Per i pazienti sottoposti a chirurgia implantare ortopedica, l'infezioni batteriche è e risposti immune indotte da infezzione sò sempre stati risichi per a vita.I materiali biologichi cunvinziunali sò suscettibili à a contaminazione biologica, chì pruvucarà chì i batteri invadenu l'area ferita è causanu infezzione postoperatoria.Per quessa, ci hè una necessità urgente di sviluppà revestimenti anti-infezzione è di fuga immune per implants ortopedici.Quì, avemu sviluppatu una tecnulugia avanzata di mudificazione di a superficia per l'implanti ortopedici chjamata Superficie di Implanti Ortopedici Lubricati (LOIS), chì hè ispirata da a superficia liscia di i pitchers di pianta.LOIS hà una repellenza di liquidu longa è forte à una varietà di liquidi è sustanzi biologichi (cumprese cellule, proteini, calcium è bacteria).Inoltre, avemu cunfirmatu a durabilità meccanica contr'à i graffi è a forza di fissazione simulando u dannu inevitabbile durante a chirurgia in vitro.U mudellu di frattura femoral infiammatoria di a medula di cunigliu hè stata utilizata per studià bè a scala antibiologica è a capacità anti-infezzione di LOIS.Avemu imaginatu chì LOIS, chì hà proprietà anti-biofouling è durabilità meccanica, hè un passu avanti in a chirurgia ortopedica senza infezzione.
Oghje, per via di l'anziane generale, u numeru di pazienti chì soffrenu di e malatie ortopediche (cum'è fratture anziani, malatie degenerative di l'articuli è osteoporosi) hè assai aumentatu (1, 2).Per quessa, l'istituzioni medichi attachenu una grande impurtanza à a cirurgia ortopedica, cumpresi implants ortopedici di viti, platti, unghji è articuli artificiali (3, 4).In ogni casu, l'impianti ortopedici tradiziunali sò stati signalati per esse suscettibili à l'adesione bacteriana è a furmazione di biofilm, chì ponu causà infezzione di u situ chirurgicu (SSI) dopu a cirurgia (5, 6).Quandu u biofilm hè furmatu nantu à a superficia di l'implante ortopedicu, a rimuzione di u biofilm diventa assai difficiule ancu cù l'usu di grande dosi di antibiotici.Dunque, di solitu porta à infizzioni postoperatorie severi (7, 8).A causa di i prublemi di sopra, u trattamentu di l'impianti infettati deve include a reoperazione, cumpresa a rimozione di tutti l'implanti è i tessuti circundante;dunque, u paci hà da soffrenu dulore severu è certi risichi (9, 10).
Per risolve alcuni di sti prublemi, l'implanti ortopedici chì eliminanu a droga sò stati sviluppati per prevene l'infezzione eliminendu i batteri attaccati à a superficia (11, 12).Tuttavia, a strategia mostra sempre parechje limitazioni.Hè statu infurmatu chì l'implantazione à longu andà di l'implanti di droga-eluting hà causatu danni à i tessuti circundanti è causatu inflammazioni, chì pò purtà à necrosi (13, 14).Inoltre, i solventi organici chì ponu esisti dopu à u prucessu di fabricazione di implanti ortopedici di droga, chì sò strettamente pruibiti da a Food and Drug Administration di i Stati Uniti, necessitanu passi di purificazione supplementari per risponde à i so standard (15).L'impianti di l'eluzione di droga sò sfida per a liberazione cuntrullata di droghe, è per via di a so carica limitata di droga, l'applicazione à longu andà di a droga ùn hè micca fattibile (16).
Un'altra strategia cumuna hè di rivesti l'implantu cù un polimeru antifouling per impedisce chì a materia biologica è a bacteria aderiscenu à a superficia (17).Per esempiu, i polimeri zwitterionici anu attiratu l'attenzione per e so proprietà non-adhesive quandu in cuntattu cù i proteini di plasma, i celluli è i batteri.Tuttavia, hà alcune limitazioni ligati à a stabilità à longu andà è a durabilità meccanica, chì impediscenu a so applicazione pratica in implants ortopedici, soprattuttu per via di scraping meccanicu durante i prucessi chirurgici (18, 19).Inoltre, per via di a so alta biocompatibilità, a mancanza di necessità per a chirurgia di rimozione, è e proprietà di pulizia di a superficia per via di a corrosione, sò stati utilizati implanti ortopedici fatti di materiali biodegradabili (20, 21).Durante a corrosione, i ligami chimichi trà a matrice di polimeru sò spartuti è staccati da a superficia, è l'aderenti puliscenu a superficia.Tuttavia, l'incrustazione antibiologica da a pulizia di a superficia hè efficace in pocu tempu.Inoltre, a maiò parte di i materiali assorbabili cumpresi u poli (copolimeru di l'acidu latticu-acidu glicolicu) (PLGA), l'acidu polilatticu (PLA) è l'aliaghji basati in magnesiu subiranu una biodegradazione irregulare è l'erosione in u corpu, chì affettanu negativamente a stabilità meccanica.(vinti dui).Inoltre, i frammenti di platti biodegradabili furniscenu un locu per a bacteria per attache, chì aumenta a probabilità di infezzione à longu andà.Stu risicu di degradazione meccanica è infezzjoni limita l'applicazione pratica di a cirugia plastica (23).
I superfici superidrofobiche (SHP) chì imitanu a struttura gerarchica di foglie di lotus sò diventate una suluzione potenziale per superfici anti-fouling (24, 25).Quandu a superficia SHP hè immersa in u liquidu, e bolle d'aria saranu intrappulate, furmendu cusì sacchetti d'aria è impediscenu l'aderenza bacteriana (26).Tuttavia, studii recenti anu dimustratu chì a superficia SHP hà svantaghji ligati à a durabilità meccanica è a stabilità à longu andà, chì impediscenu a so applicazione in implants medichi.Inoltre, i sacchetti di l'aria si dissolveranu è perderanu e so proprietà anti-fouling, cusì risultatu in una aderenza battìrica più larga per via di a grande superficie di a superficia SHP (27, 28).Ricertamenti, Aizenberg è i culleghi anu introduttu un metudu innovativu di rivestimentu di superficia anti-biofouling sviluppendu una superficia liscia inspirata da a pianta di brocca Nepenthes (29, 30).A superficia liscia mostra stabilità à longu andà in cundizioni idrauliche, hè estremamente liquidu repellente à i liquidi biologichi, è hà proprietà auto-riparanti.In ogni casu, ùn ci hè nè un metudu per applicà un revestimentu à un implantu medicale cumplessu, nè hè pruvucatu per sustene u prucessu di guariscenza di u tissutu danatu dopu l'implantazione.
Quì, introducemu una superficia di implantu ortopedicu lubricatu (LOIS), una superficia di implante ortopedicu micro / nanostrutturata è strettamente cumminata cù una fina capa di lubricante per impediscenu di esse assuciata cù a cirurgia plastica Infezioni batteriche, cum'è a fissazione di frattura.Perchè a struttura micro / nano-livellu funzionale di fluoru fissa fermamente u lubrificante nantu à a struttura, u LOIS sviluppatu pò respinge cumplettamente l'aderenza di vari liquidi è mantene a prestazione anti-fouling per un bellu pezzu.I rivestimenti LOIS ponu esse appiicati à materiali di diverse forme destinati à a sintesi di l'ossu.L'eccellenti proprietà anti-biofouling di LOIS contr'à i batteri di biofilm [Pseudomonas aeruginosa è Staphylococcus aureus resistente à methicillin (MRSA)] è sustanzi biologichi (cellule, proteini è calcium) sò stati cunfirmati in vitro.A rata di aderenza di aderenza estensiva à u sustrato hè menu di 1%.Inoltre, ancu dopu à u stress meccanicu, cum'è u graffiu di a superficia, l'auto-guarigione causata da u lubrificante penetrante aiuta à mantene e so proprietà anti-fouling.I risultati di a prova di durabilità meccanica mostranu chì ancu dopu a mudificazione strutturale è chimica, a forza tutale ùn serà micca ridutta significativamente.Inoltre, un esperimentu in vitro chì simula u stress meccanicu in l'ambiente kirurggicu hè statu realizatu per pruvà chì LOIS pò sustene diversi stresses meccanichi chì si trovanu durante a chirurgia plastica.Infine, avemu usatu un mudellu di frattura femoral in vivo basatu in cunigliu, chì hà dimustratu chì LOIS hà proprietà antibacteriale superiore è biocompatibilità.I risultati radiologichi è istologichi anu cunfirmatu chì u cumpurtamentu stabile di lubricante è e proprietà anti-biofouling in 4 settimane dopu l'implantazione ponu ottene un rendimentu efficace di l'anti-infezzione è di scappata immune senza ritardà u prucessu di guariscenza di l'osse.
A figura 1A mostra un schema schematicu di u LOIS sviluppatu, chì hè implantatu cù strutture micro / nano-scala in u mudellu di frattura femorale di cunigliu per cunfirmà e so eccellenti proprietà anti-infezzione è anti-infezzione.Un metudu biomimeticu hè realizatu per simulà a superficia di una pianta d'acqua, è per prevene u biofouling incorporendu una capa di lubricante in a struttura micro / nano di a superficia.A superficia injected with lubricant pò minimizzà u cuntattu trà sustanzi biologichi è a superficia.Dunque, per via di a furmazione di ligami chimichi stabili nantu à a superficia, hà un eccellente rendimentu antifouling è stabilità à longu andà.In u risultatu, e proprietà anti-biofouling di a superficia lubricante permettenu diverse applicazioni pratiche in a ricerca biomedica.In ogni casu, una ricerca estensiva nantu à cumu sta superficia speciale interagisce in u corpu ùn hè micca stata finita.Paragunendu LOIS cù sustrati nudi in vitro cù l'albumina è i batteri di biofilm, a non-aderenza di LOIS pò esse cunfirmata (Figura 1B).Inoltre, sguassendu e gocce d'acqua nantu à u sustrato nudu inclinatu è u sustrato LOIS (Figura S1 è Movie S1), a prestazione di contaminazione biologica pò esse dimustrata.Cum'è mostra in l'imaghjini di u microscopiu di fluoriscenza, u sustrato espostu incubatu in una sospensione di prutezione è battìri dimustrava una grande quantità di materiale biologicu aderente à a superficia.Tuttavia, per via di e so eccellenti proprietà anti-biofouling, LOIS ùn mostra quasi micca fluorescenza.Per cunfirmà e so proprietà anti-biofouling è anti-infezzione, LOIS hè stata appiicata à a superficia di implants ortopedici per a sintesi di l'ossu (plate è viti) è postu in un mudellu di frattura di cunigliu.Prima di l'implantazione, l'implante ortopedicu nudu è LOIS sò stati incubati in una sospensjoni bacteriana per 12 ore.A pre-incubazione assicura chì un biofilm hè furmatu nantu à a superficia di l'implante esposta per paragunà.A figura 1C mostra una foto di u situ di frattura 4 simane dopu l'implantazione.A manca, un cunigliu cù un implante ortopedicu nudu dimustrava un livellu severu di inflammazioni per via di a furmazione di un biofilm nantu à a superficia di l'implant.U risultatu oppostu hè statu osservatu in i cunigli implantati cù LOIS, vale à dì chì i tessuti circundanti di LOIS ùn mostravanu nè signali d'infezzione nè signali di inflammazioni.Inoltre, l'imaghjini otticu nantu à a manca indicanu u situ kirurggicu di u cunigliu cù l'implante espunutu, chì indicanu chì ùn anu micca adesivi multiplici prisenti nantu à a superficia di l'implante esposta sò stati truvati nantu à a superficia di u LOIS.Questu mostra chì LOIS hà una stabilità longu è hà a capacità di mantene a so proprietà anti-biologicu è anti-aderenza.
(A) Schema schematicu di LOIS è a so implantazione in un mudellu di frattura femorale di cunigliu.(B) Immagine di microscopia di fluorescenza di proteina è biofilm batterica nantu à a superficia nuda è sustrato LOIS.4 settimani dopu à l'implantazione, (C) una maghjina fotografica di u situ di frattura è (D) una maghjina di raghji X (resaltata da un rectangulu rossu).Image courtesy: Kyomin Chae, Università Yonsei.
I conigli sterilizzati, esposti negativamente implantati, mostravanu un prucessu di guariscenza di l'ossu normale senza alcun segnu di inflammazioni o infezzjoni.Per d 'altra banda, l'impianti SHP pre-incubati in una sospensione bacteriana mostranu inflammazioni infezzione in i tessuti circundante.Questu pò esse attribuitu à a so incapacità di impedisce l'aderenza bacteriana per un bellu pezzu (Figura S2).Per dimustrà chì LOIS ùn affetta micca u prucessu di guariscenza, ma inibisce i pussibuli infizzioni ligati à l'implantazione, l'imaghjini di raghji X di a matrice pusitiva esposta è LOIS in u situ di a frattura sò stati paragunati (Figura 1D).L'imaghjini di raghji X di l'implantu pusitivu nudu mostrava linee persistenti d'osteolisi, chì indicanu chì l'ossu ùn era micca guaritu cumpletamente.Questu suggerisce chì u prucessu di ricuperazione di l'ossu pò esse ritardatu assai per via di inflammazioni infezzione.À u cuntrariu, hà dimustratu chì i cunigli implantati cù LOIS avianu guaritu è ​​​​ùn mostrava nisun situ di frattura evidenti.
Per sviluppà implanti medichi cù stabilità è funziunalità à longu andà (cumpresa a resistenza à u biofouling), parechji sforzi sò stati fatti.In ogni casu, a prisenza di diversi sustanzi biologichi è a dinamica di l'aderenza di tissuti limitanu u sviluppu di i so metudi clinicamente affidabili.Per superà queste carenze, avemu sviluppatu una struttura micro/nano stratificata è una superficia mudificata chimicamente, chì hè ottimisata per via di una forza capillara alta è affinità chimica per mantene u lubricant più liscia à u più grande.Figura 2A mostra u prucessu di fabricazione generale di LOIS.Prima, preparate un sustrato in acciaio inox (SS) 304 di qualità medica.In siconda, a struttura micro / nano hè furmata nantu à u sustrato SS per incisione chimica cù a suluzione di l'acidu fluoridicu (HF).Per restaurà a resistenza à a corrosione di SS, una suluzione d'acidu nitricu (HNO3) (31) hè aduprata per processà u sustrato incisu.A passivazione aumenta a resistenza di corrosione di u sustrato SS è rallenta significativamente u prucessu di corrosione chì pò riduce u rendiment generale di LOIS.Allora, furmendu un monolayer self-assembled (SAM) cù 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane (POTS), a superficia hè mudificatu chimicamenti per migliurà l'interazzione chimica trà a superficia è u lubricant liscia Affinity.A mudificazione di a superficia reduce significativamente l'energia di a superficia di a superficia strutturata micro / nano-scala fabbricata, chì currisponde à l'energia di a superficia di u lubricante lisu.Questu permette chì u lubricante sia cumpletamente bagnatu, furmendu cusì una capa di lubricante stabile nantu à a superficia.La superficie modificata mostra una maggiore idrofobicità.I risultati mostranu chì u lubricant slippery presenta un cumpurtamentu stabile nantu à LOIS per via di l'alta affinità chimica è a forza capillare causata da a struttura micro / nano (32, 33).I cambiamenti ottichi nantu à a superficia di SS dopu a mudificazione di a superficia è l'iniezione di lubricante sò stati studiati.A struttura micro/nano stratificata formata nantu à a superficia pò causà cambiamenti visuali è scurisce a superficia.Stu fenominu hè attribuitu à l'effettu di scattering di luce rinfurzata nantu à a superficia rugosa, chì aumenta a riflessione diffusa causata da u mecanismu di trappula di luce (34).Inoltre, dopu chì u lubricant hè injected, u LOIS diventa più scuru.A strata lubricating causa menu luce à esse riflessu da u sustrato, cusì scura u LOIS.Per ottimisà a microstruttura / nanostruttura per mostrà u più chjucu angolo di scorrimentu (SA) per ottene prestazioni anti-biofouling, microscopia elettronica a scansione (SEM) è coppie atomiche sò state aduprate per realizà diversi tempi di incisione HF (0, 3)., 15 è 60 minuti) Force Microscope (AFM) (Figura 2B).L'imaghjini SEM è AFM mostranu chì dopu à pocu tempu di incisione (3 minuti di incisione), u sustrato nudu hà furmatu una rugosità nano-scala irregolare.A rugosità di a superficia cambia cù u tempu di incisione (Figura S3).A curva chì varia in u tempu mostra chì a rugosità di a superficia cuntinueghja à aumentà è righjunghji un piccu à 15 minuti di incisione, è dopu solu una ligera diminuzione di u valore di rugosità hè osservata à 30 minuti di incisione.À questu puntu, a rugosità nano-livellu hè incisa, mentre chì a rugosità di u micro-livellu si sviluppa vigorosamente, facendu u cambiamentu di rugosità più stabile.Dopu à l'incisione per più di 30 minuti, hè osservatu un altru aumentu di a rugosità, chì hè spiegata in dettagliu cum'è seguente: SS hè cumpostu di azzaru, alliatu cù elementi cumpresi ferru, cromu, nichel, molibdenu è assai altri elementi.Frà questi elementi, u ferru, u cromu è u molibdenu ghjucanu un rolu impurtante in a furmazione di rugosità micron / nano-scala nantu à a SS per incisione HF.In i primi fasi di a corrosione, u ferru è u cromu sò principarmenti corroditi perchè u molibdenu hà una resistenza di corrosione più altu ch'è u molibdenu.Au fur et à mesure que l'incision progresse, la solution de gravure atteint une sursaturation locale, formant fluorures et oxydes causés par l'attaque.U fluoru è l'ossidu si precipitanu è eventualmente si rimettanu nantu à a superficia, furmendu una rugosità di a superficia in a gamma micron / nano (31).Questa rugosità micro/nano-livellu ghjoca un rolu impurtante in e proprietà d'autorecurazione di LOIS.A superficia doppia scala produce un effettu sinergicu, aumentendu assai a forza capillare.Stu fenominu permette à u lubricante di penetrà in a superficia stabile è cuntribuisce à e proprietà d'autorecurazione (35).A furmazione di rugosità dipende da u tempu di incisione.Sottu à 10 minuti di incisione, a superficia cuntene solu rugosità nano-scala, chì ùn hè micca abbastanza per mantene abbastanza lubricante per avè a resistenza di biofouling (36).Per d 'altra banda, se u tempu di incisione supera i 30 minuti, a rugosità nano-scala furmata da a redeposition di ferru è cromu sparirà, è solu a rugosità di micro-scala resta per u molibdenu.A superficia over-etched manca di rugosità nano-scala è pèrdite l 'effettu sinergicu di dui stadi rugosità, chì affetta negativamente e caratteristiche self-guarigione di LOIS.E misurazioni SA sò state eseguite nantu à sustrati cù diversi tempi di incisione per pruvà a prestazione anti-fouling.Diversi tipi di liquidi sò stati scelti nantu à a viscosità è l'energia di a superficia, cumprese l'acqua deionizzata (DI), u sangue, l'ethylene glycol (EG), l'etanol (EtOH) è l'hexadecane (HD) (Figura S4).U mudellu di incisione chì varieghja in u tempu mostra chì per diversi liquidi cù energie di superficia è viscosità differenti, u SA di LOIS dopu à 15 minuti di incisione hè u più bassu.Dunque, LOIS hè ottimizatu per incisione per 15 minuti per furmà rugosità micron è nano-scala, chì hè adattatu per mantene in modu efficace a durabilità di u lubrificante è eccellenti proprietà anti-fouling.
(A) Schematic schema di u prucessu di fabricazione in quattru tappe di LOIS.L'inseritu mostra u SAM furmatu nantu à u sustrato.(B) L'imaghjini SEM è AFM, aduprate per ottimisà a struttura micro / nano di u sustrato in diverse tempi di incisione.Spettroscopia di fotoelettroni di raggi X (XPS) di (C) Cr2p è (D) F1s dopu a passivazione di a superficia è u revestimentu SAM.au, unità arbitraria.(E) Immagini rappresentative di gocce d'acqua su substrati nudi, incisi, SHP e LOIS.(F) L'angolo di cuntattu (CA) è SA misurazione di liquidi cù diverse tensioni di superficia nantu à SHP è LOIS.I dati sò espressi cum'è media ± SD.
Allora, per cunfirmà u cambiamentu in e proprietà chimiche di a superficia, a spettroscopia di fotoelettroni X-ray (XPS) hè stata aduprata per studià u cambiamentu in a cumpusizioni chimica di a superficia di u sustrato dopu à ogni rivestimentu di a superficia.A figura 2C mostra i risultati di a misura XPS di a superficia incisa HF è a superficia trattata HNO 3.I dui picchi principali à 587.3 è 577.7 eV ponu esse attribuiti à u ligame Cr-O esistenti in a capa di l'ossidu di cromu, chì hè a principal diferenza da a superficia incisa HF.Questu hè principalmente dovutu à u cunsumu di u fluoruru di ferru è di cromu nantu à a superficia da HNO3.L'incisione basata in HNO3 permette à u cromu di furmà una strata d'ossidu passivatu nantu à a superficia, chì rende u SS incisu novu resistente à a corrosione.In a Figura 2D, spettri XPS sò stati ottenuti per cunfirmà chì u silane basatu in fluorocarbonu hè statu furmatu nantu à a superficia dopu à u revestimentu SAM, chì hà una repellenza liquida estremamente alta ancu per EG, sangue è EtOH.U rivestimentu SAM hè cumpletu da a reazione di i gruppi funzionali di silane cù i gruppi idrossilici formati da u trattamentu di plasma.In u risultatu, un aumentu significativu di i picchi CF2 è CF3 hè statu osservatu.L'energia di ubligatoriu trà 286 è 296 eV indica chì a mudificazione chimica hè stata cumpletata cù successu da u revestimentu SAM.SHP mostra picchi relativamente grandi CF2 (290.1 ​​​​eV) è CF3 (293.3 eV), chì sò causati da u silane basatu in fluorocarbonu furmatu nantu à a superficia.A Figura 2E mostra l'imaghjini ottichi rapprisentanti di e misurazioni di l'angolo di cuntattu (CA) per diversi gruppi di acqua deionizzata in cuntattu cù nudi, incisi, SHP è LOIS.Queste imaghjini mostranu chì a superficia incisa diventa idrofila per via di a struttura micro/nano formata da incisione chimica in modu chì l'acqua deionizzata hè assorbita in a struttura.In ogni casu, quandu u sustrato hè ricopertu cù SAM, u sustrato mostra una forte repellenza di l'acqua, cusì una superficia SHP hè furmatu è l'area di cuntattu trà l'acqua è a superficia hè chjuca.Infine, una diminuzione di CA hè stata osservata in LOIS, chì pò esse attribuita à a penetrazione di lubricante in a microstruttura, aumentendu cusì l'area di cuntattu.Per dimustrà chì a superficia hà una eccellente repellenza di liquidi è proprietà non adesive, u LOIS hè statu paragunatu cù u sustrato SHP misurà CA è SA cù diversi liquidi (Figura 2F).Diversi tipi di liquidi sò stati scelti basatu nantu à a viscosità è l'energia di a superficia, cumprese l'acqua deionizzata, u sangue, EG, EtOH è HD (Figura S4).I risultati di a misura di CA mostranu chì quandu CA tende à HD, u valore di riduzzione di CA, induve CA hà l'energia di a superficia più bassa.Inoltre, u LOIS di u CA generale hè bassu.Tuttavia, a misura SA mostra un fenomenu completamente diversu.Eccettu per l'acqua ionizzata, tutti i liquidi aderiscenu à u sustrato SHP senza slipping off.Per d 'altra banda, LOIS mostra un SA assai bassu, induve quandu tuttu u liquidu hè inclinatu à un angulu più bassu di 10 ° à 15 °, tuttu u liquidu sarà rotulatu.Questu mostra fermamente chì a non-adhesiveness di LOIS hè megliu cà quella di a superficia SHP.Inoltre, i rivestimenti LOIS sò ancu appiicati à parechji tipi di materiali, cumpresi titaniu (Ti), polyphenylsulfone (PPSU), polyoxymethylene (POM), polyether ether cetone (PEEK) è polimeri bioabsorbable (PLGA), sò materiali ortopedici implantable (Figura). S5)).L'imaghjini sequenziali di e gocce nantu à u materiale trattatu da LOIS mostranu chì e proprietà anti-biofouling di LOIS sò listessi nantu à tutti i sustrati.Inoltre, i risultati di a misura di CA è SA mostranu chì e proprietà non-adhesive di LOIS ponu esse applicate à altri materiali.
Per cunfirmà e proprietà anti-fouling di LOIS, diversi tipi di sustrati (cumpresi nudi, incisi, SHP è LOIS) sò stati incubati cù Pseudomonas aeruginosa è MRSA.Sti dui battìri sò stati scelti cum'è battìri rapprisentanti spitali, chì ponu purtà à a furmazione di biofilms, purtendu à SSI (37).A figura 3 (A è B) mostra l'imaghjini di u microscopiu di fluoriscenza è i risultati di a misurazione di l'unità di furmazione di colonie (CFU) di i sustrati incubati in a sospensione bacteriana per a curta (12 ore) è à longu andà (72 ore), rispettivamente.In pocu tempu, i batteri formanu clusters è crescenu in grandezza, coprendu cù sustanzi mucus-like è impediscenu a so eliminazione.In ogni casu, durante l'incubazione di l'ora di 72, i battìri maturanu è diventeranu faciuli di disperse per furmà più culunie o clusters.Per quessa, pò esse cunsideratu chì l'incubazione di l'ora di 72 hè longu è hè u tempu d'incubazione appropritatu per furmà un biofilm forte nantu à a superficia (38).In pocu tempu, a superficia incisa è a superficia di u SHP mostranu aderenza bacteriana, chì hè stata ridutta da circa 25% à 50% paragunatu à u sustrato nudu.Tuttavia, per via di a so eccellente prestazione anti-biofouling è stabilità, LOIS ùn hà micca mostratu l'aderenza di biofilm bacteriale à cortu è longu termine.U schema schematicu (Figura 3C) descrive l'esplicazione di u mecanismu anti-biologicu di fouling di a suluzione di gravure, SHP è LOIS.L'assunzione è che il substrato inciso con proprietà idrofile avrà una superficie più grande rispetto al substrato nudo.Per quessa, più aderenza bacteriana si verificarà nantu à u sustrato incisu.Tuttavia, paragunatu cù u sustrato nudu, u sustrato incisu hà significativamente menu biofilm furmatu nantu à a superficia.Questu hè chì e molécule d'acqua si liganu fermamente à a superficia idrofila è agiscenu cum'è un lubrificante per l'acqua, interferendu cusì l'adesione di i batteri in u cortu termini (39).Tuttavia, a capa di molécule d'acqua hè assai fina è soluble in suspensions bacterial.Per quessa, a capa molekulari di l'acqua sparisce per un bellu pezzu, purtendu à una larga aderenza bacteriana è proliferazione.Per SHP, per via di e so proprietà non-wetting à breve termine, l'aderenza bacteriana hè inibita.L'aderenza bacteriana ridutta pò esse attribuita à i sacchetti d'aria intrappulati in a struttura stratificata è l'energia di a superficia più bassa, minimizendu cusì u cuntattu trà a sospensjoni bacteriana è a superficia.In ogni casu, l'aderenza bacteriana estensiva hè stata osservata in SHP perchè hà persu e so proprietà anti-fouling per un bellu pezzu.Questu hè principalmente per a scumparsa di i sacchetti di l'aria per via di a pressione idrostatica è a dissoluzione di l'aria in l'acqua.Questu hè principalmente dovutu à a scumparsa di i sacchetti d'aria per via di a dissoluzione è a struttura stratificata chì furnisce una superficia più grande per l'adesione (27, 40).A cuntrariu di sti dui sustrati chì anu un effettu impurtante nantu à a stabilità à longu andà, u lubricant lubricante cuntenutu in LOIS hè injected in a struttura micro / nano è ùn sparirà ancu à longu andà.I lubricanti pieni di strutture micro/nano sò assai stabili è sò assai attratti da a superficia per via di a so alta affinità chimica, impediscendu cusì l'adesione bacteriana per un bellu pezzu.A figura S6 mostra una maghjina di microscopiu confocale di riflessione di un sustrato infusu di lubricante immersa in una soluzione salina tamponata di fosfate (PBS).L'imaghjini cuntinui mostranu chì ancu dopu à 120 ore di ligera agitazione (120 rpm), a capa di lubricante nantu à u LOIS ferma invariata, chì indica stabilità à longu andà in cundizioni di flussu.Questu hè duvuta à l'alta affinità chimica trà u revestimentu SAM basatu in fluoru è u lubricante basatu in perfluorocarbonu, cusì chì una capa di lubricante stabile pò esse furmatu.Per quessa, u funziunamentu anti-fouling hè mantinutu.Inoltre, u sustrato hè stata pruvata contr'à e proteine ​​​​rappresentanti (albumina è fibrinogenu), chì sò in plasma, celluli strettamente ligati à a funzione immune (macrophages è fibroblasti), è quelli chì sò ligati à a furmazione di l'osse.U cuntenutu di calcium hè assai altu.(Figura 3D, 1 è 2, è Figura S7) (41, 42).Inoltre, l'imaghjini di u microscopiu di fluorescenza di a prova di aderenza per u fibrinogenu, l'albumina è u calciu anu mostratu diverse caratteristiche di aderenza di ogni gruppu di substratu (Figura S8).Duranti a furmazione di l'ossu, i strati di l'ossu è di calciu di novu formate ponu circundà l'implante ortopedicu, chì ùn solu rende a rimozione difficiule, ma pò ancu causà danni inesperu à u paci durante u prucessu di rimuzione.Per quessa, i bassi livelli di dipositi di calciu nantu à i platti di l'osse è i viti sò benefizii per a cirurgia ortopedica chì necessita a rimozione di l'implant.Basatu nantu à a quantificazione di l'area attaccata basata nantu à l'intensità di fluorescenza è u conte di cellule, avemu cunfirmatu chì LOIS mostra eccellenti proprietà anti-biofouling per tutte e sustanzi biologichi cumparatu cù altri sustrati.Sicondu à i risultati di spirimenti in vitro, u LOIS anti-biological fouling pò esse applicàrisi à implants orthopedic, chì pò micca solu inhibit infizzioni causata da battìri biofilm, ma dinù riducendu inflammation causata da u sistema immune attivu di u corpu.
(A) L'imaghjini di u microscopiu di fluorescenza di ogni gruppu (nudu, incisu, SHP è LOIS) incubate in sospensioni di Pseudomonas aeruginosa è MRSA per 12 è 72 ore.(B) U numaru di CFU aderenti di Pseudomonas aeruginosa è MRSA nantu à a superficia di ogni gruppu.(C) Schematic schema di u miccanisimu anti-biologicu fouling di incisione à cortu è longu andà, SHP è LOIS.(D) (1) U numaru di fibroblasti aderenti à ogni sustrato è l'imaghjini di u microscopiu di fluoriscenza di e cellule aderite à u nudu è LOIS.(2) Test d'aderenza di proteine ​​​​immune-relatate, albumina è calciu implicati in u prucessu di guariscenza di l'osse (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 è **** P <0,0001).ns, micca impurtante.
In u casu di stressi concentrati inevitabbili, a durabilità meccanica hè sempre stata a sfida principale per l'applicazione di rivestimenti antifouling.I metudi tradiziunali di gel anti-sewage sò basati nantu à polimeri cù poca solubilità in acqua è fragilità.Dunque, sò generalmente suscettibili à u stress meccanicu in l'applicazioni biomediche.Dunque, i rivestimenti antifouling meccanicamente durable restanu una sfida per applicazioni cum'è implanti ortopedici (43, 44).A Figura 4A (1) mostra i dui tipi principali di stress applicati à l'impianti ortopedici, cumpresi u scratching (shear stress) è a compressione cù l'imaghjini otticu di l'implanta dannata prodotta da i forcipi.Per esempiu, quandu u vitu hè strettu cù un cacciavite, o quandu u chirurgu tene a piastra di l'ossu strettu cù una pinzetta è applicà a forza di compressione, a piastra di l'ossu di plastica serà dannata è graffiata nantu à a scala macro è micro/nano (Figura 4A, 2).Per pruvà se u LOIS fabbricatu pò sustene questi danni durante a chirurgia plastica, a nanoindentazione hè stata realizata per paragunà a durezza di u sustrato nudu è u LOIS nantu à a scala micro / nano per studià e proprietà meccaniche di a struttura micro / nano Impact (Figura). 4B).U schema schematicu mostra u comportamentu di deformazione differente di LOIS per a presenza di strutture micro/nano.Una curva di forza-spostamentu hè stata tracciata nantu à i risultati di nanoindentazione (Figura 4C).L'imaghjini blu rapprisenta u sustrato nudu, chì mostra solu una ligera deformazione, cum'è vistu da a prufundità massima di indentazione di 0,26-μm.Per d 'altra banda, l'aumentu graduali di a forza di nanoindentazione è u spustamentu osservatu in LOIS (curva rossa) pò mostra segni di proprietà meccaniche ridotte, risultatu in una prufundità di nanoindentazione di 1.61μm.Questu hè chì a struttura micro / nano presente in u LOIS furnisce un spaziu di avanzamentu più profundo per a punta di u nanoindenter, cusì a so deformazione hè più grande di quella di u sustrato nudu.Konsta-Gdoutos et al.(45) crede chì a causa di a prisenza di nanostrutture, nanoindentation è micro / nano rugosità portanu à curve nanoindentation irregulari.L'area ombreggiata currisponde à a curva di deformazione irregulare attribuita à a nanostruttura, mentri l'area non-ombreggiata hè attribuita à a microstruttura.Questa deformazione pò dannà a microstruttura / nanostruttura di u lubrificante di tenuta è influenza negativamente u so rendimentu anti-fouling.Per studià l'impattu di i danni nantu à LOIS, i danni inevitabbili à e strutture micro/nano sò riplicati in u corpu durante a cirurgia plastica.Utilizendu testi di aderenza di sangue è di prutezione, a stabilità di e proprietà anti-biofouling di LOIS dopu in vitro pò esse determinata (Figura 4D).Una seria d'imaghjini ottichi mostra u dannu chì hè accadutu vicinu à i buchi di ogni sustrato.Una prova di aderenza di sangue hè stata realizata per dimustrà l'effettu di danni meccanichi nantu à u revestimentu anti-biofouling (Figura 4E).Cum'è SHP, i pruprietà anti-fouling sò persu per via di danni, è LOIS exhibe eccellenti proprietà anti-fouling repellendu u sangue.Questu hè chì, perchè l'energia di a superficia hè guidata da l'azzione capillare chì copre l'area dannata, u flussu in u lubricante lubricante microstrutturatu restaurà e proprietà anti-fouling (35).A stessa tendenza hè stata osservata in a prova di aderenza di a proteina cù l'albumina.In l'area dannighjata, l'aderenza di a proteina nantu à a superficia di SHP hè largamente osservata, è misurà a so copertura di l'area, pò esse quantificata cum'è a mità di u livellu di aderenza di u sustrato nudu.D'autre part, LOIS a maintenu ses propriétés anti-biofouling sans provoquer d'adhérence (Figure 4, F et G).In più, a superficia di a vite hè spessu sottumessu à un forte stress meccanicu, cum'è drilling, cusì avemu studiatu l'abilità di u revestimentu LOIS per esse intactu nantu à a vite in vitro.A Figura 4H mostra l'imaghjini ottichi di diverse viti, cumprese bare, SHP è LOIS.U rectangulu rossu rapprisenta l'area di destinazione induve un forte stress meccanicu si trova durante l'implantazione di l'ossu.Simile à a prova di aderenza di a proteina di a piastra, un microscopiu di fluoriscenza hè utilizatu per imagine l'aderenza di a proteina è misurà l'area di copertura per pruvà l'integrità di u revestimentu LOIS, ancu sottu un forte stress meccanicu (Figura 4, I è J).I viti trattati LOIS mostranu un eccellente rendimentu anti-fouling, è quasi nisuna proteina aderisce à a superficia.Per d 'altra banda, l'adesione di a proteina hè stata osservata in viti nudi è viti SHP, induve a copertura di l'area di viti SHP era un terzu di quella di viti nudi.Inoltre, l'implante ortopedicu utilizatu per a fissazione deve esse meccanicamente forte per sustene u stress applicatu à u situ di frattura, cum'è mostra in a Figura 4K.Dunque, una prova di curvatura hè stata realizata per determinà l'effettu di a mudificazione chimica nantu à e proprietà meccaniche.Inoltre, questu hè fattu per mantene a tensione fissa da l'implant.Applicà a forza meccanica verticale finu à chì l'implant hè cumpletamente plegatu è una curva di stress-strain hè ottenuta (Figura 4L, 1).Dui pruprietà cumpresi u modulu di Young è a forza di flexural sò stati paragunati trà sustrati nudi è LOIS cum'è indicatori di a so forza meccanica (Figura 4L, 2 è 3).U modulu di Young indica a capacità di un materiale per sustene i cambiamenti meccanichi.U modulu di Young di ogni sustrato hè 41.48±1.01 è 40.06±0.96 GPa, rispettivamente;a diferenza osservata hè di circa 3,4%.Inoltre, hè infurmatu chì a forza di curvatura, chì determina a durezza di u materiale, hè 102.34±1.51 GPa per u sustrato nudu è 96.99±0.86 GPa per SHP.U sustrato nudu hè circa 5,3% più altu.A ligera diminuzione di e proprietà meccaniche pò esse causata da l'effettu di tacca.In l'effettu notch, a micro / nano rugosità pò agisce cum'è un inseme di notch, purtendu à a concentrazione di stress lucale è affettendu e proprietà meccaniche di l'implant (46).Tuttavia, basatu annantu à u fattu chì a rigidità di l'ossu corticale umanu hè infurmatu trà 7,4 è 31,6 GPa, è u modulu LOIS misuratu supera quellu di l'ossu corticale umanu (47), u LOIS hè abbastanza per sustene a frattura è u so generale. e proprietà meccaniche sò minimamente affettate da a mudificazione di a superficia.
(A) Schema schematicu di (1) u stress meccanicu appiicatu à l'implant ortopedicu durante l'operazione, è (2) l'imaghjini otticu di l'implant ortopedicu danatu.(B) Schematic schema di misura nano-meccanica proprietà da nanoindentation è LOIS nantu à a superficia nuda.(C) Nanoindentation curve forza-spostamento di superficia nuda è LOIS.(D) Dopu à l'esperimenti in vitro, simulate l'imaghjini ottichi di diversi tipi di platti ortopedici (a zona dannata hè evidenziata cù un rettangulu rossu) per simulà u stress meccanicu causatu durante l'operazione.(E) Test di aderenza di sangue è (F) prova di aderenza di a proteina di u gruppu di placche ortopediche dannatu.(G) Misura l'area di copertura di a proteina aderente à a piastra.(H) L'imaghjini ottichi di diversi tipi di viti ortopedichi dopu l'esperimentu in vitro.(I) Test di adesione di proteine ​​​​per studià l'integrità di diversi rivestimenti.(J) Misura l'area di copertura di a proteina aderente à a vite.(K) U muvimentu di u cunigliu hè destinatu à generà un stress fissu nantu à l'ossu fratturatu.(L) (1) Bend i risultati di prova è l'imaghjini ottichi prima è dopu a curvatura.A diferenza in (2) u modulu di Young è (3) a forza di curvatura trà l'implante nudu è SHP.I dati sò espressi cum'è media ± SD (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 è **** P <0,0001).Image courtesy: Kyomin Chae, Università Yonsei.
In situazioni cliniche, a maiò parte di u cuntattu bacteriale cù materiali biologichi è siti di ferita vene da biofilms maturi è maturi (48).Dunque, i Centri di i Stati Uniti per u Controlu è a Prevenzione di e Malattie stimanu chì u 65% di tutte l'infizzioni umane sò ligati à i biofilms (49).In questu casu, hè necessariu di furnisce un disignu sperimentale in vivo chì furnisce una furmazione coherente di biofilm nantu à a superficia di l'implant.Dunque, avemu sviluppatu un mudellu di frattura femorale di cunigliu in u quale l'implanti ortopedici sò stati pre-incubati in una sospensjoni bacteriana è poi implantati in femuri di cunigliu per studià e proprietà anti-fouling di LOIS in vivo.A causa di i seguenti trè fatti impurtanti, l'infizzioni bacteriale sò indotte da pre-cultura invece di iniezione diretta di suspensions bacterial: (i) U sistema immune di i cunigli hè naturalmente più forte di quellu di l'omu;dunque, l'iniezione di sospensioni bacteriale è battìri planctonic hè pussibule Ùn hà micca effettu nantu à a furmazione di biofilms.(Ii) A bacteria planctonica hè più suscettibile à l'antibiotici, è l'antibiotici sò generalmente usati dopu a cirurgia;infine, (iii) a sospensjoni di bacteria planctonica pò esse diluita da i fluidi di u corpu di l'animali (50).Precultivando l'implantu in una sospensione bacteriana prima di l'implantazione, pudemu studià accuratamente l'effetti dannosi di l'infezzione bacteriana è a reazione di corpu straneru (FBR) nantu à u prucessu di guariscenza di l'osse.I cunigli sò sacrificati 4 settimani dopu à l'implantazione, perchè l'osseointegrazione essenziale per u prucessu di guariscenza di l'osse serà cumpletu in 4 simane.Allora, l'impianti sò stati eliminati da i cunigli per studii downstream.A figura 5A mostra u mecanismu di proliferazione di i batteri.L'implant ortopedicu infettatu hè introduttu in u corpu.In u risultatu di a pre-incubazione in a sospensjoni bacteriana, sei di i sei cunigli implantati cù implants nudi sò stati infettati, mentre chì nimu di i cunigli implantati cù implanti trattati LOIS sò stati infettati.L'infizzioni bacteriale prucedenu in trè tappe, cumprese a crescita, a maturazione è a dispersione (51).Prima, i battìri attaccati si riproducenu è crescenu nantu à a superficia, è dopu i battìri formanu un biofilm quandu excrete polimeru extracellulare (EPS), amiloide è DNA extracellular.Biofilm ùn solu interferiscenu cù a penetrazione di l'antibiotici, ma ancu prumove l'accumulazione di enzimi degradanti antibiotici (cum'è β-lactamase) (52).Infine, u biofilm sparghje a bacteria matura in i tessuti circundante.Dunque, l'infezzione si trova.Inoltre, quandu un corpu straneru entra in u corpu, una infizzione chì pò causà una forte risposta immune pò causà inflammazioni severi, dolore è immunità diminuite.A Figura 5B furnisce una visione generale di u FBR causatu da l'inserzione di un implante ortopedicu, invece di a risposta immune causata da una infezzjoni bacteriana.U sistema immune ricunnosce l'implante inseritu cum'è un corpu straneru, è poi face chì e cellule è i tessuti reagiscenu per incapsulà u corpu straneru (53).In i primi tempi di FBR, una matrice di furnimentu hè stata formata nantu à a superficia di l'implanti ortopedichi, chì hà risultatu in l'adsorption di fibrinogenu.U fibrinogenu adsorbitu forma allora una reta di fibrina altamente densa, chì prumove l'attache di leucociti (54).Una volta chì a reta di fibrina hè furmata, a inflamazioni aguda serà a causa di l'infiltrazione di neutrofili.In questu passu, una varietà di citochine cum'è u fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), l'interleukin-4 (IL-4) è l'IL-β sò liberati, è i monociti cumincianu à infiltrà u situ di l'implantazione è si differenzianu in cellule giganti.Phage (41, 55, 56).A riduzione di FBR hè sempre stata una sfida perchè l'FBR eccessivu pò causà inflammazioni aguda è crònica, chì pò purtà à cumplicazioni fatali.Per valutà l'impattu di l'infizzioni bacteriale in i tessuti chì circundanu l'implante nudu è LOIS, l'hematoxilina è l'eosina (H&E) è a tintura di Masson trichrome (MT) sò state utilizzate.Per i cunigli impiantati cù sustrati nudi, infizzioni bacteriale severi avanzavanu, è i diapositive di tissuti H&E mostravanu chjaramente ascessi è necrosi causati da inflammazioni.Per d 'altra banda, a superficia anti-biofouling estremamente forte LOIS inibisce l'aderenza bacteriana, cusì ùn mostra micca segni di infizzione è riduce l'inflammazione (Figura 5C).I risultati di a tintura di MT mostranu a listessa tendenza.Tuttavia, a tintura di MT hà ancu mostratu edema in i cunigli impiantati cù LOIS, chì indicanu chì a ricuperazione hè vicinu à accade (Figura 5D).Per studià u gradu di risposta immune, a tintura immunoistochimica (IHC) hè stata realizata cù citochine TNF-α è IL-6 in relazione à a risposta immune.Un implantu negativu nudu chì ùn era micca espunutu à i battìri hè statu paragunatu cù un LOIS chì era espostu à i battìri, ma micca infettatu per studià u prucessu di guariscenza in l'absenza d'infezzione bacteriana.A Figura 5E mostra una immagine ottica di una diapositiva IHC chì esprime TNF-α.L'area marrone rapprisenta a risposta immune, chì indica chì a risposta immune in LOIS hè pocu ridutta.Inoltre, l'espressione di IL-6 in LOIS era significativamente menu di l'espressione negativa di sterile nudu (Figura 5F).L'espressione di a citochina hè stata quantificata misurando l'area di colorazione di l'anticorpu currispondente à a citochina (Figura 5G).Comparatu cù i cunigli esposti à l'implanti negativi, i livelli di spressione di i cunigli implantati cù LOIS eranu più bassi, chì mostranu una diferenza significativa.A diminuzione di l'espressione di citochine indica chì e proprietà anti-fouling stabili di LOIS à longu andà ùn sò micca solu ligati à l'inibizione di l'infezioni batteriche, ma ancu à a diminuzione di FBR, chì hè indotta da macrophages aderenti à u sustrato (53, 57, 58).Dunque, a risposta immune ridutta per via di e proprietà di evasione immune di LOIS pò risolve l'effetti secundari dopu à l'implantazione, cum'è a risposta immune eccessiva dopu a cirurgia plastica.
(A) Un schema schematicu di u mecanismu di furmazione di biofilm è sparghje nantu à a superficia di un implant ortopedicu infettatu.eDNA, DNA extracellulare.(B) Schema schematicu di a risposta immune dopu l'inserimentu di l'implante ortopedicu.(C) Colorazione H&E è (D) Colorazione MT di i tessuti circostanti di implanti ortopedici con nudi positivi e LOIS.IHC di citochine immune-related (E) TNF-α è (F) IL-6 sò imaghjini macchiati di cunigli nudi-negativi è implantati LOIS.(G) Quantificazione di l'espressione di citochine per a misura di a copertura di l'area (** P <0.01).
A biocompatibilità di LOIS è u so effettu nantu à u prucessu di guariscenza di l'osse sò stati esaminati in vivo cù l'imaghjini diagnostichi [raggi X è tomografia micro-computed (CT)] è osteoclast IHC.A figura 6A mostra u prucessu di guariscenza di l'osse chì implica trè fasi diffirenti: inflammazione, riparazione è remodeling.Quandu si faci una frattura, e cellule inflamatorii è i fibroblasti penetraranu in l'ossu fratturatu è cumincianu à cresce in u tissutu vascular.Durante a fase di riparazione, l'ingrossu di tissutu vascular si sparghje vicinu à u situ di frattura.U tissutu vascular furnisce nutrienti per a furmazione di l'ossu novu, chì hè chjamatu callus.L'ultima tappa di u prucessu di guariscenza di l'ossu hè a tappa di remodeling, in quale a dimensione di u callu hè ridutta à a dimensione di l'ossu normale cù l'aiutu di un aumentu di u livellu di l'osteoclasti attivati ​​(59).A ricustruzzione tridimensionale (3D) di u situ di frattura hè stata realizata cù micro-CT scans per osservà e sferenze in u livellu di furmazione di callu in ogni gruppu.Fighjate a sezione trasversale di u femur per osservà u grossu di u callu circundante l'ossu fracturatu (Figura 6, B è C).I raghji X sò stati ancu usati per esaminà i siti di frattura di tutti i gruppi ogni settimana per osservà i diversi prucessi di regenerazione di l'osse in ogni gruppu (Figura S9).I callu è l'osse mature sò mostrati in blu / verde è avorio, rispettivamente.A maiò parte di i tessuti molli sò filtrati cù un limitu predeterminatu.Nude pusitivu è SHP cunfirmatu a furmazione di una piccula quantità di callu intornu à u situ di frattura.Per d 'altra banda, u negativu espostu di LOIS è u situ di frattura sò circundati da callu grossu.L'imaghjini di Micro-CT anu dimustratu chì a furmazione di callu hè stata impedita da l'infezzione bacteriana è l'inflamazioni infezzione.Questu hè chì u sistema immune priurità a guariscenza di e ferite settiche causate da inflammazioni infezzione, invece di ricuperazione di l'ossu (60).A tintura di IHC è Tartrate-resistant Acid Phosphatase (TRAP) hè stata realizata per osservà l'attività di l'osteoclasti è a resorption di l'osse (Figura 6D) (61).Solu uni pochi d'osteoclasti attivati ​​macchiati viola sò stati trovati in pusitivi nudi è SHP.Per d 'altra banda, assai osteoclasti attivati ​​sò stati osservati vicinu à l'osse nude pusitive è mature di LOIS.Stu fenominu indica chì in presenza di osteoclasts, u callu intornu à u situ di frattura hè sottumessu à un prucessu di remodeling viulente (62).U voluminu di l'osse è l'area d'espressione di l'osteoclastu di u callu sò stati misurati per paragunà u livellu di furmazione di callu intornu à u situ di frattura in tutti i gruppi, per quantificà u micro-CT scan è i risultati IHC (Figura 6E, 1 è 2).Cum'è s'aspittava, i negativi nudi è a furmazione di callu in LOIS eranu significativamente più altu ch'è in l'altri gruppi, chì indicanu chì a rimodellazione ossea positiva hè accaduta (63).A Figura S10 mostra l'imaghjini otticu di u situ kirurggicu, u risultatu di a tintura MT di u tissutu cullucatu vicinu à a vite, è u risultatu di a tintura TRAP chì mette in risaltu l'interfaccia di l'osse viti.In u sustrato nudu, hè stata osservata una forte formazione di callu è fibrosi, mentre chì l'implantu trattatu LOIS mostrava una superficia relativamente micca aderita.In listessu modu, paragunatu à i negativi nudi, a fibrosi più bassa hè stata osservata in i cunigli implantati cù LOIS, cum'è indicatu da e frecce bianche.Inoltre, l'edema ferma (freccia blu) pò esse attribuita à e proprietà di evasione immune di LOIS, riducendu cusì a inflamazioni severa.A superficia non-stick attornu à l'implante è a fibrosi ridutta suggerenu chì u prucessu di rimuzione hè più faciule, chì generalmente risultatu in altre fratture o inflammazioni.U prucessu di guariscenza di l'osse dopu a rimozione di a vite hè stata evaluata da l'attività di l'osteoclastu à l'interfaccia di l'osse.Sia l'ossu nudu è l'interfaccia di l'implant LOIS assorbanu livelli simili d'osteoclasti per a più guariscenza di l'ossu, chì indicanu chì u revestimentu LOIS ùn hà micca effettu negativu nantu à a guariscenza di l'osse o a risposta immune.Per cunfirmà chì a mudificazione di a superficia realizata nantu à u LOIS ùn interferiscenu micca cù u prucessu di guariscenza di l'ossu, l'esame di raghji X hè stata utilizata per paragunà a curazione di l'ossu di i cunigli cù ioni negativi esposti è 6 settimane di implantazione LOIS (Figura 6F).I risultati hà dimustratu chì paragunatu cù u gruppu pusitivu nude uninfected, LOIS hà dimustratu u listessu gradu di guariscenza di l'ossu, è ùn ci era micca segni evidenti di frattura (linea osteolysis cuntinuu) in i dui gruppi.
(A) Schema schematicu di u prucessu di guariscenza di l'osse dopu a frattura.(B) A diffarenza in u gradu di furmazione di callu di ogni gruppu di superficia è (C) l'imaghjini transversale di u situ di frattura.(D) Tintura TRAP per visualizà l'attività di l'osteoclasti è a risorzione di l'osse.Basatu nantu à l'attività di TRAP, a furmazione di callus esterni di l'ossu corticale hè stata analizata quantitativamente da (E) (1) micro-CT è (2) attività osteoclaste.(F) 6 settimani dopu à l'implantazione, l'imaghjini di raghji X di l'ossu fratturatu di u negativu espostu (saltatu da u rettangulu trattu rossu) è LOIS (spuntatu da u rettangulu trattu blu).L'analisi statistiche hè stata realizata da l'analisi di varianza unidirezionale (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
In breve, LOIS furnisce un novu tipu di strategia di infezzione antibacteriale è un revestimentu di fuga immune per implanti ortopedici.L'impianti ortopedici cunvinziunali cù a funziunalità SHP mostranu proprietà anti-biofouling à breve termine, ma ùn ponu micca mantene e so proprietà per un bellu pezzu.A superidrofobicità di u sustrato intrappola e bolle d'aria trà i batteri è u sustrato, furmendu cusì sacchetti d'aria, prevenendu cusì l'infezione batterica.Tuttavia, per via di a diffusione di l'aria, sti sacchetti di l'aria sò facilmente eliminati.Per d 'altra banda, LOIS hà dimustratu bè a so capacità per prevene l'infizzioni di biofilm.Dunque, per via di e proprietà anti-rigettu di a capa di lubricante injected in a superficia di struttura micro/nano stratificata, l'inflamazioni infezzione pò esse prevenuta.Diversi metudi di caratterizzazione cumpresi SEM, AFM, XPS è misure CA sò usati per ottimisà e cundizioni di fabricazione LOIS.Inoltre, LOIS pò ancu esse appiicata à parechji materiali biologichi cumunimenti utilizati in l'equipaggiu di fissazione ortopedica, cum'è PLGA, Ti, PE, POM è PPSU.Dopu, LOIS hè statu testatu in vitro per pruvà e so proprietà anti-biofouling contr'à batteri è sustanzi biologichi ligati à a risposta immune.I risultati mostranu chì hà eccellenti effetti antibacterial è anti-biofouling cumparatu cù l'implant nudu.Inoltre, LOIS mostra a forza meccanica ancu dopu l'applicazione di u stress meccanicu, chì hè inevitabbile in a cirugia plastica.A causa di e proprietà self-guarigione di u lubricant nantu à a superficia di a struttura micro / nano, LOIS hà mantinutu cù successu a so proprietà anti-biologicu.Per studià a biocompatibilità è e proprietà antibacteriale di LOIS in vivo, LOIS hè stata implantata in u femur di cunigliu per 4 settimane.Nisuna infezione bacteriana hè stata osservata in i cunigli implantati cù LOIS.Inoltre, l'usu di IHC hà dimustratu un livellu ridottu di risposta immune locale, chì indica chì LOIS ùn impedisce micca u prucessu di guariscenza di l'ossu.LOIS presenta eccellenti proprietà antibatteriche è di evasione immune, è hè statu pruvata per prevene efficacemente a furmazione di biofilm prima è durante a chirurgia ortopedica, in particulare per a sintesi di l'osse.Utilizendu un mudellu di frattura femorale infiammatoria di a medula ossea di cunigliu, l'effettu di l'infizzioni ligati à u biofilmu nantu à u prucessu di guariscenza di l'osse induttu da implanti pre-incubati hè statu studiatu in fondu.Cum'è un studiu futuru, un novu mudellu in vivo hè necessariu per studià e pussibuli infizzioni dopu l'implantazione per capiscenu cumplettamente è prevene l'infizzioni di biofilm durante tuttu u prucessu di guariscenza.Inoltre, l'osteoinduction hè sempre una sfida senza risolve in integrazione cù LOIS.Hè necessariu più ricerca per cumminà l'adesione selettiva di e cellule osteoinductive o a medicina regenerativa cù LOIS per superà a sfida.In generale, LOIS rapprisenta un revestimentu di implante ortopedicu promettente cù robustezza meccanica è eccellenti proprietà anti-biofouling, chì ponu riduce l'SSI è l'effetti secundari immune.
Lavate u substratu 304 SS 15mm x 15mm x 1mm (Dong Kang M-Tech Co., Korea) in acetone, EtOH è acqua DI per 15 minuti per sguassà i contaminanti.Per furmà una struttura micro / nano-livellu nantu à a superficia, u sustrato pulitu hè immersa in una suluzione HF 48% à 51% (DUKSAN Corp., Corea del Sud) à 50 ° C.U tempu di incisione varia da 0 à 60 minuti.Allora, u sustrato incisu hè stata pulita cù l'acqua deionizzata è pusatu in una suluzione 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) à 50 ° C per 30 minuti per furmà una strata di passivazione d'ossidu di cromu nantu à a superficia.Dopu a passivazione, u sustrato hè lavatu cù acqua deionizzata è secca per ottene un sustrato cù una struttura stratificata.In seguitu, u sustrato hè stata esposta à u plasma di l'ossigenu (100 W, 3 minuti), è immediatamente immersa in una suluzione di 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Germania) in toluene à a temperatura di l'ambienti per 12 ore.Allora, u sustrato rivestitu cù POTS hè stata pulita cù EtOH, è annealed à 150 ° C per 2 ore per ottene un POTS SAM densu.Dopu à u revestimentu SAM, una capa di lubricante hè stata furmata nantu à u sustrato cù l'applicazione di un lubricante perfluoropolieteru (Krytox 101; DuPont, USA) cù un voluminu di carica di 20 μm / cm 2. Prima di l'usu, filtrà u lubricante per un filtru 0,2 micron.Eliminate l'eccessu di lubricante inclinendu à un angolo di 45 ° durante 15 minuti.A listessa prucedura di fabricazione hè stata aduprata per implants ortopedici fatti di 304 SS (piastra di serratura è viti di serratura corticale; Dong Kang M-Tech Co., Corea).Tutti l'impianti ortopedici sò pensati per adattà à a geometria di u femur di cunigliu.
A morfologia di a superficia di u sustrato è l'impianti ortopedici hè stata inspeccionata da emissioni di campu SEM (Inspect F50, FEI, USA) è AFM (XE-100, Park Systems, Corea del Sud).A rugosità di a superficia (Ra, Rq) hè misurata multiplicando l'area di 20 μm per 20 μm (n=4).Un sistema XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Giappone) equipatu di una fonte di raghji X Al Kα cù una dimensione di spot di 100μm2 hè stata utilizata per analizà a cumpusizioni chimica di a superficia.Un sistema di misurazione CA dotatu di una camera dinamica di cattura d'imaghjini (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Corea di u Sud) hè stata utilizata per misurà CA è SA liquidi.Per ogni misurazione, 6 à 10 μl di gocce (acqua deionizzata, sangue di cavallu, EG, 30% etanol, è HD) sò posti nantu à a superficia per misurà CA.Quandu l'angolo di inclinazione di u sustrato aumenta à una vitezza di 2 ° / s (n = 4), u SA hè misuratu quandu a goccia casca.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] è MRSA (ATCC 25923) sò stati acquistati da ATCC (Manassas, Virginia, USA), è a cultura di stock hè stata mantenuta à -80 ° C.Prima di l'usu, a cultura congelata hè stata incubata in u caldo di soia di trypsin-thawed (Komed, Korea) à 37 ° C per l'ora di 18 è dopu trasferitu duie volte per attivà.Dopu l'incubazione, a cultura hè stata centrifugata à 10.000 rpm per 10 minuti à 4 ° C è lavata duie volte cù una suluzione PBS (pH 7,3).La cultura centrifugata è poi sottocoltivata su piastre di agar sangue (BAP).MRSA è Pseudomonas aeruginosa sò stati preparati durante a notte è cultivati ​​in u brou Luria-Bertani.A concentrazione di Pseudomonas aeruginosa è MRSA in l'inoculu hè stata determinata quantitativamente da u CFU di a sospensjoni in diluzioni seriali nantu à agar.Allora, aghjustate a cuncentrazione bacteriana à 0,5 standard McFarland, chì hè equivalente à 108 CFU/ml.Poi diluite a sospensione batterica di travagliu 100 volte à 106 CFU/ml.Per pruvà e proprietà di aderenza antibacterial, u sustrato hè sterilizatu à 121 ° C per 15 minuti prima di l'usu.U sustrato hè statu trasferitu à 25 ml di sospensjoni bacteriana è incubatu à 37 ° C cù agitazione vigorosa (200 rpm) per 12 è 72 ore.Dopu l'incubazione, ogni sustrato hè sguassatu da l'incubatore è lavatu 3 volte cù PBS per sguassà ogni bacteria flottante nantu à a superficia.Per osservà u biofilm nantu à u sustrato, u biofilm hè stata fissata cù metanol è macchiata cù 1 ml di crimidine orange per 2 minuti.Allora un microscopiu di fluoriscenza (BX51TR, Olympus, Giappone) hè stata utilizata per piglià ritratti di u biofilm macchiatu.Per quantificà u biofilm nantu à u sustrato, i celluli attaccati sò stati separati da u sustrato da u metudu di vortice di perle, chì era cunsideratu cum'è u metudu più adattatu per caccià i batteri attaccati (n = 4).Utilizendu pinza sterile, sguassate u sustrato da u mediu di crescita è toccu u pianu di pozzu per sguassà l'excedente di liquidu.E cellule appiccicate sò state eliminate per lavà duie volte cù PBS sterile.Ogni sustrato hè statu trasferitu à un provettu sterile chì cuntene 9 ml di 0,1% proteina ept saline (PSW) è 2 g di 20 à 25 perle di vetru sterile (0,4 à 0,5 mm di diametru).Dopu hè statu vortexatu per 3 minuti per staccate e cellule da u sample.Dopu u vortexing, a sospensjoni hè stata diluita in serie 10 volte cù 0,1% PSW, è dopu 0,1 ml di ogni diluzione hè stata inoculata nantu à BAP.Dopu à 24 ore di incubazione à 37 ° C, u CFU hè statu cuntatu manualmente.
Per e cellule, i fibroblasti di mouse NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) è i macrophages di mouse RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC) sò stati utilizati.Aduprate u mediu Eagle mudificatu di Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Corea) per cultivà fibroblasti di topi è supplementu cù 10% siero di vitello (S103-01, Welgene) è 1% penicillina-streptomicina (PS; LS202-02, Welgene (Welgene). Aduprate DMEM per cultivà i macrofagi di i mouse, supplementati cù 10% di serum bovinu fetale (S001-01, Welgene) è 1% PS. I celluli sò stati incubati durante a notte à 37 ° C è 5% CO2 Per a tintura di cellula, i celluli sò stati fissi cù 4% di paraformaldehyde per 20 minuti è posti in 0.5% Triton X Incubate per 5 minuti in -100 Immerse u sustrato in 50nM tetramethylrhodamine à 37 ° C per 30 minuti dopu à u prucessu d'incubazione, aduprate u sustrato cù 4′,6-diamino-2-phenylindole (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD (n = 4 per cellula). , fluorescein, fluorescein isothiocyanate-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Germany) è plasma umanu U fibrinogenu Alexa Fluor 488-conjugated (F13191, Invitrogen, USA) hè statu dissolutu in PBS (10 mM, pH 7,4).I cuncentrazioni di albumina è fibrinogenu eranu 1 è 150 μg/ml, rispettivamente.Dopu à u sustrato Prima di immerse in a suluzione di prutezione, lavate cù PBS per rehydrate a superficia.Allora immerse tutti i sustrati in una piastra di sei pozzi chì cuntene a suluzione di prutezione è incubate à 37 ° C per 30 è 90 minuti.Dopu à l'incubazione, u sustrato hè statu eliminatu da a suluzione di prutezione, lavatu cù PBS 3 volte, è fissatu cù 4% paraformaldehyde (n = 4 per ogni proteina).Per u calciu, u sodium chloride (0,21 M) è u fosfatatu di potasio (3,77 mM) hè stata dissoluta in acqua deionizzata.U pH di a suluzione hè stata aghjustata à 2,0 aghjunghjendu a suluzione di cloridrato (1M).Allora u cloru di calcium (5,62 mM) hè dissolutu in a suluzione.Aghjunghjendu 1M tris(hydroxymethyl)-amino Metanu aghjusta u pH di a suluzione à 7,4.Immerse tutti i sustrati in una piastra di sei pozzu pienu di 1,5 × suluzione di fosfatatu di calcium è sguassate da a suluzione dopu à 30 minuti.Per a tintura, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Mischjà cù 100 ml d'acqua deionized.Allora, aduprate l'idrossidu d'ammoniu 10% per aghjustà u pH à 4. Tinghje u sustrato cù a suluzione Alizarin Red durante 5 minuti, è poi scuzzulate l'excedente di tintura è blot.Dopu u prucessu di scuzzulate, sguassate u sustrato.U materiale hè disidratatu, dopu immersi in acetone per 5 minuti, dopu immersi in una suluzione acetone-xylene (1: 1) per 5 minuti, è infine lavatu cù xilene (n = 4).U microscopiu di fluorescenza (Axio Imager) cù lenti obiettivi ×10 è ×20 hè utilizzatu..A2m, Zeiss, Germania) imagine tutti i sustrati.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) hè stata utilizata per quantificà i dati di aderenza di sustanzi biologichi in ogni gruppu di quattru spazii di imaging differenti.Cunvertite tutte l'imaghjini in l'imaghjini binari cù soglie fissi per a comparazione di sustrato.
Un microscopiu cunfocale Zeiss LSM 700 hè statu utilizatu per monitorizà a stabilità di a capa di lubricante in u PBS in modu di riflessione.U campione di vetru rivestitu di SAM à base di fluoru cù una strata lubrificante injectata hè stata immersa in una soluzione PBS, è pruvata cù un agitatore orbitale (SHO-1D; Daihan Scientific, Corea di u Sud) in cundizioni di agitazione moderata (120 rpm).Allora pigliate a mostra è seguite a perdita di lubricante misurà a perdita di luce riflessa.Per acquistà l'imaghjini di fluoriscenza in modu di riflessione, a mostra hè esposta à un laser di 633 nm è poi cullata, perchè a luce serà riflessa da u sample.I campioni sò stati misurati à intervalli di tempu di 0, 30, 60 è 120 ore.
Per determinà l'influenza di u prucessu di mudificazione di a superficia nantu à e proprietà nanomeccaniche di implanti ortopedici, un nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) equipatu di una punta di diamante Berkovich in forma di piramide à trè lati hè stata utilizata per misurà nanoindenedione.A carica di punta hè 10 mN è l'area hè 100μmx 100μm.Per tutte e misurazioni, u tempu di carica è scaricamentu hè 10 s, è u tempu di mantene sottu a carica di indentazione di punta hè 2 s.Pigliate e misure da cinque lochi diffirenti è pigliate a media.Per valutà a prestazione di forza meccanica sottu carica, una prova di curvatura trasversale in trè punti hè stata realizata cù una macchina di prova universale (Instron 5966, Instron, USA).U sustrato hè cumpressu à una tarifa constante di 10 N / s cù una carica aumentata.U prugramma di software Bluehill Universal (n = 3) hè stata utilizata per calculà u modulu di flexural è u massimu stress compressive.
Per simulà u prucessu di operazione è u dannu meccanicu cunnessu causatu durante l'operazione, u prucessu di operazione hè stata realizata in vitro.I femuri sò stati cullati da i cunigli bianchi di New Zealand esecutatu.U femur hè stata pulita è fissata in 4% paraformaldehyde per 1 settimana.Cum'è discrittu in u metudu di l'esperimentu di l'animali, u femur fissu hè operatu chirurgicamente.Dopu à l'operazione, l'implante ortopedicu hè stata immersa in u sangue (sangue di cavallu, KISAN, Corea) per 10 s per cunfirmà se l'aderenza di sangue hè accadutu dopu chì a ferita meccanica hè stata applicata (n = 3).
Un totale di 24 conigli bianchi maschili di Nova Zelanda (pesu da 3,0 à 3,5 kg, età media 6 mesi) sò stati divisi aleatoriamente in quattru gruppi: nude negativu, nude pusitivu, SHP è LOIS.Tutte e prucedure chì implicanu l'animali sò state realizate in cunfurmità cù i normi etichi di u Cumitatu Istituzionale di Cura è Uso di l'Animali (IACUC appruvatu, KOREA-2017-0159).L'implant ortopedicu hè custituitu da una piastra di serratura cù cinque fori (lunghezza 41 mm, larghezza 7 mm è spessore 2 mm) è viti di serratura corticale (lunghezza 12 mm, diametru 2,7 mm) per a fissazione di frattura.Eccettu per quelli platti è viti utilizati in u gruppu bare-negativu, tutti i platti è i viti sò stati incubati in sospensjoni MRSA (106 CFU / ml) per 12 ore.U gruppu nudu-negativu (n = 6) hè statu trattatu cù implanti di superficia nuda senza esposizione à a sospensjoni bacteriana, cum'è un cuntrollu negativu per l'infezzione.U gruppu pusitivu nudu (n = 6) hè statu trattatu cù un implantu di superficia nuda esposta à i batteri cum'è un cuntrollu pusitivu per l'infezzione.U gruppu SHP (n = 6) hè statu trattatu cù implants SHP esposti à bacteria.Infine, u gruppu LOIS hè statu trattatu cù implants LOIS esposti à bacteria (n = 6).Tutti l'animali sò tenuti in una gabbia, è ci sò assai manciari è acqua.Prima di l'operazione, i cunigli eranu fasted for 12 hours.L'animali sò stati anestetizzati per iniezione intramusculare di xilazina (5mg / kg) è iniezione intravenosa di paclitaxel (3mg / kg) per induzione.Dopu quì, furnisce 2% isoflurane è 50% à 70% ossigenu medicale (tassu di flussu 2 L / min) attraversu u sistema respiratoriu per mantene l'anesthesia.Hè implantatu attraversu un accostu direttu à u femur lateral.Dopu a depilazione è a disinfezzione povidone-iodine di a pelle, una incisione di circa 6 cm di longu hè stata fatta nantu à l'esternu di u femore medio left.Apertura u spaziu trà i musculi chì coprenu u femur, u femur hè cumpletamente espostu.Pone a piastra davanti à l'arbulu femorale è fate cù quattru viti.Dopu a fissazione, aduprate una lama di sega (1 mm di grossa) per creà artificialmente una frattura in l'area trà u sicondu pirtusu è u quartu pirtusu.À a fine di l'operazione, a ferita hè stata lavata cù saline è chjusu cù suture.Ogni cunigliu hè stata iniettata sottucutanea cù enrofloxacin (5 mg / kg) diluita un terzu in saline.I raghji X postoperatori di u femur sò stati pigliati in tutti l'animali (0, 7, 14, 21, 28 è 42 ghjorni) per cunfirmà l'osteotomia di l'ossu.Dopu l'anesthesia prufonda, tutti l'animali sò stati uccisi da KCl intravenosa (2 mmol / kg) in 28 è 42 ghjorni.Dopu l'esekzione, u femur hè statu scansatu da micro-CT per osservà è paragunà u prucessu di guariscenza di l'osse è a nova furmazione di l'osse trà i quattru gruppi.
Dopu à l'esekzione, i tessuti molli chì eranu in cuntattu direttu cù l'implanti ortopedici sò stati cullati.U tissutu hè stata fissata in formalina tamponata neutra 10% per a notte è dopu disidratata in EtOH.U tissutu disidratatu hè statu incrustatu in paraffina è seccionatu à un spessore di 40 μm cù un microtomu (400CS; EXAKT, Germania).Per visualizà l'infezzione, a tintura H&E è a tintura MT sò state realizate.Per verificà a risposta di l'ospiti, u tissutu seccionatu hè statu incubatu cù l'anticorpu primariu di cunigliu anti-TNF-α (AB6671, Abcam, USA) è di cunigliu anti-IL-6 (AB6672; Abcam, USA), è poi trattatu cù rafanu.Oxidase.Applicà u sistema di tintura di avidin-biotin complex (ABC) à e rùbbriche secondu l'urdinamentu di u fabricatore.Per esse cum'è un pruduttu di reazzione marrone, 3,3-diaminobenzidine hè stata utilizata in tutte e parte.Un scanner di slide digitale (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungheria) hè stata utilizata per visualizà tutte e fette, è almenu quattru sustrati in ogni gruppu sò stati analizati da u software ImageJ.
L'imaghjini di raghji X sò stati pigliati in tutti l'animali dopu a cirurgia è ogni settimana per monitorà a curazione di frattura (n = 6 per gruppu).Dopu l'esekzione, a micro-CT d'alta risoluzione hè stata utilizata per calculà a furmazione di callu intornu à u femur dopu a guariscenza.U femur ottenutu hè stata pulita, fissata in 4% paraformaldehyde per 3 ghjorni, è disidratata in 75% etanol.L'osse disidratate sò state poi scansate utilizendu micro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgium) per generà imaghjini voxel 3D (2240 ​​× 2240 pixel) di a mostra di l'ossu.Utiliser un filtre Al 1,0 mm pour réduire le bruit du signal et appliquer une haute résolution à tous les scans (E = 133 kVp, I = 60 μA, temps d'intégration = 500 ms).U software Nrecon (versione 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgium) hè stata utilizata per generà un voluminu 3D di a mostra scannata da a proiezione laterale 2D acquistata.Per l'analisi, l'imaghjina ricustruita 3D hè divisa in cubi 10mm × 10mm × 10mm secondu u situ di frattura.Calcule u callu fora di l'ossu corticale.U software DataViewer (versione 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgium) hè stata utilizata per redirige digitalmente u voluminu di l'osse scanned, è u software CT-Analyzer (versione 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgium) hè stata utilizata per l'analisi.I coefficienti d'absorzione di raghji X relative in l'ossu maturu è u callu sò distinti da a so densità, è dopu u voluminu di callu hè quantificatu (n = 4).Per cunfirmà chì a biocompatibilità di LOIS ùn ritarda micca u prucessu di guariscenza di l'ossu, l'analisi di raghji X è micro-CT supplementari sò stati realizati in dui cunigli: i gruppi nudi-negativi è LOIS.I dui gruppi sò stati eseguiti in a 6a settimana.
I femuri da l'animali sacrificati sò stati cullati è fissi in 4% paraformaldehyde per 3 ghjorni.L'implante ortopedicu hè poi eliminatu cù cura da u femur.U femur hè statu decalcificatu per 21 ghjorni cù 0.5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Allora u femur decalcified hè stata immersa in EtOH per fà u desidratatu.U femur disidratatu hè statu eliminatu in xilene è incrustatu in paraffina.Allora a mostra hè stata tagliata cù un microtomu rotativu automaticu (Leica RM2255, Leica Biosystems, Germania) cù un spessore di 3 μm.Per a tintura TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Germania), i campioni sezionati sò stati deparaffinizzati, reidratati è incubati in reagent TRAP à 37 ° C per 1 ora.L'imaghjini sò stati acquistati cù un scanner di diapositive (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungheria) è quantificate per mezu di a copertura di l'area di l'area macchiata.In ogni esperimentu, almenu quattru sustrati in ogni gruppu sò stati analizati da u software ImageJ.
L'analisi di significazione statistica hè stata realizata cù GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Unpaired t-test è analisi unidirezionale di varianza (ANOVA) sò stati utilizati per pruvà e differenze trà i gruppi di valutazione.U livellu di significazione hè indicatu in a figura cusì: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 è ****P<0.0001;NS, nisuna differenza significativa.
Per materiali supplementarii per questu articulu, vede http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
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