Pentru pacienții supuși unei intervenții chirurgicale de implant ortopedic, infecțiile bacteriene și răspunsurile imune induse de infecții au reprezentat întotdeauna riscuri care pun viața în pericol.Materialele biologice convenționale sunt susceptibile la contaminarea biologică, ceea ce face ca bacteriile să invadeze zona rănită și să provoace infecții postoperatorii.Prin urmare, există o nevoie urgentă de a dezvolta acoperiri anti-infecții și de evacuare imună pentru implanturile ortopedice.Aici, am dezvoltat o tehnologie avansată de modificare a suprafeței pentru implanturi ortopedice numită Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), care este inspirată de suprafața netedă a ulcioarelor pentru plante.LOIS are o rezistență puternică la lichide de lungă durată pentru o varietate de lichide și substanțe biologice (inclusiv celule, proteine, calciu și bacterii).În plus, am confirmat durabilitatea mecanică împotriva zgârieturilor și forța de fixare prin simularea deteriorării inevitabile în timpul intervenției chirurgicale in vitro.Modelul de fractură femurală inflamatorie a măduvei osoase de iepure a fost utilizat pentru a studia în detaliu scalarea anti-biologică și capacitatea anti-infectie a LOIS.Ne imaginăm că LOIS, care are proprietăți anti-biofouling și durabilitate mecanică, este un pas înainte în chirurgia ortopedică fără infecții.
Astăzi, din cauza îmbătrânirii generale, numărul pacienților care suferă de boli ortopedice (cum ar fi fracturi la vârstnici, boli degenerative articulare și osteoporoză) a crescut foarte mult (1, 2).Prin urmare, instituțiile medicale acordă o mare importanță chirurgiei ortopedice, inclusiv implanturilor ortopedice de șuruburi, plăci, unghii și articulații artificiale (3, 4).Cu toate acestea, s-a raportat că implanturile ortopedice tradiționale sunt susceptibile la aderența bacteriană și la formarea de biofilm, care pot provoca infecția locului chirurgical (SSI) după intervenție chirurgicală (5, 6).Odată ce biofilmul este format pe suprafața implantului ortopedic, îndepărtarea biofilmului devine extrem de dificilă chiar și cu utilizarea unor doze mari de antibiotice.Prin urmare, de obicei duce la infecții postoperatorii severe (7, 8).Datorită problemelor de mai sus, tratamentul implanturilor infectate ar trebui să includă reoperarea, inclusiv îndepărtarea tuturor implanturilor și a țesuturilor din jur;prin urmare, pacientul va suferi dureri severe și unele riscuri (9, 10).
Pentru a rezolva unele dintre aceste probleme, au fost dezvoltate implanturi ortopedice cu eluție de medicamente pentru a preveni infecția prin eliminarea bacteriilor atașate la suprafață (11, 12).Cu toate acestea, strategia prezintă încă câteva limitări.S-a raportat că implantarea pe termen lung a implanturilor cu eliberare de medicamente a provocat leziuni țesuturilor înconjurătoare și a provocat inflamație, ceea ce poate duce la necroză (13, 14).În plus, solvenții organici care pot exista după procesul de fabricație a implanturilor ortopedice cu eluție de medicamente, care sunt strict interziși de Administrația SUA pentru Alimente și Medicamente, necesită pași suplimentari de purificare pentru a îndeplini standardele acesteia (15).Implanturile care eliberează medicamente sunt o provocare pentru eliberarea controlată a medicamentelor și, din cauza încărcăturii limitate de medicamente, aplicarea pe termen lung a medicamentului nu este fezabilă (16).
O altă strategie comună este acoperirea implantului cu un polimer antifouling pentru a preveni aderarea materiei biologice și a bacteriilor la suprafață (17).De exemplu, polimerii zwitterionici au atras atenția datorită proprietăților lor neadezive atunci când sunt în contact cu proteinele plasmatice, celulele și bacteriile.Cu toate acestea, are unele limitări legate de stabilitatea pe termen lung și durabilitatea mecanică, care împiedică aplicarea sa practică în implanturile ortopedice, în special din cauza răzuirii mecanice în timpul procedurilor chirurgicale (18, 19).În plus, datorită biocompatibilității sale ridicate, lipsei necesității unei intervenții chirurgicale de îndepărtare și proprietăților de curățare a suprafețelor prin coroziune, au fost utilizate implanturi ortopedice din materiale biodegradabile (20, 21).În timpul coroziunii, legăturile chimice dintre matricea polimerică sunt rupte și desprinse de suprafață, iar aderenții curăță suprafața.Cu toate acestea, murdărirea antibiologică prin curățarea suprafețelor este eficientă într-o perioadă scurtă de timp.În plus, majoritatea materialelor absorbabile, inclusiv copolimerul poli(acid lactic-acid glicolic) (PLGA), acidul polilactic (PLA) și aliajele pe bază de magneziu, vor suferi biodegradări neuniforme și eroziune în organism, ceea ce va afecta negativ stabilitatea mecanică.(douăzeci și doi).În plus, fragmentele de plăci biodegradabile oferă un loc pentru atașarea bacteriilor, ceea ce crește șansa de infecție pe termen lung.Acest risc de degradare mecanică și infecție limitează aplicarea practică a chirurgiei plastice (23).
Suprafețele superhidrofobe (SHP) care imită structura ierarhică a frunzelor de lotus au devenit o soluție potențială pentru suprafețele antifouling (24, 25).Când suprafața SHP este scufundată în lichid, bulele de aer vor fi prinse, formând astfel pungi de aer și împiedicând aderența bacteriană (26).Cu toate acestea, studii recente au arătat că suprafața SHP are dezavantaje legate de durabilitatea mecanică și stabilitatea pe termen lung, ceea ce împiedică aplicarea acesteia în implanturile medicale.Mai mult, pungile de aer se vor dizolva și își vor pierde proprietățile antifouling, rezultând astfel o aderență bacteriană mai largă datorită suprafeței mari a suprafeței SHP (27, 28).Recent, Aizenberg și colegii sai au introdus o metodă inovatoare de acoperire a suprafeței anti-biofouling prin dezvoltarea unei suprafețe netede inspirată de planta de ulcior Nepenthes (29, 30).Suprafața netedă prezintă stabilitate pe termen lung în condiții hidraulice, este extrem de respingătoare de lichide pentru lichidele biologice și are proprietăți de auto-reparare.Cu toate acestea, nu există nici o metodă de aplicare a unui înveliș pe un implant medical de formă complexă și nici nu este dovedit că sprijină procesul de vindecare a țesutului deteriorat după implantare.
Aici, introducem o suprafață de implant ortopedică lubrifiată (LOIS), o suprafață de implant ortopedică micro/nano-structurată și strâns combinată cu un strat subțire de lubrifiant pentru a preveni asocierea acesteia cu chirurgia plastică Infecții bacteriene, cum ar fi fixarea fracturilor.Deoarece structura micro/nano-nivel funcționalizată cu fluor fixează ferm lubrifiantul pe structură, LOIS-ul dezvoltat poate respinge complet aderența diferitelor lichide și poate menține performanța antifouling pentru o lungă perioadă de timp.Straturile LOIS pot fi aplicate pe materiale de diferite forme destinate sintezei osoase.Excelentele proprietăți anti-biofouling ale LOIS împotriva bacteriilor din biofilm [Pseudomonas aeruginosa și Staphylococcus aureus rezistent la meticilină (MRSA)] și substanțelor biologice (celule, proteine ​​și calciu) au fost confirmate in vitro.Rata de aderență a aderenței extinse la substrat este mai mică de 1%.În plus, chiar și după ce apare un stres mecanic, cum ar fi zgârierea suprafeței, auto-vindecarea cauzată de lubrifiantul penetrant ajută la menținerea proprietăților sale antifouling.Rezultatele testului de durabilitate mecanică arată că, chiar și după modificarea structurală și chimică, rezistența totală nu va fi redusă semnificativ.În plus, a fost efectuat un experiment in vitro care simulează stresul mecanic din mediul chirurgical pentru a demonstra că LOIS poate rezista la diferite solicitări mecanice care apar în timpul intervenției chirurgicale plastice.În cele din urmă, am folosit un model de fractură femurală in vivo pe bază de iepure, care a demonstrat că LOIS are proprietăți antibacteriene superioare și biocompatibilitate.Rezultatele radiologice și histologice au confirmat că comportamentul lubrifiant stabil și proprietățile anti-biofouling în decurs de 4 săptămâni de la implantare pot obține performanțe eficiente anti-infectie și evadare imună fără a întârzia procesul de vindecare a oaselor.
Figura 1A prezintă o diagramă schematică a LOIS dezvoltată, care este implantată cu structuri la scară micro/nano în modelul de fractură femurală de iepure pentru a confirma proprietățile sale excelente de murdărie biologică și anti-infectie.O metodă biomimetică este efectuată pentru a simula suprafața unei plante de ghiveci cu apă și pentru a preveni biofouling prin încorporarea unui strat de lubrifiant în structura micro/nano a suprafeței.Suprafața injectată cu lubrifiant poate minimiza contactul dintre substanțele biologice și suprafață.Prin urmare, datorită formării de legături chimice stabile pe suprafață, are o performanță excelentă antifouling și o stabilitate pe termen lung.Drept urmare, proprietățile anti-biofouling ale suprafeței de lubrifiere permit diverse aplicații practice în cercetarea biomedicală.Cu toate acestea, cercetări ample asupra modului în care această suprafață specială interacționează în organism nu au fost încă finalizate.Prin compararea LOIS cu substraturi goale in vitro folosind albumină și bacterii biofilm, neadezivitatea LOIS poate fi confirmată (Figura 1B).În plus, prin rularea picăturilor de apă pe substratul gol înclinat și substratul LOIS (Figura S1 și Filmul S1), poate fi demonstrată performanța de contaminare biologică.După cum se arată în imaginea cu microscopul cu fluorescență, substratul expus incubat într-o suspensie de proteine ​​și bacterii a arătat o cantitate mare de material biologic care aderă la suprafață.Cu toate acestea, datorită proprietăților sale excelente anti-biofouling, LOIS afișează cu greu fluorescență.Pentru a-și confirma proprietățile anti-biofouling și anti-infectie, LOIS a fost aplicat pe suprafața implanturilor ortopedice pentru sinteza osoasă (plăci și șuruburi) și plasat într-un model de fractură de iepure.Înainte de implantare, implantul ortopedic gol și LOIS au fost incubate într-o suspensie bacteriană timp de 12 ore.Pre-incubarea asigură că se formează un biofilm pe suprafața implantului expus pentru comparație.Figura 1C prezintă o fotografie a locului fracturii la 4 săptămâni după implantare.În stânga, un iepure cu un implant ortopedic gol a prezentat un nivel sever de inflamație datorită formării unui biofilm pe suprafața implantului.Rezultatul opus a fost observat la iepurii implantați cu LOIS, adică țesuturile din jur de LOIS nu au prezentat nici semne de infecție, nici semne de inflamație.În plus, imaginea optică din stânga indică locul chirurgical al iepurelui cu implantul expus, indicând faptul că pe suprafața LOIS nu s-au găsit adezivi multipli prezenți pe suprafața implantului expus.Acest lucru arată că LOIS are stabilitate pe termen lung și are capacitatea de a-și menține proprietățile anti-încrustare și anti-aderență.
(A) Diagrama schematică a LOIS și implantarea acesteia într-un model de fractură femurală de iepure.(B) Imagine de microscopie cu fluorescență a biofilmului de proteine ​​și bacterii pe suprafața goală și substrat LOIS.La 4 săptămâni după implantare, (C) o imagine fotografică a locului fracturii și (D) o imagine cu raze X (evidențiată printr-un dreptunghi roșu).Fotografie prin amabilitatea: Kyomin Chae, Universitatea Yonsei.
Iepurii sterilizați, expuși, implantați negativ, au prezentat un proces normal de vindecare a oaselor, fără semne de inflamație sau infecție.Pe de altă parte, implanturile SHP pre-incubate într-o suspensie bacteriană prezintă inflamație legată de infecție pe țesuturile din jur.Acest lucru poate fi atribuit incapacității sale de a inhiba aderența bacteriană pentru o lungă perioadă de timp (Figura S2).Pentru a demonstra că LOIS nu afectează procesul de vindecare, dar inhibă posibilele infecții legate de implantare, au fost comparate imagini cu raze X ale matricei pozitive expuse și LOIS la locul fracturii (Figura 1D).Imaginea cu raze X a implantului gol pozitiv a arătat linii persistente de osteoliză, ceea ce indică faptul că osul nu a fost complet vindecat.Acest lucru sugerează că procesul de recuperare osoasă poate fi întârziat foarte mult din cauza inflamației legate de infecție.Dimpotrivă, a arătat că iepurii implantați cu LOIS s-au vindecat și nu au prezentat niciun loc evident de fractură.
Pentru a dezvolta implanturi medicale cu stabilitate și funcționalitate pe termen lung (inclusiv rezistență la biofouling), au fost depuse multe eforturi.Cu toate acestea, prezența diferitelor substanțe biologice și dinamica aderenței tisulare limitează dezvoltarea metodelor lor fiabile clinic.Pentru a depăși aceste neajunsuri, am dezvoltat o structură micro/nano stratificată și o suprafață modificată chimic, care este optimizată datorită forței capilare mari și a afinității chimice pentru a menține cel mai fin lubrifiant în cea mai mare măsură.Figura 2A prezintă procesul general de fabricație a LOIS.Mai întâi, pregătiți un substrat din oțel inoxidabil de calitate medicală (SS) 304.În al doilea rând, structura micro/nano este formată pe substratul SS prin gravare chimică folosind soluție de acid fluorhidric (HF).Pentru a restabili rezistența la coroziune a SS, o soluție de acid azotic (HNO3) (31) este utilizată pentru a prelucra substratul gravat.Pasivarea îmbunătățește rezistența la coroziune a substratului SS și încetinește semnificativ procesul de coroziune, ceea ce poate reduce performanța generală a LOIS.Apoi, prin formarea unui monostrat auto-asamblat (SAM) cu 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltrietoxisilan (POTS), suprafața este modificată chimic pentru a îmbunătăți interacțiunea chimică dintre suprafață și lubrifiantul neted afinitate.Modificarea suprafeței reduce semnificativ energia de suprafață a suprafeței structurate la scară micro/nano fabricată, care se potrivește cu energia de suprafață a lubrifiantului neted.Acest lucru permite lubrifiantului să fie complet umezit, formând astfel un strat de lubrifiant stabil pe suprafață.Suprafața modificată prezintă o hidrofobicitate sporită.Rezultatele arată că lubrifiantul alunecos prezintă un comportament stabil pe LOIS datorită afinității chimice mari și a forței capilare cauzate de structura micro/nano (32, 33).Au fost studiate modificările optice de pe suprafața SS după modificarea suprafeței și injecția de lubrifiant.Structura micro/nano stratificată formată pe suprafață poate provoca modificări vizuale și întuneca suprafața.Acest fenomen este atribuit efectului îmbunătățit de împrăștiere a luminii pe suprafața rugoasă, care crește reflexia difuză cauzată de mecanismul de captare a luminii (34).În plus, după ce lubrifiantul este injectat, LOIS devine mai închis.Stratul de lubrifiere face ca mai puțină lumină să fie reflectată de substrat, întunecând astfel LOIS.Pentru a optimiza microstructura/nanostructura pentru a arăta cel mai mic unghi de alunecare (SA) pentru a obține performanța anti-biofouling, au fost utilizate microscopia electronică de scanare (SEM) și perechi atomice pentru a efectua diferiți timpi de gravare HF (0, 3)., 15 și 60 de minute) Microscop de forță (AFM) (Figura 2B).Imaginile SEM și AFM arată că, după un timp scurt de gravare (3 minute de gravare), substratul gol a format rugozitate neuniformă la scară nanometrică.Rugozitatea suprafeței se modifică odată cu timpul de gravare (Figura S3).Curba care variază în timp arată că rugozitatea suprafeței continuă să crească și atinge un vârf la 15 minute de gravare, iar apoi se observă doar o ușoară scădere a valorii rugozității la 30 de minute de gravare.În acest moment, rugozitatea la nivel nano este gravată, în timp ce rugozitatea la nivel micro se dezvoltă viguros, făcând schimbarea rugozității mai stabilă.După gravare mai mult de 30 de minute, se observă o creștere suplimentară a rugozității, care este explicată în detaliu după cum urmează: SS este compus din oțel, aliat cu elemente inclusiv fier, crom, nichel, molibden și multe alte elemente.Printre aceste elemente, fierul, cromul și molibdenul joacă un rol important în formarea rugozității la scară micron/nano pe SS prin gravarea HF.În stadiile incipiente ale coroziunii, fierul și cromul sunt corodate în principal, deoarece molibdenul are o rezistență la coroziune mai mare decât molibdenul.Pe măsură ce gravarea progresează, soluția de gravare ajunge la suprasaturare locală, formând fluoruri și oxizi cauzate de gravare.Fluorul și oxidul precipită și în cele din urmă se redepun pe suprafață, formând o rugozitate a suprafeței în intervalul microni/nano (31).Această rugozitate la nivel micro/nano joacă un rol important în proprietățile de auto-vindecare ale LOIS.Suprafața cu scară dublă produce un efect sinergic, crescând foarte mult forța capilară.Acest fenomen permite lubrifiantului să pătrundă stabil în suprafață și contribuie la proprietățile de auto-vindecare (35).Formarea rugozității depinde de timpul de gravare.Sub 10 minute de gravare, suprafața conține doar rugozitate la scară nanometrică, care nu este suficientă pentru a reține suficient lubrifiant pentru a avea rezistență la biofouling (36).Pe de altă parte, dacă timpul de gravare depășește 30 de minute, rugozitatea la scară nanometrică formată prin redepunerea fierului și cromului va dispărea și doar rugozitatea la scară micro va rămâne datorită molibdenului.Suprafața supragravată nu are rugozitate la scară nanometrică și pierde efectul sinergic al rugozității în două etape, care afectează negativ caracteristicile de auto-vindecare ale LOIS.Măsurătorile SA au fost efectuate pe substraturi cu timpi de gravare diferiți pentru a dovedi performanța antifouling.Au fost selectate diferite tipuri de lichide pe baza vâscozității și a energiei de suprafață, inclusiv apă deionizată (DI), sânge, etilen glicol (EG), etanol (EtOH) și hexadecan (HD) (Figura S4).Modelul de gravare care variază în timp arată că pentru diferite lichide cu energii de suprafață și vâscozități diferite, SA de LOIS după 15 minute de gravare este cel mai scăzut.Prin urmare, LOIS este optimizat pentru a grava timp de 15 minute pentru a forma rugozitate la scară micronică și nanometrică, care este potrivită pentru menținerea eficientă a durabilității lubrifiantului și a proprietăților excelente antifouling.
(A) Diagrama schematică a procesului de fabricație în patru etape a LOIS.Insertul arată SAM-ul format pe substrat.(B) Imagini SEM și AFM, utilizate pentru a optimiza structura micro/nano a substratului în diferiți timpi de gravare.Spectrele de spectroscopie fotoelectronică cu raze X (XPS) ale (C) Cr2p și (D) F1s după pasivarea suprafeței și acoperirea SAM.au, unitate arbitrară.(E) Imagini reprezentative ale picăturilor de apă pe substraturi goale, gravate, SHP și LOIS.(F) Măsurarea unghiului de contact (CA) și SA a lichidelor cu tensiuni de suprafață diferite pe SHP și LOIS.Datele sunt exprimate ca medie ± SD.
Apoi, pentru a confirma modificarea proprietăților chimice ale suprafeței, a fost utilizată spectroscopia fotoelectronului cu raze X (XPS) pentru a studia modificarea compoziției chimice a suprafeței substratului după fiecare acoperire de suprafață.Figura 2C prezintă rezultatele măsurătorii XPS ale suprafeței gravate cu HF și ale suprafeței tratate cu HNO3.Cele două vârfuri principale la 587,3 și 577,7 eV pot fi atribuite legăturii Cr-O existente în stratul de oxid de crom, care este principala diferență față de suprafața gravată cu HF.Acest lucru se datorează în principal consumului de fier și fluorură de crom la suprafață de către HNO3.Gravarea pe bază de HNO3 permite cromului să formeze un strat de oxid pasiv pe suprafață, ceea ce face ca SS gravat să fie din nou rezistent la coroziune.În Figura 2D, spectrele XPS au fost obținute pentru a confirma că silanul pe bază de fluorocarbon s-a format pe suprafață după acoperirea SAM, care are o rezistență extrem de ridicată la lichide chiar și pentru EG, sânge și EtOH.Acoperirea SAM este completată prin reacția grupărilor funcționale silan cu grupări hidroxil formate prin tratarea cu plasmă.Ca rezultat, a fost observată o creștere semnificativă a vârfurilor CF2 și CF3.Energia de legare între 286 și 296 eV indică faptul că modificarea chimică a fost finalizată cu succes de acoperirea SAM.SHP prezintă vârfuri CF2 (290,1 eV) și CF3 (293,3 eV) relativ mari, care sunt cauzate de silanul pe bază de fluorocarbon format la suprafață.Figura 2E prezintă imagini optice reprezentative ale măsurătorilor unghiului de contact (CA) pentru diferite grupuri de apă deionizată în contact cu SHP și LOIS goale, gravate.Aceste imagini arată că suprafața gravată devine hidrofilă datorită structurii micro/nano formate prin gravare chimică, astfel încât apa deionizată este absorbită în structură.Cu toate acestea, atunci când substratul este acoperit cu SAM, substratul prezintă o rezistență puternică la apă, astfel încât se formează o suprafață SHP și aria de contact dintre apă și suprafață este mică.În cele din urmă, a fost observată o scădere a CA în LOIS, care poate fi atribuită pătrunderii lubrifiantului în microstructură, crescând astfel zona de contact.Pentru a demonstra că suprafața are proprietăți excelente de respingere la lichide și neadezive, LOIS a fost comparat cu substratul SHP prin măsurarea CA și SA folosind diferite lichide (Figura 2F).Au fost selectate diferite tipuri de lichide pe baza vâscozității și a energiei de suprafață, inclusiv apă deionizată, sânge, EG, EtOH și HD (Figura S4).Rezultatele măsurătorilor CA arată că atunci când CA tinde spre HD, valoarea de reducere a CA, unde CA are cea mai mică energie de suprafață.În plus, LOIS-ul CA globală este scăzut.Cu toate acestea, măsurarea SA arată un fenomen complet diferit.Cu excepția apei ionizate, toate lichidele aderă la substratul SHP fără să alunece.Pe de altă parte, LOIS arată un SA foarte scăzut, în care atunci când tot lichidul este înclinat la un unghi mai mic de 10° până la 15°, tot lichidul se va rostogoli.Acest lucru arată puternic că non-adezivitatea LOIS este mai bună decât cea a suprafeței SHP.În plus, acoperirile LOIS sunt aplicate și pe diferite tipuri de materiale, inclusiv titan (Ti), polifenilsulfonă (PPSU), polioximetilenă (POM), polieter etercetonă (PEEK) și polimeri bioabsorbabili (PLGA). Sunt materiale ortopedice implantabile (Figura). S5)).Imaginile secvențiale ale picăturilor de pe materialul tratat cu LOIS arată că proprietățile anti-biofouling ale LOIS sunt aceleași pe toate substraturile.În plus, rezultatele măsurătorilor CA și SA arată că proprietățile neadezive ale LOIS pot fi aplicate altor materiale.
Pentru a confirma proprietățile anti-fouling ale LOIS, diferite tipuri de substraturi (inclusiv goale, gravate, SHP și LOIS) au fost incubate cu Pseudomonas aeruginosa și MRSA.Aceste două bacterii au fost selectate ca bacterii reprezentative de spital, ceea ce poate duce la formarea de biofilme, conducând la SSI (37).Figura 3 (A și B) prezintă imaginile de la microscopul cu fluorescență și rezultatele măsurării unității formatoare de colonii (CFU) ale substraturilor incubate în suspensia bacteriană pe termen scurt (12 ore) și, respectiv, pe termen lung (72 ore).Într-o perioadă scurtă de timp, bacteriile vor forma ciorchini și vor crește în dimensiune, acoperindu-se cu substanțe asemănătoare mucusului și împiedicând îndepărtarea lor.Cu toate acestea, în timpul incubației de 72 de ore, bacteriile se vor maturiza și vor deveni ușor de dispersat pentru a forma mai multe colonii sau ciorchini.Prin urmare, se poate considera că incubarea de 72 de ore este pe termen lung și este timpul potrivit de incubare pentru a forma un biofilm puternic la suprafață (38).Într-o perioadă scurtă de timp, suprafața gravată și suprafața SHP au prezentat aderență bacteriană, care a fost redusă cu aproximativ 25% până la 50% în comparație cu substratul gol.Cu toate acestea, datorită performanței și stabilității sale excelente anti-biofouling, LOIS nu a arătat aderență de biofilm bacterian pe termen scurt și lung.Diagrama schematică (Figura 3C) descrie explicația mecanismului de încrustare antibiologică a soluției de gravare, SHP și LOIS.Presupunerea este că substratul gravat cu proprietăți hidrofile va avea o suprafață mai mare decât substratul gol.Prin urmare, va avea loc mai multă aderență bacteriană pe substratul gravat.Cu toate acestea, în comparație cu substratul gol, substratul gravat are mult mai puțin biofilm format la suprafață.Acest lucru se datorează faptului că moleculele de apă se leagă ferm de suprafața hidrofilă și acționează ca un lubrifiant pentru apă, interferând astfel cu aderența bacteriilor pe termen scurt (39).Cu toate acestea, stratul de molecule de apă este foarte subțire și solubil în suspensii bacteriene.Prin urmare, stratul molecular de apă dispare pentru o lungă perioadă de timp, ceea ce duce la aderența și proliferarea bacteriilor extinse.Pentru SHP, datorită proprietăților sale de neumezire pe termen scurt, aderența bacteriană este inhibată.Aderența bacteriană redusă poate fi atribuită pungilor de aer prinse în structura stratificată și energiei de suprafață mai scăzute, reducând astfel contactul dintre suspensia bacteriană și suprafață.Cu toate acestea, s-a observat o aderență bacteriană extinsă în SHP, deoarece și-a pierdut proprietățile anti-fouling pentru o lungă perioadă de timp.Acest lucru se datorează în principal dispariției pungilor de aer din cauza presiunii hidrostatice și dizolvării aerului în apă.Acest lucru se datorează în principal dispariției pungilor de aer din cauza dizolvării și structurii stratificate care asigură o suprafață mai mare pentru aderență (27, 40).Spre deosebire de aceste două substraturi care au un efect important asupra stabilității pe termen lung, lubrifiantul lubrifiant conținut în LOIS este injectat în structura micro/nano și nu va dispărea nici pe termen lung.Lubrifianții umpluți cu micro/nano structuri sunt foarte stabili și sunt puternic atrași de suprafață datorită afinității lor chimice mari, prevenind astfel aderența bacteriilor pentru o lungă perioadă de timp.Figura S6 prezintă o imagine de reflexie la microscop confocal a unui substrat infuzat cu lubrifiant scufundat în soluție salină tamponată cu fosfat (PBS).Imaginile continue arată că, chiar și după 120 de ore de scuturare ușoară (120 rpm), stratul de lubrifiant de pe LOIS rămâne neschimbat, indicând stabilitate pe termen lung în condiții de curgere.Acest lucru se datorează afinității chimice mari dintre acoperirea SAM pe bază de fluor și lubrifiantul pe bază de perfluorocarbon, astfel încât se poate forma un strat de lubrifiant stabil.Prin urmare, performanța antifouling este menținută.În plus, substratul a fost testat împotriva proteinelor reprezentative (albumină și fibrinogen), care se află în plasmă, a celulelor strâns legate de funcția imună (macrofage și fibroblaste) și a celor legate de formarea osului.Conținutul de calciu este foarte mare.(Figura 3D, 1 și 2 și Figura S7) (41, 42).În plus, imaginile cu microscopul cu fluorescență ale testului de aderență pentru fibrinogen, albumină și calciu au arătat caracteristici de aderență diferite ale fiecărui grup de substrat (Figura S8).În timpul formării osoase, straturile osoase și de calciu nou formate pot înconjura implantul ortopedic, ceea ce nu numai că îngreunează îndepărtarea, dar poate provoca și vătămări neașteptate pacientului în timpul procesului de îndepărtare.Prin urmare, nivelurile scăzute de depozite de calciu pe plăcile osoase și șuruburi sunt benefice pentru chirurgia ortopedică care necesită îndepărtarea implantului.Pe baza cuantificării zonei atașate pe baza intensității fluorescenței și a numărului de celule, am confirmat că LOIS prezintă proprietăți excelente anti-biofouling pentru toate substanțele biologice în comparație cu alte substraturi.Conform rezultatelor experimentelor in vitro, LOIS anti-fouling biologic poate fi aplicat implanturilor ortopedice, care nu numai că pot inhiba infecțiile cauzate de bacteriile din biofilm, ci și pot reduce inflamația cauzată de sistemul imunitar activ al organismului.
(A) Imagini cu microscop cu fluorescență ale fiecărui grup (dezob, gravat, SHP și LOIS) incubate în suspensii de Pseudomonas aeruginosa și MRSA timp de 12 și 72 de ore.(B) Numărul de CFU aderente ale Pseudomonas aeruginosa și MRSA pe suprafața fiecărui grup.(C) Diagrama schematică a mecanismului de încrustare antibiologică a gravării pe termen scurt și lung, SHP și LOIS.(D) (1) Numărul de fibroblaste aderate la fiecare substrat și imaginile cu microscop cu fluorescență ale celulelor aderate la gol și LOIS.(2) Testul de aderență al proteinelor imuno-relevante, albuminei și calciului implicate în procesul de vindecare osoasă (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 și **** P <0,0001).ns, nu este important.
În cazul solicitărilor concentrate inevitabile, durabilitatea mecanică a fost întotdeauna principala provocare pentru aplicarea straturilor antifouling.Metodele tradiționale de gel anti-canal se bazează pe polimeri cu solubilitate scăzută în apă și fragilitate.Prin urmare, sunt de obicei susceptibili la stres mecanic în aplicațiile biomedicale.Prin urmare, acoperirile antifouling durabile din punct de vedere mecanic rămân o provocare pentru aplicații precum implanturile ortopedice (43, 44).Figura 4A(1) demonstrează cele două tipuri principale de stres aplicate implanturilor ortopedice, inclusiv zgârierea (stresul de forfecare) și compresia cu imaginea optică a implantului deteriorat produsă de forceps.De exemplu, când șurubul este strâns cu o șurubelniță sau când chirurgul ține strâns placa osoasă cu penseta și aplică forță de compresie, placa osoasă din plastic va fi deteriorată și zgâriată atât pe scara macro, cât și pe micro/nano (Figura 4A, 2) .Pentru a testa dacă LOIS fabricat poate rezista acestor daune în timpul intervenției chirurgicale plastice, a fost efectuată nanoindentarea pentru a compara duritatea substratului gol și LOIS la scara micro/nano pentru a studia proprietățile mecanice ale micro/nanostructurii Impact (Figura 4B).Diagrama schematică arată comportamentul diferit de deformare al LOIS datorită prezenței micro/nanostructurilor.A fost trasată o curbă forță-deplasare pe baza rezultatelor nanoindentației (Figura 4C).Imaginea albastră reprezintă substratul gol, care prezintă doar o ușoară deformare, așa cum se vede prin adâncimea maximă de indentare de 0,26-μm.Pe de altă parte, creșterea treptată a forței de nanoindentație și a deplasării observate în LOIS (curba roșie) poate prezenta semne de proprietăți mecanice reduse, rezultând o adâncime de nanoindentare de 1,61 μm.Acest lucru se datorează faptului că structura micro/nano prezentă în LOIS oferă un spațiu de avansare mai profund pentru vârful nanoindentorului, astfel încât deformarea acestuia este mai mare decât cea a substratului gol.Konsta-Gdoutos și colab.(45) consideră că, datorită prezenței nanostructurilor, nanodentația și micro/nano rugozitatea duc la curbe neregulate de nanoindentație.Zona umbrită corespunde curbei de deformare neregulată atribuită nanostructurii, în timp ce zona neumbrită este atribuită microstructurii.Această deformare poate deteriora microstructura/nanostructura lubrifiantului de reținere și poate afecta negativ performanța sa antifouling.Pentru a studia impactul daunelor asupra LOIS, leziunile inevitabile ale micro/nanostructurilor au fost replicate în organism în timpul intervenției chirurgicale plastice.Prin utilizarea testelor de aderență a sângelui și proteinelor, poate fi determinată stabilitatea proprietăților anti-biofouling ale LOIS după in vitro (Figura 4D).O serie de imagini optice arată deteriorarea care a avut loc în apropierea găurilor fiecărui substrat.A fost efectuat un test de aderență a sângelui pentru a demonstra efectul deteriorării mecanice asupra stratului anti-biofouling (Figura 4E).La fel ca SHP, proprietățile antifouling se pierd din cauza deteriorării, iar LOIS prezintă excelente proprietăți antifouling prin respingerea sângelui.Acest lucru se datorează faptului că, deoarece energia de suprafață este condusă de acțiunea capilară care acoperă zona deteriorată, fluxul în lubrifiantul lubrifiant microstructurat restabilește proprietățile antifouling (35).Aceeași tendință a fost observată în testul de aderență la proteine ​​folosind albumină.În zona deteriorată, aderența proteinei pe suprafața SHP este observată pe scară largă, iar prin măsurarea acoperirii acesteia, aceasta poate fi cuantificată ca jumătate din nivelul de aderență al substratului gol.Pe de altă parte, LOIS și-a menținut proprietățile anti-biofouling fără a provoca aderență (Figura 4, F și G).În plus, suprafața șurubului este adesea supusă unor solicitări mecanice puternice, cum ar fi găurirea, așa că am studiat capacitatea învelișului LOIS de a rămâne intactă pe șurub in vitro.Figura 4H prezintă imagini optice ale diferitelor șuruburi, inclusiv goale, SHP și LOIS.Dreptunghiul roșu reprezintă zona țintă în care apare un stres mecanic puternic în timpul implantării osoase.Similar cu testul de aderență a proteinei al plăcii, un microscop cu fluorescență este utilizat pentru a vizualiza aderența proteinei și pentru a măsura zona de acoperire pentru a dovedi integritatea învelișului LOIS, chiar și sub stres mecanic puternic (Figura 4, I și J).Șuruburile tratate cu LOIS prezintă o performanță excelentă antifouling și aproape nicio proteină nu aderă la suprafață.Pe de altă parte, aderența proteinelor a fost observată în șuruburile goale și șuruburile SHP, unde suprafața de acoperire a șuruburilor SHP a fost de o treime din cea a șuruburilor goale.În plus, implantul ortopedic utilizat pentru fixare trebuie să fie rezistent din punct de vedere mecanic pentru a rezista la stresul aplicat la locul fracturii, așa cum se arată în Figura 4K.Prin urmare, a fost efectuat un test de încovoiere pentru a determina efectul modificării chimice asupra proprietăților mecanice.În plus, acest lucru se face pentru a menține stresul fix de la implant.Aplicați o forță mecanică verticală până când implantul este pliat complet și se obține o curbă efort-deformare (Figura 4L, 1).Două proprietăți, inclusiv modulul Young și rezistența la încovoiere, au fost comparate între substraturile goale și LOIS ca indicatori ai rezistenței lor mecanice (Figura 4L, 2 și 3).Modulul Young indică capacitatea unui material de a rezista la schimbări mecanice.Modulul Young al fiecărui substrat este de 41,48±1,01 și, respectiv, 40,06±0,96 GPa;diferența observată este de aproximativ 3,4%.În plus, se raportează că rezistența la încovoiere, care determină duritatea materialului, este de 102,34±1,51 GPa pentru substratul gol și 96,99±0,86 GPa pentru SHP.Substratul gol este cu aproximativ 5,3% mai mare.Scăderea ușoară a proprietăților mecanice poate fi cauzată de efectul de crestătură.În efectul de crestătură, rugozitatea micro/nano poate acționa ca un set de crestături, conducând la concentrarea locală a tensiunilor și afectând proprietățile mecanice ale implantului (46).Cu toate acestea, pe baza faptului că rigiditatea osului cortical uman este raportată a fi între 7,4 și 31,6 GPa, iar modulul LOIS măsurat îl depășește pe cel al osului cortical uman (47), LOIS este suficient pentru a susține fractura și totalul acesteia. proprietățile mecanice sunt minim afectate de modificarea suprafeței.
(A) Diagrama schematică a (1) stresului mecanic aplicat implantului ortopedic în timpul operației și (2) imaginea optică a implantului ortopedic deteriorat.(B) Diagrama schematică a măsurării proprietăților nano-mecanice prin nanodentație și LOIS pe suprafața goală.(C) Curba forță-deplasare de nanoindentare a suprafeței goale și LOIS.(D) După experimente in vitro, simulați imaginile optice ale diferitelor tipuri de plăci ortopedice (zona deteriorată este evidențiată cu un dreptunghi roșu) pentru a simula stresul mecanic cauzat în timpul operației.(E) Test de aderență a sângelui și (F) test de aderență a proteinelor grupului de plăci ortopedice deteriorate.(G) Măsurați suprafața de acoperire a proteinei care aderă la placă.(H) Imagini optice ale diferitelor tipuri de șuruburi ortopedice după experimentul in vitro.(I) Test de aderență la proteine ​​pentru a studia integritatea diferitelor acoperiri.(J) Măsurați suprafața de acoperire a proteinei care aderă la șurub.(K) Mișcarea iepurelui are scopul de a genera un stres fix asupra osului fracturat.(L) (1) Rezultatele testului de îndoire și imaginile optice înainte și după îndoire.Diferența în (2) modulul Young și (3) rezistența la încovoiere între implantul gol și SHP.Datele sunt exprimate ca medie ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 și ****P<0,0001).Fotografie prin amabilitatea: Kyomin Chae, Universitatea Yonsei.
În situații clinice, majoritatea contactului bacterian cu materialele biologice și locurile rănilor provine din biofilme mature (48).Prin urmare, Centers for Disease Control and Prevention din SUA estimează că 65% din toate infecțiile umane sunt legate de biofilme (49).În acest caz, este necesar să se furnizeze un design experimental in vivo care să asigure formarea consistentă a biofilmului pe suprafața implantului.Prin urmare, am dezvoltat un model de fractură femurală de iepure în care implanturile ortopedice au fost pre-incubate într-o suspensie bacteriană și apoi implantate în femuri de iepure pentru a studia proprietățile antifouling ale LOIS in vivo.Datorită următoarelor trei fapte importante, infecțiile bacteriene sunt induse mai degrabă prin pre-cultură decât prin injectarea directă a suspensiilor bacteriene: (i) Sistemul imunitar al iepurilor este în mod natural mai puternic decât cel al oamenilor;prin urmare, este posibilă injectarea suspensiilor bacteriene și a bacteriilor planctonice Nu are niciun efect asupra formării biofilmelor.(Ii) Bacteriile planctonice sunt mai susceptibile la antibiotice, iar antibioticele sunt de obicei folosite după operație;în cele din urmă, (iii) suspensia de bacterii planctonice poate fi diluată de fluidele corporale ale animalului (50).Prin pre-cultivarea implantului într-o suspensie bacteriană înainte de implantare, putem studia în detaliu efectele nocive ale infecției bacteriene și ale reacției cu corpuri străine (FBR) asupra procesului de vindecare a oaselor.Iepurii au fost sacrificați la 4 săptămâni de la implantare, deoarece osteointegrarea esențială pentru procesul de vindecare osoasă se va finaliza în 4 săptămâni.Apoi, implanturile au fost îndepărtate de la iepuri pentru studii în aval.Figura 5A prezintă mecanismul de proliferare al bacteriilor.Implantul ortopedic infectat este introdus în corp.Ca urmare a preincubării în suspensie bacteriană, șase din cei șase iepuri implantați cu implanturi goale au fost infectați, în timp ce niciunul dintre iepurii implantați cu implanturi tratate cu LOIS nu a fost infectat.Infecțiile bacteriene se desfășoară în trei etape, inclusiv creșterea, maturarea și dispersia (51).Mai întâi, bacteriile atașate se reproduc și cresc la suprafață, iar apoi bacteriile formează un biofilm atunci când excretă polimer extracelular (EPS), amiloid și ADN extracelular.Biofilmul nu numai că interferează cu pătrunderea antibioticelor, dar promovează și acumularea de enzime care degradează antibioticele (cum ar fi β-lactamaza) (52).În cele din urmă, biofilmul răspândește bacteriile mature în țesuturile din jur.Prin urmare, apare infecția.În plus, atunci când un corp străin intră în organism, o infecție care poate provoca un răspuns imun puternic poate provoca inflamații severe, durere și scăderea imunității.Figura 5B oferă o privire de ansamblu asupra FBR cauzată de inserarea unui implant ortopedic, mai degrabă decât răspunsul imun cauzat de o infecție bacteriană.Sistemul imunitar recunoaște implantul inserat ca un corp străin și apoi face ca celulele și țesuturile să reacționeze pentru a încapsula corpul străin (53).În primele zile ale FBR, pe suprafața implanturilor ortopedice s-a format o matrice de alimentare, care a dus la adsorbția fibrinogenului.Fibrinogenul adsorbit formează apoi o rețea de fibrină foarte densă, care promovează atașarea leucocitelor (54).Odată formată rețeaua de fibrină, va apărea o inflamație acută din cauza infiltrării neutrofilelor.În această etapă, sunt eliberate o varietate de citokine, cum ar fi factorul de necroză tumorală-α (TNF-α), interleukina-4 (IL-4) și IL-β, iar monocitele încep să se infiltreze în locul de implantare și să se diferențieze în celule gigantice.Fagul (41, 55, 56).Reducerea FBR a fost întotdeauna o provocare, deoarece FBR excesiv poate provoca inflamație acută și cronică, care poate duce la complicații fatale.Pentru a evalua impactul infecțiilor bacteriene în țesuturile din jurul implantului gol și LOIS, au fost utilizate colorații cu hematoxilină și eozină (H&E) și tricrom Masson (MT).Pentru iepurii implantați cu substraturi goale, infecțiile bacteriene severe au progresat, iar lamele de țesut H&E au arătat clar abcese și necroze cauzate de inflamație.Pe de altă parte, suprafața extrem de puternică anti-biofouling LOIS inhibă aderența bacteriană, astfel încât nu prezintă semne de infecție și reduce inflamația (Figura 5C).Rezultatele colorării MT au arătat aceeași tendință.Cu toate acestea, colorarea MT a arătat, de asemenea, edem la iepurii implantați cu LOIS, ceea ce indică faptul că recuperarea este pe cale să apară (Figura 5D).Pentru a studia gradul de răspuns imun, s-a efectuat colorarea imunohistochimică (IHC) folosind citokinele TNF-α și IL-6 legate de răspunsul imun.Un implant negativ gol care nu a fost expus la bacterii a fost comparat cu un LOIS care a fost expus la bacterii, dar nu a fost infectat pentru a studia procesul de vindecare în absența infecției bacteriene.Figura 5E prezintă o imagine optică a unei lame IHC care exprimă TNF-α.Zona maro reprezintă răspunsul imun, indicând faptul că răspunsul imun în LOIS este ușor redus.În plus, expresia IL-6 în LOIS a fost semnificativ mai mică decât expresia negativă a sterilului gol (Figura 5F).Expresia citokinei a fost cuantificată prin măsurarea zonei de colorare a anticorpilor corespunzătoare citokinei (Figura 5G).Comparativ cu iepurii expuși la implanturi negative, nivelurile de expresie ale iepurilor implantați cu LOIS au fost mai scăzute, arătând o diferență semnificativă.Scăderea expresiei citokinelor indică faptul că proprietățile anti-fouling stabile pe termen lung ale LOIS nu sunt legate doar de inhibarea infecțiilor bacteriene, ci și de scăderea FBR, care este indusă de macrofagele care aderă la substrat (53, 57, 58).Prin urmare, răspunsul imun redus din cauza proprietăților de evaziune imună ale LOIS poate rezolva efectele secundare după implantare, cum ar fi răspunsul imunitar excesiv după intervenția chirurgicală plastică.
(A) O diagramă schematică a mecanismului de formare și răspândire a biofilmului pe suprafața unui implant ortopedic infectat.eADN, ADN extracelular.(B) Diagrama schematică a răspunsului imun după inserarea implantului ortopedic.(C) colorarea H&E și (D) colorarea MT a țesuturilor înconjurătoare ale implanturilor ortopedice cu pozitiv și LOIS.IHC ale citokinelor legate de imun (E) TNF-α și (F) IL-6 sunt imagini colorate ale iepurilor negativi și implantați cu LOIS.(G) Cuantificarea expresiei citokinelor prin măsurarea acoperirii zonei (** P <0,01).
Biocompatibilitatea LOIS și efectul său asupra procesului de vindecare osoasă au fost examinate in vivo folosind imagistica de diagnostic [radiografie și tomografie microcomputerizată (CT)] și IHC cu osteoclaste.Figura 6A prezintă procesul de vindecare osoasă care implică trei etape diferite: inflamație, reparare și remodelare.Când apare o fractură, celulele inflamatorii și fibroblastele vor pătrunde în osul fracturat și vor începe să crească în țesutul vascular.În timpul fazei de reparare, creșterea în interior a țesutului vascular se răspândește în apropierea locului fracturii.Țesutul vascular furnizează nutrienți pentru formarea de os nou, care se numește calus.Etapa finală a procesului de vindecare osoasă este etapa de remodelare, în care dimensiunea calusului este redusă la dimensiunea osului normal cu ajutorul unei creșteri a nivelului de osteoclaste activate (59).Reconstrucția tridimensională (3D) a locului fracturii a fost efectuată folosind scanări micro-CT pentru a observa diferențele în nivelul de formare a calusului în fiecare grup.Observați secțiunea transversală a femurului pentru a observa grosimea calusului din jurul osului fracturat (Figura 6, B și C).Raze X au fost, de asemenea, folosite pentru a examina locurile de fractură ale tuturor grupurilor în fiecare săptămână pentru a observa diferitele procese de regenerare osoasă din fiecare grup (Figura S9).Calusul și oasele mature sunt prezentate în albastru/verde și, respectiv, fildeș.Majoritatea țesuturilor moi sunt filtrate cu un prag prestabilit.Nud pozitiv și SHP au confirmat formarea unei cantități mici de calus în jurul locului fracturii.Pe de altă parte, negativul expus al LOIS și locul fracturii sunt înconjurate de calus gros.Imaginile micro-CT au arătat că formarea calusului a fost împiedicată de infecția bacteriană și inflamația legată de infecție.Acest lucru se datorează faptului că sistemul imunitar prioritizează vindecarea leziunilor septice cauzate de inflamația legată de infecție, mai degrabă decât recuperarea osoasă (60).Colorarea IHC și a fosfatazei acide rezistente la tartrat (TRAP) au fost efectuate pentru a observa activitatea osteoclastelor și resorbția osoasă (Figura 6D) (61).Doar câteva osteoclaste activate colorate în violet au fost găsite în pozitive goale și SHP.Pe de altă parte, multe osteoclaste activate au fost observate în apropierea oaselor goale pozitive și mature ale LOIS.Acest fenomen indică faptul că, în prezența osteoclastelor, calusul din jurul locului fracturii suferă un proces violent de remodelare (62).Volumul osos și zona de expresie a osteoclastelor a calusului au fost măsurate pentru a compara nivelul de formare a calusului în jurul locului de fractură în toate grupurile, astfel încât să se cuantifice scanarea micro-CT și rezultatele IHC (Figura 6E, 1 și 2).După cum era de așteptat, negativele goale și formarea calusului în LOIS au fost semnificativ mai mari decât în ​​celelalte grupuri, ceea ce indică faptul că a avut loc o remodelare osoasă pozitivă (63).Figura S10 prezintă imaginea optică a locului chirurgical, rezultatul colorării MT a țesutului colectat lângă șurub și rezultatul colorării TRAP care evidențiază interfața șurub-os.În substratul gol, s-a observat formare puternică de calus și fibroză, în timp ce implantul tratat cu LOIS a arătat o suprafață relativ neaderată.În mod similar, în comparație cu negativele goale, a fost observată o fibroză mai mică la iepurii implantați cu LOIS, așa cum este indicat de săgețile albe.În plus, edemul ferm (săgeată albastră) poate fi atribuit proprietăților de evaziune imună ale LOIS, reducând astfel inflamația severă.Suprafața antiaderentă din jurul implantului și fibroza redusă sugerează că procesul de îndepărtare este mai ușor, ceea ce duce de obicei la alte fracturi sau inflamații.Procesul de vindecare osoasă după îndepărtarea șurubului a fost evaluat prin activitatea osteoclastelor la interfața șurub-os.Atât osul gol, cât și interfața implantului LOIS au absorbit niveluri similare de osteoclaste pentru o vindecare ulterioară a osului, ceea ce indică faptul că învelișul LOIS nu are niciun efect negativ asupra vindecării osoase sau a răspunsului imun.Pentru a confirma că modificarea suprafeței efectuată pe LOIS nu interferează cu procesul de vindecare a osului, examinarea cu raze X a fost utilizată pentru a compara vindecarea osoasă a iepurilor cu ioni negativi expuși și 6 săptămâni de implantare LOIS (Figura 6F).Rezultatele au arătat că, în comparație cu grupul nud pozitiv neinfectat, LOIS a arătat același grad de vindecare osoasă și nu au existat semne evidente de fractură (linie de osteoliză continuă) în ambele grupuri.
(A) Diagrama schematică a procesului de vindecare a osului după fractură.(B) Diferența în gradul de formare a calusului fiecărui grup de suprafață și (C) imaginea în secțiune transversală a locului de fractură.(D) Colorare TRAP pentru a vizualiza activitatea osteoclastelor și resorbția osoasă.Pe baza activității TRAP, formarea calusului extern al osului cortical a fost analizată cantitativ prin (E) (1) micro-CT și (2) activitatea osteoclastelor.(F) La 6 săptămâni după implantare, imagini cu raze X ale osului fracturat al negativului expus (evidențiate cu dreptunghiul roșu întrerupt) și LOIS (evidențiat cu dreptunghiul albastru întrerupt).Analiza statistică a fost efectuată prin analiză unidirecțională a varianței (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Pe scurt, LOIS oferă un nou tip de strategie de infecție antibacteriană și acoperire de evadare imunitară pentru implanturile ortopedice.Implanturile ortopedice convenționale cu funcționalizare SHP prezintă proprietăți anti-biofouling pe termen scurt, dar nu își pot menține proprietățile pentru o lungă perioadă de timp.Superhidrofobicitatea substratului prinde bulele de aer între bacterii și substrat, formând astfel pungi de aer, prevenind astfel infecția bacteriană.Cu toate acestea, datorită difuziei aerului, aceste pungi de aer sunt ușor de îndepărtat.Pe de altă parte, LOIS și-a dovedit bine capacitatea de a preveni infecțiile legate de biofilm.Prin urmare, datorită proprietăților anti-respingere ale stratului de lubrifiant injectat în suprafața stratificată micro/nanostructură, inflamația legată de infecție poate fi prevenită.Sunt utilizate diferite metode de caracterizare, inclusiv măsurători SEM, AFM, XPS și CA, pentru a optimiza condițiile de fabricație LOIS.În plus, LOIS poate fi aplicat și la diferite materiale biologice utilizate în mod obișnuit în echipamentele de fixare ortopedică, cum ar fi PLGA, Ti, PE, POM și PPSU.Apoi, LOIS a fost testat in vitro pentru a-și dovedi proprietățile anti-biofouling împotriva bacteriilor și substanțelor biologice legate de răspunsul imun.Rezultatele arată că are efecte excelente antibacteriene și anti-biofouling în comparație cu implantul gol.În plus, LOIS arată rezistență mecanică chiar și după aplicarea unei solicitări mecanice, ceea ce este inevitabil în chirurgia plastică.Datorită proprietăților de auto-vindecare ale lubrifiantului de pe suprafața micro/nanostructurii, LOIS și-a menținut cu succes proprietățile anti-încrustare biologică.Pentru a studia biocompatibilitatea și proprietățile antibacteriene ale LOIS in vivo, LOIS a fost implantat în femurul de iepure timp de 4 săptămâni.Nu a fost observată nicio infecție bacteriană la iepurii implantați cu LOIS.În plus, utilizarea IHC a demonstrat un nivel redus de răspuns imun local, indicând faptul că LOIS nu inhibă procesul de vindecare a oaselor.LOIS prezintă proprietăți excelente antibacteriene și de evaziune imună și s-a dovedit că previne eficient formarea de biofilm înainte și în timpul intervențiilor chirurgicale ortopedice, în special pentru sinteza osoasă.Prin utilizarea unui model de fractură femurală inflamatorie a măduvei osoase de iepure, a fost studiat în profunzime efectul infecțiilor legate de biofilm asupra procesului de vindecare osoasă indus de implanturile pre-incubate.Ca studiu viitor, este necesar un nou model in vivo pentru a studia posibilele infecții după implantare pentru a înțelege pe deplin și a preveni infecțiile legate de biofilm pe parcursul întregului proces de vindecare.În plus, osteoinducția este încă o provocare nerezolvată în integrarea cu LOIS.Sunt necesare cercetări suplimentare pentru a combina aderența selectivă a celulelor osteoinductoare sau medicina regenerativă cu LOIS pentru a depăși provocarea.În general, LOIS reprezintă o acoperire promițătoare pentru implant ortopedic, cu robustețe mecanică și excelente proprietăți anti-biofouling, care pot reduce SSI și efectele secundare ale sistemului imunitar.
Spălați substratul 304 SS de 15 mm x 15 mm x 1 mm (Dong Kang M-Tech Co., Coreea) în acetonă, EtOH și apă DI timp de 15 minute pentru a îndepărta contaminanții.Pentru a forma o structură micro/nano-nivel pe suprafață, substratul curățat este scufundat într-o soluție HF 48% până la 51% (DUKSAN Corp., Coreea de Sud) la 50°C.Timpul de gravare variază de la 0 la 60 de minute.Apoi, substratul gravat a fost curățat cu apă deionizată și plasat într-o soluție 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) la 50°C timp de 30 de minute pentru a forma un strat de pasivare de oxid de crom pe suprafață.După pasivare, substratul este spălat cu apă deionizată și uscat pentru a obține un substrat cu o structură stratificată.Apoi, substratul a fost expus la plasmă de oxigen (100 W, 3 minute) și imediat scufundat într-o soluție de 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Germania) în toluen la temperatura camerei timp de 12 ore.Apoi, substratul acoperit cu POTS a fost curățat cu EtOH și a fost recoapt la 150°C timp de 2 ore pentru a obține un POTS SAM dens.După acoperirea SAM, pe substrat s-a format un strat de lubrifiant prin aplicarea unui lubrifiant perfluoropolieter (Krytox 101; DuPont, USA) cu un volum de încărcare de 20 μm/cm 2. Înainte de utilizare, se filtrează lubrifiantul printr-un filtru de 0,2 microni.Îndepărtați excesul de lubrifiant prin înclinarea la un unghi de 45° timp de 15 minute.Aceeași procedură de fabricație a fost utilizată pentru implanturile ortopedice din 304 SS (placă de blocare și șurub de blocare cortical; Dong Kang M-Tech Co., Coreea).Toate implanturile ortopedice sunt proiectate pentru a se potrivi cu geometria femurului iepurelui.
Morfologia suprafeței substratului și a implanturilor ortopedice a fost inspectată prin emisie de câmp SEM (Inspect F50, FEI, SUA) și AFM (XE-100, Park Systems, Coreea de Sud).Rugozitatea suprafeței (Ra, Rq) se măsoară prin înmulțirea ariei de 20 μm cu 20 μm (n=4).Pentru analiza compoziției chimice a suprafeței a fost utilizat un sistem XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japonia) echipat cu o sursă de raze X Al Kα cu o dimensiune a spotului de 100μm2.Un sistem de măsurare CA echipat cu o cameră de captare dinamică a imaginii (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Coreea de Sud) a fost utilizat pentru măsurarea CA și SA lichide.Pentru fiecare măsurătoare, 6 până la 10 μl de picături (apă deionizată, sânge de cal, EG, etanol 30% și HD) sunt plasate pe suprafață pentru a măsura CA.Când unghiul de înclinare al substratului crește cu o viteză de 2°/s (n = 4), SA se măsoară când picătura cade.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] și MRSA (ATCC 25923) au fost achiziționate de la ATCC (Manassas, Virginia, SUA), iar cultura stoc a fost menținută la -80°C.Înainte de utilizare, cultura congelată a fost incubată în bulion de soia dezghețat cu tripsină (Komed, Coreea) la 37°C timp de 18 ore și apoi transferată de două ori pentru a o activa.După incubare, cultura a fost centrifugată la 10.000 rpm timp de 10 minute la 4°C şi spălată de două ori cu o soluţie de PBS (pH 7,3).Cultura centrifugata este apoi subcultivată pe plăci de agar cu sânge (BAP).MRSA și Pseudomonas aeruginosa au fost preparate peste noapte și cultivate în bulion Luria-Bertani.Concentrația de Pseudomonas aeruginosa și MRSA în inocul a fost determinată cantitativ de CFU a suspensiei în diluții în serie pe agar.Apoi, ajustați concentrația bacteriană la 0,5 McFarland standard, care este echivalent cu 108 CFU/ml.Apoi diluați suspensia bacteriană de lucru de 100 de ori la 106 CFU/ml.Pentru a testa proprietățile de aderență antibacteriană, substratul a fost sterilizat la 121°C timp de 15 minute înainte de utilizare.Substratul a fost apoi transferat la 25 ml de suspensie bacteriană și incubat la 37°C cu agitare puternică (200 rpm) timp de 12 și 72 de ore.După incubare, fiecare substrat a fost îndepărtat din incubator și spălat de 3 ori cu PBS pentru a îndepărta orice bacterie plutitoare de pe suprafață.Pentru a observa biofilmul pe substrat, biofilmul a fost fixat cu metanol și colorat cu 1 ml de crimidină portocalie timp de 2 minute.Apoi a fost folosit un microscop cu fluorescență (BX51TR, Olympus, Japonia) pentru a fotografia biofilmul colorat.Pentru a cuantifica biofilmul de pe substrat, celulele atașate au fost separate de substrat prin metoda vortexului de mărgele, care a fost considerată a fi cea mai potrivită metodă pentru îndepărtarea bacteriilor atașate (n = 4).Folosind pensete sterile, îndepărtați substratul din mediul de creștere și bateți placa cu godeuri pentru a îndepărta excesul de lichid.Celulele atașate slab au fost îndepărtate prin spălare de două ori cu PBS steril.Fiecare substrat a fost apoi transferat într-o eprubetă sterilă care conține 9 ml de ser fiziologic proteic ept (PSW) 0,1% și 2 g de 20 până la 25 de sticlă sterilă (0,4 până la 0,5 mm în diametru).Apoi a fost agitat timp de 3 minute pentru a desprinde celulele din probă.După agitare în vortex, suspensia a fost diluată în serie de 10 ori cu 0,1% PSW și apoi 0,1 ml din fiecare diluție a fost inoculată pe BAP.După 24 de ore de incubare la 37°C, CFU a fost numărat manual.
Pentru celule, au fost utilizate fibroblaste de șoarece NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) și macrofage de șoarece RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC).Utilizați mediu Eagle modificat de la Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Coreea) pentru a cultiva fibroblaste de șoarece și completați cu 10% ser de vițel (S103-01, Welgene) și 1% penicilină-streptomicina (PS; LS202-02, Welgene (Welgene) Utilizați DMEM pentru a cultiva macrofagele de șoarece, suplimentat cu 10% ser bovin fetal (S001-01, Welgene) și 1% PS. Se plasează substratul într-o placă de cultură celulară cu șase godeuri și se inoculează celulele la 105 celule/cm2. Celulele au fost incubate peste noapte la 37°C și 5% CO2. Pentru colorarea celulelor, celulele au fost fixate cu 4% paraformaldehidă timp de 20 de minute și plasate în 0,5% Triton X Incubat timp de 5 minute în -100. Se scufundă substratul în tetrametilrodamină la 37°C timp de 30 de minute După procesul de incubare, se utilizează substratul cu mediu de fixare VECTASHIELD 4′,6-diamino-2-fenilindol (H -1200, Vector Laboratories, UK). , fluoresceină, fluoresceină izotiocianat-albumină (A9771, Sigma-Aldrich, Germania) și plasmă umană Fibrinogenul conjugat Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, SUA) a fost dizolvat în PBS (10 mM, pH 7,4).Concentrațiile de albumină și fibrinogen au fost de 1, respectiv 150 μg/ml.După substrat Înainte de a le scufunda în soluția de proteine, clătiți-le cu PBS pentru a rehidrata suprafața.Apoi se scufundă toate substraturile într-o placă cu șase godeuri care conține soluția de proteine ​​și se incubează la 37°C timp de 30 și 90 de minute.După incubare, substratul a fost apoi îndepărtat din soluția de proteine, spălat ușor cu PBS de 3 ori și fixat cu paraformaldehidă 4% (n = 4 pentru fiecare proteină).Pentru calciu, clorură de sodiu (0,21 M) și fosfat de potasiu (3,77 mM) s-au dizolvat în apă deionizată.pH-ul soluţiei a fost ajustat la 2,0 prin adăugarea de soluţie de clorhidrat (1 M).Apoi clorură de calciu (5,62 mM) a fost dizolvată în soluţie.Prin adăugarea de 1 M tris(hidroximetil)-amino Metanul ajustează pH-ul soluției la 7,4.Se scufundă toate substraturile într-o placă cu șase godeuri umplută cu soluție de fosfat de calciu 1,5 × și se scoate din soluție după 30 de minute.Pentru colorare se amestecă 2 g Roșu Alizarin S (CI 58005) cu 100 ml apă deionizată.Apoi, utilizați hidroxid de amoniu 10% pentru a ajusta pH-ul la 4. Vopsiți substratul cu soluție de roșu de alizarină timp de 5 minute, apoi scuturați excesul de colorant și tamponați.După procesul de agitare, îndepărtați substratul.Materialul este deshidratat, apoi scufundat în acetonă timp de 5 minute, apoi scufundat într-o soluție de acetonă-xilen (1:1) timp de 5 minute și, în final, spălat cu xilen (n = 4).Se folosește microscopul cu fluorescență (Axio Imager) cu lentile obiective ×10 și ×20..A2m, Zeiss, Germania) imagini toate substraturile.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) a fost folosit pentru a cuantifica datele de aderență ale substanțelor biologice pe fiecare grup de patru zone de imagistică diferite.Convertiți toate imaginile în imagini binare cu praguri fixe pentru compararea substratului.
Un microscop confocal Zeiss LSM 700 a fost utilizat pentru a monitoriza stabilitatea stratului de lubrifiant în PBS în modul de reflexie.Proba de sticlă acoperită cu SAM pe bază de fluor cu un strat lubrifiant injectat a fost scufundată într-o soluție de PBS și testată folosind un agitator orbital (SHO-1D; Daihan Scientific, Coreea de Sud) în condiții de agitare ușoară (120 rpm).Apoi prelevați proba și monitorizați pierderea de lubrifiant prin măsurarea pierderii de lumină reflectată.Pentru a obține imagini de fluorescență în modul de reflexie, proba este expusă la un laser de 633 nm și apoi colectată, deoarece lumina va fi reflectată înapoi de la probă.Probele au fost măsurate la intervale de timp de 0, 30, 60 și 120 de ore.
Pentru a determina influența procesului de modificare a suprafeței asupra proprietăților nanomecanice ale implanturilor ortopedice, a fost utilizat un nanoindentor (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, SUA) echipat cu un vârf de diamant Berkovich în formă de piramidă cu trei fețe pentru a măsura nanoindendiona.Sarcina de vârf este de 10 mN și aria este de 100μmx 100μm.Pentru toate măsurătorile, timpul de încărcare și descărcare este de 10 s, iar timpul de menținere la sarcina maximă de indentare este de 2 s.Faceți măsurători din cinci locații diferite și luați media.Pentru a evalua performanța rezistenței mecanice sub sarcină, a fost efectuat un test de încovoiere transversal în trei puncte folosind o mașină de testare universală (Instron 5966, Instron, SUA).Substratul este comprimat cu o viteză constantă de 10 N/s cu o sarcină crescută.Programul software Bluehill Universal (n = 3) a fost utilizat pentru a calcula modulul de încovoiere și efortul maxim de compresiune.
Pentru a simula procesul de operare și deteriorarea mecanică aferentă cauzată în timpul operației, procesul de operare a fost efectuat in vitro.Femurii au fost colectați de la iepurii albi din Noua Zeelandă executați.Femurul a fost curățat și fixat în paraformaldehidă 4% timp de 1 săptămână.După cum este descris în metoda experimentului pe animale, femurul fix a fost operat chirurgical.După operație, implantul ortopedic a fost scufundat în sânge (sânge de cal, KISAN, Coreea) timp de 10 s pentru a confirma dacă au apărut aderențe de sânge după aplicarea leziunii mecanice (n = 3).
Un total de 24 de iepuri albi masculi din Noua Zeelandă (greutate 3,0 până la 3,5 kg, vârsta medie 6 luni) au fost împărțiți aleatoriu în patru grupuri: nud negativ, nud pozitiv, SHP și LOIS.Toate procedurile care implică animale au fost efectuate în conformitate cu standardele etice ale Comitetului Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor (aprobat IACUC, KOREA-2017-0159).Implantul ortopedic constă dintr-o placă de blocare cu cinci orificii (lungime 41 mm, lățime 7 mm și grosime 2 mm) și șuruburi de blocare corticale (lungime 12 mm, diametru 2,7 mm) pentru fixarea fracturii.Cu excepția plăcilor și șuruburilor utilizate în grupul negativ, toate plăcile și șuruburile au fost incubate în suspensie de MRSA (106 CFU/ml) timp de 12 ore.Grupul gol-negativ (n=6) a fost tratat cu implanturi de suprafață goală fără expunere la suspensie bacteriană, ca control negativ pentru infecție.Grupul nu pozitiv (n = 6) a fost tratat cu un implant de suprafață goală expus la bacterii ca martor pozitiv pentru infecție.Grupul SHP (n = 6) a fost tratat cu implanturi SHP expuse bacteriene.În cele din urmă, grupul LOIS a fost tratat cu implanturi LOIS expuse bacteriene (n = 6).Toate animalele sunt ținute într-o cușcă și se asigură multă hrană și apă.Înainte de operație, iepurii erau ținuți timp de 12 ore.Animalele au fost anesteziate prin injectare intramusculară de xilazină (5 mg/kg) și injectare intravenoasă cu paclitaxel (3 mg/kg) pentru inducție.După aceea, administrați 2% izofluran și 50% până la 70% oxigen medical (debit 2 L/min) prin sistemul respirator pentru a menține anestezia.Se implantează printr-o abordare directă a femurului lateral.După îndepărtarea părului și dezinfecția cu povidon-iodă a pielii, s-a făcut o incizie de aproximativ 6 cm lungime pe exteriorul femurului mijlociu stâng.Prin deschiderea spațiului dintre mușchii care acoperă femurul, femurul este complet expus.Așezați placa în fața diafului femural și fixați-o cu patru șuruburi.După fixare, utilizați o pânză de ferăstrău (1 mm grosime) pentru a crea artificial o fractură în zona dintre a doua gaură și a patra gaură.La sfârșitul operației, rana a fost spălată cu ser fiziologic și închisă cu suturi.Fiecare iepure a fost injectat subcutanat cu enrofloxacină (5 mg/kg) diluată cu o treime în ser fiziologic.La toate animalele au fost efectuate radiografii postoperatorii ale femurului (0, 7, 14, 21, 28 și 42 de zile) pentru a confirma osteotomia osului.După anestezie profundă, toate animalele au fost ucise prin KCl intravenos (2 mmol/kg) în 28 și 42 de zile.După execuție, femurul a fost scanat prin micro-CT pentru a observa și compara procesul de vindecare a osului și formarea de oase noi între cele patru grupuri.
După execuție, s-au recoltat țesuturile moi care au fost în contact direct cu implanturile ortopedice.Țesutul a fost fixat în formol tamponat neutru 10% peste noapte și apoi deshidratat în EtOH.Țesutul deshidratat a fost încorporat în parafină și secționat la o grosime de 40 μm folosind un microtom (400CS; EXAKT, Germania).Pentru a vizualiza infecția, au fost efectuate colorarea H&E și colorarea MT.Pentru a verifica răspunsul gazdei, țesutul secționat a fost incubat cu anticorp primar anti-TNF-α de iepure (AB6671, Abcam, SUA) și anti-IL-6 de iepure (AB6672; Abcam, SUA) și apoi tratat cu hrean.Oxidaza.Aplicați sistemul de colorare complex avidină-biotină (ABC) pe secțiuni conform instrucțiunilor producătorului.Pentru a apărea ca un produs de reacție maro, 3,3-diaminobenzidina a fost utilizată în toate părțile.Un scanner digital de diapozitive (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungaria) a fost utilizat pentru a vizualiza toate feliile și au fost analizate cel puțin patru substraturi din fiecare grup prin software-ul ImageJ.
Imaginile cu raze X au fost luate la toate animalele după operație și în fiecare săptămână pentru a monitoriza vindecarea fracturilor (n=6 per grup).După execuție, s-a folosit micro-CT de înaltă rezoluție pentru a calcula formarea calusului în jurul femurului după vindecare.Femurul obținut a fost curățat, fixat în paraformaldehidă 4% timp de 3 zile și deshidratat în etanol 75%.Oasele deshidratate au fost apoi scanate folosind micro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgia) pentru a genera imagini voxel 3D (2240×2240 pixeli) ale probei osoase.Utilizați filtrul de 1,0 mm Al pentru a reduce zgomotul semnalului și aplicați rezoluție înaltă tuturor scanărilor (E = 133 kVp, I = 60 μA, timp de integrare = 500 ms).Software-ul Nrecon (versiunea 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgia) a fost utilizat pentru a genera un volum 3D al probei scanate din proiecția laterală 2D achiziționată.Pentru analiză, imaginea reconstruită 3D este împărțită în cuburi de 10 mm × 10 mm × 10 mm în funcție de locul fracturii.Calculați calusul din afara osului cortical.Software-ul DataViewer (versiunea 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgia) a fost folosit pentru a redirecționa digital volumul osos scanat, iar software-ul CT-Analyzer (versiunea 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgia) a fost folosit pentru analiză.Coeficienții relativi de absorbție de raze X în osul matur și calusul se disting prin densitatea lor, iar apoi volumul calusului este cuantificat (n = 4).Pentru a confirma că biocompatibilitatea LOIS nu întârzie procesul de vindecare a oaselor, au fost efectuate analize suplimentare cu raze X și micro-CT la doi iepuri: grupul nud-negativ și LOIS.Ambele grupuri au fost executate în a 6-a săptămână.
Femurii de la animalele sacrificate au fost colectate și fixate în paraformaldehidă 4% timp de 3 zile.Implantul ortopedic este apoi îndepărtat cu grijă din femur.Femurul a fost decalcificat timp de 21 de zile utilizând 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Apoi femurul decalcificat a fost scufundat în EtOH pentru a se deshidrata.Femurul deshidratat a fost îndepărtat în xilen și încorporat în parafină.Apoi proba a fost tăiată cu un microtom rotativ automat (Leica RM2255, Leica Biosystems, Germania) cu o grosime de 3 μm.Pentru colorarea TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Germania), probele secţionate au fost deparafinizate, rehidratate şi incubate în reactiv TRAP la 37°C timp de 1 oră.Imaginile au fost achiziționate folosind un scanner de diapozitive (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungaria) și cuantificate prin măsurarea zonei de acoperire a zonei colorate.În fiecare experiment, cel puțin patru substraturi din fiecare grup au fost analizate prin software-ul ImageJ.
Analiza semnificației statistice a fost efectuată utilizând GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., SUA).Testul t nepereche și analiza unidirecțională a varianței (ANOVA) au fost utilizate pentru a testa diferențele dintre grupurile de evaluare.Nivelul de semnificație este indicat în figură după cum urmează: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 și ****P<0,0001;NS, nicio diferență semnificativă.
Pentru materiale suplimentare pentru acest articol, vă rugăm să consultați http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Acesta este un articol cu ​​acces deschis distribuit în condițiile Licenței Creative Commons Atribuire-Non-Comercial, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea pe orice mediu, atâta timp cât utilizarea nu este în scop comercial și se presupune că originalul munca este corecta.Referinţă.
Notă: Vă cerem doar să furnizați o adresă de e-mail, astfel încât persoana pe care o recomandați paginii să știe că doriți ca ea să vadă e-mailul și că e-mailul nu este spam.Nu vom captura nicio adresă de e-mail.
Această întrebare este folosită pentru a testa dacă sunteți un vizitator uman și pentru a preveni trimiterile automate de spam.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Acoperirile antibacteriene și de evacuare imunitară ale implanturilor ortopedice pot reduce infecțiile și răspunsurile imune cauzate de infecții.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Acoperirile antibacteriene și de evacuare imunitară ale implanturilor ortopedice pot reduce infecțiile și răspunsurile imune cauzate de infecții.
©2021 Asociația Americană pentru Avansarea Științei.toate drepturile rezervate.AAAS este partener al HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef și COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.