Pacientams, kuriems atliekamos ortopedinės implantacijos operacijos, bakterinės infekcijos ir infekcijų sukeltas imuninis atsakas visada buvo pavojinga gyvybei.Įprastos biologinės medžiagos yra jautrios biologiniam užteršimui, dėl kurio bakterijos įsiveržia į sužeistą vietą ir sukelia pooperacinę infekciją.Todėl skubiai reikia sukurti antiinfekcines ir imunines dangas ortopediniams implantams.Čia mes sukūrėme pažangią ortopedinių implantų paviršiaus modifikavimo technologiją, vadinamą suteptu ortopediniu implantu paviršiumi (LOIS), kurią įkvėpė lygus ąsočių augalų ąsočių paviršius.LOIS pasižymi ilgalaikiu ir stipriu skysčių atsparumu įvairiems skysčiams ir biologinėms medžiagoms (įskaitant ląsteles, baltymus, kalcį ir bakterijas).Be to, imituodami neišvengiamą žalą in vitro operacijos metu, patvirtinome mechaninį atsparumą įbrėžimams ir tvirtinimo jėgą.Triušio kaulų čiulpų uždegiminio šlaunikaulio lūžio modelis buvo naudojamas nuodugniai ištirti LOIS antibiologinį pleiskanojimą ir antiinfekcinį gebėjimą.Mes įsivaizduojame, kad LOIS, pasižymintis antibiotinėmis savybėmis ir mechaniniu patvarumu, yra žingsnis į priekį ortopedinėje chirurgijoje be infekcijų.
Šiandien dėl bendro senėjimo labai padaugėjo pacientų, sergančių ortopedinėmis ligomis (pavyzdžiui, vyresnio amžiaus žmonių lūžiai, degeneracinės sąnarių ligos, osteoporozė) (1, 2).Todėl gydymo įstaigos didelę reikšmę teikia ortopedinei chirurgijai, įskaitant ortopedinius varžtų, plokštelių, vinių ir dirbtinių sąnarių implantus (3, 4).Tačiau pranešta, kad tradiciniai ortopediniai implantai yra jautrūs bakterijų sukibimui ir bioplėvelės susidarymui, o tai gali sukelti chirurginės vietos infekciją (SSI) po operacijos (5, 6).Susiformavus bioplėvelei ant ortopedinio implanto paviršiaus, bioplėvelės pašalinimas tampa itin sunkus net ir naudojant dideles antibiotikų dozes.Todėl dažniausiai tai sukelia sunkias pooperacines infekcijas (7, 8).Dėl minėtų problemų gydant užkrėstus implantus turėtų būti atliekama pakartotinė operacija, įskaitant visų implantų ir aplinkinių audinių pašalinimą;todėl pacientas patirs stiprų skausmą ir tam tikrą riziką (9, 10).
Siekiant išspręsti kai kurias iš šių problemų, buvo sukurti vaistus išskiriantys ortopediniai implantai, siekiant užkirsti kelią infekcijai, pašalinant bakterijas, pritvirtintas prie paviršiaus (11, 12).Tačiau strategija vis dar turi keletą apribojimų.Buvo pranešta, kad ilgą laiką implantuojant vaistus išskiriančius implantus buvo pažeisti aplinkiniai audiniai ir atsirado uždegimas, dėl kurio gali išsivystyti nekrozė (13, 14).Be to, dėl organinių tirpiklių, kurie gali egzistuoti pagaminus vaistus išskiriančius ortopedinius implantus, kuriuos griežtai draudžia JAV maisto ir vaistų administracija, reikia atlikti papildomus gryninimo veiksmus, kad atitiktų jos standartus (15).Vaistinį preparatą išskiriantys implantai yra sudėtingi kontroliuojant vaistų atpalaidavimą, o dėl riboto vaistų kiekio, ilgalaikis vaisto taikymas yra neįmanomas (16).
Kita įprasta strategija yra padengti implantą antifouling polimeru, kad būtų išvengta biologinių medžiagų ir bakterijų prilipimo prie paviršiaus (17).Pavyzdžiui, cviterioniniai polimerai patraukė dėmesį dėl savo nelipnių savybių, kai jie liečiasi su plazmos baltymais, ląstelėmis ir bakterijomis.Tačiau jis turi tam tikrų apribojimų, susijusių su ilgalaikiu stabilumu ir mechaniniu patvarumu, o tai trukdo praktiškai naudoti ortopediniuose implantuose, ypač dėl mechaninio grandymo chirurginių procedūrų metu (18, 19).Be to, dėl didelio biologinio suderinamumo, pašalinimo operacijos poreikio nebuvimo ir paviršiaus valymo savybių dėl korozijos buvo naudojami ortopediniai implantai, pagaminti iš biologiškai skaidžių medžiagų (20, 21).Korozijos metu cheminiai ryšiai tarp polimerinės matricos yra suskaidomi ir atsiskiria nuo paviršiaus, o sukibėjai nuvalo paviršių.Tačiau paviršių valant antibiologinis užterštumas yra veiksmingas per trumpą laiką.Be to, dauguma absorbuojamų medžiagų, įskaitant poli(pieno rūgšties ir glikolio rūgšties kopolimerą) (PLGA), polipieno rūgštį (PLA) ir magnio lydinius, organizme biologiškai skaidosi ir erozuojasi, o tai neigiamai paveiks mechaninį stabilumą.(dvidešimt du).Be to, biologiškai skaidžių plokštelių fragmentai suteikia vietą bakterijoms prisitvirtinti, o tai ilgainiui padidina infekcijos tikimybę.Ši mechaninio skilimo ir infekcijos rizika riboja praktinį plastinės chirurgijos taikymą (23).
Superhidrofobiniai (SHP) paviršiai, imituojantys lotoso lapų hierarchinę struktūrą, tapo potencialiu paviršių nuo užsiteršimo sprendimu (24, 25).Kai SHP paviršius panardinamas į skystį, oro burbuliukai bus įstrigę, taip suformuodami oro kišenes ir užkirsdami kelią bakterijų sukibimui (26).Tačiau naujausi tyrimai parodė, kad SHP paviršius turi trūkumų, susijusių su mechaniniu patvarumu ir ilgalaikiu stabilumu, o tai trukdo jį naudoti medicininiuose implantuose.Be to, oro kišenės ištirps ir praras savo anti-puvimo savybes, todėl dėl didelio SHP paviršiaus ploto bus platesnis bakterijų sukibimas (27, 28).Neseniai Aizenbergas ir jo kolegos pristatė naujovišką paviršiaus dangos nuo biologinio užteršimo metodą, sukurdami lygų paviršių, įkvėptą Nepenthes ąsočio augalo (29, 30).Lygus paviršius pasižymi ilgalaikiu stabilumu hidraulinėmis sąlygomis, yra itin skysčius atstumiantis biologiniams skysčiams ir pasižymi savaime atsinaujinančiomis savybėmis.Tačiau nėra nei metodo, kaip padengti dangą kompleksinės formos medicininiam implantui, ir neįrodyta, kad jis palaikytų pažeisto audinio gijimo procesą po implantacijos.
Čia pristatome suteptą ortopedinio implanto paviršių (LOIS), mikro/nano struktūros ortopedinio implanto paviršių ir sandariai sujungtą su plonu tepalo sluoksniu, kad jis nebūtų siejamas su plastine chirurgija Bakterinės infekcijos, pvz., lūžių fiksacija.Kadangi fluoro funkcionalizuota mikro/nano lygio struktūra tvirtai pritvirtina tepalą ant konstrukcijos, sukurtas LOIS gali visiškai atremti įvairių skysčių sukibimą ir ilgą laiką išlaikyti apsaugą nuo užsiteršimo.LOIS dangomis galima padengti įvairių formų medžiagas, skirtas kaulų sintezei.Puikios LOIS antibiotikų savybės prieš bioplėvelės bakterijas [Pseudomonas aeruginosa ir meticilinui atsparų Staphylococcus aureus (MRSA)] ir biologines medžiagas (ląsteles, baltymus ir kalcį) patvirtintos in vitro.Didelio sukibimo su pagrindu sukibimo greitis yra mažesnis nei 1%.Be to, net ir po mechaninio įtempimo, pvz., paviršiaus įbrėžimų, prasiskverbiančio tepalo sukeltas savaiminis gijimas padeda išlaikyti jo apsaugančias nuo užsiteršimo savybes.Mechaninio patvarumo bandymo rezultatai rodo, kad net ir po konstrukcinių ir cheminių modifikacijų bendras stiprumas ženkliai nesumažės.Be to, buvo atliktas eksperimentas in vitro, imituojantis mechaninį įtempimą chirurginėje aplinkoje, siekiant įrodyti, kad LOIS gali atlaikyti įvairius mechaninius įtempius, atsirandančius plastinės chirurgijos metu.Galiausiai, mes panaudojome triušio pagrindu sukurtą šlaunikaulio lūžio modelį in vivo, kuris įrodė, kad LOIS pasižymi geresnėmis antibakterinėmis savybėmis ir biologiniu suderinamumu.Radiologiniai ir histologiniai rezultatai patvirtino, kad stabilus tepalo elgesys ir antibiotinio užteršimo savybės per 4 savaites po implantacijos gali pasiekti veiksmingą antiinfekciją ir imuninį pabėgimą, nevėlinant kaulų gijimo proceso.
1A paveiksle parodyta sukurto LOIS schema, kuri triušio šlaunikaulio lūžio modelyje yra implantuota mikro/nano masto struktūromis, kad būtų patvirtintos puikios antibiologinės užteršimo ir antiinfekcinės savybės.Biomimetinis metodas naudojamas vandens vazono augalo paviršiui imituoti ir biologiniam užteršimui išvengti, į paviršiaus mikro/nano struktūrą įterpiant tepalo sluoksnį.Paviršius, įpurškiamas lubrikantu, gali sumažinti biologinių medžiagų ir paviršiaus sąlytį.Dėl to, kad paviršiuje susidaro stabilūs cheminiai ryšiai, jis pasižymi puikiomis apsaugos nuo užsiteršimo savybėmis ir ilgalaikiu stabilumu.Dėl to tepalo paviršiaus antibiotikų savybės leidžia įvairiai praktiškai pritaikyti biomedicininius tyrimus.Tačiau išsamūs tyrimai, kaip šis ypatingas paviršius sąveikauja organizme, dar nebaigti.Palyginus LOIS su nuogais substratais in vitro naudojant albuminą ir bioplėvelės bakterijas, galima patvirtinti LOIS nelipnumą (1B pav.).Be to, nuvalius vandens lašelius ant nuožulnaus pliko pagrindo ir LOIS substrato (S1 pav. ir S1 filmas), galima parodyti biologinio užterštumo efektyvumą.Kaip parodyta fluorescencinio mikroskopo vaizde, eksponuotas substratas, inkubuotas baltymų ir bakterijų suspensijoje, parodė, kad prie paviršiaus prilipo didelis kiekis biologinės medžiagos.Tačiau dėl puikių antibiotikų užteršimo savybių LOIS beveik nerodo fluorescencijos.Siekiant patvirtinti jo antibiotikų užteršimo ir antiinfekcines savybes, LOIS buvo uždėtas ant ortopedinių implantų, skirtų kaulų sintezei (plokštelių ir varžtų), paviršiaus ir įdėtas į triušio lūžių modelį.Prieš implantavimą plikas ortopedinis implantas ir LOIS buvo inkubuojami bakterijų suspensijoje 12 valandų.Išankstinė inkubacija užtikrina, kad ant eksponuoto implanto paviršiaus susidarytų bioplėvelė palyginimui.1C paveiksle parodyta lūžio vietos nuotrauka praėjus 4 savaitėms po implantacijos.Kairėje triušiui su pliku ortopediniu implantu buvo nustatytas stiprus uždegimo lygis, nes ant implanto paviršiaus susidarė bioplėvelė.Priešingas rezultatas buvo pastebėtas triušiams, implantuotiems LOIS, ty aplinkiniuose LOIS audiniuose nebuvo nei infekcijos, nei uždegimo požymių.Be to, optinis vaizdas kairėje rodo triušio su atidengtu implantu chirurginę vietą, o tai rodo, kad LOIS paviršiuje nebuvo rasta kelių klijų, esančių ant eksponuoto implanto paviršiaus.Tai rodo, kad LOIS pasižymi ilgalaikiu stabilumu ir gali išlaikyti savo antibiologines užteršimo ir sukibimo savybes.
(A) Scheminė LOIS diagrama ir jos implantavimas triušio šlaunikaulio lūžio modelyje.(B) Baltymų ir bakterijų bioplėvelės fluorescencinis mikroskopinis vaizdas ant pliko paviršiaus ir LOIS substrato.Praėjus 4 savaitėms po implantacijos, (C) lūžio vietos fotografinis vaizdas ir (D) rentgeno vaizdas (paryškintas raudonu stačiakampiu).Vaizdo sutikimas: Kyomin Chae, Yonsei universitetas.
Sterilizuotų, eksponuotų neigiamai implantuotų triušių kaulų gijimo procesas buvo normalus be jokių uždegimo ar infekcijos požymių.Kita vertus, SHP implantai, iš anksto inkubuoti bakterijų suspensijoje, turi su infekcija susijusį uždegimą aplinkiniuose audiniuose.Tai gali būti siejama su jo nesugebėjimu ilgą laiką slopinti bakterijų adheziją (S2 pav.).Siekiant įrodyti, kad LOIS neturi įtakos gijimo procesui, bet slopina galimas su implantacija susijusias infekcijas, buvo lyginami eksponuotos teigiamos matricos ir LOIS lūžio vietoje rentgeno vaizdai (1D pav.).Apnuoginto teigiamo implanto rentgeno vaizdas parodė nuolatines osteolizės linijas, o tai rodo, kad kaulas nebuvo visiškai išgydytas.Tai rodo, kad kaulų atsigavimo procesas gali būti labai atidėtas dėl su infekcija susijusio uždegimo.Priešingai, tai parodė, kad triušiai, kuriems buvo implantuotas LOIS, sugijo ir neturėjo jokios akivaizdžios lūžio vietos.
Siekiant sukurti medicininius implantus, turinčius ilgalaikį stabilumą ir funkcionalumą (įskaitant atsparumą biologiniam užteršimui), buvo įdėta daug pastangų.Tačiau įvairių biologinių medžiagų buvimas ir audinių sukibimo dinamika riboja kliniškai patikimų jų metodų kūrimą.Siekdami pašalinti šiuos trūkumus, sukūrėme mikro/nano sluoksnių struktūrą ir chemiškai modifikuotą paviršių, kuris optimizuotas dėl didelės kapiliarinės jėgos ir cheminio afiniteto, kad išliktų kuo lygesnis tepalas.2A paveiksle parodytas bendras LOIS gamybos procesas.Pirmiausia paruoškite medicininio nerūdijančio plieno (SS) 304 pagrindą.Antra, mikro / nano struktūra susidaro ant SS substrato cheminiu ėsdinimo būdu naudojant vandenilio fluorido rūgšties (HF) tirpalą.Siekiant atkurti SS atsparumą korozijai, ėsdinto substrato apdorojimui naudojamas azoto rūgšties (HNO3) tirpalas (31).Pasyvavimas padidina SS pagrindo atsparumą korozijai ir žymiai sulėtina korozijos procesą, kuris gali sumažinti bendrą LOIS veikimą.Tada, suformuojant savaime surenkamą monosluoksnį (SAM) su 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktiltrietoksisilanu (POTS), paviršius chemiškai modifikuojamas, kad būtų pagerinta cheminė sąveika tarp paviršiaus ir lygaus tepalo Affinity.Paviršiaus modifikacija žymiai sumažina pagaminto mikro/nano masto struktūrinio paviršiaus paviršiaus energiją, kuri atitinka lygaus tepalo paviršiaus energiją.Tai leidžia lubrikantą visiškai sudrėkinti ir taip suformuoti stabilų tepalo sluoksnį ant paviršiaus.Modifikuotas paviršius pasižymi padidintu hidrofobiškumu.Rezultatai rodo, kad slidus tepalas LOIS veikia stabiliai dėl didelio cheminio afiniteto ir kapiliarinės jėgos, kurią sukelia mikro/nano struktūra (32, 33).Ištirti optiniai pokyčiai SS paviršiuje po paviršiaus modifikavimo ir tepalo įpurškimo.Paviršiuje susidariusi mikro/nano sluoksninė struktūra gali sukelti vizualinius pokyčius ir patamsinti paviršių.Šis reiškinys siejamas su sustiprintu šviesos sklaidos efektu ant šiurkštaus paviršiaus, kuris padidina išsklaidytą atspindį, kurį sukelia šviesos gaudymo mechanizmas (34).Be to, suleidus lubrikantą, LOIS tampa tamsesnis.Dėl tepimo sluoksnio nuo pagrindo atsispindi mažiau šviesos, todėl LOIS patamsėja.Siekiant optimizuoti mikrostruktūrą / nanostruktūrą, kad būtų rodomas mažiausias slydimo kampas (SA), kad būtų pasiektas biologinis užteršimas, skenuojanti elektronų mikroskopija (SEM) ir atominės poros buvo naudojamos skirtingiems HF ėsdinimo laikams (0, 3)., 15 ir 60 minučių) Jėgos mikroskopas (AFM) (2B pav.).SEM ir AFM vaizdai rodo, kad po trumpo ėsdinimo laiko (3 minučių ėsdinimo) plikas substratas suformavo nevienodą nano masto šiurkštumą.Paviršiaus šiurkštumas keičiasi su ėsdinimo laiku (S3 pav.).Laike kintanti kreivė rodo, kad paviršiaus šiurkštumas toliau didėja ir pasiekia piką po 15 ėsdinimo minučių, o po 30 ėsdinimo minučių pastebimas tik nedidelis šiurkštumo sumažėjimas.Šiuo metu nanolygio šiurkštumas yra išgraviruotas, o mikrolygio šiurkštumas intensyviai vystosi, todėl šiurkštumo pokytis tampa stabilesnis.Po ėsdinimo ilgiau nei 30 minučių pastebimas tolesnis šiurkštumo padidėjimas, kuris išsamiai paaiškinamas taip: SS sudarytas iš plieno, legiruoto su tokiais elementais kaip geležis, chromas, nikelis, molibdenas ir daugelis kitų elementų.Tarp šių elementų geležis, chromas ir molibdenas vaidina svarbų vaidmenį formuojant mikronų / nano skalės šiurkštumą ant SS naudojant HF ėsdinimą.Ankstyvosiose korozijos stadijose geležis ir chromas yra daugiausia korozijos, nes molibdenas turi didesnį atsparumą korozijai nei molibdenas.Vykstant ėsdinimui, ėsdinimo tirpalas vietiškai persotina, todėl susidaro fluoridai ir oksidai, kuriuos sukelia ėsdinimas.Fluoras ir oksidas nusėda ir galiausiai vėl nusėda ant paviršiaus, sudarydami paviršiaus šiurkštumą mikronų/nano diapazone (31).Šis mikro/nano lygmens šiurkštumas vaidina svarbų vaidmenį LOIS savaiminio gydymo savybėse.Dviejų skalių paviršius sukuria sinergetinį efektą, labai padidindamas kapiliarinę jėgą.Šis reiškinys leidžia lubrikantui stabiliai prasiskverbti į paviršių ir prisideda prie savaiminio gijimo savybių (35).Šiurkštumo susidarymas priklauso nuo ėsdinimo laiko.Mažiau nei 10 minučių ėsdinimo, paviršiuje yra tik nano masto šiurkštumas, kurio nepakanka, kad būtų pakankamai tepalo, kad būtų atsparus biologiniam užsiteršimui (36).Kita vertus, jei ėsdinimo laikas viršija 30 minučių, geležies ir chromo persodinimo metu susidaręs nano masto šiurkštumas išnyks, o dėl molibdeno liks tik mikro skalės šiurkštumas.Per daug išgraviruotas paviršius neturi nano masto šiurkštumo ir praranda sinerginį dviejų pakopų šiurkštumo efektą, o tai neigiamai veikia LOIS savaiminio gijimo savybes.SA matavimai buvo atlikti ant substratų, kurių ėsdinimo laikas yra skirtingas, siekiant įrodyti, kad jie apsaugo nuo užsiteršimo.Įvairių tipų skysčiai buvo parinkti pagal klampumą ir paviršiaus energiją, įskaitant dejonizuotą (DI) vandenį, kraują, etilenglikolį (EG), etanolį (EtOH) ir heksadekaną (HD) (S4 pav.).Laikui bėgant kintantis ėsdinimo modelis rodo, kad įvairiems skysčiams, kurių paviršiaus energija ir klampumas skiriasi, LOIS SA po 15 minučių ėsdinimo yra mažiausia.Todėl LOIS yra optimizuotas ėsdinti 15 minučių, kad susidarytų mikronų ir nano mastelio šiurkštumas, kuris yra tinkamas veiksmingai išlaikyti tepalo patvarumą ir puikias apsaugos nuo užsiteršimo savybes.
(A) LOIS keturių etapų gamybos proceso schema.Įdėklas rodo ant pagrindo susidariusį SAM.(B) SEM ir AFM vaizdai, naudojami substrato mikro/nano struktūrai optimizuoti skirtingu ėsdinimo laiku.(C) Cr2p ir (D) F1s rentgeno fotoelektroninės spektroskopijos (XPS) spektrai po paviršiaus pasyvavimo ir SAM padengimo.au, savavališkas vienetas.(E) Reprezentatyvūs vandens lašelių vaizdai ant plikų, išgraviruotų, SHP ir LOIS substratų.(F) SHP ir LOIS skirtingų paviršiaus įtempių skysčių kontaktinio kampo (CA) ir SA matavimas.Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SD.
Tada, siekiant patvirtinti paviršiaus cheminių savybių pasikeitimą, rentgeno fotoelektronų spektroskopija (XPS) buvo naudojama substrato paviršiaus cheminės sudėties pokyčiams po kiekvieno paviršiaus padengimo ištirti.2C paveiksle pavaizduoti HF išgraviruoto paviršiaus ir HNO 3 apdoroto paviršiaus XPS matavimo rezultatai.Dvi pagrindinės smailės ties 587,3 ir 577,7 eV gali būti priskirtos Cr-O ryšiui, esančiam chromo oksido sluoksnyje, kuris yra pagrindinis skirtumas nuo HF išgraviruoto paviršiaus.Taip yra daugiausia dėl to, kad HNO3 paviršiuje sunaudoja geležies ir chromo fluorido.HNO3 pagrindu pagamintas ėsdinimas leidžia chromui suformuoti pasyvų oksido sluoksnį ant paviršiaus, todėl išgraviruotas SS vėl atsparus korozijai.2D paveiksle buvo gauti XPS spektrai, siekiant patvirtinti, kad po SAM dangos paviršiuje susidarė fluoro angliavandenilio pagrindu pagamintas silanas, kuris pasižymi itin dideliu skysčių atstumimu net EG, kraujui ir EtOH.SAM danga užbaigiama silano funkcinėms grupėms reaguojant su hidroksilo grupėmis, susidariusiomis apdorojant plazmą.Dėl to buvo pastebėtas reikšmingas CF2 ir CF3 smailių padidėjimas.Ryšio energija nuo 286 iki 296 eV rodo, kad cheminė modifikacija sėkmingai atlikta naudojant SAM dangą.SHP rodo palyginti dideles CF2 (290,1 eV) ir CF3 (293,3 eV) smailes, kurias sukelia paviršiuje susidaręs silanas fluoro anglies pagrindu.2E paveiksle pavaizduoti tipiniai optiniai kontaktinio kampo (CA) matavimų vaizdai skirtingoms dejonizuoto vandens grupėms, liečiančioms pliką, išgraviruotą, SHP ir LOIS.Šie vaizdai rodo, kad išgraviruotas paviršius tampa hidrofiliniu dėl mikro/nano struktūros, susidariusios cheminio ėsdinimo būdu, kad dejonizuotas vanduo būtų absorbuojamas į struktūrą.Tačiau, kai substratas yra padengtas SAM, substratas pasižymi stipriu vandeniui atsparumu, todėl susidaro paviršiaus SHP, o kontaktinis plotas tarp vandens ir paviršiaus yra mažas.Galiausiai, LOIS buvo pastebėtas CA sumažėjimas, kuris gali būti siejamas su tepalo įsiskverbimu į mikrostruktūrą, taip padidinant kontaktinį plotą.Siekiant įrodyti, kad paviršius pasižymi puikiomis skysčių atstumiančiomis ir nelipniomis savybėmis, LOIS buvo lyginamas su SHP substratu, matuojant CA ir SA naudojant įvairius skysčius (2F pav.).Atsižvelgiant į klampumą ir paviršiaus energiją, buvo parinkti įvairūs skysčių tipai, įskaitant dejonizuotą vandenį, kraują, EG, EtOH ir HD (S4 pav.).CA matavimo rezultatai rodo, kad kai CA linksta į HD, sumažinama CA, kur CA paviršiaus energija yra mažiausia.Be to, bendros CA LOIS yra žemas.Tačiau SA matavimas rodo visiškai kitokį reiškinį.Visi skysčiai, išskyrus jonizuotą vandenį, prilimpa prie SHP pagrindo nenuslysdami.Kita vertus, LOIS rodo labai žemą SA, kai visas skystis pakreiptas mažesniu nei 10°–15° kampu, visas skystis nukris.Tai aiškiai rodo, kad LOIS nelipnumas yra geresnis nei SHP paviršiaus.Be to, LOIS dangos taip pat taikomos įvairių tipų medžiagoms, įskaitant titaną (Ti), polifenilsulfoną (PPSU), polioksimetileną (POM), polieterio eterio ketoną (PEEK) ir biologiškai absorbuojamus polimerus (PLGA). Tai yra implantuojamos ortopedinės medžiagos (pav. S5)).LOIS apdorotos medžiagos nuoseklūs lašelių vaizdai rodo, kad LOIS antibiotikų savybės yra vienodos visuose substratuose.Be to, CA ir SA matavimų rezultatai rodo, kad LOIS nelipnios savybės gali būti pritaikytos ir kitoms medžiagoms.
Siekiant patvirtinti LOIS apsaugančias nuo užteršimo savybes, įvairių tipų substratai (įskaitant pliką, išgraviruotą, SHP ir LOIS) buvo inkubuojami su Pseudomonas aeruginosa ir MRSA.Šios dvi bakterijos buvo atrinktos kaip tipinės ligoninės bakterijos, dėl kurių gali susidaryti bioplėvelės, dėl kurių gali atsirasti SSI (37).3 paveiksle (A ir B) pavaizduoti fluorescencinio mikroskopo vaizdai ir kolonijų formavimo vieneto (CFU) matavimo rezultatai, gauti iš substratų, inkubuotų bakterijų suspensijoje atitinkamai trumpą laiką (12 valandų) ir ilgą laiką (72 valandas).Per trumpą laiką bakterijos suformuos grupes ir padidės, pasidengdamos į gleives panašiomis medžiagomis ir neleisdamos joms pasišalinti.Tačiau per 72 valandas trunkančią inkubaciją bakterijos subręs ir jas bus lengva išsklaidyti, kad susidarytų daugiau kolonijų ar grupių.Todėl galima manyti, kad 72 valandų inkubacija yra ilgalaikė ir yra tinkamas inkubacijos laikas, kad paviršiuje susidarytų stipri bioplėvelė (38).Per trumpą laiką išgraviruotas paviršius ir SHP paviršius parodė bakterijų sukibimą, kuris sumažėjo maždaug 25–50%, palyginti su plika substratu.Tačiau dėl puikių biologinio užteršimo savybių ir stabilumo LOIS neparodė bakterijų bioplėvelės sukibimo trumpuoju ir ilgalaikiu laikotarpiu.Schemoje (3C pav.) aprašomas ėsdinimo tirpalo, SHP ir LOIS, antibiologinio užsiteršimo mechanizmas.Daroma prielaida, kad išgraviruotas substratas, turintis hidrofilinių savybių, turės didesnį paviršiaus plotą nei plikas substratas.Todėl ant išgraviruoto pagrindo atsiras daugiau bakterijų sukibimo.Tačiau, palyginti su plika substratu, išgraviruoto pagrindo paviršiuje susidaro žymiai mažiau bioplėvelių.Taip yra todėl, kad vandens molekulės tvirtai jungiasi prie hidrofilinio paviršiaus ir veikia kaip vandens tepalas, todėl trumpuoju laikotarpiu trukdo bakterijų sukibimui (39).Tačiau vandens molekulių sluoksnis yra labai plonas ir tirpsta bakterijų suspensijose.Todėl vandens molekulinis sluoksnis ilgam išnyksta, o tai lemia platų bakterijų sukibimą ir dauginimąsi.SHP dėl trumpalaikių nedrėkinančių savybių yra slopinamas bakterijų sukibimas.Sumažėjęs bakterijų sukibimas gali būti siejamas su oro kišenėmis, įstrigusiomis sluoksniuotoje struktūroje, ir mažesne paviršiaus energija, taip sumažinant bakterijų suspensijos ir paviršiaus kontaktą.Tačiau SHP buvo pastebėtas didelis bakterijų sukibimas, nes jis ilgą laiką prarado savo anti-užteršimo savybes.Tai daugiausia lemia oro kišenių išnykimas dėl hidrostatinio slėgio ir oro ištirpimo vandenyje.Taip yra daugiausia dėl oro kišenių išnykimo dėl tirpimo ir sluoksniuotos struktūros, kuri suteikia didesnį paviršiaus plotą sukibimui (27, 40).Skirtingai nuo šių dviejų pagrindų, turinčių svarbų poveikį ilgalaikiam stabilumui, LOIS esantis tepimo tepalas įpurškiamas į mikro/nano struktūrą ir neišnyks net ilgainiui.Tepalai, užpildyti mikro/nano struktūromis, yra labai stabilūs ir dėl didelio cheminio afiniteto stipriai traukiasi prie paviršiaus, taip ilgą laiką užkertant kelią bakterijų sukibimui.S6 paveiksle parodytas atspindžio konfokalinis mikroskopinis lubrikantų užpilto substrato, panardinto į fosfatiniu buferiniu tirpalu (PBS), vaizdas.Ištisiniai vaizdai rodo, kad net po 120 valandų nežymaus purtymo (120 aps./min.), LOIS tepimo sluoksnis išlieka nepakitęs, o tai rodo ilgalaikį stabilumą tekėjimo sąlygomis.Taip yra dėl didelio cheminio afiniteto tarp fluoro pagrindu pagamintos SAM dangos ir perfluorangliavandenilio pagrindo lubrikanto, todėl gali susidaryti stabilus tepalo sluoksnis.Todėl išlaikomas apsaugos nuo užsiteršimo efektyvumas.Be to, substratas buvo išbandytas pagal tipinius baltymus (albuminą ir fibrinogeną), kurie yra plazmoje, ląstelėse, glaudžiai susijusiose su imunine funkcija (makrofagais ir fibroblastais), ir tų, kurios yra susijusios su kaulų formavimu.Kalcio kiekis yra labai didelis.(3D pav., 1 ir 2 bei S7 pav.) (41, 42).Be to, fibrinogeno, albumino ir kalcio adhezijos testo fluorescencinio mikroskopo vaizdai parodė skirtingas kiekvienos substrato grupės sukibimo charakteristikas (S8 pav.).Kaulo formavimosi metu ortopedinį implantą gali supti naujai susidarę kaulo ir kalcio sluoksniai, kurie ne tik apsunkina pašalinimą, bet ir gali sukelti netikėtą žalą pacientui pašalinimo proceso metu.Todėl mažas kalcio nuosėdų kiekis ant kaulų plokštelių ir varžtų yra naudingas ortopedinėms operacijoms, kai reikia pašalinti implantą.Remdamiesi kiekybiniu prijungto ploto įvertinimu, pagrįstu fluorescencijos intensyvumu ir ląstelių skaičiumi, patvirtinome, kad LOIS pasižymi puikiomis antibiotinėmis savybėmis visoms biologinėms medžiagoms, palyginti su kitais substratais.Remiantis in vitro eksperimentų rezultatais, ortopediniams implantams gali būti taikomas antibiologinis užsiteršimas LOIS, kuris gali ne tik slopinti bioplėvelės bakterijų sukeliamas infekcijas, bet ir sumažinti uždegimą, kurį sukelia aktyvi organizmo imuninė sistema.
(A) Kiekvienos grupės (plikos, išgraviruotos, SHP ir LOIS) fluorescenciniai mikroskopiniai vaizdai, inkubuoti Pseudomonas aeruginosa ir MRSA suspensijose 12 ir 72 valandas.(B) Pseudomonas aeruginosa ir MRSA prilipusių CFU skaičius kiekvienos grupės paviršiuje.(C) Trumpalaikio ir ilgalaikio ėsdinimo, SHP ir LOIS, antibiologinio užteršimo mechanizmo schema.(D) (1) Fibroblastų, prilipusių prie kiekvieno substrato, skaičius ir ląstelių, prilipusių prie pliko ir LOIS, fluorescencinio mikroskopo vaizdai.(2) Su imunine sistema susijusių baltymų, albumino ir kalcio, dalyvaujančių kaulų gijimo procese, adhezijos testas (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ir **** P <0,0001).ns, nesvarbu.
Esant neišvengiamiems koncentruotoms įtempimams, mechaninis patvarumas visada buvo pagrindinis iššūkis dengiant antifouling dangas.Tradiciniai nuotekų gelio metodai yra pagrįsti mažai tirpiais ir trapiais polimerais.Todėl biomedicinoje jie paprastai yra jautrūs mechaniniam poveikiui.Todėl mechaniškai patvarios antipuvimo dangos tebėra iššūkis taikant, pavyzdžiui, ortopedinius implantus (43, 44).4A(1) paveiksle pavaizduoti du pagrindiniai ortopediniams implantams taikomi įtempių tipai, įskaitant įbrėžimą (šlyties įtempį) ir suspaudimą, naudojant žnyplėmis sukurtą pažeisto implanto optinį vaizdą.Pavyzdžiui, kai varžtas priveržiamas atsuktuvu arba kai chirurgas tvirtai laiko kaulo plokštelę pincetu ir taiko suspaudimo jėgą, plastikinė kaulo plokštelė bus pažeista ir subraižyta tiek makro, tiek mikro/nano svarstyklėse (4A pav., 2) .Siekiant patikrinti, ar pagamintas LOIS gali atlaikyti šiuos pažeidimus plastinės chirurgijos metu, buvo atlikta nanoįtraukta, siekiant palyginti pliko pagrindo ir LOIS kietumą mikro/nano skalėje, siekiant ištirti mechanines mikro/nano struktūros savybes Poveikis (pav. 4B).Scheminė diagrama rodo skirtingą LOIS deformacijos elgesį dėl mikro / nano struktūrų buvimo.Jėgos ir poslinkio kreivė buvo nubrėžta remiantis nanoindentacijos rezultatais (4C pav.).Mėlynas vaizdas vaizduoja pliką pagrindą, kuris rodo tik nedidelę deformaciją, kaip matyti iš didžiausio 0, 26 μm įdubimo gylio.Kita vertus, laipsniškas nanoįtraukimo jėgos ir poslinkio padidėjimas, pastebėtas LOIS (raudona kreivė), gali rodyti sumažėjusių mechaninių savybių požymius, todėl nanoįtraukimo gylis yra 1, 61 μm.Taip yra todėl, kad LOIS esanti mikro/nano struktūra suteikia gilesnę erdvę nanoindenterio galui, todėl jo deformacija yra didesnė nei pliko pagrindo.Konsta-Gdoutos ir kt.(45) mano, kad dėl nanostruktūrų atsiradimo dėl nanoįdubimų ir mikro/nano šiurkštumo susidaro netaisyklingos nanoindentacijos kreivės.Tamsintas plotas atitinka netaisyklingos deformacijos kreivę, priskiriamą nanostruktūrai, o neužtemdytas plotas priskiriamas mikrostruktūrai.Ši deformacija gali pažeisti laikančiojo tepalo mikrostruktūrą/nanostruktūrą ir neigiamai paveikti jo apsaugą nuo užsiteršimo.Siekiant ištirti žalos poveikį LOIS, plastinės chirurgijos metu organizme buvo pakartota neišvengiama mikro/nano struktūrų žala.Naudojant kraujo ir baltymų adhezijos testus, galima nustatyti LOIS antibiotikų užteršimo savybių stabilumą po in vitro (4D pav.).Optinių vaizdų serija rodo žalą, atsiradusią šalia kiekvieno pagrindo skylių.Buvo atliktas sukibimo su krauju tyrimas, siekiant parodyti mechaninio pažeidimo poveikį antibiotinio užteršimo dangai (4E pav.).Kaip ir SHP, dėl pažeidimų prarandamos apsaugos nuo užsiteršimo savybės, o LOIS pasižymi puikiomis apsaugos nuo užsiteršimo savybėmis, nes atstumia kraują.Taip yra todėl, kad paviršiaus energiją skatina kapiliarinis veiksmas, apimantis pažeistą vietą, mikrostruktūrinio tepalo tepalų srautas atkuria apsaugos nuo užsiteršimo savybes (35).Ta pati tendencija buvo pastebėta baltymų sukibimo bandyme naudojant albuminą.Pažeistoje vietoje plačiai stebimas baltymų sukibimas su SHP paviršiumi, o išmatavus jo ploto aprėptį galima įvertinti kaip pusę pliko pagrindo sukibimo lygio.Kita vertus, LOIS išlaikė savo antibiotikų užteršimo savybes nesukeldama sukibimo (4 pav., F ir G).Be to, varžto paviršius dažnai patiria stiprų mechaninį įtempimą, pvz., gręžimą, todėl tyrėme LOIS dangos gebėjimą išlikti nepažeistai ant varžto in vitro.4H paveiksle pavaizduoti įvairių varžtų, įskaitant pliko, SHP ir LOIS, optiniai vaizdai.Raudonas stačiakampis žymi tikslinę sritį, kurioje kaulo implantacijos metu atsiranda stiprus mechaninis įtempis.Panašiai kaip ir plokštelės baltymų sukibimo bandymas, fluorescencinis mikroskopas naudojamas baltymų sukibimui vaizduoti ir aprėpties plotui išmatuoti, kad būtų įrodytas LOIS dangos vientisumas net ir esant stipriam mechaniniam įtempimui (4 pav., I ir J).LOIS apdoroti sraigtai pasižymi puikiomis apsaugos nuo užsiteršimo savybėmis, o prie paviršiaus beveik neprilimpa baltymai.Kita vertus, baltymų sukibimas buvo pastebėtas plikuose varžtuose ir SHP varžtuose, kur SHP varžtų plotas buvo trečdalis plikų varžtų.Be to, fiksavimui naudojamas ortopedinis implantas turi būti mechaniškai tvirtas, kad atlaikytų lūžio vietos apkrovą, kaip parodyta 4K paveiksle.Todėl buvo atliktas lenkimo bandymas, siekiant nustatyti cheminės modifikacijos poveikį mechaninėms savybėms.Be to, tai daroma siekiant išlaikyti fiksuotą implanto įtempimą.Taikykite vertikalią mechaninę jėgą, kol implantas visiškai susilankstys ir bus gauta įtempių ir deformacijų kreivė (4L pav., 1).Dvi savybės, įskaitant Youngo modulį ir stiprumą lenkimui, buvo palygintos tarp pliko ir LOIS substratų kaip jų mechaninio stiprumo rodiklių (4L, 2 ir 3 pav.).Youngo modulis rodo medžiagos gebėjimą atlaikyti mechaninius pokyčius.Kiekvieno substrato Youngo modulis yra atitinkamai 41,48±1,01 ir 40,06±0,96 GPa;pastebėtas skirtumas yra apie 3,4%.Be to, pranešama, kad stipris lenkiant, lemiantis medžiagos kietumą, yra 102,34±1,51 GPa pliko pagrindo ir 96,99±0,86 GPa SHP.Plikas substratas yra maždaug 5,3 % didesnis.Nedidelį mechaninių savybių sumažėjimą gali sukelti įpjovos efektas.Esant įpjovos efektui, mikro/nano šiurkštumas gali veikti kaip įpjovų rinkinys, dėl kurio susidaro vietinė įtempių koncentracija ir paveikiamos mechaninės implanto savybės (46).Tačiau, remiantis tuo, kad žmogaus žievės kaulo standumas yra nuo 7,4 iki 31,6 GPa, o išmatuotas LOIS modulis viršija žmogaus žievės kaulo modulį (47), LOIS pakanka palaikyti lūžį ir jo bendrą mechanines savybes minimaliai paveikia paviršiaus modifikavimas.
(A) Scheminė (1) mechaninio įtempio, taikomo ortopediniam implantui operacijos metu, ir (2) pažeisto ortopedinio implanto optinio vaizdo schema.(B) Scheminė nanomechaninių savybių matavimo nanoindentacija ir LOIS ant pliko paviršiaus diagrama.(C) Nanoindentation jėgos poslinkio kreivė pliko paviršiaus ir LOIS.(D) Atlikę eksperimentus in vitro, imituokite skirtingų tipų ortopedinių plokštelių optinius vaizdus (pažeista vieta paryškinta raudonu stačiakampiu), kad imituotumėte operacijos metu sukeltą mechaninį įtempį.(E) kraujo sukibimo tyrimas ir (F) pažeistos ortopedinės plokštelės grupės baltymų adhezijos tyrimas.(G) Išmatuokite baltymo, prilipusio prie plokštelės, plotą.(H) įvairių tipų ortopedinių varžtų optiniai vaizdai po eksperimento in vitro.(I) Baltymų sukibimo testas skirtingų dangų vientisumui tirti.(J) Išmatuokite baltymo, prilipusio prie varžto, plotą.(K) Triušio judėjimas turi sukelti fiksuotą lūžusio kaulo apkrovą.(L) (1) Lenkimo bandymo rezultatai ir optiniai vaizdai prieš ir po lenkimo.Skirtumas tarp (2) Youngo modulio ir (3) atsparumo lenkimui tarp pliko implanto ir SHP.Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 ir ****P<0,0001).Vaizdo sutikimas: Kyomin Chae, Yonsei universitetas.
Klinikinėse situacijose dauguma bakterijų kontakto su biologinėmis medžiagomis ir žaizdų vietomis atsiranda iš subrendusių, subrendusių bioplėvelių (48).Todėl JAV ligų kontrolės ir prevencijos centrai apskaičiavo, kad 65 % visų žmonių infekcijų yra susijusios su bioplėvelėmis (49).Šiuo atveju būtina pateikti in vivo eksperimentinį projektą, kuris užtikrintų nuoseklų bioplėvelės susidarymą ant implanto paviršiaus.Todėl sukūrėme triušio šlaunikaulio lūžio modelį, kuriame ortopediniai implantai buvo iš anksto inkubuojami bakterijų suspensijoje, o po to implantuojami į triušio šlaunikaulius, kad ištirtume LOIS anti-užteršimo savybes in vivo.Dėl šių trijų svarbių faktų bakterinės infekcijos sukeliamos iš anksto kultivuojant, o ne tiesiogiai suleidus bakterijų suspensijas: i) triušių imuninė sistema natūraliai yra stipresnė nei žmonių;todėl galimas bakterijų suspensijų ir planktoninių bakterijų suleidimas Tai neturi įtakos bioplėvelių susidarymui.(Ii) Planktoninės bakterijos yra jautresnės antibiotikams, o antibiotikai dažniausiai naudojami po operacijos;galiausiai, (iii) planktoninių bakterijų suspensija gali būti atskiesta gyvūno kūno skysčiais (50).Prieš implantavimą iš anksto kultivuodami implantą bakterijų suspensijoje, galime nuodugniai ištirti žalingą bakterinės infekcijos ir svetimkūnio reakcijos (SKVN) poveikį kaulų gijimo procesui.Triušiai buvo paaukoti praėjus 4 savaitėms po implantacijos, nes kaulų gijimo procesui būtina kaulų integracija bus baigta per 4 savaites.Tada implantai buvo pašalinti iš triušių tolesniems tyrimams.5A paveiksle parodytas bakterijų dauginimosi mechanizmas.Užkrėstas ortopedinis implantas įvedamas į kūną.Dėl išankstinio inkubavimo bakterijų suspensijoje šeši iš šešių triušių, implantuotų plika implantais, buvo užkrėsti, o nė vienas triušis, implantuotas LOIS apdorotais implantais, nebuvo užkrėstas.Bakterinės infekcijos vyksta trimis etapais, įskaitant augimą, brendimą ir sklaidą (51).Pirmiausia prisitvirtinusios bakterijos dauginasi ir auga paviršiuje, o tada, išskirdamos ekstraląstelinį polimerą (EPS), amiloidą ir ekstraląstelinę DNR, bakterijos suformuoja bioplėvelę.Bioplėvelė ne tik trukdo antibiotikų įsiskverbimui, bet ir skatina antibiotikų ardančių fermentų (pvz., β-laktamazės) kaupimąsi (52).Galiausiai bioplėvelė subrendusias bakterijas paskleidžia į aplinkinius audinius.Todėl atsiranda infekcija.Be to, svetimkūniui patekus į organizmą, infekcija, galinti sukelti stiprų imuninį atsaką, gali sukelti stiprų uždegimą, skausmą ir susilpnėti imunitetą.5B paveiksle pateikiama FBR, kurį sukelia ortopedinio implanto įdėjimas, o ne imuninio atsako, kurį sukelia bakterinė infekcija, apžvalga.Imuninė sistema atpažįsta įdėtą implantą kaip svetimkūnį, o tada ląstelės ir audiniai sureaguoja, kad svetimkūnis būtų įkapsuliuotas (53).Pirmosiomis FBR dienomis ant ortopedinių implantų paviršiaus buvo suformuota tiekimo matrica, dėl kurios buvo adsorbuotas fibrinogenas.Tada adsorbuotas fibrinogenas sudaro labai tankų fibrino tinklą, kuris skatina leukocitų prisitvirtinimą (54).Susiformavus fibrino tinklui, dėl neutrofilų įsiskverbimo atsiras ūmus uždegimas.Šiame etape išsiskiria įvairūs citokinai, tokie kaip naviko nekrozės faktorius-α (TNF-α), interleukinas-4 (IL-4) ir IL-β, o monocitai pradeda skverbtis į implantacijos vietą ir diferencijuotis į milžiniškas ląsteles.Fagas (41, 55, 56).FBR mažinimas visada buvo iššūkis, nes per didelis FBR gali sukelti ūminį ir lėtinį uždegimą, kuris gali sukelti mirtinų komplikacijų.Siekiant įvertinti bakterinių infekcijų poveikį audiniuose, supančius pliką implantą ir LOIS, buvo naudojamas hematoksilino ir eozino (H&E) ir Masson trichromo (MT) dažymas.Triušiams, implantuotiems su plika substratu, progresavo sunkios bakterinės infekcijos, o H&E audinių skaidrės aiškiai parodė uždegimo sukeltus abscesus ir nekrozę.Kita vertus, itin stiprus anti-biofouling paviršius LOIS slopina bakterijų adheziją, todėl nerodo infekcijos požymių ir mažina uždegimą (5C pav.).MT dažymo rezultatai parodė tą pačią tendenciją.Tačiau MT dažymas taip pat parodė edemą triušiams, implantuotiems su LOIS, o tai rodo, kad netrukus atsigaus (5D pav.).Siekiant ištirti imuninio atsako laipsnį, imunohistocheminis (IHC) dažymas buvo atliktas naudojant citokinus TNF-α ir IL-6, susijusius su imuniniu atsaku.Nuogas neigiamas implantas, kuris nebuvo veikiamas bakterijų, buvo lyginamas su LOIS, kuris buvo veikiamas bakterijų, bet nebuvo užkrėstas, siekiant ištirti gijimo procesą nesant bakterinės infekcijos.5E paveiksle parodytas TNF-α išreiškiančio IHC stiklelio optinis vaizdas.Ruda sritis rodo imuninį atsaką, o tai rodo, kad imuninis atsakas LOIS yra šiek tiek sumažintas.Be to, IL-6 ekspresija LOIS buvo žymiai mažesnė nei neigiama sterilaus nuogo ekspresija (5F pav.).Citokino ekspresija buvo kiekybiškai įvertinta išmatuojant citokiną atitinkančio antikūnų dažymo plotą (5G pav.).Palyginti su triušiais, kuriems buvo neigiami implantai, LOIS implantuotų triušių ekspresijos lygis buvo mažesnis, o tai rodo reikšmingą skirtumą.Citokinų ekspresijos sumažėjimas rodo, kad ilgalaikės, stabilios LOIS priešužteršimo savybės yra susijusios ne tik su bakterinių infekcijų slopinimu, bet ir su FBR sumažėjimu, kurį sukelia prie substrato prilipę makrofagai (53, 57, 58).Todėl sumažėjęs imuninis atsakas dėl LOIS imuninės sistemos vengimo savybių gali išspręsti šalutinį poveikį po implantacijos, pvz., per didelį imuninį atsaką po plastinių operacijų.
(A) Scheminė bioplėvelės susidarymo ir plitimo ant užkrėsto ortopedinio implanto paviršiaus mechanizmo schema.eDNR, ekstraląstelinė DNR.(B) Imuninio atsako schema po ortopedinio implanto įdėjimo.(C) ortopedinių implantų aplinkinių audinių H&E dažymas ir (D) MT dažymas su pliku teigiamu ir LOIS.Su imunitetu susijusių citokinų (E) TNF-α ir (F) IL-6 IHC yra nudažyti plikų neigiamų ir LOIS implantuotų triušių vaizdai.(G) Citokinų ekspresijos kiekybinis įvertinimas pagal ploto aprėpties matavimą (** P <0,01).
LOIS biologinis suderinamumas ir jo poveikis kaulų gijimo procesui buvo tiriamas in vivo naudojant diagnostinį vaizdą [rentgeno ir mikrokompiuterinę tomografiją (CT)] ir osteoklastų IHC.6A paveiksle parodytas kaulų gijimo procesas, apimantis tris skirtingus etapus: uždegimą, atstatymą ir remodeliavimą.Kai įvyksta lūžis, uždegiminės ląstelės ir fibroblastai prasiskverbs į lūžusį kaulą ir pradės augti į kraujagyslių audinį.Atkūrimo fazėje kraujagyslinio audinio įaugimas plinta šalia lūžio vietos.Kraujagyslių audinys aprūpina maistinėmis medžiagomis naujam kaului, vadinamam kaliuku, formuotis.Paskutinis kaulo gijimo proceso etapas yra remodeliavimosi stadija, kurios metu kalio dydis sumažinamas iki normalaus kaulo dydžio, padidėjus aktyvuotų osteoklastų kiekiui (59).Trimatė (3D) lūžio vietos rekonstrukcija buvo atlikta naudojant mikro-KT nuskaitymus, siekiant stebėti kalio susidarymo lygio skirtumus kiekvienoje grupėje.Stebėkite šlaunikaulio skerspjūvį ir stebėkite lūžusį kaulą supančio kalio storį (6 pav., B ir C).Rentgeno spinduliai taip pat buvo naudojami tiriant visų grupių lūžių vietas kiekvieną savaitę, kad būtų galima stebėti skirtingus kiekvienos grupės kaulų regeneracijos procesus (S9 pav.).Kaulai ir subrendę kaulai atitinkamai pavaizduoti mėlyna / žalia ir dramblio kaulo spalva.Dauguma minkštųjų audinių išfiltruojami pagal iš anksto nustatytą slenkstį.Nude teigiamas ir SHP patvirtino, kad aplink lūžio vietą susidarė nedidelis kalio kiekis.Kita vertus, atviras LOIS negatyvas ir lūžio vieta yra apsupti storu nuospaudu.Mikro-KT vaizdai parodė, kad kalio susidarymą trukdė bakterinė infekcija ir su infekcija susijęs uždegimas.Taip yra todėl, kad imuninė sistema teikia pirmenybę septinių sužalojimų, sukeltų su infekcija susijusio uždegimo, gydymui, o ne kaulų atstatymui (60).Buvo atliktas IHC ir tartratui atsparios rūgštinės fosfatazės (TRAP) dažymas, siekiant stebėti osteoklastų aktyvumą ir kaulų rezorbciją (6D pav.) (61).Tik keli aktyvuoti osteoklastai, nudažyti purpurine spalva, buvo rasti nuoguose teigiamuose ir SHP.Kita vertus, prie plikų teigiamų ir subrendusių LOIS kaulų buvo pastebėta daug aktyvuotų osteoklastų.Šis reiškinys rodo, kad esant osteoklastams, aplink lūžio vietą esantis kaliusas intensyviai remodeliuojasi (62).Buvo išmatuotas kaulo kaulo tūris ir osteoklastų ekspresijos sritis, siekiant palyginti kalio susidarymo lygį aplink lūžio vietą visose grupėse, kad būtų galima kiekybiškai įvertinti mikro-KT skenavimo ir IHC rezultatus (6E, 1 ir 2 pav.).Kaip ir tikėtasi, nuogi negatyvai ir nuospaudų susidarymas LOIS buvo žymiai didesnis nei kitose grupėse, o tai rodo, kad įvyko teigiamas kaulų remodeliavimas (63).S10 paveiksle parodytas optinis chirurginės vietos vaizdas, šalia varžto surinkto audinio MT dažymo rezultatas ir TRAP dažymo rezultatas, pabrėžiantis varžto ir kaulo sąsają.Pliktame substrate buvo pastebėtas stiprus kalio ir fibrozės susidarymas, o LOIS apdoroto implanto paviršius buvo santykinai neprilipęs.Panašiai, palyginti su nuogais negatyvais, triušiams, implantuotiems LOIS, buvo pastebėta mažesnė fibrozė, kaip rodo baltos rodyklės.Be to, tvirta edema (mėlyna rodyklė) gali būti siejama su LOIS imuninės sistemos vengimo savybėmis, taip sumažinant sunkų uždegimą.Nelipnus paviršius aplink implantą ir sumažėjusi fibrozė rodo, kad pašalinimo procesas yra lengvesnis, todėl dažniausiai atsiranda kitų lūžių ar uždegimų.Kaulų gijimo procesas po varžto pašalinimo buvo įvertintas pagal osteoklastų aktyvumą varžto ir kaulo sąsajoje.Tiek plikas kaulas, tiek LOIS implanto sąsaja absorbavo panašų kiekį osteoklastų, kad kaulas toliau gytų, o tai rodo, kad LOIS danga neturi neigiamo poveikio kaulų gijimui ar imuniniam atsakui.Siekiant patvirtinti, kad LOIS atlikta paviršiaus modifikacija netrukdo kaulų gijimo procesui, buvo atliktas rentgeno tyrimas, siekiant palyginti triušių kaulų gijimą su neigiamais jonais ir 6 savaites po LOIS implantacijos (6F pav.).Rezultatai parodė, kad, palyginti su neinfekuota nuoga teigiama grupe, LOIS parodė tokį patį kaulų gijimo laipsnį ir abiejose grupėse nebuvo akivaizdžių lūžio požymių (nuolatinė osteolizės linija).
(A) Scheminė kaulų gijimo proceso schema po lūžio.(B) kiekvienos paviršiaus grupės kalio susidarymo laipsnio skirtumas ir (C) lūžio vietos skerspjūvio vaizdas.(D) TRAP dažymas, kad būtų galima vizualizuoti osteoklastų aktyvumą ir kaulų rezorbciją.Remiantis TRAP aktyvumu, žievės kaulo išorinio kalio susidarymas buvo kiekybiškai išanalizuotas pagal (E) (1) mikro-KT ir (2) osteoklastų aktyvumą.(F) praėjus 6 savaitėms po implantacijos, rentgeno nuotraukos su lūžusiu kaulo eksponuotu negatyvu (paryškintas raudonu brūkšniu stačiakampiu) ir LOIS (paryškintas mėlynu brūkšniu stačiakampiu).Statistinė analizė atlikta taikant vienpusę dispersinę analizę (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Trumpai tariant, LOIS suteikia naujo tipo antibakterinės infekcijos strategiją ir imuninę dangą, skirtą ortopediniams implantams.Įprasti ortopediniai implantai su SHP funkcionalizacija pasižymi trumpalaikėmis antibiotinėmis savybėmis, tačiau negali išlaikyti savo savybių ilgą laiką.Substrato superhidrofobiškumas sulaiko oro burbuliukus tarp bakterijų ir substrato, taip suformuodamas oro kišenes ir taip užkertant kelią bakterinei infekcijai.Tačiau dėl oro difuzijos šios oro kišenės lengvai pašalinamos.Kita vertus, LOIS gerai įrodė savo gebėjimą užkirsti kelią su bioplėvele susijusioms infekcijoms.Todėl dėl lubrikanto sluoksnio, įpurškto į sluoksniuotą mikro/nano struktūros paviršių, savybių, apsaugančių nuo atmetimo, galima išvengti su infekcija susijusių uždegimų.LOIS gamybos sąlygoms optimizuoti naudojami įvairūs apibūdinimo metodai, įskaitant SEM, AFM, XPS ir CA matavimus.Be to, LOIS taip pat gali būti taikomas įvairioms biologinėms medžiagoms, paprastai naudojamoms ortopedinėje fiksavimo įrangoje, tokioms kaip PLGA, Ti, PE, POM ir PPSU.Tada LOIS buvo išbandytas in vitro, siekiant įrodyti, kad jis apsaugo nuo bakterijų ir su imuniniu atsaku susijusių biologinių medžiagų.Rezultatai rodo, kad jis turi puikų antibakterinį ir antibiotikų poveikį, palyginti su plika implantu.Be to, LOIS demonstruoja mechaninį stiprumą net ir po mechaninio įtempimo, o tai neišvengiama atliekant plastinę chirurgiją.Dėl savaime gyjančių lubrikanto savybių mikro/nano struktūros paviršiuje LOIS sėkmingai išlaikė savo antibiologines užteršimo savybes.Siekiant ištirti LOIS biologinį suderinamumą ir antibakterines savybes in vivo, LOIS buvo implantuotas į triušio šlaunikaulį 4 savaites.Triušiams, implantuotiems LOIS, bakterinės infekcijos nepastebėta.Be to, IHC naudojimas parodė sumažėjusį vietinio imuninio atsako lygį, o tai rodo, kad LOIS neslopina kaulų gijimo proceso.LOIS pasižymi puikiomis antibakterinėmis ir imuninės sistemos vengimo savybėmis ir, kaip įrodyta, veiksmingai apsaugo nuo bioplėvelės susidarymo prieš ortopedinę operaciją ir jos metu, ypač kaulų sintezei.Naudojant triušio kaulų čiulpų uždegiminio šlaunikaulio lūžio modelį, buvo nuodugniai ištirtas su bioplėvele susijusių infekcijų poveikis kaulų gijimo procesui, kurį sukelia iš anksto inkubuoti implantai.Būsimame tyrime reikalingas naujas in vivo modelis, norint ištirti galimas infekcijas po implantacijos, kad būtų galima visiškai suprasti ir užkirsti kelią su bioplėvele susijusioms infekcijoms viso gijimo proceso metu.Be to, osteoindukcija vis dar yra neišspręstas iššūkis integruojant su LOIS.Norint įveikti iššūkį, reikia atlikti tolesnius tyrimus, siekiant suderinti selektyvų osteoindukcinių ląstelių adheziją arba regeneracinę mediciną su LOIS.Apskritai LOIS yra daug žadanti ortopedinė implantų danga, pasižyminti mechaniniu tvirtumu ir puikiomis antibiotikų užteršimo savybėmis, kurios gali sumažinti SSI ir imuninės sistemos šalutinį poveikį.
Plaukite 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS substratą (Dong Kang M-Tech Co., Korėja) acetone, EtOH ir DI vandenyje 15 minučių, kad pašalintumėte teršalus.Kad paviršiuje susidarytų mikro/nano lygmens struktūra, nuvalytas substratas panardinamas į 48–51 % HF tirpalą (DUKSAN Corp., Pietų Korėja) 50°C temperatūroje.Išgraviravimo laikas svyruoja nuo 0 iki 60 minučių.Tada išgraviruotas substratas buvo nuvalytas dejonizuotu vandeniu ir 30 minučių įdėtas į 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) tirpalą 50 ° C temperatūroje, kad ant paviršiaus susidarytų chromo oksido pasyvavimo sluoksnis.Po pasyvavimo substratas nuplaunamas dejonizuotu vandeniu ir išdžiovinamas, kad būtų gautas sluoksninės struktūros substratas.Tada substratas buvo veikiamas deguonies plazma (100 W, 3 minutes) ir nedelsiant panardintas į 8, 88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Vokietija) tirpalą toluene kambario temperatūroje 12 valandų.Tada substratas, padengtas POTS, buvo išvalytas EtOH ir atkaitintas 150 ° C temperatūroje 2 valandas, kad būtų gautas tankus POTS SAM.Po SAM dengimo ant pagrindo buvo suformuotas lubrikanto sluoksnis, užtepus perfluorpolieterio lubrikantą (Krytox 101; DuPont, JAV), kurio įkrovimo tūris yra 20 μm/cm 2. Prieš naudojimą lubrikantą perfiltruokite per 0,2 mikrono filtrą.Pašalinkite tepalo perteklių 15 minučių pakreipdami 45° kampu.Ta pati gamybos procedūra buvo naudojama ortopediniams implantams, pagamintiems iš 304 SS (fiksavimo plokštė ir žievės fiksavimo varžtas; Dong Kang M-Tech Co., Korėja).Visi ortopediniai implantai yra sukurti taip, kad atitiktų triušio šlaunikaulio geometriją.
Pagrindo ir ortopedinių implantų paviršiaus morfologija buvo patikrinta lauko emisijos SEM (Inspect F50, FEI, JAV) ir AFM (XE-100, Park Systems, Pietų Korėja).Paviršiaus šiurkštumas (Ra, Rq) matuojamas 20 μm plotą padauginus iš 20 μm (n=4).Paviršiaus cheminės sudėties analizei buvo naudojama XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japonija) sistema su Al Kα rentgeno spindulių šaltiniu, kurio dėmės dydis yra 100 μm2.Skystam CA ir SA matuoti buvo naudojama CA matavimo sistema su dinamine vaizdo fiksavimo kamera (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Pietų Korėja).Kiekvienam matavimui ant paviršiaus uždedama 6–10 μl lašelių (dejonizuoto vandens, arklio kraujo, EG, 30 % etanolio ir HD), kad būtų galima išmatuoti CA.Kai substrato pasvirimo kampas didėja 2°/s greičiu (n = 4), SA matuojamas lašeliui krentant.
Pseudomonas aeruginosa [Amerikos tipo kultūrų kolekcija (ATCC) 27853] ir MRSA (ATCC 25923) buvo įsigyti iš ATCC (Manasas, Virdžinija, JAV), o pradinė kultūra buvo palaikoma -80 °C temperatūroje.Prieš naudojimą užšaldyta kultūra buvo inkubuojama tripsinu atšildytame sojų pupelių sultinyje (Komed, Korėja) 37 °C temperatūroje 18 valandų, o po to du kartus perkelta, kad ją suaktyvintų.Po inkubacijos kultūra buvo centrifuguojama 10 000 aps./min. greičiu 10 minučių 4 °C temperatūroje ir du kartus plaunama PBS (pH 7,3) tirpalu.Tada centrifuguota kultūra subkultūruojama ant kraujo agaro plokštelių (BAP).MRSA ir Pseudomonas aeruginosa buvo paruošti per naktį ir auginami Luria-Bertani sultinyje.Pseudomonas aeruginosa ir MRSA koncentracija inokuliate buvo kiekybiškai nustatyta pagal suspensijos CFU serijiniuose praskiedimuose ant agaro.Tada sureguliuokite bakterijų koncentraciją iki 0,5 McFarland standarto, kuris atitinka 108 KSV/ml.Tada darbinę bakterijų suspensiją praskieskite 100 kartų iki 106 KSV/ml.Norint patikrinti antibakterines sukibimo savybes, substratas prieš naudojimą buvo sterilizuojamas 121 °C temperatūroje 15 minučių.Tada substratas buvo perkeltas į 25 ml bakterijų suspensijos ir 12 ir 72 valandas inkubuojamas 37 ° C temperatūroje, intensyviai kratant (200 aps./min.).Po inkubacijos kiekvienas substratas buvo pašalintas iš inkubatoriaus ir 3 kartus plaunamas PBS, kad būtų pašalintos plūduriuojančios bakterijos ant paviršiaus.Norint stebėti bioplėvelę ant substrato, bioplėvelė buvo fiksuota metanoliu ir 2 minutes nudažyta 1 ml krimidino apelsino.Tada fluorescencinis mikroskopas (BX51TR, Olympus, Japonija) buvo naudojamas dažytos bioplėvelės nuotraukoms fotografuoti.Siekiant kiekybiškai įvertinti bioplėvelę ant substrato, pritvirtintos ląstelės buvo atskirtos nuo substrato granulių sūkurio metodu, kuris buvo laikomas tinkamiausiu metodu pritvirtintoms bakterijoms pašalinti (n = 4).Steriliomis žnyplėmis nuimkite substratą iš auginimo terpės ir bakstelėkite šulinio plokštelę, kad pašalintumėte skysčio perteklių.Laisvai pritvirtintos ląstelės buvo pašalintos du kartus plaunant steriliu PBS.Tada kiekvienas substratas buvo perkeltas į sterilų mėgintuvėlį, kuriame yra 9 ml 0,1% baltyminio ept fiziologinio tirpalo (PSW) ir 2 g 20–25 sterilių stiklo karoliukų (0,4–0,5 mm skersmens).Tada jis buvo maišomas 3 minutes, kad ląstelės būtų atskirtos nuo mėginio.Po maišymo suspensija buvo 10 kartų skiedžiama 0, 1% PSW, o po to 0, 1 ml kiekvieno skiedimo buvo pasėta BAP.Po 24 valandų inkubacijos 37 ° C temperatūroje CFU buvo skaičiuojamas rankiniu būdu.
Ląstelėms buvo naudojami pelių fibroblastai NIH/3T3 (CRL-1658; Amerikos ATCC) ir pelių makrofagai RAW 264.7 (TIB-71; Amerikos ATCC).Naudokite „Dulbecco“ modifikuotą „Eagle“ terpę (DMEM; LM001-05, Welgene, Korėja) pelių fibroblastams kultivuoti ir papildykite 10% veršelio serumo (S103-01, Welgene) ir 1% penicilino-streptomicino (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene). ). Ląstelės buvo inkubuojamos per naktį 37 °C temperatūroje ir 5% CO2 37°C temperatūroje 30 minučių. Po inkubavimo naudokite substratą su 4',6-diamino-2-fenilindoliu (H-1200, Vector Laboratories, JK) VECTASHIELD fiksavimo terpe (n = 4 vienai ląstelei). , fluoresceinas, fluoresceino izotiocianatas-albuminas (A9771, Sigma-Aldrich, Vokietija) ir žmogaus plazma Alexa Fluor 488 konjuguotas fibrinogenas (F13191, Invitrogen, JAV) buvo ištirpintas PBS (10 mM, pH 7,4).Albumino ir fibrinogeno koncentracijos buvo atitinkamai 1 ir 150 μg/ml.Po substrato Prieš panardindami į baltymų tirpalą, nuplaukite juos PBS, kad paviršius rehidratuotų.Tada panardinkite visus substratus į šešių šulinėlių plokštelę, kurioje yra baltymų tirpalas, ir inkubuokite 37 °C temperatūroje 30 ir 90 minučių.Po inkubacijos substratas buvo pašalintas iš baltymų tirpalo, 3 kartus švelniai plaunamas PBS ir fiksuojamas 4% paraformaldehidu (n = 4 kiekvienam baltymui).Kalciui natrio chloridas (0,21 M) ir kalio fosfatas (3,77 mM) buvo ištirpintas dejonizuotame vandenyje.Tirpalo pH sureguliuotas iki 2,0 pridedant hidrochlorido tirpalo (1 M).Tada kalcio chloridas (5,62 mM) buvo ištirpintas tirpale.Pridėjus 1 M tris(hidroksimetil)-amino, metanas sureguliuoja tirpalo pH iki 7,4.Panardinkite visus substratus į šešių šulinėlių plokštelę, užpildytą 1,5 × kalcio fosfato tirpalu, ir išimkite iš tirpalo po 30 minučių.Dažymui 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Sumaišykite su 100 ml dejonizuoto vandens.Tada naudokite 10 % amonio hidroksidą, kad sureguliuotumėte pH iki 4. Dažykite substratą Alizarin Red tirpalu 5 minutes, tada nukratykite dažų perteklių ir nusausinkite.Po kratymo pašalinkite substratą.Medžiaga dehidratuojama, po to 5 minutėms panardinama į acetoną, po to 5 minutėms panardinama į acetono-ksileno (1:1) tirpalą ir galiausiai plaunama ksilenu (n = 4).Naudojamas fluorescencinis mikroskopas (Axio Imager) su ×10 ir ×20 objektyvais..A2m, Zeiss, Vokietija) vaizduoja visus substratus.„ImageJ/FIJI“ (//imagej.nih.gov/ij/) buvo naudojamas kiekybiškai įvertinti biologinių medžiagų sukibimo duomenis kiekvienoje keturių skirtingų vaizdavimo sričių grupėje.Konvertuokite visus vaizdus į dvejetainius vaizdus su fiksuotais substrato palyginimo slenksčiais.
Zeiss LSM 700 konfokalinis mikroskopas buvo naudojamas stebėti tepalo sluoksnio stabilumą PBS atspindžio režimu.Fluoru dengtas SAM stiklo mėginys su įpuršktu tepimo sluoksniu buvo panardintas į PBS tirpalą ir išbandytas naudojant orbitinį purtiklį (SHO-1D; Daihan Scientific, Pietų Korėja) švelniomis purtymo sąlygomis (120 aps./min.).Tada paimkite mėginį ir stebėkite tepalo praradimą matuodami atspindėtos šviesos praradimą.Norint gauti fluorescencinius vaizdus atspindžio režimu, mėginys veikiamas 633 nm lazeriu ir surenkamas, nes šviesa atsispindės nuo mėginio.Mėginiai buvo matuojami kas 0, 30, 60 ir 120 valandų.
Siekiant nustatyti paviršiaus modifikavimo proceso įtaką ortopedinių implantų nanomechaninėms savybėms, nanoindenedionui matuoti buvo naudojamas nanoindenteris (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, JAV) su tripusiu piramidės formos Berkovich deimantiniu antgaliu.Didžiausia apkrova yra 10 mN, o plotas yra 100 μm x 100 μm.Atliekant visus matavimus, pakrovimo ir iškrovimo laikas yra 10 s, o laikymo laikas esant didžiausiai įdubimo apkrovai yra 2 s.Atlikite matavimus iš penkių skirtingų vietų ir paimkite vidurkį.Siekiant įvertinti mechaninio stiprumo charakteristikas veikiant apkrovai, buvo atliktas skersinio trijų taškų lenkimo bandymas, naudojant universalią bandymo mašiną (Instron 5966, Instron, JAV).Pagrindas suspaudžiamas pastoviu 10 N/s greičiu, esant padidintai apkrovai.Lenkimo moduliui ir didžiausiam gniuždymo įtempiui apskaičiuoti buvo naudojama Bluehill Universal programinė įranga (n = 3).
Siekiant imituoti operacijos procesą ir su juo susijusius mechaninius pažeidimus, padarytus operacijos metu, operacijos procesas buvo atliktas in vitro.Šlaunikauliai buvo paimti iš nužudytų Naujosios Zelandijos baltųjų triušių.Šlaunikaulis buvo išvalytas ir fiksuotas 4% paraformaldehidu 1 savaitę.Kaip aprašyta eksperimento su gyvūnais metodu, fiksuotas šlaunikaulis buvo operuotas chirurgiškai.Po operacijos ortopedinis implantas buvo panardintas į kraują (arklio kraują, KISAN, Korėja) 10 s, siekiant patvirtinti, ar po mechaninio pažeidimo atsirado kraujo sukibimas (n = 3).
Iš viso 24 Naujosios Zelandijos baltųjų triušių patinai (svoris 3,0–3,5 kg, vidutinis amžius 6 mėn.) buvo atsitiktinai suskirstyti į keturias grupes: nuogi neigiami, nuogi teigiami, SHP ir LOIS.Visos procedūros su gyvūnais buvo atliktos laikantis Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto etikos standartų (IACUC patvirtinta, KOREJA-2017-0159).Ortopedinis implantas susideda iš fiksuojančios plokštelės su penkiomis angomis (ilgis 41 mm, plotis 7 mm ir storis 2 mm) ir žievės fiksavimo varžtais (ilgis 12 mm, skersmuo 2,7 mm), skirti lūžiams fiksuoti.Išskyrus tas plokštes ir varžtus, kurie buvo naudojami neigiamų grupių grupėje, visos plokštės ir varžtai buvo inkubuojami MRSA suspensijoje (106 KSV/ml) ​​12 valandų.Nuoga neigiama grupė (n = 6) buvo gydoma pliko paviršiaus implantais be bakterijų suspensijos poveikio, kaip neigiamą infekcijos kontrolę.Teigiama grupė (n = 6) buvo apdorota pliko paviršiaus implantu, paveiktu bakterijų, kaip teigiamą infekcijos kontrolę.SHP grupė (n = 6) buvo gydoma bakterijų paveiktais SHP implantais.Galiausiai LOIS grupė buvo gydoma bakterijų paveiktais LOIS implantais (n = 6).Visi gyvūnai laikomi narve, duodama daug maisto ir vandens.Prieš operaciją triušiai buvo nevalginti 12 valandų.Gyvūnai buvo anestezuoti į raumenis ksilazino (5 mg/kg) injekcija ir paklitakselio (3 mg/kg) injekcija į veną.Po to per kvėpavimo sistemą tiekite 2% izoflurano ir 50–70% medicininio deguonies (tėkmės greitis 2 l/min.), kad išlaikytumėte anesteziją.Jis implantuojamas tiesiogiai priartėjus prie šoninio šlaunikaulio.Po plaukelių pašalinimo ir odos dezinfekcijos povidonu jodu, kairiojo vidurinio šlaunikaulio išorinėje pusėje buvo padarytas apie 6 cm ilgio pjūvis.Atvėrus tarpą tarp šlaunikaulį dengiančių raumenų, šlaunikaulis visiškai atidengiamas.Padėkite plokštę prieš šlaunikaulio veleną ir pritvirtinkite keturiais varžtais.Po fiksavimo naudokite pjūklo diską (1 mm storio), kad dirbtinai sukurtumėte lūžį srityje tarp antrosios ir ketvirtosios skylės.Operacijos pabaigoje žaizda nuplaunama fiziologiniu tirpalu ir užrišama siūlais.Kiekvienam triušiui po oda buvo švirkščiamas enrofloksacinas (5 mg/kg), praskiesto vienu trečdaliu fiziologiniu tirpalu.Visiems gyvūnams (0, 7, 14, 21, 28 ir 42 dienomis) buvo darytos pooperacinės šlaunikaulio rentgeno nuotraukos, siekiant patvirtinti kaulo osteotomiją.Po gilios anestezijos visi gyvūnai buvo nužudyti intraveniniu KCl (2 mmol/kg) 28 ir 42 dienomis.Po egzekucijos šlaunikaulis buvo nuskaitytas mikro-KT, kad būtų galima stebėti ir palyginti kaulų gijimo procesą ir naujų kaulų formavimąsi tarp keturių grupių.
Po egzekucijos buvo surinkti minkštieji audiniai, kurie tiesiogiai liečiasi su ortopediniais implantais.Audinys buvo fiksuotas 10% neutraliame buferiniame formaline per naktį ir po to dehidratuotas EtOH.Dehidratuotas audinys buvo įterptas į parafiną ir mikrotomu (400CS; EXAKT, Vokietija) supjaustomas 40 μm storiu.Siekiant vizualizuoti infekciją, buvo atliktas H&E dažymas ir MT dažymas.Norint patikrinti šeimininko atsaką, padalintas audinys buvo inkubuojamas su triušio anti-TNF-α pirminiu antikūnu (AB6671, Abcam, JAV) ir triušio anti-IL-6 (AB6672; Abcam, JAV), o po to apdorotas krienais.Oksidazė.Sekcijas užtepkite avidino-biotino komplekso (ABC) dažymo sistema pagal gamintojo instrukcijas.Kad pasirodytų kaip rudas reakcijos produktas, visose dalyse buvo naudojamas 3,3-diaminobenzidinas.Visiems pjūviams vizualizuoti buvo naudojamas skaitmeninis skaidrių skaitytuvas (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Vengrija), o mažiausiai keturi substratai kiekvienoje grupėje buvo išanalizuoti ImageJ programine įranga.
Rentgeno nuotraukos buvo daromos visiems gyvūnams po operacijos ir kas savaitę, kad būtų galima stebėti lūžių gijimą (n = 6 grupėje).Po atlikimo didelės skiriamosios gebos mikro-KT buvo naudojamas apskaičiuoti kalio susidarymą aplink šlaunikaulį po gijimo.Gautas šlaunikaulis buvo išvalytas, fiksuotas 4% paraformaldehidu 3 dienas ir dehidratuotas 75% etanolyje.Tada dehidratuoti kaulai buvo nuskaityti naudojant mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgija), kad būtų sukurti 3D vokselių vaizdai (2240 ​​× 2240 pikselių).Naudokite 1,0 mm Al filtrą, kad sumažintumėte signalo triukšmą ir visiems nuskaitymams pritaikytumėte didelę skiriamąją gebą (E = 133 kVp, I = 60 μA, integravimo laikas = 500 ms).Nrecon programinė įranga (versija 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgija) buvo naudojama nuskaityto mėginio 3D tūriui generuoti iš gautos 2D šoninės projekcijos.Analizei 3D rekonstruotas vaizdas padalijamas į 10mm×10mm×10mm kubus pagal lūžio vietą.Apskaičiuokite kaliusą už žievės kaulo ribų.Skaitmeniniam nuskaityto kaulo tūrio peradresavimui buvo naudojama DataViewer (versija 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgija) programinė įranga, analizei – CT-Analyzer (versija 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgija).Santykiniai rentgeno spindulių absorbcijos koeficientai brandžiame kaule ir kaliuke išskiriami pagal jų tankį, o tada kiekybiškai įvertinamas kalio tūris (n = 4).Siekiant patvirtinti, kad LOIS biologinis suderinamumas nevilkina kaulų gijimo proceso, buvo atlikta papildoma rentgeno ir mikro-KT analizė dviem triušiams: plikų neigiamų ir LOIS grupių.Abiem grupėms mirties bausmė buvo įvykdyta 6 savaitę.
Paaukotų gyvūnų šlaunikauliai buvo surinkti ir fiksuoti 4% paraformaldehidu 3 dienas.Tada ortopedinis implantas atsargiai pašalinamas iš šlaunikaulio.Šlaunikaulis buvo nukalkintas 21 dieną naudojant 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Tada nukalkintas šlaunikaulis buvo panardintas į EtOH, kad jis būtų dehidratuotas.Dehidratuotas šlaunikaulis buvo pašalintas ksilenu ir įterptas į parafiną.Tada mėginys buvo supjaustytas automatiniu rotaciniu mikrotomu (Leica RM2255, Leica Biosystems, Vokietija), kurio storis 3 μm.TRAP dažymui (F6760, Sigma-Aldrich, Vokietija), atskirti mėginiai buvo deparafinuoti, rehidratuoti ir 1 valandą inkubuoti TRAP reagente 37 ° C temperatūroje.Vaizdai buvo gauti naudojant skaidrių skaitytuvą (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Vengrija) ir kiekybiškai įvertinti išmatuojant nudažytos srities plotą.Kiekviename eksperimente mažiausiai keturi substratai kiekvienoje grupėje buvo išanalizuoti ImageJ programine įranga.
Statistinė reikšmingumo analizė atlikta naudojant GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., JAV).Vertinimo grupių skirtumams patikrinti buvo naudojamas nesuporuotas t testas ir vienpusė dispersinė analizė (ANOVA).Reikšmingumo lygis paveiksle nurodytas taip: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 ir ****P<0,0001;NS, reikšmingo skirtumo nėra.
Norėdami gauti papildomos medžiagos šiam straipsniui, žr. http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Tai yra atviros prieigos straipsnis, platinamas pagal Creative Commons priskyrimo nekomercinę licenciją, leidžiančią naudoti, platinti ir atgaminti bet kokioje laikmenoje, jei tai nėra naudojama siekiant komercinės naudos ir yra prielaida, kad originalas darbas teisingas.Nuoroda.
Pastaba: prašome jūsų pateikti tik el. pašto adresą, kad puslapyje rekomenduotas asmuo žinotų, jog norite, kad jis matytų el. laišką ir kad el. laiškas nėra šlamštas.Mes neužfiksuosime jokių el. pašto adresų.
Šis klausimas naudojamas norint patikrinti, ar esate žmogus, ir išvengti automatinio šlamšto pateikimo.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Antibakterinės ir imuninės ortopedinių implantų dangos gali sumažinti infekcijų sukeltas infekcijas ir imuninį atsaką.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Antibakterinės ir imuninės ortopedinių implantų dangos gali sumažinti infekcijų sukeltas infekcijas ir imuninį atsaką.
©2021 Amerikos mokslo pažangos asociacija.Visos teisės saugomos.AAAS yra HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ir COUNTER partneris.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.