For patienter, der gennemgår ortopædisk implantatkirurgi, har bakterielle infektioner og infektionsinducerede immunresponser altid været livstruende risici.Konventionelle biologiske materialer er modtagelige for biologisk forurening, som får bakterier til at invadere det skadede område og forårsage postoperativ infektion.Derfor er der et presserende behov for at udvikle anti-infektion og immune escape coatings til ortopædiske implantater.Her har vi udviklet en avanceret overflademodifikationsteknologi til ortopædiske implantater kaldet Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), som er inspireret af den glatte overflade af kandeplantekander.LOIS har langvarig og stærk væskeafvisende modstand mod en række forskellige væsker og biologiske stoffer (inklusive celler, proteiner, calcium og bakterier).Derudover bekræftede vi den mekaniske holdbarhed mod ridser og fikseringskraft ved at simulere den uundgåelige skade under in vitro-kirurgien.Modellen for inflammatorisk lårbensfraktur fra kaninknoglemarv blev brugt til grundigt at studere LOIS's anti-biologiske skalering og anti-infektionsevne.Vi forestiller os, at LOIS, som har anti-biofouling egenskaber og mekanisk holdbarhed, er et skridt fremad inden for infektionsfri ortopædkirurgi.
I dag er antallet af patienter, der lider af ortopædiske sygdomme (såsom ældre frakturer, degenerative ledsygdomme og osteoporose), steget kraftigt (1, 2).Derfor lægger medicinske institutioner stor vægt på ortopædkirurgi, herunder ortopædiske implantater af skruer, plader, søm og kunstige led (3, 4).Traditionelle ortopædiske implantater er imidlertid blevet rapporteret at være modtagelige for bakteriel adhæsion og biofilmdannelse, som kan forårsage infektion på operationsstedet (SSI) efter operation (5, 6).Når først biofilmen er dannet på overfladen af ​​det ortopædiske implantat, bliver det ekstremt vanskeligt at fjerne biofilmen selv ved brug af store doser antibiotika.Derfor fører det normalt til alvorlige postoperative infektioner (7, 8).På grund af ovenstående problemer bør behandlingen af ​​inficerede implantater omfatte reoperation, herunder fjernelse af alle implantater og omgivende væv;derfor vil patienten lide af stærke smerter og nogle risici (9, 10).
For at løse nogle af disse problemer er lægemiddel-eluerende ortopædiske implantater blevet udviklet for at forhindre infektion ved at eliminere bakterier, der er knyttet til overfladen (11, 12).Strategien viser dog stadig flere begrænsninger.Det er blevet rapporteret, at langvarig implantation af lægemiddel-eluerende implantater har forårsaget skade på omgivende væv og forårsaget inflammation, som kan føre til nekrose (13, 14).Derudover kræver de organiske opløsningsmidler, der kan eksistere efter fremstillingsprocessen af ​​lægemiddel-eluerende ortopædiske implantater, som er strengt forbudt af US Food and Drug Administration, yderligere oprensningstrin for at opfylde deres standarder (15).Lægemiddeleluerende implantater er udfordrende for den kontrollerede frigivelse af lægemidler, og på grund af deres begrænsede lægemiddelbelastning er langtidsanvendelse af lægemidlet ikke mulig (16).
En anden almindelig strategi er at belægge implantatet med en antifouling-polymer for at forhindre biologisk materiale og bakterier i at klæbe til overfladen (17).For eksempel har zwitterioniske polymerer tiltrukket sig opmærksomhed på grund af deres ikke-klæbende egenskaber, når de er i kontakt med plasmaproteiner, celler og bakterier.Det har dog nogle begrænsninger relateret til langsigtet stabilitet og mekanisk holdbarhed, som hindrer dets praktiske anvendelse i ortopædiske implantater, især på grund af mekanisk afskrabning under kirurgiske procedurer (18, 19).På grund af dets høje biokompatibilitet, manglende behov for fjernelseskirurgi og overfladerensende egenskaber gennem korrosion, er der blevet brugt ortopædiske implantater lavet af biologisk nedbrydelige materialer (20, 21).Under korrosion nedbrydes de kemiske bindinger mellem polymermatrixen og løsnes fra overfladen, og klæberne renser overfladen.Anti-biologisk begroning ved overfladerensning er dog effektiv på kort tid.Derudover vil de fleste absorberbare materialer, herunder poly(mælkesyre-glykolsyre-copolymer) (PLGA), polymælkesyre (PLA) og magnesiumbaserede legeringer, gennemgå ujævn biologisk nedbrydning og erosion i kroppen, hvilket vil påvirke den mekaniske stabilitet negativt.(to og tyve).Derudover giver de biologisk nedbrydelige pladefragmenter et sted for bakterier at sætte sig fast, hvilket øger risikoen for infektion på sigt.Denne risiko for mekanisk nedbrydning og infektion begrænser den praktiske anvendelse af plastikkirurgi (23).
Superhydrofobe (SHP) overflader, der efterligner den hierarkiske struktur af lotusblade, er blevet en potentiel løsning til antibegroningsoverflader (24, 25).Når SHP-overfladen er nedsænket i væske, vil luftbobler blive fanget og derved danne luftlommer og forhindre bakteriel adhæsion (26).Nylige undersøgelser har dog vist, at SHP-overfladen har ulemper relateret til mekanisk holdbarhed og langtidsstabilitet, hvilket hindrer dens anvendelse i medicinske implantater.Desuden vil luftlommerne opløses og miste deres antifouling-egenskaber, hvilket resulterer i bredere bakteriel adhæsion på grund af det store overfladeareal af SHP-overfladen (27, 28).For nylig introducerede Aizenberg og kolleger en innovativ metode til anti-biofouling overfladebelægning ved at udvikle en glat overflade inspireret af Nepenthes kandeplante (29, 30).Den glatte overflade viser langtidsstabilitet under hydrauliske forhold, er ekstremt væskeafvisende over for biologiske væsker og har selvreparerende egenskaber.Der er dog hverken en metode til at påføre en belægning på et kompleksformet medicinsk implantat, og det er heller ikke bevist, at det understøtter helingsprocessen af ​​beskadiget væv efter implantation.
Her introducerer vi en smurt ortopædisk implantatoverflade (LOIS), en mikro/nano-struktureret ortopædisk implantatoverflade og tæt kombineret med et tyndt smørelag for at forhindre det i at blive forbundet med plastikkirurgi Bakterielle infektioner, såsom brudfiksering.Fordi den fluorfunktionaliserede mikro/nano-niveau struktur fastgør smøremidlet på strukturen, kan den udviklede LOIS fuldt ud afvise adhæsionen af ​​forskellige væsker og opretholde antifouling ydeevne i lang tid.LOIS-belægninger kan påføres materialer af forskellige former beregnet til knoglesyntese.De fremragende anti-biobegroningsegenskaber af LOIS mod biofilmbakterier [Pseudomonas aeruginosa og methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)] og biologiske stoffer (celler, proteiner og calcium) er blevet bekræftet in vitro.Vedhæftningshastigheden for omfattende vedhæftning til underlaget er mindre end 1 %.Derudover hjælper selvhelbredelsen forårsaget af det gennemtrængende smøremiddel med at bevare dets antibegroningsegenskaber, selv efter mekanisk belastning såsom overfladeridsning.De mekaniske holdbarhedstestresultater viser, at selv efter strukturel og kemisk modifikation vil den samlede styrke ikke blive væsentligt reduceret.Derudover blev der udført et in vitro-eksperiment, der simulerer den mekaniske belastning i det kirurgiske miljø, for at bevise, at LOIS kan modstå forskellige mekaniske belastninger, der opstår under plastikkirurgi.Endelig brugte vi en kanin-baseret in vivo femoral frakturmodel, som beviste, at LOIS har overlegne antibakterielle egenskaber og biokompatibilitet.Radiologiske og histologiske resultater bekræftede, at stabil smøremiddeladfærd og anti-biobegroningsegenskaber inden for 4 uger efter implantation kan opnå effektiv anti-infektion og immunflugt uden at forsinke knoglehelingsprocessen.
Figur 1A viser et skematisk diagram af den udviklede LOIS, som er implanteret med mikro/nano-skala strukturer i kanin femoral fraktur modellen for at bekræfte dens fremragende anti-biologisk begroning og anti-infektion egenskaber.En biomimetisk metode udføres for at simulere overfladen af ​​en vandpotteplante og for at forhindre biobegroning ved at inkorporere et smøremiddellag i overfladens mikro/nano-struktur.Overfladen indsprøjtet med smøremiddel kan minimere kontakten mellem biologiske stoffer og overfladen.På grund af dannelsen af ​​stabile kemiske bindinger på overfladen har den derfor fremragende antifouling-ydeevne og langtidsstabilitet.Som et resultat tillader smøreoverfladens anti-biobegroningsegenskaber forskellige praktiske anvendelser inden for biomedicinsk forskning.Omfattende forskning i, hvordan denne særlige overflade interagerer i kroppen, er dog endnu ikke afsluttet.Ved at sammenligne LOIS med nøgne substrater in vitro ved hjælp af albumin og biofilmbakterier kan LOIS's ikke-klæbeevne bekræftes (figur 1B).Ved at rulle vanddråberne af på det skrånende nøgne substrat og LOIS-substratet (Figur S1 og Movie S1) kan den biologiske kontamineringsydelse desuden påvises.Som vist på fluorescensmikroskopbilledet viste det eksponerede substrat inkuberet i en suspension af protein og bakterier en stor mængde biologisk materiale, der klæber til overfladen.På grund af dens fremragende anti-biobegroningsegenskaber viser LOIS næsten ikke nogen fluorescens.For at bekræfte dets anti-biofouling og anti-infektionsegenskaber blev LOIS påført overfladen af ​​ortopædiske implantater til knoglesyntese (plader og skruer) og placeret i en kaninfrakturmodel.Før implantation blev det nøgne ortopædiske implantat og LOIS inkuberet i en bakteriesuspension i 12 timer.Præ-inkubationen sikrer, at der dannes en biofilm på overfladen af ​​det eksponerede implantat til sammenligning.Figur 1C viser et foto af frakturstedet 4 uger efter implantation.Til venstre viste en kanin med et blottet ortopædisk implantat et alvorligt niveau af betændelse på grund af dannelsen af ​​en biofilm på overfladen af ​​implantatet.Det modsatte resultat blev observeret hos kaniner implanteret med LOIS, det vil sige, det omgivende væv af LOIS viste hverken tegn på infektion eller tegn på inflammation.Derudover angiver det optiske billede til venstre det operationssted for kaninen med det blottede implantat, hvilket indikerer, at der ikke blev fundet flere klæbemidler på overfladen af ​​det eksponerede implantat på overfladen af ​​LOIS.Dette viser, at LOIS har langtidsstabilitet og har evnen til at bevare sine anti-biologiske begroning og anti-adhæsionsegenskaber.
(A) Skematisk diagram af LOIS og dets implantation i en lårbensfrakturmodel af kanin.(B) Fluorescensmikroskopibillede af protein og bakteriel biofilm på bar overflade og LOIS-substrat.4 uger efter implantation, (C) et fotografisk billede af frakturstedet og (D) et røntgenbillede (fremhævet med et rødt rektangel).Billede udlånt: Kyomin Chae, Yonsei University.
De steriliserede, eksponerede negativt implanterede kaniner viste en normal knoglehelingsproces uden tegn på betændelse eller infektion.På den anden side udviser SHP-implantater, der er præ-inkuberet i en bakteriesuspension, infektionsrelateret inflammation på det omgivende væv.Dette kan tilskrives dens manglende evne til at hæmme bakteriel adhæsion i lang tid (figur S2).For at bevise, at LOIS ikke påvirker helingsprocessen, men hæmmer mulige infektioner relateret til implantation, blev røntgenbilleder af den eksponerede positive matrix og LOIS på frakturstedet sammenlignet (figur 1D).Røntgenbilledet af det blottede positive implantat viste vedvarende osteolyselinjer, hvilket indikerer, at knoglen ikke var fuldstændig helet.Dette tyder på, at knoglegendannelsesprocessen kan blive meget forsinket på grund af infektionsrelateret inflammation.Tværtimod viste den, at kaninerne implanteret med LOIS var helet og ikke viste noget tydeligt brudsted.
For at udvikle medicinske implantater med langsigtet stabilitet og funktionalitet (herunder resistens over for biobegroning) er der gjort mange anstrengelser.Tilstedeværelsen af ​​forskellige biologiske stoffer og dynamikken i vævsadhæsion begrænser imidlertid udviklingen af ​​deres klinisk pålidelige metoder.For at overvinde disse mangler har vi udviklet en mikro/nano lagdelt struktur og kemisk modificeret overflade, som er optimeret på grund af høj kapillærkraft og kemisk affinitet til at holde det glatteste smøremiddel i størst muligt omfang.Figur 2A viser den overordnede fremstillingsproces af LOIS.Forbered først et rustfrit stål (SS) 304-substrat af medicinsk kvalitet.For det andet dannes mikro/nano-strukturen på SS-substratet ved kemisk ætsning under anvendelse af flussyreopløsning (HF).For at genoprette korrosionsbestandigheden af ​​SS, bruges en salpetersyre (HNO3) opløsning (31) til at behandle det ætsede substrat.Passivering øger korrosionsbestandigheden af ​​SS-substratet og sænker korrosionsprocessen betydeligt, hvilket kan reducere den samlede ydeevne af LOIS.Derefter, ved at danne et selvsamlet monolag (SAM) med 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroctyltriethoxysilan (POTS), modificeres overfladen kemisk for at forbedre den kemiske interaktion mellem overfladen og den glatte smøremiddelaffinitet.Overflademodifikationen reducerer markant overfladeenergien af ​​den fremstillede mikro/nanoskala strukturerede overflade, som matcher overfladeenergien af ​​det glatte smøremiddel.Dette gør, at smøremidlet kan vædes fuldstændigt, hvorved der dannes et stabilt smøremiddellag på overfladen.Den modificerede overflade udviser øget hydrofobicitet.Resultaterne viser, at det glatte smøremiddel udviser stabil adfærd på LOIS på grund af den høje kemiske affinitet og kapillarkraft forårsaget af mikro/nano-strukturen (32, 33).De optiske ændringer på overfladen af ​​SS efter overflademodifikation og smøremiddelinjektion blev undersøgt.Den mikro/nano lagdelte struktur dannet på overfladen kan forårsage visuelle ændringer og gøre overfladen mørkere.Dette fænomen tilskrives den forbedrede lysspredningseffekt på den ru overflade, som øger den diffuse refleksion forårsaget af lysfangemekanismen (34).Derudover bliver LOIS mørkere, efter at smøremidlet er indsprøjtet.Det smørende lag bevirker, at mindre lys reflekteres fra underlaget, hvorved LOIS bliver mørkere.For at optimere mikrostrukturen/nanostrukturen til at vise den mindste glidevinkel (SA) for at opnå anti-biofouling-ydeevne, blev scanningselektronmikroskopi (SEM) og atompar brugt til at udføre forskellige HF-ætsningstider (0, 3).15 og 60 minutter) kraftmikroskop (AFM) (figur 2B).SEM- og AFM-billeder viser, at efter kort tids ætsning (3 minutters ætsning) har det nøgne substrat dannet ujævn nanoskala ruhed.Overfladeruheden ændres med ætsetiden (Figur S3).Den tidsvarierende kurve viser, at overfladeruheden fortsætter med at stige og når et toppunkt ved 15 minutters ætsning, og derefter observeres kun et lille fald i ruhedsværdien ved 30 minutters ætsning.På dette tidspunkt ætses ruheden på nanoniveau væk, mens ruheden på mikroniveau udvikler sig kraftigt, hvilket gør ruhedsændringen mere stabil.Efter ætsning i mere end 30 minutter observeres en yderligere stigning i ruhed, hvilket forklares i detaljer som følger: SS er sammensat af stål, legeret med elementer, herunder jern, krom, nikkel, molybdæn og mange andre grundstoffer.Blandt disse grundstoffer spiller jern, krom og molybdæn en vigtig rolle i dannelsen af ​​mikron/nanoskala ruhed på SS ved HF-ætsning.I de tidlige stadier af korrosion er jern og krom hovedsageligt korroderet, fordi molybdæn har højere korrosionsbestandighed end molybdæn.Efterhånden som ætsningen skrider frem, når ætseopløsningen lokal overmætning og danner fluorider og oxider forårsaget af ætsning.Fluorid og oxid udfældes og til sidst genaflejres på overfladen og danner en overfladeruhed i mikron/nano-området (31).Denne ruhed på mikro-/nanoniveau spiller en vigtig rolle i LOIS's selvhelbredende egenskaber.Den dobbelte skalaoverflade frembringer en synergistisk effekt, hvilket i høj grad øger kapillærkraften.Dette fænomen gør det muligt for smøremidlet at trænge stabilt ind i overfladen og bidrager til selvhelbredende egenskaber (35).Dannelsen af ​​ruhed afhænger af ætsetiden.Under 10 minutters ætsning indeholder overfladen kun ruhed i nanoskala, hvilket ikke er nok til at indeholde nok smøremiddel til at have modstandsdygtighed over for biobegroning (36).På den anden side, hvis ætsningstiden overstiger 30 minutter, vil ruheden i nanoskala dannet ved genafsætning af jern og krom forsvinde, og kun mikroskala ruheden vil forblive på grund af molybdæn.Den overætsede overflade mangler ruhed i nanoskala og mister den synergistiske effekt af to-trins ruhed, hvilket negativt påvirker LOIS's selvhelbredende egenskaber.SA-målinger blev udført på substrater med forskellige ætsningstider for at bevise antifouling-ydeevne.Forskellige typer væsker blev udvalgt baseret på viskositet og overfladeenergi, herunder deioniseret (DI) vand, blod, ethylenglycol (EG), ethanol (EtOH) og hexadecan (HD) (Figur S4).Det tidsvarierende ætsningsmønster viser, at for forskellige væsker med forskellige overfladeenergier og viskositeter er SA for LOIS efter 15 minutters ætsning den laveste.Derfor er LOIS optimeret til at ætse i 15 minutter for at danne mikron- og nanoskala ruhed, hvilket er velegnet til effektivt at opretholde smøremidlets holdbarhed og fremragende antifouling-egenskaber.
(A) Skematisk diagram af LOIS's fire-trins fremstillingsproces.Indsatsen viser SAM dannet på substratet.(B) SEM- og AFM-billeder, der bruges til at optimere mikro/nano-strukturen af ​​substratet under forskellige ætsningstider.Røntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) spektre af (C) Cr2p og (D) F1s efter overfladepassivering og SAM belægning.au, vilkårlig enhed.(E) Repræsentative billeder af vanddråber på nøgne, ætsede, SHP- og LOIS-substrater.(F) Kontaktvinklen (CA) og SA-måling af væsker med forskellige overfladespændinger på SHP og LOIS.Data er udtrykt som middelværdi ± SD.
Derefter, for at bekræfte ændringen i overfladens kemiske egenskaber, blev røntgenfotoelektronspektroskopi (XPS) brugt til at studere ændringen i den kemiske sammensætning af substratoverfladen efter hver overfladebelægning.Figur 2C viser XPS-måleresultaterne af den HF-ætsede overflade og den HNO3-behandlede overflade.De to hovedtoppe ved 587,3 og 577,7 eV kan tilskrives Cr-O-bindingen, der findes i kromoxidlaget, som er den største forskel fra den HF-ætsede overflade.Dette skyldes hovedsageligt forbruget af jern og chromfluorid på overfladen af ​​HNO3.Den HNO3-baserede ætsning gør det muligt for krom at danne et passiverende oxidlag på overfladen, hvilket gør det ætsede SS igen modstandsdygtigt over for korrosion.I figur 2D blev XPS-spektre opnået for at bekræfte, at fluorcarbon-baseret silan blev dannet på overfladen efter SAM-belægningen, som har ekstrem høj væskeafvisning selv for EG, blod og EtOH.SAM-belægningen fuldendes ved at reagere silanfunktionelle grupper med hydroxylgrupper dannet ved plasmabehandling.Som et resultat blev der observeret en signifikant stigning i CF2- og CF3-toppe.Bindingsenergien mellem 286 og 296 eV indikerer, at den kemiske modifikation er blevet gennemført med succes af SAM-coatingen.SHP viser relativt store CF2 (290,1 eV) og CF3 (293,3 eV) toppe, som er forårsaget af den fluorcarbonbaserede silan dannet på overfladen.Figur 2E viser repræsentative optiske billeder af kontaktvinkelmålinger (CA) for forskellige grupper af deioniseret vand i kontakt med blottet, ætset, SHP og LOIS.Disse billeder viser, at den ætsede overflade bliver hydrofil på grund af mikro/nano-strukturen dannet ved kemisk ætsning, så deioniseret vand absorberes i strukturen.Men når substratet er belagt med SAM, udviser substratet en stærk vandafvisende evne, så der dannes et overflade-SHP, og kontaktområdet mellem vand og overfladen er lille.Endelig blev der observeret et fald i CA i LOIS, hvilket kan tilskrives indtrængning af smøremiddel i mikrostrukturen, hvorved kontaktarealet øges.For at bevise, at overfladen har fremragende væskeafvisende og ikke-klæbende egenskaber, blev LOIS sammenlignet med SHP-substratet ved at måle CA og SA ved hjælp af forskellige væsker (figur 2F).Forskellige typer væsker blev udvalgt baseret på viskositet og overfladeenergi, herunder deioniseret vand, blod, EG, EtOH og HD (Figur S4).CA-målingsresultater viser, at når CA har tendens til HD, er reduktionsværdien af ​​CA, hvor CA har den laveste overfladeenergi.Derudover er LOIS for den samlede CA lav.SA-målingen viser dog et helt andet fænomen.Bortset fra det ioniserede vand, klæber alle væsker til SHP-substratet uden at glide af.På den anden side viser LOIS en meget lav SA, hvor når al væsken vippes i en vinkel lavere end 10° til 15°, vil al væsken rulle af.Dette viser stærkt, at LOIS's ikke-klæbeevne er bedre end SHP-overfladen.Derudover påføres LOIS-belægninger også på forskellige typer materialer, herunder titanium (Ti), polyphenylsulfon (PPSU), polyoxymethylen (POM), polyetheretherketon (PEEK) og bioabsorberbare polymerer (PLGA), De er implanterbare ortopædiske materialer (figur S5)).De sekventielle billeder af dråberne på materialet behandlet af LOIS viser, at LOIS's anti-biobegroningsegenskaber er de samme på alle substrater.Derudover viser måleresultaterne fra CA og SA, at LOIS' ikke-klæbende egenskaber kan anvendes på andre materialer.
For at bekræfte LOIS' antibegroningsegenskaber blev forskellige typer substrater (inklusive bare, ætset, SHP og LOIS) inkuberet med Pseudomonas aeruginosa og MRSA.Disse to bakterier blev udvalgt som repræsentative hospitalsbakterier, hvilket kan føre til dannelse af biofilm, hvilket fører til SSI (37).Figur 3 (A og B) viser fluorescensmikroskopbillederne og måleresultaterne for kolonidannende enhed (CFU) af substraterne inkuberet i bakteriesuspensionen i henholdsvis kortvarig (12 timer) og langvarig (72 timer).I løbet af kort tid vil bakterier danne klynger og vokse i størrelse, dække sig med slimlignende stoffer og forhindre deres fjernelse.Men i løbet af 72-timers inkubationen vil bakterierne modnes og blive nemme at sprede for at danne flere kolonier eller klynger.Derfor kan det anses for, at 72-timers inkubation er langsigtet og er den passende inkubationstid til at danne en stærk biofilm på overfladen (38).På kort tid udviste den ætsede overflade og overfladen af ​​SHP bakteriel adhæsion, som blev reduceret med ca. 25% til 50% sammenlignet med det nøgne substrat.På grund af dens fremragende anti-biofouling ydeevne og stabilitet viste LOIS imidlertid ikke bakteriel biofilmadhæsion på kort og lang sigt.Det skematiske diagram (figur 3C) beskriver forklaringen af ​​den anti-biologiske begroningsmekanisme af ætseopløsningen, SHP og LOIS.Antagelsen er, at det ætsede substrat med hydrofile egenskaber vil have et større overfladeareal end det nøgne substrat.Derfor vil der opstå mere bakteriel adhæsion på det ætsede underlag.Sammenlignet med det nøgne substrat har det ætsede substrat imidlertid væsentligt mindre biofilm dannet på overfladen.Dette skyldes, at vandmolekyler binder sig fast til den hydrofile overflade og fungerer som et smøremiddel for vand og dermed forstyrrer bakteriers vedhæftning på kort sigt (39).Laget af vandmolekyler er dog meget tyndt og opløseligt i bakteriesuspensioner.Derfor forsvinder det vandmolekylære lag i lang tid, hvilket fører til omfattende bakteriel adhæsion og spredning.For SHP er bakteriel adhæsion hæmmet på grund af dets kortsigtede ikke-befugtende egenskaber.Den reducerede bakterielle adhæsion kan tilskrives luftlommer fanget i den lagdelte struktur og lavere overfladeenergi, hvorved kontakten mellem bakteriesuspensionen og overfladen minimeres.Der blev dog observeret omfattende bakteriel adhæsion i SHP, fordi det mistede sine antifouling-egenskaber i lang tid.Dette skyldes hovedsageligt forsvinden af ​​luftlommer på grund af hydrostatisk tryk og opløsning af luft i vand.Dette skyldes hovedsageligt forsvinden af ​​luftlommer på grund af opløsning og den lagdelte struktur, der giver et større overfladeareal til vedhæftning (27, 40).I modsætning til disse to substrater, der har en vigtig effekt på langtidsstabiliteten, sprøjtes smøremidlet indeholdt i LOIS ind i mikro/nano-strukturen og vil ikke forsvinde selv på lang sigt.Smøremidler fyldt med mikro/nano strukturer er meget stabile og tiltrækkes stærkt af overfladen på grund af deres høje kemiske affinitet og forhindrer derved bakteriel adhæsion i lang tid.Figur S6 viser et reflektionskonfokalt mikroskopbillede af et smøremiddel-infunderet substrat nedsænket i fosfatbufret saltvand (PBS).Kontinuerlige billeder viser, at selv efter 120 timers let rystning (120 rpm) forbliver smøremiddellaget på LOIS uændret, hvilket indikerer langtidsstabilitet under strømningsforhold.Dette skyldes den høje kemiske affinitet mellem den fluorbaserede SAM-belægning og det perfluorcarbonbaserede smøremiddel, således at der kan dannes et stabilt smøremiddellag.Derfor bibeholdes antifouling-ydelsen.Derudover blev substratet testet mod repræsentative proteiner (albumin og fibrinogen), som er i plasma, celler tæt relateret til immunfunktion (makrofager og fibroblaster), og dem relateret til knogledannelse.Indholdet af calcium er meget højt.(Figur 3D, 1 og 2 og Figur S7) (41, 42).Derudover viste fluorescensmikroskopbillederne af adhæsionstesten for fibrinogen, albumin og calcium forskellige adhæsionskarakteristika for hver substratgruppe (figur S8).Under knogledannelse kan nydannede knogle- og calciumlag omgive det ortopædiske implantat, hvilket ikke kun gør fjernelse vanskelig, men også kan forårsage uventet skade på patienten under fjernelsesprocessen.Derfor er lave niveauer af kalkaflejringer på knogleplader og skruer gavnlige til ortopædkirurgi, der kræver implantatfjernelse.Baseret på kvantificeringen af ​​det vedhæftede område baseret på fluorescensintensiteten og celletallet bekræftede vi, at LOIS viser fremragende anti-biobegroningsegenskaber for alle biologiske stoffer sammenlignet med andre substrater.Ifølge resultaterne af in vitro-forsøg kan den anti-biologiske begroning LOIS påføres ortopædiske implantater, som ikke kun kan hæmme infektioner forårsaget af biofilmbakterier, men også reducere inflammation forårsaget af kroppens aktive immunsystem.
(A) Fluorescensmikroskopbilleder af hver gruppe (nøgen, ætset, SHP og LOIS) inkuberet i Pseudomonas aeruginosa og MRSA suspensioner i 12 og 72 timer.(B) Antallet af adhærente CFU af Pseudomonas aeruginosa og MRSA på overfladen af ​​hver gruppe.(C) Skematisk diagram af den anti-biologiske begroningsmekanisme ved kortsigtet og langsigtet ætsning, SHP og LOIS.(D) (1) Antallet af fibroblaster adhæreret til hvert substrat og fluorescensmikroskopbilleder af cellerne adhæreret til bare og LOIS.(2) Adhæsionstest af immunrelaterede proteiner, albumin og calcium involveret i knoglehelingsprocessen (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 og **** P <0,0001).ns, ikke vigtigt.
I tilfælde af uundgåelige koncentrerede belastninger har mekanisk holdbarhed altid været hovedudfordringen for påføring af antifouling-belægninger.Traditionelle anti-kloakgelmetoder er baseret på polymerer med lav vandopløselighed og skrøbelighed.Derfor er de normalt modtagelige for mekanisk stress i biomedicinske applikationer.Derfor forbliver mekanisk holdbare antifouling-belægninger en udfordring for applikationer som ortopædiske implantater (43, 44).Figur 4A(1) viser de to hovedtyper af stress, der påføres ortopædiske implantater, herunder ridsning (forskydningsspænding) og kompression med det optiske billede af det beskadigede implantat, der produceres af pincet.For eksempel, når skruen strammes med en skruetrækker, eller når kirurgen holder knoglepladen stramt med en pincet og anvender trykkraft, vil plastikknoglepladen blive beskadiget og ridset på både makro- og mikro/nano-skalaen (Figur 4A, 2).For at teste, om den fremstillede LOIS kan modstå disse skader under plastikkirurgi, blev der udført nanoindentation for at sammenligne hårdheden af ​​det nøgne substrat og LOIS på mikro/nano-skalaen for at studere de mekaniske egenskaber af mikro/nano-strukturen Impact (figur 4B).Det skematiske diagram viser den forskellige deformationsopførsel af LOIS på grund af tilstedeværelsen af ​​mikro/nano-strukturer.En kraft-forskydningskurve blev tegnet baseret på resultaterne af nanoindentation (figur 4C).Det blå billede repræsenterer det nøgne substrat, som kun viser en lille deformation, som det ses af den maksimale indrykningsdybde på 0,26-μm.På den anden side kan den gradvise stigning i nanoindentationskraft og forskydning observeret i LOIS (rød kurve) vise tegn på reducerede mekaniske egenskaber, hvilket resulterer i en nanoindentationsdybde på 1,61μm.Dette skyldes, at mikro/nano-strukturen, der er til stede i LOIS'en, giver et dybere fremføringsrum for spidsen af ​​nanoindenteren, så dens deformation er større end det blotte substrat.Konsta-Gdoutos et al.(45) mener, at på grund af tilstedeværelsen af ​​nanostrukturer fører nanoindentation og mikro/nano-ruhed til uregelmæssige nanoindentationskurver.Det skraverede område svarer til den uregelmæssige deformationskurve, der tilskrives nanostrukturen, mens det ikke-skraverede område tilskrives mikrostrukturen.Denne deformation kan beskadige mikrostrukturen/nanostrukturen af ​​holdesmøremidlet og påvirke dets antibegroningsevne negativt.For at studere virkningen af ​​skade på LOIS blev uundgåelig skade på mikro/nano-strukturer replikeret i kroppen under plastikkirurgi.Ved at bruge blod- og proteinadhæsionstests kan stabiliteten af ​​LOIS's anti-biofouling-egenskaber efter in vitro bestemmes (figur 4D).En række optiske billeder viser den skade, der opstod nær hullerne i hvert substrat.En blodadhæsionstest blev udført for at demonstrere virkningen af ​​mekanisk beskadigelse på antibiobegroningsbelægningen (figur 4E).Ligesom SHP går antifouling-egenskaberne tabt på grund af beskadigelse, og LOIS udviser fremragende antifouling-egenskaber ved at afvise blod.Dette skyldes, at fordi overfladeenergien drives af kapillærvirkningen, der dækker det beskadigede område, genskaber strømmen i det mikrostrukturerede smøremiddel de antibegroningsegenskaber (35).Den samme tendens blev observeret i proteinadhæsionstesten under anvendelse af albumin.I det beskadigede område observeres adhæsionen af ​​protein på overfladen af ​​SHP i vid udstrækning, og ved at måle dens arealdækning kan den kvantificeres som halvdelen af ​​adhæsionsniveauet for det nøgne substrat.På den anden side bevarede LOIS sine anti-biobegroningsegenskaber uden at forårsage adhæsion (figur 4, F og G).Derudover er skruens overflade ofte udsat for stærk mekanisk belastning, såsom boring, så vi undersøgte LOIS-belægningens evne til at forblive intakt på skruen in vitro.Figur 4H viser optiske billeder af forskellige skruer, inklusive bare, SHP og LOIS.Det røde rektangel repræsenterer målområdet, hvor der opstår stærk mekanisk belastning under knogleimplantation.I lighed med pladens proteinadhæsionstest bruges et fluorescensmikroskop til at afbilde proteinadhæsionen og måle dækningsområdet for at bevise integriteten af ​​LOIS-belægningen, selv under stærk mekanisk belastning (Figur 4, I og J).De LOIS-behandlede skruer udviser fremragende antifouling-ydeevne, og næsten intet protein klæber til overfladen.På den anden side blev proteinadhæsion observeret i blottede skruer og SHP-skruer, hvor arealdækningen af ​​SHP-skruer var en tredjedel af den for blottede skruer.Derudover skal det ortopædiske implantat, der bruges til fiksering, være mekanisk stærkt for at modstå belastningen på brudstedet, som vist i figur 4K.Derfor blev der udført en bøjningstest for at bestemme effekten af ​​kemisk modifikation på mekaniske egenskaber.Derudover gøres dette for at opretholde den faste belastning fra implantatet.Påfør lodret mekanisk kraft, indtil implantatet er fuldt foldet, og der opnås en stress-strain-kurve (Figur 4L, 1).To egenskaber, herunder Youngs modul og bøjningsstyrke, blev sammenlignet mellem nøgne og LOIS-substrater som indikatorer for deres mekaniske styrke (figur 4L, 2 og 3).Youngs modul angiver et materiales evne til at modstå mekaniske ændringer.Youngs modul for hvert substrat er henholdsvis 41,48±1,01 og 40,06±0,96 GPa;den observerede forskel er omkring 3,4 %.Derudover er det rapporteret, at bøjningsstyrken, som bestemmer materialets sejhed, er 102,34±1,51 GPa for det nøgne substrat og 96,99±0,86 GPa for SHP.Det nøgne underlag er ca. 5,3 % højere.Det lille fald i mekaniske egenskaber kan være forårsaget af notch-effekten.I notch-effekten kan mikro/nano-ruheden fungere som et sæt hak, hvilket fører til lokal stresskoncentration og påvirker implantatets mekaniske egenskaber (46).Baseret på det faktum, at stivheden af ​​menneskelig kortikal knogle rapporteres til at være mellem 7,4 og 31,6 GPa, og det målte LOIS-modul overstiger stivheden af ​​menneskelig kortikal knogle (47), er LOIS tilstrækkelig til at understøtte bruddet og dets samlede knogle. mekaniske egenskaber påvirkes minimalt af overflademodifikationer.
(A) Skematisk diagram af (1) den mekaniske belastning, der påføres det ortopædiske implantat under operationen, og (2) det optiske billede af det beskadigede ortopædiske implantat.(B) Skematisk diagram af måling af nano-mekaniske egenskaber ved nanoindentation og LOIS på den bare overflade.(C) Nanoindentationskraft-forskydningskurve af bar overflade og LOIS.(D) Efter in vitro-eksperimenter, simuler de optiske billeder af forskellige typer ortopædiske plader (det beskadigede område er fremhævet med et rødt rektangel) for at simulere den mekaniske stress forårsaget under operationen.(E) Blodadhæsionstest og (F) proteinadhæsionstest af den beskadigede ortopædiske pladegruppe.(G) Mål arealdækningen af ​​proteinet, der klæber til pladen.(H) Optiske billeder af forskellige typer ortopædiske skruer efter in vitro-eksperimentet.(I) Proteinadhæsionstest for at studere integriteten af ​​forskellige belægninger.(J) Mål arealdækningen af ​​proteinet, der klæber til skruen.(K) Bevægelsen af ​​kaninen er beregnet til at generere en fast belastning på den brækkede knogle.(L) (1) Bøjningstestresultater og optiske billeder før og efter bøjning.Forskellen i (2) Youngs modul og (3) bøjningsstyrke mellem blottet implantat og SHP.Data er udtrykt som middelværdi ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 og ****P<0,0001).Billede udlånt: Kyomin Chae, Yonsei University.
I kliniske situationer kommer det meste af bakteriel kontakt med biologiske materialer og sårsteder fra modne, modne biofilm (48).Derfor anslår US Centers for Disease Control and Prevention, at 65 % af alle menneskelige infektioner er relateret til biofilm (49).I dette tilfælde er det nødvendigt at tilvejebringe et in vivo eksperimentelt design, der giver ensartet biofilmdannelse på implantatets overflade.Derfor udviklede vi en kanin femoral frakturmodel, hvor ortopædiske implantater blev præ-inkuberet i en bakteriesuspension og derefter implanteret i kanin femur for at studere antifouling egenskaberne af LOIS in vivo.På grund af de følgende tre vigtige kendsgerninger induceres bakterielle infektioner af prækultur snarere end direkte injektion af bakteriesuspensioner: (i) Immunsystemet hos kaniner er naturligt stærkere end menneskers;derfor er injektion af bakteriesuspensioner og planktonbakterier mulig. Det har ingen effekt på dannelsen af ​​biofilm.(Ii) Planktonbakterier er mere modtagelige for antibiotika, og antibiotika bruges normalt efter operationen;endelig, (iii) planktonbakteriesuspensionen kan fortyndes af dyrets kropsvæsker (50).Ved at fordyrke implantatet i en bakteriesuspension før implantation, kan vi grundigt studere de skadelige virkninger af bakteriel infektion og fremmedlegemereaktion (FBR) på knoglehelingsprocessen.Kaninerne blev aflivet 4 uger efter implantation, fordi den osseointegration, der er afgørende for knoglehelingsprocessen, vil være afsluttet inden for 4 uger.Derefter blev implantaterne fjernet fra kaninerne til nedstrømsundersøgelser.Figur 5A viser spredningsmekanismen for bakterier.Det inficerede ortopædiske implantat indføres i kroppen.Som et resultat af præinkubation i bakteriesuspension blev seks af de seks kaniner implanteret med nøgne implantater inficeret, mens ingen af ​​kaninerne implanteret med LOIS-behandlede implantater var inficeret.Bakterielle infektioner forløber i tre trin, herunder vækst, modning og spredning (51).Først formerer og vokser de vedhæftede bakterier på overfladen, og derefter danner bakterierne en biofilm, når de udskiller ekstracellulær polymer (EPS), amyloid og ekstracellulært DNA.Biofilm interfererer ikke kun med penetrationen af ​​antibiotika, men fremmer også akkumuleringen af ​​antibiotika-nedbrydende enzymer (såsom β-lactamase) (52).Endelig spreder biofilmen de modne bakterier ud i det omgivende væv.Derfor opstår der infektion.Derudover, når et fremmedlegeme kommer ind i kroppen, kan en infektion, der kan forårsage et stærkt immunrespons, forårsage alvorlig betændelse, smerte og nedsat immunitet.Figur 5B giver et overblik over FBR forårsaget af indsættelsen af ​​et ortopædisk implantat snarere end immunresponset forårsaget af en bakteriel infektion.Immunsystemet genkender det indsatte implantat som et fremmedlegeme og får derefter cellerne og vævene til at reagere for at indkapsle fremmedlegemet (53).I de tidlige dage af FBR blev der dannet en forsyningsmatrix på overfladen af ​​ortopædiske implantater, hvilket resulterede i adsorption af fibrinogen.Det adsorberede fibrinogen danner derefter et meget tæt fibrin-netværk, som fremmer vedhæftningen af ​​leukocytter (54).Når først fibrin-netværket er dannet, vil der opstå akut inflammation på grund af infiltration af neutrofiler.I dette trin frigives en række forskellige cytokiner såsom tumornekrosefaktor-a (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) og IL-β, og monocytter begynder at infiltrere implantationsstedet og differentiere til kæmpeceller.Fag (41, 55, 56).At reducere FBR har altid været en udfordring, fordi overdreven FBR kan forårsage akut og kronisk betændelse, som kan føre til fatale komplikationer.For at vurdere virkningen af ​​bakterielle infektioner i vævene omkring det blottede implantat og LOIS, blev hæmatoxylin og eosin (H&E) og Masson trichrome (MT) farvning brugt.For kaniner implanteret med nøgne substrater udviklede alvorlige bakterielle infektioner sig, og H&E-vævsglas viste tydeligt bylder og nekrose forårsaget af inflammation.På den anden side hæmmer den ekstremt stærke anti-biofouling-overflade LOIS bakteriel adhæsion, så den viser ingen tegn på infektion og reducerer inflammation (Figur 5C).Resultaterne af MT-farvning viste samme tendens.Imidlertid viste MT-farvning også ødem hos kaniner implanteret med LOIS, hvilket indikerer, at genopretning er ved at finde sted (figur 5D).For at studere graden af ​​immunrespons blev immunhistokemisk (IHC) farvning udført under anvendelse af cytokiner TNF-a og IL-6 relateret til immunrespons.Et nøgent negativt implantat, der ikke var udsat for bakterier, blev sammenlignet med et LOIS, der var udsat for bakterier, men ikke inficeret for at studere helingsprocessen i fravær af bakteriel infektion.Figur 5E viser et optisk billede af et IHC-objektglas, der udtrykker TNF-a.Det brune område repræsenterer immunresponset, hvilket indikerer, at immunresponset i LOIS er lidt reduceret.Derudover var ekspressionen af ​​IL-6 i LOIS signifikant mindre end den negative ekspression af steril nøgen (figur 5F).Ekspressionen af ​​​​cytokin blev kvantificeret ved at måle området af antistoffarvning svarende til cytokinet (figur 5G).Sammenlignet med de kaniner, der blev udsat for de negative implantater, var ekspressionsniveauerne for kaninerne implanteret med LOIS lavere, hvilket viste en meningsfuld forskel.Faldet i cytokinekspression indikerer, at de langsigtede, stabile antibegroningsegenskaber af LOIS ikke kun er relateret til inhiberingen af ​​bakterielle infektioner, men også til faldet af FBR, som induceres af makrofager, der klæber til substratet (53, 57, 58).Derfor kan det reducerede immunrespons på grund af LOIS's immunundvigende egenskaber løse bivirkningerne efter implantation, såsom overdreven immunrespons efter plastikkirurgi.
(A) Et skematisk diagram af mekanismen for biofilmdannelse og spredning på overfladen af ​​et inficeret ortopædisk implantat.eDNA, ekstracellulært DNA.(B) Skematisk diagram af immunrespons efter ortopædisk implantatindsættelse.(C) H&E-farvning og (D) MT-farvning af det omgivende væv af ortopædiske implantater med bare positiv og LOIS.IHC af immun-relaterede cytokiner (E) TNF-α og (F) IL-6 er farvede billeder af nøgne-negative og LOIS-implanterede kaniner.(G) Kvantificering af cytokinekspression ved arealdækningsmåling (** P <0,01).
Biokompatibiliteten af ​​LOIS og dens effekt på knoglehelingsprocessen blev undersøgt in vivo ved hjælp af diagnostisk billeddannelse [røntgen- og mikrocomputertomografi (CT)] og osteoklast IHC.Figur 6A viser knoglehelingsprocessen, der involverer tre forskellige stadier: inflammation, reparation og ombygning.Når der opstår et brud, vil inflammatoriske celler og fibroblaster trænge ind i den brækkede knogle og begynde at vokse ind i det vaskulære væv.Under reparationsfasen spredes indvæksten af ​​vaskulært væv nær brudstedet.Karvæv giver næringsstoffer til dannelsen af ​​ny knogle, som kaldes callus.Den sidste fase af knoglehelingsprocessen er remodeling-stadiet, hvor størrelsen af ​​callus reduceres til størrelsen af ​​normal knogle ved hjælp af en stigning i niveauet af aktiverede osteoklaster (59).Tredimensionel (3D) rekonstruktion af frakturstedet blev udført ved hjælp af mikro-CT-scanninger for at observere forskellene i niveauet af callusdannelse i hver gruppe.Observer tværsnittet af lårbenet for at observere tykkelsen af ​​callus, der omgiver den brækkede knogle (Figur 6, B og C).Røntgenstråler blev også brugt til at undersøge frakturstederne for alle grupper hver uge for at observere de forskellige knogleregenereringsprocesser i hver gruppe (figur S9).Callus og modne knogler er vist i henholdsvis blå/grøn og elfenben.De fleste bløddele filtreres fra med en forudindstillet tærskel.Nøgen positiv og SHP bekræftede dannelsen af ​​en lille mængde callus omkring frakturstedet.På den anden side er den eksponerede negativ af LOIS og frakturstedet omgivet af tyk callus.Mikro-CT-billeder viste, at dannelsen af ​​callus blev forhindret af bakteriel infektion og infektionsrelateret inflammation.Dette skyldes, at immunsystemet prioriterer helingen af ​​septiske skader forårsaget af infektionsrelateret inflammation frem for knoglegendannelse (60).IHC og Tartrat-resistent Acid Phosphatase (TRAP) farvning blev udført for at observere osteoklastaktivitet og knogleresorption (figur 6D) (61).Kun få aktiverede osteoklaster farvet lilla blev fundet i nøgne positiver og SHP.På den anden side blev mange aktiverede osteoklaster observeret nær de nøgne positive og modne knogler af LOIS.Dette fænomen indikerer, at i nærvær af osteoklaster gennemgår callus omkring frakturstedet en voldsom ombygningsproces (62).Knoglevolumen og osteoklastekspressionsområdet af callus blev målt for at sammenligne niveauet af callusdannelse omkring frakturstedet i alle grupper for at kvantificere mikro-CT-scanningen og IHC-resultaterne (Figur 6E, 1 og 2).Som forventet var de nøgne negativer og callus-dannelsen i LOIS signifikant højere end i de andre grupper, hvilket indikerer, at positiv knogleombygning fandt sted (63).Figur S10 viser det optiske billede af operationsstedet, MT-farvningsresultatet af vævet opsamlet nær skruen og TRAP-farvningsresultatet, der fremhæver skrue-knoglegrænsefladen.I det nøgne substrat blev der observeret kraftig callus- og fibrosedannelse, mens det LOIS-behandlede implantat viste en relativt uadhæreret overflade.Sammenlignet med nøgne negativer blev lavere fibrose observeret hos kaniner implanteret med LOIS, som angivet med de hvide pile.Derudover kan det faste ødem (blå pil) tilskrives LOIS's immunundvigelsesegenskaber, hvorved alvorlig inflammation reduceres.Den non-stick overflade omkring implantatet og reduceret fibrose tyder på, at fjernelsesprocessen er lettere, hvilket normalt resulterer i andre brud eller betændelse.Knoglehelingsprocessen efter skruefjernelse blev evalueret ved osteoklastaktiviteten ved skrue-knoglegrænsefladen.Både den blotte knogle og LOIS-implantatgrænsefladen absorberede lignende niveauer af osteoklaster for yderligere knogleheling, hvilket indikerer, at LOIS-belægningen ikke har nogen negativ effekt på knogleheling eller immunrespons.For at bekræfte, at overflademodifikationen udført på LOIS ikke interfererer med knoglehelingsprocessen, blev røntgenundersøgelse brugt til at sammenligne kaninernes knogleheling med udsatte negative ioner og 6 ugers LOIS-implantation (Figur 6F).Resultaterne viste, at sammenlignet med den uinficerede nøgen positive gruppe viste LOIS samme grad af knogleheling, og der var ingen tydelige tegn på fraktur (kontinuerlig osteolyselinje) i begge grupper.
(A) Skematisk diagram af knoglehelingsproces efter fraktur.(B) Forskellen i graden af ​​callusdannelse af hver overfladegruppe og (C) tværsnitsbilledet af frakturstedet.(D) TRAP-farvning for at visualisere osteoklastaktivitet og knogleresorption.Baseret på TRAP-aktivitet blev dannelsen af ​​ekstern callus af kortikal knogle kvantitativt analyseret ved (E) (1) mikro-CT og (2) osteoklastaktivitet.(F) 6 uger efter implantation, røntgenbilleder af den brækkede knogle af det eksponerede negativ (fremhævet af det røde stiplede rektangel) og LOIS (fremhævet af det blå stiplede rektangel).Statistisk analyse blev udført ved en-vejs variansanalyse (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Kort sagt giver LOIS en ny type antibakteriel infektionsstrategi og immunescape-coating til ortopædiske implantater.Konventionelle ortopædiske implantater med SHP-funktionalisering udviser kortsigtede anti-biofouling-egenskaber, men kan ikke bevare deres egenskaber i lang tid.Substratets superhydrofobicitet fanger luftbobler mellem bakterierne og substratet og danner derved luftlommer og forhindrer derved bakteriel infektion.Men på grund af spredningen af ​​luft fjernes disse luftlommer let.På den anden side har LOIS godt bevist sin evne til at forhindre biofilm-relaterede infektioner.Derfor kan infektionsrelateret inflammation forhindres på grund af de anti-afstødningsegenskaber af smøremiddellaget, der sprøjtes ind i den lagdelte mikro/nano strukturoverflade.Forskellige karakteriseringsmetoder, herunder SEM, AFM, XPS og CA målinger, bruges til at optimere LOIS fremstillingsbetingelser.Derudover kan LOIS også anvendes på forskellige biologiske materialer, der almindeligvis anvendes i ortopædisk fikseringsudstyr, såsom PLGA, Ti, PE, POM og PPSU.Derefter blev LOIS testet in vitro for at bevise dets anti-biofouling egenskaber mod bakterier og biologiske stoffer relateret til immunrespons.Resultaterne viser, at det har fremragende antibakterielle og anti-biobegroningseffekter sammenlignet med det bare implantat.Derudover viser LOIS mekanisk styrke selv efter påføring af mekanisk belastning, hvilket er uundgåeligt i plastikkirurgi.På grund af smøremidlets selvhelbredende egenskaber på overfladen af ​​mikro/nano-strukturen har LOIS med succes bevaret sine anti-biologiske begroningsegenskaber.For at studere biokompatibiliteten og de antibakterielle egenskaber af LOIS in vivo blev LOIS implanteret i kanin femur i 4 uger.Der blev ikke observeret nogen bakteriel infektion hos kaniner implanteret med LOIS.Derudover viste brugen af ​​IHC et reduceret niveau af lokal immunrespons, hvilket indikerer, at LOIS ikke hæmmer knoglehelingsprocessen.LOIS udviser fremragende antibakterielle og immunundvigende egenskaber og har vist sig effektivt at forhindre biofilmdannelse før og under ortopædkirurgi, især til knoglesyntese.Ved at bruge en model for inflammatorisk lårbensfraktur fra kaninknoglemarv blev effekten af ​​biofilm-relaterede infektioner på knoglehelingsprocessen induceret af præ-inkuberede implantater dybt undersøgt.Som et fremtidigt studie er der behov for en ny in vivo-model til at studere mulige infektioner efter implantation for fuldt ud at forstå og forhindre biofilm-relaterede infektioner under hele helingsprocessen.Derudover er osteoinduktion stadig en uløst udfordring i integration med LOIS.Yderligere forskning er nødvendig for at kombinere selektiv adhæsion af osteoinduktive celler eller regenerativ medicin med LOIS for at overvinde udfordringen.Samlet set repræsenterer LOIS en lovende ortopædisk implantatbelægning med mekanisk robusthed og fremragende anti-biobegroningsegenskaber, som kan reducere SSI og immunbivirkninger.
Vask 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS-substratet (Dong Kang M-Tech Co., Korea) i acetone, EtOH og DI-vand i 15 minutter for at fjerne forurenende stoffer.For at danne en struktur på mikro/nano-niveau på overfladen nedsænkes det rensede substrat i en 48% til 51% HF-opløsning (DUKSAN Corp., Sydkorea) ved 50°C.Ætsetiden varierer fra 0 til 60 minutter.Derefter blev det ætsede substrat renset med deioniseret vand og anbragt i en 65% HNO3-opløsning (Korea DUKSAN Corp.) ved 50°C i 30 minutter for at danne et chromoxid-passiveringslag på overfladen.Efter passivering vaskes substratet med deioniseret vand og tørres for at opnå et substrat med en lagdelt struktur.Derefter blev substratet udsat for oxygenplasma (100 W, 3 minutter) og straks nedsænket i en opløsning af 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Tyskland) i toluen ved stuetemperatur i 12 timer.Derefter blev substratet coatet med POTS renset med EtOH og udglødet ved 150°C i 2 timer for at opnå en tæt POTS SAM.Efter SAM-belægning blev der dannet et smørelag på underlaget ved at påføre et perfluorpolyether-smøremiddel (Krytox 101; DuPont, USA) med et belastningsvolumen på 20 μm/cm 2. Før brug filtreres smøremidlet gennem et 0,2 mikron filter.Fjern overskydende smøremiddel ved at vippe i en vinkel på 45° i 15 minutter.Den samme fremstillingsprocedure blev brugt til ortopædiske implantater lavet af 304 SS (låseplade og kortikal låseskrue; Dong Kang M-Tech Co., Korea).Alle ortopædiske implantater er designet til at passe til geometrien af ​​kaninens lårben.
Overflademorfologien af ​​substratet og ortopædiske implantater blev inspiceret af feltemissions-SEM (Inspect F50, FEI, USA) og AFM (XE-100, Park Systems, Sydkorea).Overfladeruheden (Ra, Rq) måles ved at gange arealet på 20 μm med 20 μm (n=4).Et XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japan) system udstyret med en Al Kα røntgenkilde med en pletstørrelse på 100μm2 blev brugt til at analysere overfladens kemiske sammensætning.Et CA-målesystem udstyret med et dynamisk billedoptagelseskamera (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Sydkorea) blev brugt til at måle flydende CA og SA.For hver måling anbringes 6 til 10 μl dråber (deioniseret vand, hesteblod, EG, 30 % ethanol og HD) på overfladen for at måle CA.Når hældningsvinklen for substratet øges med en hastighed på 2°/s (n = 4), måles SA, når dråben falder.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] og MRSA (ATCC 25923) blev købt fra ATCC (Manassas, Virginia, USA), og stamkulturen blev holdt ved -80°C.Før brug blev den frosne kultur inkuberet i trypsin-optøet sojabouillon (Komed, Korea) ved 37°C i 18 timer og derefter overført to gange for at aktivere den.Efter inkubation blev kulturen centrifugeret ved 10.000 rpm i 10 minutter ved 4°C og vasket to gange med en PBS (pH 7,3) opløsning.Den centrifugerede kultur subkultureres derefter på blodagarplader (BAP).MRSA og Pseudomonas aeruginosa blev fremstillet natten over og dyrket i Luria-Bertani bouillon.Koncentrationen af ​​Pseudomonas aeruginosa og MRSA i inokulumet blev kvantitativt bestemt af suspensionens CFU i serielle fortyndinger på agar.Juster derefter bakteriekoncentrationen til 0,5 McFarland-standard, hvilket svarer til 108 CFU/ml.Fortynd derefter den fungerende bakteriesuspension 100 gange til 106 CFU/ml.For at teste de antibakterielle adhæsionsegenskaber blev substratet steriliseret ved 121°C i 15 minutter før brug.Substratet blev derefter overført til 25 ml bakteriesuspension og inkuberet ved 37°C under kraftig rystning (200 rpm) i 12 og 72 timer.Efter inkubation blev hvert substrat fjernet fra inkubatoren og vasket 3 gange med PBS for at fjerne eventuelle flydende bakterier på overfladen.For at observere biofilmen på substratet blev biofilmen fikseret med methanol og farvet med 1 ml crimidin orange i 2 minutter.Derefter blev et fluorescensmikroskop (BX51TR, Olympus, Japan) brugt til at tage billeder af den farvede biofilm.For at kvantificere biofilmen på substratet blev de vedhæftede celler adskilt fra substratet ved hjælp af perlehvirvelmetoden, som blev anset for at være den mest egnede metode til at fjerne vedhæftede bakterier (n = 4).Brug en steril pincet, fjern substratet fra vækstmediet og bank på brøndpladen for at fjerne overskydende væske.Løst fæstnede celler blev fjernet ved vask to gange med steril PBS.Hvert substrat blev derefter overført til et sterilt reagensglas indeholdende 9 ml 0,1 % protein ept saltvand (PSW) og 2 g 20 til 25 sterile glasperler (0,4 til 0,5 mm i diameter).Den blev derefter hvirvlet i 3 minutter for at frigøre cellerne fra prøven.Efter vortexing blev suspensionen seriefortyndet 10 gange med 0,1 % PSW, og derefter blev 0,1 ml af hver fortynding podet på BAP.Efter 24 timers inkubation ved 37°C blev CFU talt manuelt.
Til cellerne blev der anvendt musefibroblaster NIH/3T3 (CRL-1658; amerikansk ATCC) og musemakrofager RAW 264.7 (TIB-71; amerikansk ATCC).Brug Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) til at dyrke musefibroblaster og suppler med 10 % kalveserum (S103-01, Welgene) og 1 % penicillin-streptomycin (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene) Brug DMEM til at dyrke musemakrofager suppleret med 10% føtalt bovint serum (S001-01, Welgene) og 1% PS. Placer substratet i en cellekulturplade med seks brønde, og inokulér cellerne ved 105 celler/cm2. Cellerne blev inkuberet natten over ved 37°C og 5% CO2. Til cellefarvning blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd i 20 minutter og anbragt i 0,5% Triton X Incubate i 5 minutter i -100 nM tetramethylrhodamin ved 37°C i 30 minutter Efter inkubationsprocessen, brug substratet med 4',6-diamino-2-phenylindol (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD fikseringsmedium (n = 4 pr. celle). fluorescein, fluorescein-isothiocyanat-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Tyskland) og human plasma. Alexa Fluor 488-konjugeret fibrinogen (F13191, Invitrogen, USA) blev opløst i PBS (10 mM, pH 7,4).Koncentrationerne af albumin og fibrinogen var henholdsvis 1 og 150 μg/ml.Efter substratet Inden nedsænkning i proteinopløsningen, skyl dem med PBS for at rehydrere overfladen.Nedsænk derefter alle substraterne i en plade med seks brønde indeholdende proteinopløsningen og inkuber ved 37°C i 30 og 90 minutter.Efter inkubation blev substratet derefter fjernet fra proteinopløsningen, vasket forsigtigt med PBS 3 gange og fikseret med 4% paraformaldehyd (n = 4 for hvert protein).For calcium blev natriumchlorid (0,21 M) og kaliumphosphat (3,77 mM)) opløst i deioniseret vand.Opløsningens pH blev justeret til 2,0 ved tilsætning af hydrochloridopløsning (1 M).Derefter blev calciumchlorid (5,62 mM) opløst i opløsningen.Ved at tilsætte 1 M tris(hydroxymethyl)-amino justerer Methan opløsningens pH til 7,4.Nedsænk alle substrater i en plade med seks brønde fyldt med 1,5 x calciumphosphatopløsning og fjern fra opløsningen efter 30 minutter.Til farvning blandes 2 g Alizarin Red S (CI 58005) med 100 ml deioniseret vand.Brug derefter 10 % ammoniumhydroxid til at justere pH-værdien til 4. Farv substratet med Alizarin Red-opløsning i 5 minutter, og ryst derefter det overskydende farvestof af og blot.Efter rysteprocessen fjernes substratet.Materialet dehydreres, nedsænkes derefter i acetone i 5 minutter, nedsænkes derefter i en acetone-xylen-opløsning (1:1) i 5 minutter og vaskes til sidst med xylen (n = 4).Der anvendes fluorescensmikroskop (Axio Imager) med ×10 og ×20 objektiv..A2m, Zeiss, Tyskland) afbilder alle substrater.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) blev brugt til at kvantificere adhæsionsdata for biologiske stoffer på hver gruppe af fire forskellige billeddannelsesområder.Konverter alle billeder til binære billeder med faste tærskler for substratsammenligning.
Et Zeiss LSM 700 konfokalmikroskop blev brugt til at overvåge stabiliteten af ​​smøremiddellaget i PBS i reflektionstilstand.Den fluorbaserede SAM-coatede glasprøve med et injiceret smørelag blev nedsænket i en PBS-opløsning og testet ved anvendelse af en orbitalryster (SHO-1D; Daihan Scientific, Sydkorea) under milde rysteforhold (120 rpm).Tag derefter prøven og overvåg tabet af smøremiddel ved at måle tabet af reflekteret lys.For at opnå fluorescensbilleder i reflektionstilstand udsættes prøven for en 633 nm laser og derefter opsamles, fordi lyset vil blive reflekteret tilbage fra prøven.Prøverne blev målt med tidsintervaller på 0, 30, 60 og 120 timer.
For at bestemme indflydelsen af ​​overflademodifikationsprocessen på de nanomekaniske egenskaber af ortopædiske implantater, blev en nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) udstyret med en tresidet pyramideformet Berkovich diamantspids brugt til at måle nanoindenedion.Spidsbelastningen er 10 mN og arealet er 100μmx 100μm.For alle målinger er på- og aflæsningstiden 10 s, og holdetiden under spidsbelastning er 2 s.Tag målinger fra fem forskellige steder og tag gennemsnittet.For at evaluere den mekaniske styrkeydelse under belastning blev der udført en tværgående trepunktsbøjningstest ved brug af en universel testmaskine (Instron 5966, Instron, USA).Substratet komprimeres med en konstant hastighed på 10 N/s med en øget belastning.Bluehill Universal-softwareprogrammet (n = 3) blev brugt til at beregne bøjningsmodulet og maksimal trykspænding.
For at simulere operationsprocessen og den relaterede mekaniske skade forårsaget under operationen, blev operationsprocessen udført in vitro.Lårbenene blev indsamlet fra de henrettede New Zealand hvide kaniner.Lårbenet blev renset og fikseret i 4% paraformaldehyd i 1 uge.Som beskrevet i dyreforsøgsmetoden blev det fikserede lårben kirurgisk opereret.Efter operationen blev det ortopædiske implantat nedsænket i blod (hesteblod, KISAN, Korea) i 10 s for at bekræfte, om der opstod blodadhæsioner efter den mekaniske skade blev påført (n = 3).
I alt 24 New Zealand hvide hankaniner (vægt 3,0 til 3,5 kg, gennemsnitsalder 6 måneder) blev tilfældigt opdelt i fire grupper: nøgen negative, nøgen positive, SHP og LOIS.Alle procedurer, der involverede dyr, blev udført i overensstemmelse med de etiske standarder fra Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC godkendt, KOREA-2017-0159).Det ortopædiske implantat består af en låseplade med fem huller (længde 41 mm, bredde 7 mm og tykkelse 2 mm) og kortikale låseskruer (længde 12 mm, diameter 2,7 mm) til brudfiksering.Bortset fra de plader og skruer, der blev brugt i den bare-negative gruppe, blev alle plader og skruer inkuberet i MRSA-suspension (106 CFU/ml) i 12 timer.Den nøgne-negative gruppe (n=6) blev behandlet med nøgne overfladeimplantater uden eksponering for bakteriesuspension, som en negativ kontrol for infektion.Den nøgne positive gruppe (n = 6) blev behandlet med et bart overfladeimplantat udsat for bakterier som en positiv kontrol for infektion.SHP-gruppen (n = 6) blev behandlet med bakterielt eksponerede SHP-implantater.Til sidst blev LOIS-gruppen behandlet med bakterieeksponerede LOIS-implantater (n = 6).Alle dyr holdes i bur, og der bliver sørget for en masse mad og vand.Før operationen blev kaninerne fastet i 12 timer.Dyrene blev bedøvet ved intramuskulær injektion af xylazin (5 mg/kg) og intravenøs injektion af paclitaxel (3 mg/kg) til induktion.Derefter tilføres 2 % isofluran og 50 % til 70 % medicinsk oxygen (flowhastighed 2 l/min) gennem åndedrætssystemet for at opretholde anæstesi.Det implanteres gennem en direkte tilgang til det laterale lårben.Efter hårfjerning og povidon-jod-desinfektion af huden blev der lavet et snit på ca. 6 cm på ydersiden af ​​venstre midterste lårben.Ved at åbne mellemrummet mellem musklerne, der dækker lårbenet, er lårbenet helt blottet.Placer pladen foran lårbensskaftet og fastgør den med fire skruer.Efter fiksering skal du bruge et savblad (1 mm tykt) til kunstigt at skabe et brud i området mellem det andet hul og det fjerde hul.Ved afslutningen af ​​operationen blev såret vasket med saltvand og lukket med suturer.Hver kanin blev injiceret subkutant med enrofloxacin (5 mg/kg) fortyndet en tredjedel i saltvand.Postoperative røntgenbilleder af lårbenet blev taget i alle dyr (0, 7, 14, 21, 28 og 42 dage) for at bekræfte knoglens osteotomi.Efter dyb anæstesi blev alle dyr aflivet med intravenøs KCl (2 mmol/kg) på 28 og 42 dage.Efter udførelse blev lårbenet scannet med mikro-CT for at observere og sammenligne knoglehelingsprocessen og ny knogledannelse mellem de fire grupper.
Efter udførelsen blev det bløde væv, der var i direkte kontakt med de ortopædiske implantater, opsamlet.Vævet blev fikseret i 10 % neutral bufret formalin natten over og derefter dehydreret i EtOH.Det dehydrerede væv blev indlejret i paraffin og snit i en tykkelse på 40 μm ved hjælp af en mikrotom (400CS; EXAKT, Tyskland).For at visualisere infektionen blev der udført H&E-farvning og MT-farvning.For at kontrollere værtsresponset blev det sektionerede væv inkuberet med kanin-anti-TNF-a primært antistof (AB6671, Abcam, USA) og kanin-anti-IL-6 (AB6672; Abcam, USA) og derefter behandlet med peberrod.Oxidase.Påfør farvningssystemet avidin-biotinkompleks (ABC) på sektionerne i henhold til producentens instruktioner.For at fremstå som et brunt reaktionsprodukt blev 3,3-diaminobenzidin anvendt i alle dele.En digital diasscanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungarn) blev brugt til at visualisere alle skiver, og mindst fire substrater i hver gruppe blev analyseret med ImageJ-software.
Røntgenbilleder blev taget i alle dyr efter operationen og hver uge for at overvåge frakturheling (n=6 pr. gruppe).Efter udførelse blev mikro-CT i høj opløsning brugt til at beregne dannelsen af ​​callus omkring lårbenet efter heling.Det opnåede lårben blev renset, fikseret i 4 % paraformaldehyd i 3 dage og dehydreret i 75 % ethanol.De dehydrerede knogler blev derefter scannet ved at bruge mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgien) for at generere 3D-voxelbilleder (2240×2240 pixels) af knogleprøven.Brug 1,0 mm Al-filter til at reducere signalstøj og anvende høj opløsning på alle scanninger (E = 133 kVp, I = 60 μA, integrationstid = 500 ms).Nrecon-software (version 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgien) blev brugt til at generere et 3D-volumen af ​​den scannede prøve fra den erhvervede 2D-laterale projektion.Til analyse er det 3D-rekonstruerede billede opdelt i 10 mm × 10 mm × 10 mm terninger i henhold til brudstedet.Beregn callus uden for den kortikale knogle.DataViewer (version 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgien) software blev brugt til digitalt omdirigere den scannede knoglevolumen, og CT-Analyzer (version 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgien) software blev brugt til analyse.De relative røntgenabsorptionskoefficienter i moden knogle og callus er kendetegnet ved deres tæthed, og derefter kvantificeres volumenet af callus (n = 4).For at bekræfte, at biokompatibiliteten af ​​LOIS ikke forsinker knoglehelingsprocessen, blev der udført yderligere røntgen- og mikro-CT-analyser i to kaniner: den nøgne-negative og LOIS-gruppen.Begge grupper blev henrettet i den 6. uge.
Lårbenene fra aflivede dyr blev opsamlet og fikseret i 4% paraformaldehyd i 3 dage.Det ortopædiske implantat fjernes derefter forsigtigt fra lårbenet.Lårbenet blev afkalket i 21 dage ved anvendelse af 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Derefter blev det afkalkede lårben nedsænket i EtOH for at gøre det dehydreret.Det dehydrerede lårben blev fjernet i xylen og indlejret i paraffin.Derefter blev prøven skåret i skiver med en automatisk roterende mikrotom (Leica RM2255, Leica Biosystems, Tyskland) med en tykkelse på 3 μm.Til TRAP-farvning (F6760, Sigma-Aldrich, Tyskland) blev de sektionerede prøver afparaffineret, rehydreret og inkuberet i TRAP-reagens ved 37°C i 1 time.Billeder blev erhvervet ved hjælp af en diasscanner (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungarn) og kvantificeret ved at måle områdets dækning af det farvede område.I hvert eksperiment blev mindst fire substrater i hver gruppe analyseret med ImageJ-software.
Statistisk signifikansanalyse blev udført ved at bruge GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Uparret t-test og envejsvariansanalyse (ANOVA) blev brugt til at teste forskellene mellem evalueringsgrupperne.Signifikansniveauet er angivet i figuren som følger: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 og ****P<0,0001;NS, ingen signifikant forskel.
For supplerende materialer til denne artikel, se venligst http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Dette er en artikel med åben adgang distribueret under vilkårene i Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, som tillader brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, så længe brugen ikke er for kommerciel vinding, og forudsætningen er, at den originale arbejdet er korrekt.Reference.
Bemærk: Vi beder dig kun om at oplyse en e-mailadresse, så den person, du anbefaler til siden, ved, at du ønsker, at de skal se e-mailen, og at e-mailen ikke er spam.Vi vil ikke fange nogen e-mailadresser.
Dette spørgsmål bruges til at teste, om du er en menneskelig besøgende og til at forhindre automatiske spam-indsendelser.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
De antibakterielle og immune escape-belægninger af ortopædiske implantater kan reducere infektioner og immunreaktioner forårsaget af infektioner.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
De antibakterielle og immune escape-belægninger af ortopædiske implantater kan reducere infektioner og immunreaktioner forårsaget af infektioner.
©2021 American Association for the Advancement of Science.alle rettigheder forbeholdes.AAAS er partner af HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.