정형외과 임플란트 수술을 받는 환자의 경우 세균 감염과 감염으로 인한 면역 반응은 항상 생명을 위협하는 위험이었습니다.기존의 생물학적 재료는 생물학적 오염에 취약하여 박테리아가 손상된 부위에 침입하여 수술 후 감염을 유발합니다.따라서 정형외과용 임플란트용 항감염 및 면역 탈출 코팅제의 개발이 시급한 상황이다.여기서 우리는 투수 식물 피처의 매끄러운 표면에서 영감을 얻은 LOIS(Lubricated Orthopaedic Implant Surface)라는 정형외과 임플란트용 고급 표면 수정 기술을 개발했습니다.LOIS는 다양한 액체 및 생물학적 물질(세포, 단백질, 칼슘, 박테리아 포함)에 대해 오래 지속되고 강력한 발액성을 가지고 있습니다.또한, 체외 수술 중 불가피한 손상을 시뮬레이션하여 긁힘에 대한 기계적 내구성과 고정력을 확인했습니다.토끼 골수 염증성 대퇴부 골절 모델을 사용하여 LOIS의 항생물학적 스케일링 및 항감염 능력을 철저하게 연구했습니다.우리는 생물부착 방지 특성과 기계적 내구성을 갖춘 LOIS가 무감염 정형외과 수술의 한 단계 발전이 될 것으로 기대합니다.
오늘날 전반적인 고령화로 인해 정형외과 질환(노인 골절, 퇴행성 관절질환, 골다공증 등)을 앓고 있는 환자의 수가 크게 증가하였다(1, 2).따라서 의료기관에서는 나사, 판, 손톱 및 인공 관절의 정형외과 임플란트를 포함한 정형외과 수술을 매우 중요하게 생각합니다(3, 4).그러나 기존의 정형외과용 임플란트는 박테리아 부착 및 생물막 형성에 취약한 것으로 보고되었으며, 이는 수술 후 수술 부위 감염(SSI)을 일으킬 수 있습니다(5, 6).정형외과용 임플란트의 표면에 일단 바이오필름이 형성되면, 다량의 항생제를 사용해도 바이오필름을 제거하는 것이 극도로 어려워집니다.따라서 대개 심각한 수술 후 감염으로 이어진다(7, 8).위와 같은 문제로 인해 감염된 임플란트의 치료에는 모든 임플란트와 주변 조직을 제거하는 재수술이 포함되어야 합니다.따라서 환자는 심한 통증과 일부 위험을 겪게 됩니다(9, 10).
이러한 문제 중 일부를 해결하기 위해 표면에 부착된 박테리아를 제거하여 감염을 방지하는 약물 용출 정형외과용 임플란트가 개발되었습니다(11, 12).그러나 이 전략은 여전히 ​​몇 가지 한계를 보여줍니다.약물방출 임플란트를 장기간 이식하면 주변 조직이 손상되고 염증이 발생하여 괴사를 일으킬 수 있다는 보고가 있다(13, 14).또한, 미국 식품의약국(FDA)에서 엄격히 금지하고 있는 약물 용출 정형외과용 임플란트 제조 과정 이후에 존재할 수 있는 유기용매는 해당 표준을 충족하기 위해 추가적인 정제 단계가 필요합니다(15).약물 방출 임플란트는 약물 방출을 조절하기가 어렵고 약물 부하가 제한되어 있어 약물을 장기간 적용하는 것이 불가능합니다(16).
또 다른 일반적인 전략은 생물학적 물질과 박테리아가 표면에 부착되는 것을 방지하기 위해 오염 방지 폴리머로 임플란트를 코팅하는 것입니다(17).예를 들어, 양쪽이온성 폴리머는 혈장 단백질, 세포 및 박테리아와 접촉할 때 비접착성 특성으로 인해 주목을 받았습니다.그러나 장기 안정성 및 기계적 내구성과 관련된 몇 가지 제한 사항이 있어 정형외과 임플란트에서의 실제 적용을 방해하며, 특히 수술 중 기계적 긁힘으로 인해 더욱 그렇습니다(18, 19).또한 생체 적합성이 높고 제거 수술이 필요하지 않으며 부식을 통한 표면 세척 특성으로 인해 생분해성 재료로 만든 정형외과용 임플란트가 사용되어 왔습니다(20, 21).부식이 진행되는 동안 폴리머 매트릭스 사이의 화학적 결합이 분해되어 표면에서 분리되고 부착물이 표면을 청소합니다.그러나 표면 청소에 의한 항균 오염은 단시간에 효과적입니다.또한 폴리(락트산-글리콜산 공중합체)(PLGA), 폴리락트산(PLA) 및 마그네슘 기반 합금을 포함한 대부분의 흡수성 물질은 체내에서 고르지 않은 생분해 및 침식을 겪게 되어 기계적 안정성에 부정적인 영향을 미칩니다.(스물 둘).또한 생분해성 판 조각은 박테리아가 부착할 수 있는 장소를 제공하므로 장기적으로 감염 가능성이 높아집니다.이러한 기계적 저하 및 감염 위험은 성형수술의 실제 적용을 제한합니다(23).
연꽃 잎의 계층 구조를 모방한 초소수성(SHP) 표면은 오염 방지 표면을 위한 잠재적인 솔루션이 되었습니다(24, 25).SHP 표면을 액체에 담그면 기포가 갇히게 되어 공기 주머니를 형성하고 박테리아 부착을 방지합니다(26).그러나 최근 연구에 따르면 SHP 표면은 기계적 내구성 및 장기 안정성과 관련된 단점이 있어 의료용 임플란트에 적용하는 데 방해가 되는 것으로 나타났습니다.더욱이 에어 포켓은 용해되어 오염 방지 특성을 잃어 SHP 표면의 넓은 표면적으로 인해 박테리아 부착이 더 넓어집니다(27, 28).최근 Aizenberg와 동료들은 Nepenthes 투수 식물에서 영감을 받아 매끄러운 표면을 개발하여 생물 부착 방지 표면 코팅의 혁신적인 방법을 소개했습니다(29, 30).매끄러운 표면은 수압 조건에서 장기간 안정성을 나타내며 생물학적 액체에 대한 액체 반발성이 매우 뛰어나며 자가 복구 특성을 갖습니다.그러나 복잡한 모양의 의료용 임플란트에 코팅을 적용하는 방법은 없으며, 이식 후 손상된 조직의 치유 과정을 지원하는 것도 입증되지 않았습니다.
여기에서는 마이크로/나노 구조의 정형외과 임플란트 표면인 윤활 정형외과 임플란트 표면(LOIS)을 소개하고 얇은 윤활층과 긴밀하게 결합하여 성형수술 골절 고정과 같은 세균 감염과 관련되지 않도록 합니다.개발된 LOIS는 불소화 마이크로/나노급 구조가 윤활제를 구조물에 견고하게 고정시키기 때문에 다양한 액체의 부착을 완벽하게 차단하고 오랫동안 방오 성능을 유지할 수 있다.LOIS 코팅은 뼈 합성을 위한 다양한 형태의 재료에 적용될 수 있습니다.LOIS의 생물막 박테리아(녹농균 및 메티실린 저항성 황색포도상구균(MRSA))와 생물학적 물질(세포, 단백질, 칼슘)에 대한 우수한 생물부착 방지 특성이 시험관 내에서 확인되었습니다.기재에 대한 광범위한 접착의 접착률은 1% 미만입니다.또한, 표면 긁힘과 같은 기계적 응력이 발생한 후에도 윤활제가 침투하여 자가 치유되어 방오 특성을 유지하는 데 도움이 됩니다.기계적 내구성 테스트 결과, 구조적, 화학적 변형 후에도 전체 강도가 크게 감소하지 않는 것으로 나타났습니다.또한, LOIS가 성형수술 중 발생하는 다양한 기계적 응력을 견딜 수 있음을 입증하기 위해 수술 환경에서 기계적 응력을 시뮬레이션하는 시험관 내 실험을 수행했습니다.마지막으로 우리는 토끼 기반의 생체 내 대퇴골 골절 모델을 사용하여 LOIS가 우수한 항균 특성과 생체 적합성을 가지고 있음을 입증했습니다.방사선학적 및 조직학적 결과를 통해 이식 후 4주 이내에 안정적인 윤활 작용과 항생물 부착 특성이 뼈 치유 과정을 지연시키지 않으면서 효과적인 항감염 및 면역 탈출 성능을 달성할 수 있음을 확인했습니다.
그림 1A는 우수한 항생물학적 오염 및 항감염 특성을 확인하기 위해 토끼 대퇴골 골절 모델에 마이크로/나노 규모 구조가 이식된 개발된 LOIS의 개략도를 보여줍니다.화분 식물의 표면을 시뮬레이션하고, 표면의 마이크로/나노 구조 내에 윤활제 층을 삽입하여 생물 부착을 방지하기 위해 생체 모방 방법이 수행됩니다.윤활제를 주입한 표면은 생물학적 물질과 표면의 접촉을 최소화할 수 있습니다.따라서 표면에 안정적인 화학결합이 형성되어 있어 방오성능이 우수하고 장기 안정성이 우수합니다.결과적으로 윤활 표면의 생물부착 방지 특성은 생물 의학 연구에서 다양한 실제 응용을 가능하게 합니다.그러나 이 특별한 표면이 신체 내에서 어떻게 상호작용하는지에 대한 광범위한 연구는 아직 완료되지 않았습니다.알부민과 생물막 박테리아를 사용하여 LOIS를 체외에서 노출된 기판과 비교함으로써 LOIS의 비접착성을 확인할 수 있습니다(그림 1B).또한 경사진 기판과 LOIS 기판(그림 S1 및 영화 S1)의 물방울을 굴려 생물학적 오염 성능을 입증할 수 있습니다.형광현미경 이미지에서 볼 수 있듯이, 단백질과 박테리아의 현탁액에 배양된 노출된 기질은 표면에 다량의 생물학적 물질이 부착되어 있는 것으로 나타났습니다.그러나 뛰어난 생물부착 방지 특성으로 인해 LOIS는 형광을 거의 나타내지 않습니다.LOIS의 항생물부착 및 항감염 특성을 확인하기 위해 뼈 합성용 정형외과용 임플란트(플레이트 및 나사) 표면에 LOIS를 적용하고 토끼 골절 모델에 배치했습니다.이식 전, 노출된 정형외과 임플란트와 LOIS를 세균 현탁액에서 12시간 동안 배양하였다.사전 배양을 통해 비교를 위해 노출된 임플란트 표면에 생물막이 형성됩니다.그림 1C는 이식 후 4주가 지난 골절 부위의 사진을 보여줍니다.왼쪽은 노출된 정형외과 보형물을 장착한 토끼의 경우 보형물 표면에 바이오필름이 형성되어 염증이 심한 수준으로 나타났습니다.LOIS를 이식한 토끼에서는 반대 결과가 관찰되었습니다. 즉, LOIS 주변 조직에서는 감염 징후나 염증 징후가 전혀 나타나지 않았습니다.또한 왼쪽의 광학 이미지는 보형물이 노출된 토끼의 수술 부위를 나타내며, 노출된 보형물 표면에 존재하는 다중 접착제가 LOIS 표면에서 발견되지 않았음을 나타냅니다.이는 LOIS가 장기적인 안정성을 갖고 있으며, 항생물학적 오염 방지 및 유착 방지 특성을 유지하는 능력이 있음을 보여줍니다.
(A)토끼 대퇴 골절 모델에 LOIS와 이식의 개략도.(B) 노출된 표면과 LOIS 기판의 단백질 및 박테리아 생물막의 형광 현미경 이미지.이식 4주 후, (C) 골절 부위의 사진 이미지 및 (D) X선 이미지(빨간색 직사각형으로 강조 표시).이미지 제공: 채교민, 연세대학교.
멸균되고 노출된 음성 이식 토끼는 염증이나 감염의 징후 없이 정상적인 뼈 치유 과정을 보여주었습니다.반면, 박테리아 현탁액에서 사전 배양된 SHP 임플란트는 주변 조직에 감염 관련 염증을 나타냅니다.이는 박테리아 부착을 오랫동안 억제할 수 없기 때문일 수 있습니다(그림 S2).LOIS가 치유 과정에 영향을 미치지 않지만 이식과 관련된 감염 가능성을 억제한다는 것을 증명하기 위해 노출된 양성 매트릭스의 X선 이미지와 골절 부위의 LOIS를 비교했습니다(그림 1D).노출된 양성 임플란트의 X-ray 이미지에서는 지속적인 골용해선이 나타나 뼈가 완전히 치유되지 않았음을 나타냅니다.이는 감염과 관련된 염증으로 인해 뼈 회복 과정이 크게 지연될 수 있음을 시사합니다.반면, LOIS를 이식한 토끼는 치유되었으며 뚜렷한 골절 부위가 보이지 않는 것으로 나타났습니다.
장기적인 안정성과 기능성(생체오염 저항성 포함)을 갖춘 의료용 임플란트를 개발하기 위해 많은 노력이 이루어져 왔습니다.그러나 다양한 생물학적 물질의 존재와 조직 접착의 역학으로 인해 임상적으로 신뢰할 수 있는 방법의 개발이 제한됩니다.이러한 단점을 극복하기 위해 우리는 마이크로/나노 층 구조와 화학적으로 개질된 표면을 개발했습니다. 이는 높은 모세관력과 화학적 친화력으로 최적화되어 가장 부드러운 윤활유를 최대한 유지합니다.그림 2A는 LOIS의 전체 제조 공정을 보여줍니다.먼저 의료용 스테인리스강(SS) 304 기판을 준비합니다.둘째, 불산(HF) 용액을 이용한 화학적 식각을 통해 SS 기판에 마이크로/나노 구조를 형성한다.SS의 내식성을 회복하기 위해 질산(HNO3) 용액(31)을 사용하여 에칭된 기판을 처리한다.패시베이션은 SS 기판의 내식성을 향상시키고 LOIS의 전반적인 성능을 저하시킬 수 있는 부식 과정을 크게 늦춥니다.그런 다음 1H, 1H, 2H, 2H-퍼플루오로옥틸트리에톡시실란(POTS)으로 자기 조립 단층(SAM)을 형성함으로써 표면을 화학적으로 개질하여 표면과 매끄러운 윤활제 친화력 사이의 화학적 상호 작용을 향상시킵니다.표면 변형은 제작된 마이크로/나노 규모 구조 표면의 표면 에너지를 크게 감소시키며 이는 매끄러운 윤활제의 표면 에너지와 일치합니다.이를 통해 윤활유가 완전히 젖어 표면에 안정적인 윤활층을 형성할 수 있습니다.변형된 표면은 향상된 소수성을 나타냅니다.결과는 미끄러운 윤활제가 마이크로/나노 구조로 인한 높은 화학적 친화력과 모세관력으로 인해 LOIS에서 안정적인 거동을 나타냄을 보여줍니다(32, 33).표면 개질 및 윤활제 주입 후 SS 표면의 광학적 변화를 연구했습니다.표면에 형성된 마이크로/나노 층 구조는 시각적인 변화를 일으키고 표면을 어둡게 만들 수 있습니다.이 현상은 거친 표면에서 향상된 광산란 효과에 기인하며, 이는 광 포획 메커니즘(34)에 의해 발생하는 확산 반사를 증가시킵니다.또한 윤활유 주입 후 LOIS가 어두워집니다.윤활층은 기판에서 반사되는 빛의 양을 줄여 LOIS를 어둡게 만듭니다.미생물 오염 방지 성능을 달성하기 위해 가장 작은 슬라이딩 각도(SA)를 표시하도록 미세 구조/나노 구조를 최적화하기 위해 주사 전자 현미경(SEM)과 원자 쌍을 사용하여 서로 다른 HF 에칭 시간(0, 3)을 수행했습니다., 15분 및 60분) 힘 현미경(AFM)(그림 2B).SEM 및 AFM 이미지는 짧은 에칭 시간(에칭 3분) 후에 베어 기판이 고르지 않은 나노 크기 거칠기를 형성했음을 보여줍니다.표면 거칠기는 에칭 시간에 따라 변합니다(그림 S3).시간 변화 곡선은 표면 거칠기가 계속 증가하여 에칭 15분에 최고점에 도달한 다음 에칭 30분에 거칠기 값이 약간 감소하는 것을 보여줍니다.이 시점에서 나노 수준의 거칠기는 식각되어 없어지고, 마이크로 수준의 거칠기는 활발하게 발달하여 거칠기 변화가 보다 안정적으로 이루어집니다.30분 이상 에칭한 후 거칠기가 더욱 증가한 것이 관찰되었으며, 이는 다음과 같이 자세히 설명됩니다. SS는 철, 크롬, 니켈, 몰리브덴 및 기타 여러 원소를 포함한 원소와 합금된 강철로 구성됩니다.이들 원소 중에서 철, 크롬, 몰리브덴은 HF 에칭에 의해 SS에 미크론/나노 규모의 거칠기를 형성하는 데 중요한 역할을 합니다.부식 초기에는 몰리브덴이 몰리브덴보다 내식성이 높기 때문에 철과 크롬이 주로 부식됩니다.에칭이 진행됨에 따라 에칭 용액은 국부적인 과포화 상태에 도달하여 에칭으로 인해 불화물과 산화물이 형성됩니다.불화물과 산화물은 침전되어 결국 표면에 재침전되어 미크론/나노 범위의 표면 거칠기를 형성합니다(31).이 마이크로/나노 수준의 거칠기는 LOIS의 자가 치유 특성에서 중요한 역할을 합니다.이중 스케일 표면은 시너지 효과를 생성하여 모세관력을 크게 증가시킵니다.이 현상은 윤활제가 표면에 안정적으로 침투할 수 있게 하고 자가 치유 특성에 기여합니다(35).거칠기의 형성은 에칭 시간에 따라 달라집니다.10분 동안 에칭하면 표면에는 나노 크기의 거칠기만 포함되는데, 이는 생물 오염 저항성을 갖기에 충분한 윤활유를 담기에 충분하지 않습니다(36).반면, 에칭 시간이 30분을 초과하면 철과 크롬이 재증착되어 형성된 나노 크기의 거칠기가 사라지고, 몰리브덴으로 인해 미세한 크기의 거칠기만 남게 된다.과도하게 에칭된 표면은 나노 크기 거칠기가 부족하고 2단계 거칠기의 시너지 효과를 잃어 LOIS의 자가 치유 특성에 부정적인 영향을 미칩니다.오염 방지 성능을 입증하기 위해 에칭 시간이 다른 기판에 대해 SA 측정을 수행했습니다.탈이온수(DI), 혈액, 에틸렌 글리콜(EG), 에탄올(EtOH) 및 헥사데칸(HD)을 포함하여 점도 및 표면 에너지를 기준으로 다양한 유형의 액체가 선택되었습니다(그림 S4).시간에 따라 변하는 에칭 패턴은 표면 에너지와 점도가 다른 다양한 액체에 대해 에칭 15분 후 LOIS의 SA가 가장 낮다는 것을 보여줍니다.따라서 LOIS는 15분 동안 에칭하여 마이크론 및 나노 수준의 거칠기를 형성하도록 최적화되어 있으며, 이는 윤활유의 내구성과 우수한 방오성을 효과적으로 유지하는 데 적합합니다.
(A) LOIS의 4단계 제조 공정에 대한 개략도.삽입된 그림은 기판에 형성된 SAM을 보여줍니다.(B) SEM 및 AFM 이미지는 다양한 에칭 시간에 따라 기판의 마이크로/나노 구조를 최적화하는 데 사용됩니다.표면 패시베이션 및 SAM 코팅 후 (C) Cr2p 및 (D) F1s의 X선 광전자 분광법(XPS) 스펙트럼.au, 임의의 단위.(E) 베어, 에칭, SHP 및 LOIS 기판에 있는 물방울의 대표적인 이미지입니다.(F) SHP 및 LOIS에서 표면 장력이 다른 액체의 접촉각(CA) 및 SA 측정.데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다.
이후 표면의 화학적 성질 변화를 확인하기 위해 XPS(X-ray Photoelectron Spectroscopy)를 이용하여 각 표면 코팅 후 기재 표면의 화학적 조성 변화를 연구하였다.그림 2C는 HF 에칭 표면과 HNO 3 처리 표면의 XPS 측정 결과를 보여줍니다.587.3 및 577.7 eV의 두 가지 주요 피크는 크롬 산화물 층에 존재하는 Cr-O 결합에 기인할 수 있으며, 이는 HF 에칭 표면과의 주요 차이점입니다.이는 주로 HNO3에 의한 표면의 철 및 불화크롬 소비로 인해 발생합니다.HNO3 기반 에칭을 통해 크롬은 표면에 보호 산화물 층을 형성할 수 있으며, 이는 에칭된 SS가 다시 부식에 저항하도록 만듭니다.그림 2D에서는 SAM 코팅 후 표면에 플루오로카본 기반 실란이 형성되었음을 확인하기 위해 XPS 스펙트럼을 얻었으며, 이는 EG, 혈액 및 EtOH에 대해서도 매우 높은 발액성을 나타냅니다.SAM 코팅은 플라즈마 처리에 의해 형성된 수산기와 실란 작용기를 반응시켜 완성됩니다.그 결과, CF2 및 CF3 피크의 유의한 증가가 관찰되었습니다.286과 296 eV 사이의 결합 에너지는 SAM 코팅에 의해 화학적 변형이 성공적으로 완료되었음을 나타냅니다.SHP에서는 상대적으로 큰 CF2(290.1eV) 피크와 CF3(293.3eV) 피크가 나타나는데 이는 표면에 형성된 플루오르카본계 실란으로 인해 발생한다.그림 2E는 베어, 에칭, SHP 및 LOIS와 접촉하는 다양한 그룹의 탈이온수에 대한 접촉각(CA) 측정의 대표적인 광학 이미지를 보여줍니다.이러한 이미지는 화학적 에칭에 의해 형성된 마이크로/나노 구조로 인해 에칭된 표면이 친수성이 되어 탈이온수가 구조에 흡수되는 것을 보여줍니다.그러나 기재에 SAM을 코팅하면 기재가 강한 발수성을 나타내므로 표면 SHP가 형성되어 물과 표면의 접촉 면적이 작다.마지막으로 LOIS에서 CA의 감소가 관찰되었는데, 이는 윤활제가 미세 구조에 침투하여 접촉 면적이 증가했기 때문일 수 있습니다.표면이 우수한 발액성 및 비접착성을 가짐을 입증하기 위해 다양한 액체를 사용하여 CA 및 SA를 측정하여 LOIS를 SHP 기판과 비교했습니다(그림 2F).탈이온수, 혈액, EG, EtOH 및 HD를 포함하여 점도 및 표면 에너지를 기준으로 다양한 유형의 액체가 선택되었습니다(그림 S4).CA 측정 결과는 CA가 HD 경향이 있을 때 CA가 가장 낮은 표면 에너지를 갖는 CA의 감소 값을 보여줍니다.또한 전체 CA의 LOIS가 낮습니다.그러나 SA 측정에서는 전혀 다른 현상이 나타난다.이온화된 물을 제외한 모든 액체는 미끄러지지 않고 SHP 기판에 부착됩니다.반면, LOIS는 매우 낮은 SA를 보여줍니다. 모든 액체가 10°~15° 미만의 각도로 기울어지면 모든 액체가 굴러가는 것입니다.이는 LOIS의 비접착성이 SHP 표면보다 우수함을 강력하게 보여줍니다.또한, LOIS 코팅은 티타늄(Ti), 폴리페닐설폰(PPSU), 폴리옥시메틸렌(POM), 폴리에테르에테르케톤(PEEK), 생체흡수성폴리머(PLGA) 등 다양한 형태의 소재에도 적용되며, 이식 가능한 정형외과용 소재이다(그림). S5)).LOIS로 처리된 재료에 있는 물방울의 연속 이미지는 LOIS의 생물부착 방지 특성이 모든 기판에서 동일하다는 것을 보여줍니다.또한, CA와 SA의 측정 결과는 LOIS의 비접착 특성이 다른 소재에도 적용 가능함을 보여줍니다.
LOIS의 방오 특성을 확인하기 위해 다양한 유형의 기판(베어, 에칭, SHP 및 LOIS 포함)을 Pseudomonas aeruginosa 및 MRSA와 함께 배양했습니다.이 두 세균은 생물막을 형성하여 SSI를 일으킬 수 있는 대표적인 병원세균으로 선정되었다(37).그림 3(A 및 B)는 각각 단기(12시간) 및 장기(72시간) 동안 박테리아 현탁액에서 배양된 기질의 형광 현미경 이미지와 콜로니 형성 단위(CFU) 측정 결과를 보여줍니다.짧은 시간 내에 박테리아는 클러스터를 형성하고 크기가 커지며 점액 같은 물질로 덮여 제거를 방해합니다.그러나 72시간 배양 동안 박테리아는 성숙하고 쉽게 분산되어 더 많은 콜로니나 클러스터를 형성하게 됩니다.따라서 72시간 배양은 장기간이며 표면에 강한 생물막을 형성하기에 적절한 배양 시간이라고 볼 수 있다(38).짧은 시간 내에 식각된 표면과 SHP 표면에는 세균 부착이 나타났으며 이는 노출된 기판에 비해 약 25%~50% 감소했습니다.그러나 LOIS는 뛰어난 항생물부착 성능과 안정성으로 인해 단기 및 장기적으로 세균 생물막 부착을 나타내지 않았습니다.회로도(그림 3C)는 에칭 용액 SHP 및 LOIS의 항생물학적 오염 메커니즘에 대한 설명을 설명합니다.친수성을 지닌 에칭된 기판은 노출된 기판보다 표면적이 더 크다고 가정합니다.따라서 에칭된 기판에 더 많은 박테리아 부착이 발생합니다.그러나 노출된 기판과 비교하여 에칭된 기판은 표면에 형성된 생물막이 훨씬 적습니다.이는 물 분자가 친수성 표면에 단단히 결합하여 물에 대한 윤활제 역할을 하여 단기적으로 박테리아의 부착을 방해하기 때문입니다(39).그러나 물 분자 층은 매우 얇고 박테리아 현탁액에 용해됩니다.따라서 물분자층이 오랜 시간 동안 사라지게 되어 광범위한 세균 부착 및 증식이 일어나게 됩니다.SHP의 경우 단기적인 비습윤성으로 인해 박테리아 부착이 억제됩니다.감소된 박테리아 부착은 층상 구조에 갇힌 공기 주머니와 낮은 표면 에너지로 인해 박테리아 현탁액과 표면 사이의 접촉이 최소화되기 때문일 수 있습니다.그러나 SHP에서는 오랫동안 방오 특성을 상실했기 때문에 광범위한 박테리아 부착이 관찰되었습니다.이는 주로 정수압과 물에 공기가 용해되어 공기 주머니가 사라지기 때문입니다.이는 주로 용해로 인한 에어 포켓의 소멸과 접착을 위한 더 넓은 표면적을 제공하는 층상 구조에 기인합니다(27, 40).장기 안정성에 중요한 영향을 미치는 이 두 기판과 달리 LOIS에 포함된 윤활 윤활제는 마이크로/나노 구조에 주입되어 장기간에도 사라지지 않습니다.마이크로/나노 구조로 충진된 윤활제는 안정성이 매우 높으며 화학적 친화력이 높아 표면에 강하게 흡착되어 세균 부착을 장기간 방지합니다.그림 S6은 인산염 완충 식염수(PBS)에 담긴 윤활제 주입 기판의 반사 공초점 현미경 이미지를 보여줍니다.연속 이미지는 120시간의 약간의 흔들림(120rpm) 후에도 LOIS의 윤활제 층이 변하지 않고 유지되어 흐름 조건에서 장기적인 안정성을 나타냄을 보여줍니다.이는 불소계 SAM 코팅과 과불화탄소계 윤활제 사이의 화학적 친화력이 높아 안정적인 윤활층을 형성할 수 있기 때문이다.따라서 방오성능이 유지됩니다.또한, 혈장에 있는 대표적인 단백질(알부민 및 피브리노겐), 면역 기능과 밀접하게 관련된 세포(대식세포 및 섬유아세포), 뼈 형성과 관련된 세포에 대해 기질을 테스트했습니다.칼슘 함량이 매우 높습니다.(그림 3D, 1 및 2, 그림 S7) (41, 42).또한, 피브리노겐, 알부민 및 칼슘에 대한 접착력 테스트의 형광 현미경 이미지는 각 기질 그룹마다 서로 다른 접착 특성을 보여주었습니다(그림 S8).뼈가 형성되는 동안 새로 형성된 뼈와 칼슘층이 정형외과용 임플란트를 둘러쌀 수 있어 제거가 어려울 뿐만 아니라 제거 과정에서 환자에게 예상치 못한 해를 끼칠 수도 있습니다.따라서 뼈판과 나사에 칼슘 침착량이 적으면 임플란트 제거가 필요한 정형외과 수술에 유리합니다.형광강도와 세포수를 기준으로 부착면적을 정량화한 결과, LOIS가 다른 기질에 비해 모든 생물학적 물질에 대해 우수한 항생물부착 특성을 나타내는 것을 확인했습니다.체외 실험 결과에 따르면 항생물학적 오염물질인 LOIS를 정형외과용 임플란트에 적용할 수 있어 생물막 박테리아로 인한 감염을 억제할 수 있을 뿐만 아니라 신체의 활성 면역 체계로 인해 발생하는 염증도 줄일 수 있다.
(A) 녹농균 및 MRSA 현탁액에서 12시간 및 72시간 동안 배양한 각 그룹(네이키드, 에칭, SHP 및 LOIS)의 형광 현미경 이미지.(B) 각 그룹의 표면에 부착된 녹농균 및 MRSA의 CFU 수.(C) 단기 및 장기 에칭, SHP 및 LOIS의 항생물학적 오염 메커니즘에 대한 개략도.(D) (1) 각 기판에 부착된 섬유아세포의 수와 베어 및 LOIS에 부착된 세포의 형광현미경 이미지.(2) 뼈 치유 과정에 관여하는 면역 관련 단백질, 알부민, 칼슘의 접착력 시험(* P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001).ns, 중요하지 않습니다.
피할 수 없는 집중 응력의 경우, 기계적 내구성은 항상 방오 코팅 적용의 주요 과제였습니다.전통적인 하수 방지 젤 방법은 수용성이 낮고 취약한 폴리머를 기반으로 합니다.따라서 일반적으로 생의학 응용 분야에서 기계적 응력에 취약합니다.따라서 기계적으로 내구성이 있는 방오 코팅은 정형외과 임플란트와 같은 응용 분야에서 여전히 과제로 남아 있습니다(43, 44).그림 4A(1)은 겸자에 의해 생성된 손상된 임플란트의 광학 이미지를 통해 긁힘(전단 응력)과 압축을 포함하여 정형외과 임플란트에 적용되는 두 가지 주요 응력 유형을 보여줍니다.예를 들어 드라이버로 나사를 조이거나 외과의사가 핀셋으로 뼈판을 단단히 잡고 압축력을 가할 때 플라스틱 뼈판이 매크로 및 마이크로/나노 스케일 모두에서 손상되고 긁힐 수 있습니다(그림 4A, 2) .제작된 LOIS가 성형수술 중 이러한 손상을 견딜 수 있는지 테스트하기 위해 나노압입을 수행하여 베어 기판의 경도와 마이크로/나노 스케일의 LOIS를 비교하여 마이크로/나노 구조의 기계적 특성을 연구했습니다. 4B).개략도는 마이크로/나노 구조의 존재로 인한 LOIS의 다양한 변형 거동을 보여줍니다.나노압입의 결과를 기반으로 힘-변위 곡선이 그려졌습니다(그림4C).파란색 이미지는 0.26μm의 최대 압입 깊이에서 볼 수 있듯이 약간의 변형만 보이는 베어 기판을 나타냅니다.반면, LOIS(빨간색 곡선)에서 관찰된 나노압입 힘과 변위의 점진적인 증가는 기계적 특성이 감소한 징후를 보여 1.61μm의 나노압입 깊이를 초래합니다.이는 LOIS에 존재하는 마이크로/나노 구조가 나노인덴터 팁에 더 깊은 전진 공간을 제공하여 베어 기판보다 변형이 더 크기 때문입니다.Konsta-Gdoutoset al.(45)은 나노 구조의 존재로 인해 나노압입 및 마이크로/나노 거칠기가 불규칙한 나노압입 곡선을 초래한다고 믿습니다.음영처리된 영역은 나노구조에 따른 불규칙한 변형 곡선에 해당하고, 음영처리되지 않은 영역은 미세구조에 따른 것입니다.이러한 변형은 고정 윤활제의 미세 구조/나노 구조를 손상시키고 오염 방지 성능에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.손상이 LOIS에 미치는 영향을 연구하기 위해 성형수술 중 마이크로/나노 구조의 불가피한 손상이 체내에서 재현되었습니다.혈액 및 단백질 부착 테스트를 사용하여 시험관 내 후 LOIS의 생물 부착 방지 특성의 안정성을 확인할 수 있습니다(그림4D).일련의 광학 이미지는 각 기판의 구멍 근처에서 발생한 손상을 보여줍니다.생물 부착 방지 코팅에 대한 기계적 손상의 영향을 입증하기 위해 혈액 접착 테스트를 수행했습니다(그림4E).SHP와 마찬가지로 손상으로 인해 방오성이 소실되며, LOIS는 혈액을 밀어내는 우수한 방오성을 나타냅니다.이는 표면 에너지가 손상된 영역을 덮는 모세관 작용에 의해 구동되기 때문에 미세 구조 윤활제 윤활제의 흐름이 오염 방지 특성을 복원하기 때문입니다(35).알부민을 이용한 단백질 부착 시험에서도 동일한 경향이 관찰되었다.손상된 부위에서는 SHP 표면의 단백질 접착이 널리 관찰되며, 면적 범위를 측정하면 노출된 기판 접착 수준의 절반으로 정량화할 수 있습니다.반면, LOIS는 접착을 유발하지 않고 생물부착 방지 특성을 유지했습니다(그림 4, F 및 G).또한 나사 표면은 드릴링과 같은 강한 기계적 응력을 받는 경우가 많으므로 LOIS 코팅이 나사에 그대로 유지되는 능력을 시험관 내에서 연구했습니다.그림 4H는 베어, SHP 및 LOIS를 포함한 다양한 나사의 광학 이미지를 보여줍니다.빨간색 직사각형은 뼈 이식 중에 강한 기계적 응력이 발생하는 대상 영역을 나타냅니다.플레이트의 단백질 접착 테스트와 유사하게 형광 현미경을 사용하여 단백질 접착을 이미지화하고 적용 범위를 측정하여 강한 기계적 응력 하에서도 LOIS 코팅의 무결성을 입증합니다(그림 4, I 및 J).LOIS 처리된 나사는 탁월한 방오 성능을 발휘하며, 표면에 단백질이 거의 부착되지 않습니다.반면, 나선 나사와 SHP 나사에서는 단백질 접착이 관찰되었으며, SHP 나사의 면적 범위는 나선 나사의 1/3이었습니다.또한 고정에 사용되는 정형외과 임플란트는 그림 4K와 같이 골절 부위에 가해지는 응력을 견딜 수 있도록 기계적으로 강해야 합니다.따라서 화학적 변형이 기계적 특성에 미치는 영향을 확인하기 위해 굽힘 테스트를 수행했습니다.또한 이는 임플란트의 고정된 응력을 유지하기 위해 수행됩니다.임플란트가 완전히 접히고 응력-변형 곡선이 얻어질 때까지 수직 기계적 힘을 적용합니다(그림4L, 1).영률과 굽힘 강도를 포함한 두 가지 특성을 기계적 강도의 지표로 베어 기판과 LOIS 기판 사이에서 비교했습니다(그림 4L, 2 및 3).영률은 기계적 변화를 견딜 수 있는 재료의 능력을 나타냅니다.각 기판의 영률은 각각 41.48±1.01 및 40.06±0.96GPa입니다.관찰된 차이는 약 3.4%이다.또한 재료의 인성을 결정하는 굽힘강도는 베어기판의 경우 102.34±1.51 GPa, SHP의 경우 96.99±0.86 GPa로 보고되었다.베어 기판은 약 5.3% 더 높습니다.노치 효과로 인해 기계적 특성이 약간 저하될 수 있습니다.노치 효과에서 마이크로/나노 거칠기는 노치 세트로 작용하여 국부적인 응력 집중을 초래하고 임플란트의 기계적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다(46).그러나 인간 피질골의 강성은 7.4~31.6GPa 사이로 보고되고 측정된 LOIS 계수는 인간 피질골의 강성을 초과한다는 사실을 토대로(47), LOIS는 골절과 그 전체를 지지하기에 충분합니다. 기계적 성질은 표면 변형에 의해 최소한의 영향을 받습니다.
(A) (1) 수술 중 정형외과 임플란트에 가해지는 기계적 응력, (2) 손상된 정형외과 임플란트의 광학 이미지의 개략도.(B) 노출된 표면의 나노압입 및 LOIS에 의한 나노 기계적 특성 측정의 개략도.(C) 맨 표면과 LOIS의 나노압입 힘-변위 곡선.(D) 체외 실험 후 다양한 유형의 정형외과 플레이트의 광학 이미지를 시뮬레이션하여(손상된 영역은 빨간색 직사각형으로 강조 표시됨) 작업 중에 발생하는 기계적 응력을 시뮬레이션합니다.(E) 손상된 정형외과 플레이트 그룹의 혈액 접착 테스트 및 (F) 단백질 접착 테스트.(G) 플레이트에 부착된 단백질의 면적 범위를 측정합니다.(H) 체외 실험 후 다양한 유형의 정형외과 나사의 광학 이미지.(I) 다양한 코팅의 무결성을 연구하기 위한 단백질 접착 테스트.(J)나사에 부착된 단백질의 면적을 측정합니다.(K) 토끼의 움직임은 골절된 뼈에 고정된 응력을 생성하도록 의도되었습니다.(L) (1) 굽힘 전후의 굽힘 시험 결과 및 광학 이미지.베어 임플란트와 SHP 사이의 (2) 영률과 (3) 굽힘 강도의 차이.데이터는 평균 ± SD(*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001)로 표시됩니다.이미지 제공: 채교민, 연세대학교.
임상 상황에서 생물학적 물질 및 상처 부위와의 대부분의 박테리아 접촉은 성숙하고 성숙한 생물막에서 발생합니다(48).따라서 미국 질병 통제 예방 센터는 모든 인간 감염의 65%가 생물막과 관련이 있다고 추정합니다(49).이 경우 임플란트 표면에 일관된 생물막 형성을 제공하는 생체 내 실험 설계를 제공하는 것이 필요합니다.따라서 우리는 정형외과 임플란트를 박테리아 현탁액에서 미리 배양한 다음 토끼 대퇴골에 이식하여 생체 내 LOIS의 방오 특성을 연구하는 토끼 대퇴골 골절 모델을 개발했습니다.다음 세 가지 중요한 사실로 인해 박테리아 감염은 박테리아 현탁액을 직접 주입하는 것이 아니라 사전 배양에 의해 유발됩니다. (i) 토끼의 면역 체계는 자연적으로 인간의 면역 체계보다 강합니다.따라서 박테리아 현탁액 및 플랑크톤 박테리아의 주입이 가능합니다. 생물막 형성에는 영향을 미치지 않습니다.(ii) 플랑크톤 박테리아는 항생제에 더 취약하며 일반적으로 수술 후에 항생제를 사용합니다.마지막으로, (iii) 플랑크톤 박테리아 현탁액은 동물의 체액(50)에 의해 희석될 수 있다.임플란트를 식립하기 전에 박테리아 현탁액에서 임플란트를 사전 배양함으로써 박테리아 감염과 이물질 반응(FBR)이 뼈 치유 과정에 미치는 유해한 영향을 철저하게 연구할 수 있습니다.뼈 치유 과정에 필수적인 골유착이 4주 이내에 완료되므로 이식 후 4주 후에 토끼를 희생시켰다.그런 다음 다운스트림 연구를 위해 토끼에서 임플란트를 제거했습니다.그림 5A는 박테리아의 증식 메커니즘을 보여줍니다.감염된 정형외과 임플란트가 체내로 삽입됩니다.세균 현탁액에서 사전 배양한 결과, 노출된 보형물을 이식한 토끼 6마리 중 6마리가 감염되었으며, LOIS 처리된 보형물을 이식한 토끼에서는 감염되지 않았습니다.세균 감염은 성장, 성숙, 분산의 세 단계로 진행됩니다(51).먼저 부착된 박테리아가 표면에서 번식하고 성장한 후, 박테리아가 세포외고분자(EPS), 아밀로이드, 세포외 DNA를 배설하면서 바이오필름을 형성합니다.생물막은 항생제의 침투를 방해할 뿐만 아니라 항생제 분해 효소(예: β-락타마제)의 축적을 촉진합니다(52).마지막으로, 생물막은 성숙한 박테리아를 주변 조직으로 퍼뜨립니다.따라서 감염이 발생합니다.또한 체내에 이물질이 들어오면 강한 면역반응을 일으킬 수 있는 감염이 발생하면 심한 염증과 통증, 면역력 저하 등이 나타날 수 있다.그림 5B는 세균 감염으로 인한 면역 반응이 아닌 정형외과 임플란트 삽입으로 인한 FBR의 개요를 제공합니다.면역체계는 삽입된 보형물을 이물질로 인식한 후 세포와 조직이 반응하여 이물질을 감싸게 한다(53).FBR 초기에는 정형외과 임플란트 표면에 공급 매트릭스가 형성되어 피브리노겐이 흡착되었습니다.흡착된 피브리노겐은 고밀도 피브린 네트워크를 형성하여 백혈구 부착을 촉진합니다(54).피브린 네트워크가 형성되면 호중구의 침투로 인해 급성 염증이 발생합니다.이 단계에서는 종양괴사인자-α(TNF-α), 인터루킨-4(IL-4), IL-β 등 다양한 사이토카인이 방출되고, 단핵구가 착상 부위에 침투해 거대세포로 분화되기 시작한다.파지(41, 55, 56).과도한 FBR은 급성 및 만성 염증을 유발하여 치명적인 합병증을 유발할 수 있기 때문에 FBR을 줄이는 것은 항상 어려운 일이었습니다.노출된 임플란트와 LOIS 주변 조직의 세균 감염 영향을 평가하기 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 Masson trichrome(MT) 염색을 사용했습니다.노출된 기판을 이식한 토끼의 경우 심각한 세균 감염이 진행되었으며 H&E 조직 슬라이드에서는 염증으로 인한 농양과 괴사가 명확하게 나타났습니다.반면, 매우 강력한 생물부착 방지 표면 LOIS는 박테리아 부착을 억제하므로 감염 징후가 보이지 않고 염증을 감소시킵니다(그림 5C).MT 염색 결과도 같은 경향을 보였다.그러나 MT 염색은 LOIS를 이식한 토끼에서도 부종을 보여 회복이 곧 일어날 것임을 나타냅니다(그림5D).면역반응 정도를 알아보기 위해 면역반응과 관련된 사이토카인인 TNF-α와 IL-6를 이용하여 면역조직화학적(IHC) 염색을 실시하였다.박테리아에 노출되지 않은 노출된 음성 임플란트를 박테리아에 노출되었지만 감염되지 않은 LOIS와 비교하여 박테리아 감염이 없는 치유 과정을 연구했습니다.그림 5E는 TNF-α를 발현하는 IHC 슬라이드의 광학 이미지를 보여줍니다.갈색 부분은 면역반응을 나타내며, LOIS의 면역반응이 약간 감소되었음을 나타냅니다.또한, LOIS에서 IL-6의 발현은 멸균 알몸의 음성 발현보다 현저히 적었습니다(그림 5F).사이토카인의 발현은 사이토카인에 해당하는 항체 염색 면적을 측정하여 정량화하였다(도 5G).음성 임플란트에 노출된 토끼와 비교하여 LOIS를 이식한 토끼의 발현 수준이 낮아져 유의미한 차이를 보였습니다.사이토카인 발현의 감소는 LOIS의 장기적이고 안정적인 항파울링 특성이 세균 감염 억제뿐만 아니라 기질에 부착된 대식세포에 의해 유발되는 FBR의 감소와도 관련이 있음을 나타냅니다(53, 57, 58).따라서 LOIS의 면역회피 특성으로 인해 감소된 면역반응은 성형수술 후 과도한 면역반응 등 이식 후 부작용을 해결할 수 있다.
(A) 감염된 정형외과 임플란트 표면에 생물막 형성 및 확산 메커니즘에 대한 개략도입니다.eDNA, 세포외 DNA.(B) 정형외과 임플란트 삽입 후 면역 반응의 개략도.(C) H&E 염색 및 (D) 베어 양성 및 LOIS가 있는 정형외과 임플란트 주변 조직의 MT 염색.면역 관련 사이토카인(E) TNF-α 및(F) IL-6의 IHC는 나체 음성 및 LOIS 이식 토끼의 염색된 이미지입니다.(G) 면적 범위 측정에 의한 사이토카인 발현의 정량화(** P<0.01).
LOIS의 생체 적합성과 뼈 치유 과정에 미치는 영향은 진단 영상[X선 및 미세 컴퓨터 단층 촬영(CT)]과 파골 세포 IHC를 사용하여 생체 내에서 검사되었습니다.그림 6A는 염증, 복구 및 리모델링의 세 가지 단계를 포함하는 뼈 치유 과정을 보여줍니다.골절이 발생하면 염증 세포와 섬유아세포가 골절된 뼈에 침투하여 혈관 조직으로 성장하기 시작합니다.복구 단계에서는 혈관 조직의 내성장이 골절 부위 근처로 퍼집니다.혈관 조직은 굳은 살이라고 불리는 새로운 뼈의 형성을 위한 영양분을 제공합니다.뼈 치유 과정의 마지막 단계는 리모델링 단계로, 활성화된 파골세포 수준의 증가를 통해 굳은 살의 크기가 정상 뼈의 크기로 감소됩니다(59).각 그룹의 굳은 살 형성 수준의 차이를 관찰하기 위해 마이크로 CT 스캔을 사용하여 골절 부위의 3차원 재구성을 수행했습니다.대퇴골의 단면을 관찰하여 골절된 뼈를 둘러싼 굳은살의 두께를 관찰합니다(그림 6, B 및 C).또한 X-ray를 사용하여 매주 모든 그룹의 골절 부위를 검사하여 각 그룹의 다양한 뼈 재생 과정을 관찰했습니다(그림 S9).굳은 살과 성숙한 뼈는 각각 파란색/녹색 및 상아색으로 표시됩니다.대부분의 연조직은 미리 설정된 임계값으로 필터링됩니다.누드 양성 및 SHP에서는 골절 부위 주변에 소량의 굳은살이 형성되어 있음을 확인했습니다.반면에 노출된 LOIS의 음성과 골절 부위는 두꺼운 굳은 살로 둘러싸여 있습니다.Micro-CT 영상을 통해 세균 감염과 감염 관련 염증으로 인해 캘러스 형성이 방해를 받는 것으로 나타났습니다.이는 면역체계가 뼈 회복보다는 감염 관련 염증으로 인한 패혈성 손상의 치유를 우선시하기 때문입니다(60).파골세포 활성과 골흡수를 관찰하기 위해 IHC와 TRAP(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase) 염색을 수행했습니다(그림 6D)(61).보라색으로 염색된 활성화된 파골세포는 소수와 SHP에서 발견되었습니다.반면에 LOIS의 노출된 양성 및 성숙한 뼈 근처에서는 활성화된 파골세포가 많이 관찰되었습니다.이러한 현상은 파골세포가 있는 경우 골절 부위 주변의 굳은살이 격렬한 리모델링 과정을 겪고 있음을 나타냅니다(62).모든 군에서 골절 부위 주변의 캘러스 형성 정도를 비교하기 위해 캘러스의 골량과 파골세포 발현 면적을 측정하여 마이크로 CT 스캔 및 IHC 결과를 정량화하였다(도 6E, 1 및 2).예상한 대로 LOIS의 네거티브 음성 및 굳은살 형성은 다른 그룹보다 상당히 높았으며 이는 양성 뼈 재형성이 발생했음을 나타냅니다(63).그림 S10은 수술 부위의 광학 이미지, 나사 근처에 수집된 조직의 MT 염색 결과, 나사-뼈 경계면이 강조된 TRAP 염색 결과를 보여줍니다.노출된 기판에서는 강한 굳은 살과 섬유화 형성이 관찰된 반면, LOIS 처리된 임플란트는 상대적으로 접착되지 않은 표면을 보여주었습니다.유사하게, 백색 화살표로 표시된 바와 같이, 노출된 음성과 비교하여, LOIS를 이식한 토끼에서 더 낮은 섬유증이 관찰되었습니다.또한, 단단한 부종(파란색 화살표)은 LOIS의 면역 회피 특성에 기인하여 심각한 염증을 줄일 수 있습니다.임플란트 주변의 달라붙지 않는 표면과 감소된 섬유증은 제거 과정이 더 쉽다는 것을 의미하며, 이는 일반적으로 다른 골절이나 염증을 초래합니다.나사 제거 후 뼈 치유 과정은 나사-뼈 경계면의 파골세포 활성으로 평가되었습니다.기본 뼈와 LOIS 임플란트 경계면 모두 유사한 수준의 파골세포를 흡수하여 뼈 치유를 촉진했으며, 이는 LOIS 코팅이 뼈 치유나 면역 반응에 부정적인 영향을 미치지 않음을 나타냅니다.LOIS에서 수행된 표면 변형이 뼈 치유 과정을 방해하지 않는지 확인하기 위해 X선 검사를 사용하여 음이온에 노출된 토끼의 뼈 치유와 6주간의 LOIS 이식을 비교했습니다(그림 6F).그 결과, 감염되지 않은 누드양성군과 비교하여 LOIS는 동일한 정도의 골치유 정도를 보였으며, 두 군 모두 뚜렷한 골절 징후(연속 골용해선)가 없는 것으로 나타났다.
(A) 골절 후 뼈 치유 과정의 개략도.(B) 각 표면 그룹의 굳은 살 형성 정도의 차이와 (C) 골절 부위의 단면 이미지입니다.(D) 파골세포 활동과 뼈 흡수를 시각화하기 위한 TRAP 염색.TRAP 활성을 바탕으로 피질골의 외부 굳은살 형성을 (E) (1) micro-CT 및 (2) 파골세포 활성으로 정량 분석하였다.(F) 이식 6주 후, 노출된 네거티브(빨간색 점선 직사각형으로 강조 표시) 및 LOIS(파란색 점선 직사각형으로 강조 표시)의 골절된 뼈의 X선 이미지입니다.통계 분석은 일원 분산 분석(ANOVA)으로 수행되었습니다.* P<0.05.** P<0.01.
즉, LOIS는 정형외과 임플란트에 대한 새로운 유형의 항균 감염 전략과 면역 탈출 코팅을 제공합니다.SHP 기능을 갖춘 기존의 정형외과용 임플란트는 단기적인 항생체부착 특성을 나타내지만 오랫동안 그 특성을 유지할 수는 없습니다.기판의 초소수성은 박테리아와 기판 사이에 기포를 가두어 에어 포켓을 형성함으로써 박테리아 감염을 방지합니다.그러나 공기의 확산으로 인해 이러한 공기 주머니는 쉽게 제거됩니다.반면, LOIS는 생물막 관련 감염을 예방하는 능력이 잘 입증되었습니다.따라서 층상 마이크로/나노 구조 표면에 주입된 윤활층의 거부반응 방지 특성으로 인해 감염 관련 염증을 예방할 수 있습니다.SEM, AFM, XPS 및 CA 측정을 포함한 다양한 특성화 방법을 사용하여 LOIS 제조 조건을 최적화합니다.또한 LOIS는 PLGA, Ti, PE, POM, PPSU 등 정형외과 고정 장비에 일반적으로 사용되는 다양한 생체 재료에도 적용할 수 있습니다.그런 다음 LOIS는 면역 반응과 관련된 박테리아 및 생물학적 물질에 대한 항생물 부착 특성을 입증하기 위해 시험관 내 테스트를 거쳤습니다.그 결과 베어 임플란트에 비해 항균 및 생물부착 방지 효과가 우수한 것으로 나타났다.또한, LOIS는 성형수술에서 피할 수 없는 기계적 응력을 가한 후에도 기계적 강도를 나타냅니다.마이크로/나노 구조 표면에 있는 윤활유의 자가 치유 특성으로 인해 LOIS는 항생물학적 오염 특성을 성공적으로 유지했습니다.생체 내에서 LOIS의 생체 적합성과 항균 특성을 연구하기 위해 LOIS를 토끼 대퇴골에 4주 동안 이식했습니다.LOIS를 이식한 토끼에서는 세균 감염이 관찰되지 않았습니다.또한 IHC를 사용하면 국소 면역 반응 수준이 감소하여 LOIS가 뼈 치유 과정을 억제하지 않음을 나타냅니다.LOIS는 탁월한 항균 및 면역 회피 특성을 나타내며, 특히 뼈 합성을 위한 정형외과 수술 전 및 수술 중 생물막 형성을 효과적으로 방지하는 것으로 입증되었습니다.토끼 골수 염증성 대퇴골 골절 모델을 사용하여 사전 배양된 임플란트에 의해 유도된 뼈 치유 과정에 대한 생물막 관련 감염의 영향을 깊이 연구했습니다.향후 연구로서 전체 치유 과정에서 생물막 관련 감염을 완전히 이해하고 예방하기 위해 이식 후 가능한 감염을 연구하기 위한 새로운 생체 ​​내 모델이 필요합니다.또한 골유도는 LOIS와의 통합에서 여전히 해결되지 않은 과제입니다.이 문제를 극복하기 위해 골유도 세포 또는 재생 의학의 선택적 접착을 LOIS와 결합하기 위한 추가 연구가 필요합니다.전반적으로 LOIS는 SSI와 면역 부작용을 줄일 수 있는 기계적 견고성과 탁월한 생물 부착 방지 특성을 갖춘 유망한 정형외과용 임플란트 코팅을 나타냅니다.
15mm x 15mm x 1mm 304 SS 기판(동강엠텍, 한국)을 아세톤, EtOH, DI수에 15분간 세척하여 오염물질을 제거합니다.표면에 마이크로/나노 수준의 구조를 형성하기 위해 세척된 기판을 50°C의 48%~51% HF 용액(덕산, 한국)에 담급니다.에칭 시간은 0~60분까지 다양합니다.그런 다음 식각된 기판을 탈이온수로 세척한 후 65% HNO3(한국덕산) 용액에 50°C에서 30분간 놓아 표면에 크롬 산화물 보호층을 형성하였다.패시베이션 후 기판을 탈이온수로 세척하고 건조하여 층상 구조의 기판을 얻는다.다음으로, 기판을 산소 플라즈마(100W, 3분)에 노출시킨 후 즉시 8.88mM POTS(Sigma-Aldrich, Germany)를 톨루엔에 녹인 용액에 실온에서 12시간 동안 담갔다.이후, POTS가 코팅된 기판을 EtOH로 세척하고, 150℃에서 2시간 동안 어닐링하여 치밀한 POTS SAM을 얻었다.SAM 코팅 후, 퍼플루오로폴리에테르 윤활제(Krytox 101, DuPont, USA)를 로딩 부피 20 μm/cm 2 로 도포하여 기재 상에 윤활제 층을 형성하였다. 사용 전, 0.2 미크론 필터를 통해 윤활제를 여과하였다.15분 동안 45° 각도로 기울여 과도한 윤활제를 제거합니다.304 SS(잠금판 및 피질 잠금 나사, 동강엠텍, 한국)로 제작된 정형외과용 임플란트에도 동일한 제조과정을 사용하였다.모든 정형외과 임플란트는 토끼 대퇴골의 기하학적 구조에 맞게 설계되었습니다.
기판과 정형외과용 임플란트의 표면 형태는 전계 방출 SEM(Inspect F50, FEI, USA)과 AFM(XE-100, Park Systems, South Korea)으로 검사되었습니다.표면 거칠기(Ra, Rq)는 20μm의 면적에 20μm를 곱하여 측정됩니다(n=4).표면 화학적 조성을 분석하기 위해 스팟 크기가 100μm2인 Al Kα X선 소스가 장착된 XPS(PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japan) 시스템을 사용했습니다.액체 CA 및 SA를 측정하기 위해 동적 이미지 캡처 카메라(SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​South Korea)가 장착된 CA 측정 시스템을 사용했습니다.각 측정마다 6~10μl의 액적(탈이온수, 말혈, EG, 30% 에탄올, HD)을 표면에 놓아 CA를 측정합니다.기판의 경사각이 2°/s(n = 4)의 속도로 증가할 때 액적이 떨어질 때 SA가 측정됩니다.
Pseudomonas aeruginosa[American Type Culture Collection(ATCC) 27853]와 MRSA(ATCC 25923)는 ATCC(Manassas, Virginia, USA)에서 구입하였고, 스톡배양액은 -80℃에서 유지하였다.사용 전, 동결된 배양물을 트립신 해동된 대두육수(Komed, 한국)에서 37°C에서 18시간 동안 배양한 후 2회 옮겨 활성화시켰다.배양 후, 배양물을 4℃에서 10분간 10,000rpm으로 원심분리하고 PBS(pH 7.3) 용액으로 2회 세척하였다.원심분리된 배양물은 혈액 한천 플레이트(BAP)에서 계대배양됩니다.MRSA와 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)을 밤새 준비하고 Luria-Bertani 액체배지에서 배양했습니다.접종물 내 녹농균 및 MRSA의 농도는 한천에서 연속 희석된 현탁액의 CFU에 의해 정량적으로 결정되었습니다.그런 다음 박테리아 농도를 108 CFU/ml에 해당하는 0.5 McFarland 표준으로 조정합니다.그런 다음 작업 박테리아 현탁액을 106 CFU/ml로 100배 희석합니다.항균 접착 특성을 테스트하기 위해 기판을 사용하기 전에 121°C에서 15분간 멸균했습니다.그런 다음 기질을 25ml의 박테리아 현탁액으로 옮기고 12시간 및 72시간 동안 강하게 흔들면서(200rpm) 37°C에서 배양했습니다.인큐베이션 후, 각 기질을 인큐베이터에서 꺼내어 PBS로 3회 세척하여 표면에 부유하는 박테리아를 제거했습니다.기판 위의 바이오필름을 관찰하기 위해 바이오필름을 메탄올로 고정한 후 크리미딘 오렌지 1ml로 2분간 염색하였다.그런 다음 형광현미경(BX51TR, Olympus, Japan)을 사용하여 염색된 생물막의 사진을 찍었습니다.기질 위의 생물막을 정량화하기 위해 부착된 세균을 제거하는 데 가장 적합한 방법으로 판단되는 비드 볼텍스법(bead vortex method)으로 부착된 세포를 기질에서 분리하였다(n=4).멸균 집게를 사용하여 성장 배지에서 기판을 제거하고 웰 플레이트를 탭하여 과잉 액체를 제거합니다.느슨하게 부착된 세포는 멸균 PBS로 2회 세척하여 제거했습니다.그런 다음 각 기판을 0.1% 단백질 식염수(PSW) 9ml와 20~25개의 멸균 유리 비드(직경 0.4~0.5mm) 2g이 들어 있는 멸균 시험관으로 옮겼습니다.그런 다음 3분 동안 와동시켜 샘플에서 세포를 분리했습니다.vortexing 후 현탁액을 0.1% PSW로 10배 연속 희석한 후, 각 희석액을 0.1 ml씩 BAP에 접종하였다.37°C에서 24시간 동안 배양한 후 CFU를 수동으로 계산했습니다.
세포로는 마우스 섬유아세포 NIH/3T3(CRL-1658; American ATCC) 및 마우스 대식세포 RAW 264.7(TIB-71; American ATCC)을 사용하였다.Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM; LM001-05, Welgene, Korea)를 사용하여 마우스 섬유아세포를 배양하고 10% 송아지 혈청(S103-01, Welgene)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(PS; LS202-02, Welgene(Welgene)을 보충합니다. ) DMEM을 사용하여 10% 태아 소 혈청(S001-01, Welgene) 및 1% PS가 보충된 마우스 대식세포를 배양합니다. 기질을 6웰 세포 배양 플레이트에 놓고 세포를 105 세포/cm2로 접종합니다. 세포를 37°C 및 5% CO2에서 밤새 배양했습니다. 세포 염색을 위해 세포를 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정하고 0.5% Triton X 배양액에 5분간 넣어 두었습니다. 기질을 50nM 테트라메틸로다민에 담급니다. 37°C에서 30분 동안 배양한 후 기질을 4',6-diamino-2-phenylindole(H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD 고정 배지(단백질의 경우 n = 4)와 함께 사용합니다. , 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트-알부민(A9771, Sigma-Aldrich, Germany) 및 인간 혈장 Alexa Fluor 488-접합 피브리노겐(F13191, Invitrogen, USA)을 PBS(10 mM, pH 7.4)에 용해시켰습니다.알부민과 피브리노겐의 농도는 각각 1과 150μg/ml였습니다.기질을 단백질 용액에 담그기 전에 PBS로 헹구어 표면을 재수화시킵니다.그런 다음 단백질 용액이 들어 있는 6웰 플레이트에 모든 기질을 담그고 37°C에서 30분 및 90분 동안 배양합니다.인큐베이션 후, 기질을 단백질 용액에서 제거하고 PBS로 3회 부드럽게 세척한 후 4% 파라포름알데히드(각 단백질에 대해 n = 4)로 고정했습니다.칼슘의 경우 염화나트륨(0.21M) 및 인산칼륨(3.77mM)을 탈이온수에 용해시켰다.염산염 용액(1M)을 첨가하여 용액의 pH를 2.0으로 조정하였다.그 다음 염화칼슘(5.62mM)을 용액에 용해시켰다.1M 트리스(하이드록시메틸)-아미노 메탄을 첨가하여 용액의 pH를 7.4로 조정합니다.1.5× 인산칼슘 용액이 채워진 6웰 플레이트에 모든 기질을 담그고 30분 후에 용액에서 제거합니다.염색을 위해 Alizarin Red S(CI 58005) 2g을 탈이온수 100ml와 섞습니다.그런 다음 10% 수산화암모늄을 사용하여 pH를 4로 조정합니다. 기질을 Alizarin Red 용액으로 5분간 염색한 후 여분의 염료를 털어내고 얼룩을 제거합니다.쉐이킹 과정이 끝나면 기판을 제거합니다.물질을 탈수시킨 후 아세톤에 5분간 담근 후, 아세톤-자일렌(1:1) 용액에 5분간 담근 후 최종적으로 자일렌(n=4)으로 세척한다.×10 및 ×20 대물렌즈를 갖춘 형광 현미경(Axio Imager)이 사용됩니다..A2m, 독일 Zeiss)는 모든 기판을 이미지화합니다.ImageJ/FIJI(https://imagej.nih.gov/ij/)를 사용하여 4개의 서로 다른 이미징 영역의 각 그룹에 대한 생물학적 물질의 부착 데이터를 정량화했습니다.기판 비교를 위해 모든 이미지를 고정된 임계값을 사용하여 이진 이미지로 변환합니다.
Zeiss LSM 700 공초점 현미경을 사용하여 반사 모드에서 PBS의 윤활제 층의 안정성을 모니터링했습니다.윤활층이 주입된 불소계 SAM 코팅 유리 샘플을 PBS 용액에 담근 후 오비탈 셰이커(SHO-1D, Daihan Scientific, South Korea)를 사용하여 약한 흔들림 조건(120rpm)에서 테스트했습니다.그런 다음 샘플을 채취하고 반사광의 손실을 측정하여 윤활유의 손실을 모니터링합니다.반사 모드에서 형광 이미지를 얻으려면 샘플을 633nm 레이저에 노출한 다음 수집합니다. 왜냐하면 빛이 샘플에서 다시 반사되기 때문입니다.샘플은 0, 30, 60, 120시간 간격으로 측정되었습니다.
정형외과 임플란트의 나노역학적 특성에 대한 표면 개질 공정의 영향을 확인하기 위해 3면 피라미드 모양의 Berkovich 다이아몬드 팁이 장착된 나노인덴터(TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA)를 사용하여 나노인덴디온을 측정했습니다.피크 하중은 10mN이고 면적은 100μmx 100μm입니다.모든 측정에서 로딩 및 언로딩 시간은 10초이고, 최대 압입 하중 하에서 유지 시간은 2초입니다.5개의 서로 다른 위치에서 측정하고 평균을 구합니다.하중에 따른 기계적 강도 성능을 평가하기 위해 만능시험기(Instron 5966, Instron, USA)를 이용하여 횡방향 3점 굽힘시험을 수행하였다.기판은 부하가 증가하면서 10N/s의 일정한 속도로 압축됩니다.Bluehill Universal 소프트웨어 프로그램(n = 3)을 사용하여 굴곡 탄성률과 최대 압축 응력을 계산했습니다.
작동 과정과 작동 중 발생하는 관련 기계적 손상을 시뮬레이션하기 위해 작동 과정을 시험관 내에서 수행했습니다.대퇴골은 처형된 뉴질랜드 흰토끼로부터 수집되었습니다.대퇴골을 세척하고 4% 파라포름알데히드에 1주 동안 고정시켰습니다.동물실험 방법에 기술된 바와 같이 고정된 대퇴골을 수술적으로 수술하였다.수술 후 정형외과용 임플란트를 혈액(말 혈액, KISAN, 한국)에 10초간 담가서 기계적 손상을 가한 후 혈액 유착이 발생하는지 확인했습니다(n=3).
총 24마리의 수컷 뉴질랜드 흰토끼(체중 3.0~3.5kg, 평균 연령 6개월)를 무작위로 누드 음성, 누드 양성, SHP 및 LOIS의 4개 그룹으로 나누었습니다.동물과 관련된 모든 절차는 동물기관관리위원회(IACUC 승인, KOREA-2017-0159)의 윤리 기준에 따라 수행되었습니다.정형외과용 임플란트는 골절 고정을 위한 5개의 구멍(길이 41mm, 너비 7mm, 두께 2mm)이 있는 잠금 플레이트와 피질 잠금 나사(길이 12mm, 직경 2.7mm)로 구성됩니다.순수 음성 그룹에 사용된 플레이트와 나사를 제외하고 모든 플레이트와 나사는 MRSA 현탁액(106 CFU/ml)에서 12시간 동안 배양되었습니다.노출 음성 그룹(n=6)은 감염에 대한 음성 대조군으로서 박테리아 현탁액에 노출되지 않은 노출 표면 임플란트로 치료되었습니다.노출된 양성 그룹(n = 6)은 감염에 대한 양성 대조군으로 박테리아에 노출된 노출된 표면 임플란트로 치료되었습니다.SHP 그룹(n = 6)은 박테리아에 노출된 SHP 임플란트로 치료되었습니다.마지막으로, LOIS 그룹은 박테리아에 노출된 LOIS 임플란트(n = 6)로 치료되었습니다.모든 동물은 우리 안에 갇히게 되며, 많은 양의 먹이와 물이 제공됩니다.수술 전 토끼를 12시간 동안 금식시켰다.유도를 위해 자일라진(5mg/kg)을 근육주사하고 파클리탁셀(3mg/kg)을 정맥주사하여 동물을 마취시켰다.그 후, 마취를 유지하기 위해 호흡기 시스템을 통해 이소플루란 2%와 의료용 산소 50%~70%(유량 2L/min)를 전달합니다.외측 대퇴골에 직접 접근하여 이식됩니다.제모 및 피부 포비돈 요오드 소독 후 좌측 중퇴 대퇴골 외측에 약 6 cm 길이의 절개를 하였다.대퇴골을 덮고 있는 근육 사이의 틈을 열어줌으로써 대퇴골이 완전히 노출되게 됩니다.플레이트를 대퇴골 샤프트 앞에 놓고 4개의 나사로 고정합니다.고정 후 톱날(두께 1mm)을 사용하여 두 번째 구멍과 네 번째 구멍 사이에 인위적으로 파단을 만듭니다.수술이 끝나면 식염수로 상처를 씻어내고 봉합사로 봉합하였다.각 토끼에게 식염수에 1/3로 희석된 엔로플록사신(5 mg/kg)을 피하 주사했습니다.뼈의 절골술을 확인하기 위해 모든 동물(0, 7, 14, 21, 28 및 42일)에서 대퇴골의 수술 후 X-레이를 촬영했습니다.깊은 마취 후 28일과 42일에 모든 동물을 정맥내 KCl(2mmol/kg)로 죽였습니다.시행 후 micro-CT로 대퇴골을 스캔하여 4개 그룹 간의 뼈 치유 과정과 새로운 뼈 형성을 관찰하고 비교했습니다.
시술 후 정형외과용 임플란트와 직접적으로 접촉된 연조직을 채취하였다.조직을 10% 중성 완충 포르말린에 밤새 고정시킨 후 EtOH에서 탈수시켰다.탈수된 조직을 파라핀에 포매한 후 마이크로톰(400CS; EXAKT, Germany)을 이용하여 40 μm 두께로 절편하였다.감염 여부를 시각화하기 위해 H&E 염색과 MT 염색을 시행하였다.숙주의 반응을 확인하기 위해 절편된 조직을 토끼 항-TNF-α 1차 항체(AB6671, Abcam, USA) 및 토끼 항-IL-6(AB6672, Abcam, USA)와 함께 배양한 후 양 고추냉이를 처리하였다.산화효소.제조업체의 지침에 따라 아비딘-비오틴 복합체(ABC) 염색 시스템을 섹션에 적용합니다.갈색 반응 생성물로 나타나도록 모든 부분에 3,3-diaminobenzidine을 사용하였다.모든 슬라이스를 시각화하기 위해 디지털 슬라이드 스캐너(Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, 헝가리)를 사용했으며 각 그룹의 최소 4개 기판을 ImageJ 소프트웨어로 분석했습니다.
골절 치유를 모니터링하기 위해 수술 후 모든 동물과 매주 X선 이미지를 촬영했습니다(그룹당 n=6).시행 후 고해상도 micro-CT를 사용하여 치유 후 대퇴골 주변의 굳은살 형성을 계산했습니다.얻은 대퇴골을 세척한 후 4% 파라포름알데히드에 3일간 고정한 후 75% 에탄올에 탈수하였다.탈수된 뼈는 micro-CT(SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgium)를 사용하여 스캔하여 뼈 샘플의 3D 복셀 이미지(2240×2240 픽셀)를 생성했습니다.1.0mm Al 필터를 사용하여 신호 잡음을 줄이고 모든 스캔에 고해상도를 적용합니다(E = 133kVp, I = 60μA, 통합 시간 = 500ms).Nrecon 소프트웨어(버전 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, 벨기에)를 사용하여 획득한 2D 측면 투영에서 스캔된 샘플의 3D 볼륨을 생성했습니다.분석을 위해 3차원 재구성 영상을 골절 부위에 따라 10mm×10mm×10mm 큐브로 분할한다.피질골 외부의 굳은살을 계산합니다.DataViewer(버전 1.5.1.2, Bruker microCT, Kontich, 벨기에) 소프트웨어를 사용하여 스캔한 뼈량을 디지털 방식으로 리디렉션하고 CT-Analyzer(버전 1.14.4.1, Bruker microCT, 벨기에 Kontich) 소프트웨어를 사용하여 분석했습니다.성숙한 뼈와 굳은살의 상대 X-선 흡수 계수는 밀도로 구별되며, 굳은살의 부피는 정량화됩니다(n = 4).LOIS의 생체적합성이 뼈 치유 과정을 지연시키지 않는다는 것을 확인하기 위해 두 마리의 토끼(Naked-negative 그룹과 LOIS 그룹)에서 추가 X-ray 및 micro-CT 분석을 수행했습니다.두 그룹 모두 6주차에 처형됐다.
희생된 동물의 대퇴골을 수집하고 4% 파라포름알데히드에 3일 동안 고정했습니다.그런 다음 정형외과용 임플란트를 대퇴골에서 조심스럽게 제거합니다.0.5 M EDTA(EC-900, National Diagnostics Corporation)를 사용하여 21일 동안 대퇴골의 석회질을 제거하였다.그런 다음 석회질이 제거된 대퇴골을 EtOH에 담가서 탈수시켰다.탈수된 대퇴골을 자일렌에서 제거하고 파라핀에 포매했습니다.그런 다음 자동 회전 마이크로톰(Leica RM2255, Leica Biosystems, Germany)을 사용하여 샘플을 3μm 두께로 슬라이스했습니다.TRAP 염색(F6760, Sigma-Aldrich, Germany)을 위해 절편화된 샘플을 탈파라핀화하고 재수화한 후 TRAP 시약에서 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다.슬라이드 스캐너(Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, 헝가리)를 사용하여 이미지를 획득하고 염색된 영역의 면적 범위를 측정하여 정량화했습니다.각 실험에서 각 그룹의 최소 4개 기판을 ImageJ 소프트웨어로 분석했습니다.
통계적 유의성 분석은 GraphPad Prism(GraphPad Software Inc., USA)을 이용하여 수행하였다.평가 그룹 간의 차이를 테스트하기 위해 Unpaired t-test와 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용했습니다.유의 수준은 그림에 다음과 같이 표시됩니다: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 및 ****P<0.0001;NS, 큰 차이는 없습니다.
이 기사의 보충 자료는 http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1을 참조하세요.
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최경민, 오영장, 박준준, 이진혁, 김현철, 이경문, 이창규, 이연택, 이선욱, 정모이
정형외과 임플란트의 항균 및 면역 탈출 코팅은 감염과 감염으로 인한 면역 반응을 줄일 수 있습니다.
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