hankittiin diaskannerilla (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Unkari) ja kvantifioitiin mittaamalla värjäytyneen alueen peittoalue.Jokaisessa kokeessa vähintään neljä substraattia kussakin ryhmässä analysoitiin ImageJ-ohjelmistolla.
Tilastollinen merkitsevyysanalyysi suoritettiin käyttämällä GraphPad Prismia (GraphPad Software Inc., USA).Pariton t-testi ja yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) käytettiin arvioimaan arviointiryhmien välisiä eroja.Merkitystaso on esitetty kuvassa seuraavasti: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 ja ****P<0,0001;NS, ei merkittävää eroa.
Tämän artikkelin lisämateriaalit ovat osoitteessa http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Tämä on avoimen pääsyn artikkeli, jota jaetaan Creative Commons Attribution-Non-Commercial License -lisenssin ehtojen mukaisesti ja joka sallii käytön, jakelun ja jäljentämisen missä tahansa välineessä, kunhan käyttö ei ole kaupallista hyötyä ja lähtökohtana on, että alkuperäinen työ on oikein.Viite.
Huomautus: Pyydämme sinua antamaan sähköpostiosoitteen vain, jotta sivulle suosittelemasi henkilö tietää, että haluat hänen näkevän sähköpostin ja ettei sähköposti ole roskapostia.Emme tallenna sähköpostiosoitteita.
Tätä kysymystä käytetään testaamaan, oletko ihminen vierailija, ja estämään automaattiset roskapostin lähetykset.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Ortopedisten implanttien antibakteeriset ja immuunivasteet voivat vähentää infektioita ja infektioiden aiheuttamia immuunivasteita.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Ortopedisten implanttien antibakteeriset ja immuunivasteet voivat vähentää infektioita ja infektioiden aiheuttamia immuunivasteita.
©2021 American Association for the Advanced of Science.kaikki oikeudet pidätetään.AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER kumppani.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.