За пациентите кои се подложени на операција на ортопедски имплант, бактериските инфекции и имунолошките реакции предизвикани од инфекции отсекогаш биле ризици опасни по живот.Конвенционалните биолошки материјали се подложни на биолошка контаминација, што предизвикува бактерии да навлезат во повредената област и да предизвикаат постоперативна инфекција.Затоа, постои итна потреба да се развијат антиинфективни и имунолошки облоги за бегство за ортопедски импланти.Овде, развивме напредна технологија за модификација на површината за ортопедски импланти наречена подмачкана ортопедска имплантна површина (LOIS), која е инспирирана од мазната површина на стомните со стомни растенија.LOIS има долготрајна и силна течноодбивност на различни течности и биолошки супстанции (вклучувајќи клетки, протеини, калциум и бактерии).Дополнително, ја потврдивме механичката издржливост против гребнатинки и силата на фиксирање со симулирање на неизбежното оштетување за време на ин витро операцијата.Моделот на инфламаторна фрактура на коскена срцевина на зајакот беше искористен за темелно проучување на антибиолошкото скалирање и антиинфективната способност на LOIS.Замислуваме дека LOIS, кој има својства против бионасипување и механичка издржливост, е чекор напред во ортопедската хирургија без инфекции.
Денес, поради целокупното стареење, бројот на пациенти кои страдаат од ортопедски заболувања (како што се фрактури на постари лица, дегенеративни заболувања на зглобовите и остеопороза) е значително зголемен (1, 2).Затоа, медицинските установи придаваат големо значење на ортопедската хирургија, вклучувајќи ортопедски импланти на завртки, плочи, нокти и вештачки зглобови (3, 4).Сепак, забележано е дека традиционалните ортопедски импланти се подложни на бактериска адхезија и формирање на биофилм, што може да предизвика инфекција на хируршката локација (SSI) по операцијата (5, 6).Откако биофилмот ќе се формира на површината на ортопедскиот имплант, отстранувањето на биофилмот станува исклучително тешко дури и со употреба на големи дози на антибиотици.Затоа, обично доведува до тешки постоперативни инфекции (7, 8).Поради горенаведените проблеми, третманот на заразените импланти треба да вклучува повторна операција, вклучувајќи отстранување на сите импланти и околните ткива;затоа, пациентот ќе претрпи силна болка и некои ризици (9, 10).
За да се решат некои од овие проблеми, развиени се ортопедски импланти кои се излачуваат со лекови за да се спречи инфекцијата со елиминирање на бактериите прикачени на површината (11, 12).Сепак, стратегијата сè уште покажува неколку ограничувања.Пријавено е дека долготрајната имплантација на импланти кои се излачуваат со лекови предизвика оштетување на околните ткива и предизвика воспаление, што може да доведе до некроза (13, 14).Дополнително, органските растворувачи што може да постојат по процесот на производство на ортопедски импланти кои се леат со лекови, кои се строго забранети од страна на Управата за храна и лекови на САД, бараат дополнителни чекори за прочистување за да се исполнат нејзините стандарди (15).Имплантите кои се елутираат со лекови се предизвик за контролирано ослободување на лекови, и поради нивното ограничено оптоварување со лекови, долгорочната примена на лекот не е изводлива (16).
Друга вообичаена стратегија е да се обложи имплантот со полимер против ѓубре за да се спречи биолошката материја и бактериите да се залепат на површината (17).На пример, цвитерионските полимери привлекоа внимание поради нивните нелепливи својства кога се во контакт со плазма протеините, клетките и бактериите.Сепак, тој има некои ограничувања поврзани со долготрајна стабилност и механичка издржливост, кои ја попречуваат неговата практична примена во ортопедските импланти, особено поради механичкото стружење за време на хируршки процедури (18, 19).Дополнително, поради неговата висока биокомпатибилност, недостаток на потреба од операција за отстранување и својства за чистење на површината преку корозија, користени се ортопедски импланти направени од биоразградливи материјали (20, 21).За време на корозија, хемиските врски помеѓу полимерната матрица се распаѓаат и се одвојуваат од површината, а прилепувачите ја чистат површината.Сепак, антибиолошкото валкање со чистење на површината е ефективно за краток временски период.Дополнително, повеќето материјали што се апсорбираат, вклучително и поли (кополимер на млечна киселина-гликолна киселина) (PLGA), полилактична киселина (PLA) и легури базирани на магнезиум ќе претрпат нерамномерна биоразградување и ерозија во телото, што негативно ќе влијае на механичката стабилност.(Дваесет и два).Покрај тоа, биоразградливите фрагменти од плочата обезбедуваат место за прицврстување на бактериите, што ја зголемува можноста за инфекција на долг рок.Овој ризик од механичка деградација и инфекција ја ограничува практичната примена на пластичната хирургија (23).
Суперхидрофобните (SHP) површини кои ја имитираат хиерархиската структура на листовите од лотос станаа потенцијално решение за површини против валкање (24, 25).Кога површината на SHP е потопена во течност, воздушните меури ќе бидат заробени, а со тоа ќе формираат воздушни џебови и ќе ја спречат бактериската адхезија (26).Сепак, неодамнешните студии покажаа дека површината на SHP има недостатоци поврзани со механичка издржливост и долгорочна стабилност, што ја попречува нејзината примена во медицински импланти.Покрај тоа, воздушните џебови ќе се растворат и ќе ги изгубат своите својства против валкање, што ќе резултира со поширока бактериска адхезија поради големата површина на површината на МХП (27, 28).Неодамна, Ајзенберг и неговите колеги воведоа иновативен метод за премачкување на површината против биораспадливост преку развивање на мазна површина инспирирана од фабриката за стомна Непентес (29, 30).Мазната површина покажува долготрајна стабилност при хидраулични услови, е исклучително течно отвратителна за биолошките течности и има својства за самопоправка.Сепак, не постои ниту метод за нанесување облога на медицински имплант во сложена форма, ниту пак е докажано дека го поддржува процесот на заздравување на оштетеното ткиво по имплантацијата.
Овде, воведуваме подмачкана ортопедска имплантна површина (LOIS), микро/нано-структурирана ортопедска имплантна површина и цврсто комбинирана со тенок слој за подмачкување за да се спречи нејзиното поврзување со пластична хирургија Бактериски инфекции, како што е фиксација на фрактура.Бидејќи структурата на микро/нано ниво, функционализирана со флуор, цврсто го фиксира лубрикантот на структурата, развиениот LOIS може целосно да го одбие адхезијата на различни течности и да ги одржува перформансите против валкање долго време.LOIS облогите може да се применат на материјали со различни форми наменети за синтеза на коските.Ин витро се потврдени одличните својства против бионасипување на LOIS против биофилмските бактерии [Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus отпорен на метицилин (MRSA)] и биолошките супстанции (клетки, протеини и калциум).Стапката на адхезија на екстензивната адхезија на подлогата е помала од 1%.Дополнително, дури и откако ќе дојде до механички стрес, како што е гребење на површината, самозаздравувањето предизвикано од пенетрирачкиот лубрикант помага да се одржат неговите својства против валкање.Резултатите од тестот за механичка издржливост покажуваат дека дури и по структурна и хемиска модификација, вкупната јачина нема значително да се намали.Дополнително, беше спроведен ин витро експеримент кој го симулира механичкиот стрес во хируршката средина за да се докаже дека LOIS може да издржи различни механички стресови кои се јавуваат за време на пластичната хирургија.Конечно, користевме модел на in vivo фрактура на бедрената коска базирана на зајак, кој докажа дека LOIS има супериорни антибактериски својства и биокомпатибилност.Радиолошките и хистолошките резултати потврдија дека стабилното однесување на лубрикантот и својствата против бионасипување во рок од 4 недели по имплантацијата може да постигнат ефективни антиинфективни и имунолошки перформанси без одложување на процесот на заздравување на коските.
Слика 1А покажува шематски дијаграм на развиениот LOIS, кој е вграден со микро/нано-размерни структури во моделот на фрактура на бутната коска на зајакот за да се потврдат неговите одлични антибиолошки својства на валкање и антиинфекција.Се спроведува биомиметичка метода за да се симулира површината на фабрика за воден саксии и да се спречи бионасипување со инкорпорирање на слој за подмачкување во микро/нано структурата на површината.Површината инјектирана со лубрикант може да го минимизира контактот помеѓу биолошките супстанции и површината.Поради тоа, поради формирањето на стабилни хемиски врски на површината, има одлични антифаулирачки перформанси и долгорочна стабилност.Како резултат на тоа, својствата против бионасипување на површината за подмачкување овозможуваат различни практични примени во биомедицинските истражувања.Сепак, опсежното истражување за тоа како оваа посебна површина комуницира во телото сè уште не е завршено.Со споредување на LOIS со голи супстрати in vitro со користење на албумин и биофилм бактерии, може да се потврди нелепливоста на LOIS (Слика 1Б).Дополнително, со исфрлање на капките вода на навалената гола подлога и подлогата LOIS (слика S1 и филм S1), може да се докаже ефикасноста на биолошката контаминација.Како што е прикажано на сликата со флуоресцентен микроскоп, изложената супстрат инкубирана во суспензија од протеини и бактерии покажа дека голема количина на биолошки материјал се прилепува на површината.Сепак, поради одличните својства против биораспаѓање, LOIS речиси и не покажува флуоресценција.Со цел да се потврдат неговите антибионасипни и антиинфективни својства, LOIS беше нанесен на површината на ортопедските импланти за синтеза на коските (плочи и завртки) и беше поставен во модел на фрактура на зајак.Пред имплантација, голиот ортопедски имплант и LOIS беа инкубирани во бактериска суспензија 12 часа.Пред-инкубацијата осигурува дека на површината на изложениот имплант се формира биофилм за споредба.Слика 1C покажува фотографија од местото на фрактура 4 недели по имплантацијата.Лево, зајакот со гол ортопедски имплант покажал сериозно ниво на воспаление поради формирање на биофилм на површината на имплантот.Спротивниот резултат беше забележан кај зајаците имплантирани со LOIS, односно околните ткива на LOIS не покажаа знаци на инфекција ниту знаци на воспаление.Дополнително, оптичката слика лево го означува хируршкото место на зајакот со изложениот имплант, што покажува дека на површината на LOIS не се пронајдени повеќекратни лепила присутни на површината на изложениот имплант.Ова покажува дека LOIS има долгорочна стабилност и има способност да ги одржува своите антибиолошки својства на валкање и антиадхезија.
(А) Шематски дијаграм на LOIS и негова имплантација во модел на фрактура на бедрената коска на зајакот.(Б) Флуоресцентна микроскопска слика на протеин и бактериски биофилм на гола површина и LOIS супстрат.4 недели по имплантацијата, (C) фотографска слика на местото на фрактурата и (D) слика на Х-зраци (нагласена со црвен правоаголник).Сликата е учтивост: Kyomin Chae, Универзитетот Јонсеи.
Стерилизираните, изложени негативно имплантирани зајаци покажаа нормален процес на заздравување на коските без никакви знаци на воспаление или инфекција.Од друга страна, SHP импланти претходно инкубирани во бактериска суспензија покажуваат воспаление поврзано со инфекција на околните ткива.Ова може да се припише на неговата неможност да ја инхибира бактериската адхезија долго време (Слика S2).Со цел да се докаже дека LOIS не влијае на процесот на заздравување, туку ги инхибира можните инфекции поврзани со имплантација, споредени се рендгенски слики од изложената позитивна матрица и LOIS на местото на фрактурата (Слика 1Д).Рендгенската слика на голиот позитивен имплант покажа постојани линии на остеолиза, што укажува дека коската не е целосно заздравена.Ова сугерира дека процесот на обновување на коските може да биде значително одложен поради воспаление поврзано со инфекција.Напротив, покажа дека зајаците имплантирани со LOIS се излечиле и не покажале очигледна локација на фрактура.
Со цел да се развијат медицински импланти со долготрајна стабилност и функционалност (вклучувајќи отпорност на бионасипување), направени се многу напори.Сепак, присуството на различни биолошки супстанции и динамиката на ткивната адхезија го ограничува развојот на нивните клинички сигурни методи.Со цел да ги надминеме овие недостатоци, развивме структура со микро/нано слоеви и хемиски модифицирана површина, која е оптимизирана поради високата капиларна сила и хемискиот афинитет за да го задржи најмазниот лубрикант во најголема мера.Слика 2А го прикажува целокупниот процес на производство на LOIS.Прво, подгответе подлога од нерѓосувачки челик (SS) 304 за медицински квалитет.Второ, микро/нано структурата се формира на SS подлогата со хемиско гравирање со помош на раствор на флуороводородна киселина (HF).За да се врати отпорноста на корозија на SS, растворот на азотна киселина (HNO3) (31) се користи за обработка на гравираната подлога.Пасивацијата ја подобрува отпорноста на корозија на SS подлогата и значително го забавува процесот на корозија што може да ги намали вкупните перформанси на LOIS.Потоа, со формирање на самосклопен монослој (SAM) со 1H, 1H, 2H, 2H-перфлуорооктилтриетоксисилан (POTS), површината хемиски се менува за да се подобри хемиската интеракција помеѓу површината и афинитетот на мазниот лубрикант.Модификацијата на површината значително ја намалува површинската енергија на изработената структурирана површина во микро/нано размери, што одговара на површинската енергија на мазниот лубрикант.Ова овозможува лубрикантот целосно да се навлажни, со што се формира стабилен лубрикант слој на површината.Модифицираната површина покажува зголемена хидрофобност.Резултатите покажуваат дека лизгавиот лубрикант покажува стабилно однесување на LOIS поради високиот хемиски афинитет и капиларната сила предизвикана од микро/нано структурата (32, 33).Проучени се оптичките промени на површината на СС по модификација на површината и вбризгување на лубрикант.Микро/нанослојната структура формирана на површината може да предизвика визуелни промени и да ја затемни површината.Овој феномен се припишува на засилениот ефект на расејување на светлината на грубата површина, што ја зголемува дифузната рефлексија предизвикана од механизмот за заробување на светлината (34).Дополнително, откако ќе се вбризга лубрикантот, LOIS станува потемен.Слојот за подмачкување предизвикува помалку светлина да се рефлектира од подлогата, со што се затемнува LOIS.Со цел да се оптимизира микроструктурата/наноструктурата за да се прикаже најмалиот агол на лизгање (SA) за да се постигнат перформанси против бионасипување, се користеа електронска микроскопија за скенирање (SEM) и атомски парови за извршување на различни времиња на офорт на HF (0, 3)., 15 и 60 минути) Силен микроскоп (AFM) (Слика 2Б).Сликите на SEM и AFM покажуваат дека по кратко време на офорт (3 минути офорт), голата подлога формирала нерамна грубост во нано размери.Грубоста на површината се менува со времето на офорт (слика S3).Кривата што варира во време покажува дека грубоста на површината продолжува да се зголемува и достигнува максимум на 15 минути офорт, а потоа се забележува само мало намалување на вредноста на грубоста при 30 минути офорт.Во овој момент, грубоста на нано-нивото е издлабена, додека грубоста на микро-нивото се развива енергично, што ја прави промената на грубоста постабилна.По офорт подолго од 30 минути, се забележува дополнително зголемување на грубоста, што е детално објаснето на следниов начин: SS е составен од челик, легиран со елементи вклучувајќи железо, хром, никел, молибден и многу други елементи.Помеѓу овие елементи, железото, хромот и молибденот играат важна улога во формирањето на грубост на микрон/нано размери на SS со HF офорт.Во раните фази на корозија, железото и хромот главно се кородираат бидејќи молибденот има поголема отпорност на корозија од молибденот.Како што напредува офортувањето, растворот за офорт достигнува локална презаситеност, формирајќи флуориди и оксиди предизвикани од офорт.Флуоридот и оксидот се таложат и на крајот повторно се таложат на површината, формирајќи грубост на површината во опсегот микрон/нано (31).Оваа грубост на микро/нано ниво игра важна улога во самолекувачките својства на LOIS.Површината со двојна скала произведува синергетски ефект, во голема мера ја зголемува капиларната сила.Овој феномен му овозможува на лубрикантот стабилно да навлезе во површината и придонесува за само-лекувачки својства (35).Формирањето на грубост зависи од времето на офорт.Под 10 минути офорт, површината содржи само грубост во нано размери, што не е доволно за да се одржи доволно лубрикант за да има отпорност на биорасплодување (36).Од друга страна, ако времето на офорт надминува 30 минути, грубоста на нано-размерот формирана од повторното таложење на железо и хром ќе исчезне, а само грубоста на микро-скалата ќе остане поради молибденот.На прекумерно гравираната површина нема грубост со нано размери и го губи синергетскиот ефект на грубоста во две фази, што негативно влијае на карактеристиките на самолекување на LOIS.Мерењата на SA беа извршени на подлоги со различни времиња на офорт за да се докажат перформансите против валкање.Различни видови течности беа избрани врз основа на вискозноста и површинската енергија, вклучувајќи дејонизирана (DI) вода, крв, етилен гликол (EG), етанол (EtOH) и хексадекан (HD) (Слика S4).Моделот на офорт што варира во времето покажува дека за различни течности со различна површинска енергија и вискозитет, SA на LOIS по 15 минути офорт е најниска.Затоа, LOIS е оптимизиран да оградува 15 минути за да формира грубост во микрони и нано размери, што е погодно за ефикасно одржување на издржливоста на лубрикантот и одличните својства против валкање.
(А) Шематски дијаграм на процесот на производство во четири чекори на LOIS.Вметнувањето го прикажува SAM формиран на подлогата.(Б) SEM и AFM слики, кои се користат за оптимизирање на микро/нано структурата на подлогата при различни времиња на офорт.Рендгенска фотоелектронска спектроскопија (XPS) спектри на (C) Cr2p и (D) F1s по површинска пасивација и SAM обложување.au, произволна единица.(Д) Репрезентативни слики на капки вода на голи, гравирани, SHP и LOIS подлоги.(F) Мерење на контактниот агол (CA) и SA на течности со различни површински напнатости на SHP и LOIS.Податоците се изразуваат како средна вредност ± SD.
Потоа, со цел да се потврди промената на хемиските својства на површината, се користеше фотоелектронска спектроскопија на Х-зраци (XPS) за проучување на промената на хемискиот состав на површината на подлогата по секоја површинска обвивка.Слика 2C ги прикажува резултатите од мерењето XPS на гравираната површина HF и површината третирана со HNO 3.Двата главни врвови на 587,3 и 577,7 eV може да се припишат на врската Cr-O која постои во слојот од хром оксид, што е главната разлика од гравираната површина HF.Ова главно се должи на потрошувачката на железо и хром флуорид на површината од HNO3.Офорт врз основа на HNO3 му овозможува на хромот да формира пасивизирачки оксиден слој на површината, што го прави гравираниот SS повторно отпорен на корозија.На Слика 2Д, XPS спектрите се добиени за да се потврди дека на површината по SAM облогата се формирал силин базиран на флуоројаглерод, кој има екстремно висока течна одбивност дури и за EG, крв и EtOH.SAM облогата се комплетира со реакција на силински функционални групи со хидроксилни групи формирани со плазма третман.Како резултат на тоа, забележано е значително зголемување на врвовите на CF2 и CF3.Енергијата на врзување помеѓу 286 и 296 eV покажува дека хемиската модификација е успешно завршена со SAM облогата.SHP покажува релативно големи врвови CF2 (290,1 eV) и CF3 (293,3 eV), кои се предизвикани од силинот базиран на флуоројаглерод формиран на површината.Слика 2E покажува репрезентативни оптички слики од мерењата на аголот на контакт (CA) за различни групи дејонизирана вода во контакт со гола, гравирана, SHP и LOIS.Овие слики покажуваат дека гравираната површина станува хидрофилна поради микро/нано структурата формирана со хемиско офорт, така што дејонизираната вода се апсорбира во структурата.Меѓутоа, кога подлогата е обложена со SAM, подлогата покажува силна водоотпорност, така што се формира површинска SHP и површината за контакт помеѓу водата и површината е мала.Конечно, намалување на CA беше забележано кај LOIS, што може да се припише на пенетрацијата на лубрикантот во микроструктурата, со што се зголемува површината на контактот.Со цел да се докаже дека површината има одлична отпорност на течности и нелепливи својства, LOIS беше спореден со подлогата SHP со мерење на CA и SA користејќи различни течности (Слика 2F).Различни видови течности беа избрани врз основа на вискозноста и површинската енергија, вклучувајќи дејонизирана вода, крв, EG, EtOH и HD (слика S4).Резултатите од мерењето на CA покажуваат дека кога CA се стреми кон HD, вредноста на намалувањето на CA, каде што CA има најниска површинска енергија.Дополнително, LOIS на севкупниот CA е низок.Меѓутоа, мерењето на СА покажува сосема поинаков феномен.Освен јонизираната вода, сите течности се прилепуваат на SHP подлогата без да се лизгаат.Од друга страна, LOIS покажува многу ниска SA, каде што кога целата течност е навалена под агол помал од 10° до 15°, целата течност ќе се тркала.Ова силно покажува дека нелепливоста на LOIS е подобра од онаа на површината на МХП.Дополнително, LOIS облогите се применуваат и на различни видови материјали, вклучувајќи титаниум (Ti), полифенилсулфон (PPSU), полиоксиметилен (POM), полиетер етер кетон (PEEK) и биоапсорбирачки полимери (PLGA), Тие се ортопедски материјали што се имплантираат (Слика S5)).Секвенцијалните слики на капките на материјалот обработен со LOIS покажуваат дека својствата против биорасплодување на LOIS се исти на сите подлоги.Дополнително, резултатите од мерењето на CA и SA покажуваат дека нелепливите својства на LOIS може да се применат и на други материјали.
Со цел да се потврдат својствата против валкање на LOIS, различни типови на подлоги (вклучувајќи голи, гравирани, SHP и LOIS) беа инкубирани со Pseudomonas aeruginosa и MRSA.Овие две бактерии беа избрани како репрезентативни болнички бактерии, што може да доведе до формирање на биофилмови, што доведува до SSI (37).Слика 3 (А и Б) ги прикажува сликите на флуоресцентниот микроскоп и резултатите од мерењето на единицата за формирање колонии (CFU) на супстратите инкубирани во бактериската суспензија за краткорочни (12 часа) и долгорочни (72 часа), соодветно.За краток временски период, бактериите ќе формираат кластери и ќе растат во големина, покривајќи се со супстанции слични на слуз и спречувајќи нивно отстранување.Меѓутоа, за време на 72-часовната инкубација, бактериите ќе созреат и ќе станат лесни за дисперзирање за да формираат повеќе колонии или кластери.Затоа, може да се смета дека 72-часовната инкубација е долгорочна и е соодветно време на инкубација за да се формира силен биофилм на површината (38).За краток временски период, гравираната површина и површината на МХП покажаа бактериска адхезија, која беше намалена за околу 25% до 50% во споредба со голиот супстрат.Сепак, поради одличните перформанси и стабилност против бионасипување, LOIS не покажа адхезија на бактериски биофилм на краток и долг рок.Шематскиот дијаграм (слика 3C) го опишува објаснувањето на антибиолошкиот механизам за валкање на растворот за офорт, SHP и LOIS.Претпоставката е дека гравираната подлога со хидрофилни својства ќе има поголема површина од голиот супстрат.Затоа, ќе се појави повеќе бактериска адхезија на гравираната подлога.Меѓутоа, во споредба со голиот супстрат, гравираниот супстрат има значително помалку биофилм формиран на површината.Тоа е затоа што молекулите на водата цврсто се врзуваат за хидрофилната површина и делуваат како лубрикант за вода, со што се мешаат со адхезијата на бактериите на краток рок (39).Сепак, слојот на молекулите на водата е многу тенок и растворлив во бактериски суспензии.Затоа, молекуларниот слој на водата исчезнува долго време, што доведува до екстензивна бактериска адхезија и пролиферација.За SHP, поради неговите краткорочни својства што не навлажнуваат, бактериската адхезија е инхибирана.Намалената бактериска адхезија може да се припише на воздушните џебови заробени во слоевитата структура и енергијата на долната површина, со што се минимизира контактот помеѓу бактериската суспензија и површината.Меѓутоа, во МХП е забележана екстензивна бактериска адхезија бидејќи долго време ги изгубила своите анти-фаулирачки својства.Ова главно се должи на исчезнувањето на воздушните џебови поради хидростатичкиот притисок и растворањето на воздухот во водата.Ова главно се должи на исчезнувањето на воздушните џебови поради растворање и слоевитата структура која обезбедува поголема површина за адхезија (27, 40).За разлика од овие два супстрати кои имаат важен ефект врз долгорочната стабилност, подмачкувачкиот лубрикант содржан во LOIS се вбризгува во микро/нано структурата и нема да исчезне дури и на долг рок.Лубрикантите исполнети со микро/нано структури се многу стабилни и силно се привлекуваат кон површината поради нивниот висок хемиски афинитет, а со тоа ја спречуваат бактериската адхезија долго време.Сликата S6 покажува слика на рефлективен конфокален микроскоп на супстрат наполнет со лубрикант, потопен во солен раствор со фосфат пуфер (PBS).Континуираните слики покажуваат дека дури и по 120 часа мало тресење (120 вртежи во минута), слојот за подмачкување на LOIS останува непроменет, што укажува на долгорочна стабилност во услови на проток.Ова се должи на високиот хемиски афинитет помеѓу SAM-облогата базирана на флуор и лубрикантот базиран на перфлуоројаглерод, така што може да се формира стабилен лубрикантски слој.Затоа, се одржуваат перформансите против фаулирање.Дополнително, супстратот беше тестиран против репрезентативни протеини (албумин и фибриноген), кои се во плазмата, клетки тесно поврзани со имунолошката функција (макрофаги и фибробласти) и оние поврзани со формирање на коски.Содржината на калциум е многу висока.(Слика 3D, 1 и 2, и слика S7) (41, 42).Дополнително, сликите со флуоресцентен микроскоп од тестот за адхезија за фибриноген, албумин и калциум покажаа различни карактеристики на адхезија на секоја група на супстрат (слика S8).За време на формирањето на коските, новоформираните коски и калциумови слоеви може да го опкружат ортопедскиот имплант, што не само што го отежнува отстранувањето, туку може да предизвика и неочекувана штета на пациентот за време на процесот на отстранување.Затоа, ниските нивоа на депозити на калциум на коскените плочи и завртки се корисни за ортопедска хирургија која бара отстранување на имплантот.Врз основа на квантификацијата на закачената површина врз основа на интензитетот на флуоресценција и бројот на клетки, потврдивме дека LOIS покажува одлични својства против биорасплодување за сите биолошки супстанции во споредба со другите супстрати.Според резултатите од ин витро експериментите, антибиолошкото валкано LOIS може да се примени на ортопедски импланти, кои не само што можат да ги инхибираат инфекциите предизвикани од бактерии на биофилм, туку и да го намалат воспалението предизвикано од активниот имунолошки систем на телото.
(А) Сликите на флуоресцентен микроскоп од секоја група (голи, гравирани, SHP и LOIS) инкубирани во суспензии Pseudomonas aeruginosa и MRSA 12 и 72 часа.(Б) Бројот на адхерентни CFU на Pseudomonas aeruginosa и MRSA на површината на секоја група.(В) Шематски дијаграм на антибиолошкиот механизам за фаулирање на краткорочно и долгорочно офортување, SHP и LOIS.(Г) (1) Бројот на фибробласти залепени на секој супстрат и флуоресцентни микроскопски слики на клетките прилепени на голи и LOIS.(2) Тест на адхезија на протеини поврзани со имунолошкиот систем, албумин и калциум вклучени во процесот на заздравување на коските (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 и **** P <0,0001).ns, не е важно.
Во случај на неизбежни концентрирани напрегања, механичката издржливост отсекогаш била главниот предизвик за нанесување на премази против ѓубре.Традиционалните методи на гел против канализација се засноваат на полимери со мала растворливост и кршливост во вода.Затоа, тие обично се подложни на механички стрес во биомедицинските апликации.Затоа, механички издржливите антифунгирачки премази остануваат предизвик за апликации како што се ортопедските импланти (43, 44).Слика 4А(1) ги прикажува двата главни типа на напрегање применети на ортопедски импланти, вклучувајќи гребење (напрегање на смолкнување) и компресија со оптичката слика на оштетениот имплант произведен од форцепсот.На пример, кога завртката е затегната со шрафцигер, или кога хирургот цврсто ја држи коскената плоча со пинцета и применува сила на компресија, пластичната коскена плоча ќе се оштети и изгребе и на макро и на микро/нано скали (Слика 4А, 2) .Со цел да се тестира дали произведениот LOIS може да ги издржи овие оштетувања за време на пластична хирургија, беше извршена наноиндентација за да се спореди цврстината на голата подлога и LOIS на микро/нано скалата за да се проучат механичките својства на микро/нано структурата Влијание (слика 4Б).Шематскиот дијаграм го прикажува различното деформационо однесување на LOIS поради присуството на микро/нано структури.Кривата на сила-поместување беше нацртана врз основа на резултатите од нановдлабнувањето (Слика 4В).Сината слика ја претставува голата подлога, која покажува само мала деформација, што се гледа од максималната длабочина на вдлабнување од 0,26 μm.Од друга страна, постепеното зголемување на силата на нановдлабнување и поместувањето забележано во LOIS (црвена крива) може да покаже знаци на намалени механички својства, што резултира со длабочина на нановдлабнување од 1,61 μm.Тоа е затоа што микро/нано структурата присутна во LOIS обезбедува подлабок простор за напредување за врвот на наноиндентерот, така што неговата деформација е поголема од онаа на голата подлога.Конста-Гдутос и др.(45) верува дека поради присуството на наноструктури, нановдлабнувањето и микро/нано грубоста доведуваат до неправилни криви на нановдлабнување.Засенчената област одговара на кривата на неправилна деформација која се припишува на наноструктурата, додека незасенчената област се припишува на микроструктурата.Оваа деформација може да ја оштети микроструктурата/наноструктурата на лубрикантот за држење и негативно да влијае на неговите перформанси против валкање.Со цел да се проучи влијанието на оштетувањето на LOIS, неизбежното оштетување на микро/нано структурите беше реплицирано во телото за време на пластичната хирургија.Со користење на тестови за адхезија на крв и протеини, може да се одреди стабилноста на својствата против бионасипување на LOIS по ин витро (Слика 4Д).Серија оптички слики го прикажуваат оштетувањето што се случило во близина на дупките на секоја подлога.Беше направен тест за адхезија на крв за да се демонстрира ефектот на механичкото оштетување на облогата против биорасплодување (слика 4E).Како и SHP, својствата против валкање се губат поради оштетување, а LOIS покажува одлични својства против валкање со одбивање на крв.Тоа е затоа што, бидејќи површинската енергија е поттикната од капиларното дејство што ја покрива оштетената област, протокот во микроструктурниот лубрикант за подмачкување ги обновува својствата против валкање (35).Истиот тренд беше забележан во тестот за адхезија на протеини со употреба на албумин.Во оштетената област, адхезијата на протеинот на површината на SHP е широко забележана, а со мерење на неговата покриеност на површината може да се квантифицира како половина од нивото на адхезија на голиот супстрат.Од друга страна, LOIS ги задржа своите својства против бионасипување без да предизвика адхезија (Слика 4, F и G).Покрај тоа, површината на завртката често е подложена на силен механички стрес, како што е дупчењето, така што ја проучувавме способноста на LOIS облогата да остане недопрена на завртката ин витро.Слика 4H прикажува оптички слики на различни завртки, вклучувајќи голи, SHP и LOIS.Црвениот правоаголник ја претставува целната област каде што се јавува силен механички стрес при имплантација на коските.Слично на тестот за протеинска адхезија на плочата, флуоресцентен микроскоп се користи за сликање на протеинската адхезија и мерење на површината на покриеност за да се докаже интегритетот на LOIS облогата, дури и при силен механички стрес (Слика 4, I и J).Завртките обработени со LOIS покажуваат одлични перформанси против валкање и речиси ниту еден протеин не се прилепува на површината.Од друга страна, протеинската адхезија беше забележана кај голите завртки и SHP завртките, каде што покриеноста на површината на SHP завртките беше една третина од онаа на голите завртки.Дополнително, ортопедскиот имплант што се користи за фиксација мора да биде механички силен за да го издржи напрегањето што се применува на местото на фрактурата, како што е прикажано на Слика 4К.Затоа, беше извршен тест за свиткување за да се утврди ефектот на хемиската модификација врз механичките својства.Покрај тоа, ова е направено за да се одржи фиксниот стрес од имплантот.Нанесете вертикална механичка сила додека имплантот не се превитка целосно и не се добие крива напрегање-деформација (Слика 4L, 1).Две својства, вклучувајќи го Јанг-овиот модул и јакоста на виткање, беа споредени помеѓу голи и LOIS подлоги како индикатори за нивната механичка сила (слика 4L, 2 и 3).Модулот на Јанг укажува на способноста на материјалот да издржи механички промени.Young-овиот модул на секоја подлога е 41,48±1,01 и 40,06±0,96 GPa, соодветно;забележаната разлика е околу 3,4%.Дополнително, се известува дека јачината на свиткување, која ја одредува цврстината на материјалот, е 102,34±1,51 GPa за гола подлога и 96,99±0,86 GPa за SHP.Голиот супстрат е приближно 5,3% поголем.Малото намалување на механичките својства може да биде предизвикано од ефектот на засек.Во ефектот на засек, микро/нано грубоста може да дејствува како збир на засеци, што доведува до локална концентрација на стрес и влијае на механичките својства на имплантот (46).Сепак, врз основа на фактот дека вкочанетоста на човечката кортикална коска е пријавена дека е помеѓу 7,4 и 31,6 GPa, а измерениот LOIS модул го надминува оној на човечката кортикална коска (47), LOIS е доволна за да ја поддржи фрактурата и нејзиниот целокупен механичките својства се минимално засегнати од модификацијата на површината.
(А) Шематски дијаграм на (1) механичкиот стрес применет на ортопедскиот имплант за време на операцијата и (2) оптичката слика на оштетениот ортопедски имплант.(Б) Шематски дијаграм на мерење на нано-механички својства со нановдлабнување и LOIS на гола површина.(В) Крива на наноиндентациона сила-поместување на гола површина и LOIS.(Г) По ин витро експерименти, симулирајте ги оптичките слики на различни видови ортопедски плочи (оштетената област е означена со црвен правоаголник) за да го симулирате механичкиот стрес предизвикан за време на операцијата.(Д) Тест за адхезија на крв и (F) тест за адхезија на протеини на оштетената група на ортопедски плочи.(Г) Измерете ја покриеноста на површината на протеинот што се прилепува на плочата.(H) Оптички слики на различни видови ортопедски завртки по ин витро експериментот.(I) Тест за адхезија на протеини за проучување на интегритетот на различни облоги.(Ј) Измерете ја покриеноста на протеинот што се прилепува на завртката.(К) Движењето на зајакот е наменето да генерира фиксен стрес на скршената коска.(L) (1) Свиткајте ги резултатите од тестот и оптичките слики пред и по свиткување.Разликата во (2) Јанг-овиот модул и (3) силата на свиткување помеѓу голиот имплант и SHP.Податоците се изразуваат како средна вредност ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 и ****P<0,0001).Сликата е учтивост: Kyomin Chae, Универзитетот Јонсеи.
Во клинички ситуации, повеќето бактериски контакти со биолошки материјали и места на рана доаѓаат од зрели, зрели биофилмови (48).Затоа, американскиот центар за контрола и превенција на болести проценува дека 65% од сите човечки инфекции се поврзани со биофилмови (49).Во овој случај, неопходно е да се обезбеди in vivo експериментален дизајн кој обезбедува конзистентно формирање на биофилм на површината на имплантот.Затоа, развивме модел на фрактура на бедрената коска на зајакот во кој ортопедските импланти беа претходно инкубирани во бактериска суспензија, а потоа имплантирани во бедрената коска на зајакот за да ги проучат својствата против валкање на LOIS in vivo.Поради следните три важни факти, бактериските инфекции се предизвикани со предкултура наместо директно инјектирање на бактериски суспензии: (i) Имунолошкиот систем на зајаците е природно посилен од оној на луѓето;затоа, можно е инјектирање на бактериски суспензии и планктонски бактерии. Нема ефект врз формирањето на биофилмови.(Ii) Планктонските бактерии се поподложни на антибиотици, а антибиотиците обично се користат по операцијата;конечно, (iii) суспензијата на планктонските бактерии може да се разреди со телесните течности на животното (50).Со претходно одгледување на имплантот во бактериска суспензија пред имплантација, можеме темелно да ги проучиме штетните ефекти на бактериската инфекција и реакцијата на туѓо тело (FBR) врз процесот на заздравување на коските.Зајаците беа жртвувани 4 недели по имплантацијата, бидејќи остеоинтеграцијата од суштинско значење за процесот на заздравување на коските ќе биде завршена во рок од 4 недели.Потоа, имплантите беа отстранети од зајаците за низводно студии.Слика 5А го прикажува механизмот на пролиферација на бактериите.Инфицираниот ортопедски имплант се внесува во телото.Како резултат на претходна инкубација во бактериска суспензија, шест од шесте зајаци имплантирани со голи импланти биле заразени, додека ниту еден од зајаците вградени со импланти третирани со LOIS не бил заразен.Бактериските инфекции се одвиваат во три чекори, вклучувајќи раст, созревање и дисперзија (51).Прво, прикачените бактерии се репродуцираат и растат на површината, а потоа бактериите формираат биофилм кога излачуваат екстрацелуларен полимер (ЕПС), амилоид и екстрацелуларна ДНК.Биофилмот не само што го попречува пенетрацијата на антибиотиците, туку и промовира акумулација на ензими кои разградуваат антибиотици (како што е β-лактамазата) (52).Конечно, биофилмот ги шири зрелите бактерии во околните ткива.Затоа, се јавува инфекција.Покрај тоа, кога туѓо тело влегува во телото, инфекција која може да предизвика силен имунолошки одговор може да предизвика сериозно воспаление, болка и намален имунитет.Слика 5Б дава преглед на FBR предизвикана од вметнување на ортопедски имплант, наместо имунолошкиот одговор предизвикан од бактериска инфекција.Имунолошкиот систем го препознава вметнатиот имплант како туѓо тело, а потоа предизвикува клетките и ткивата да реагираат за да го инкапсулираат туѓото тело (53).Во раните денови на FBR, беше формирана матрица за снабдување на површината на ортопедските импланти, што резултираше со адсорпција на фибриноген.Адсорбираниот фибриноген потоа формира високо густа фибринска мрежа, која го промовира прицврстувањето на леукоцитите (54).Откако ќе се формира фибринската мрежа, ќе се појави акутно воспаление поради инфилтрација на неутрофили.Во овој чекор, се ослободуваат различни цитокини како што се факторот на туморска некроза-α (TNF-α), интерлеукин-4 (IL-4) и IL-β, а моноцитите почнуваат да се инфилтрираат на местото на имплантација и да се диференцираат во гигантски клетки.Фаг (41, 55, 56).Намалувањето на FBR отсекогаш било предизвик бидејќи прекумерниот FBR може да предизвика акутно и хронично воспаление, што може да доведе до фатални компликации.Со цел да се процени влијанието на бактериските инфекции во ткивата што го опкружуваат голиот имплант и LOIS, се користеа боење со хематоксилин и еозин (H&E) и Масон трихром (MT).Кај зајаците имплантирани со голи супстрати, тешките бактериски инфекции напредуваа, а ткивните слајдови на H&E јасно покажаа апсцеси и некроза предизвикани од воспаление.Од друга страна, екстремно силната површина против бионасипување LOIS ја инхибира бактериската адхезија, така што не покажува знаци на инфекција и го намалува воспалението (слика 5C).Резултатите од MT боењето го покажаа истиот тренд.Сепак, боењето со МТ исто така покажа едем кај зајаци имплантирани со LOIS, што покажува дека закрепнувањето ќе се случи (Слика 5Д).Со цел да се проучи степенот на имунолошкиот одговор, имунохистохемиското (IHC) боење беше изведено со употреба на цитокини TNF-α и IL-6 поврзани со имунолошкиот одговор.Гол негативен имплант кој не бил изложен на бактерии бил спореден со LOIS кој бил изложен на бактерии, но не бил инфициран за да го проучува процесот на заздравување во отсуство на бактериска инфекција.Слика 5E покажува оптичка слика на IHC слајд кој изразува TNF-α.Кафеавата област го претставува имунолошкиот одговор, што покажува дека имунолошкиот одговор во LOIS е малку намален.Дополнително, изразот на IL-6 во LOIS беше значително помал од негативниот израз на стерилен гол (Слика 5F).Изразот на цитокинот беше квантифициран со мерење на областа на боење на антитела што одговара на цитокинот (Слика 5G).Во споредба со зајаците изложени на негативни импланти, нивоата на изразување на зајаците имплантирани со LOIS беа пониски, што покажуваше значајна разлика.Намалувањето на експресијата на цитокините покажува дека долготрајните, стабилни анти-фаулирачки својства на LOIS не се поврзани само со инхибиција на бактериски инфекции, туку и со намалување на FBR, што е индуцирано од макрофагите кои се прилепуваат на подлогата (53, 57, 58).Затоа, намалениот имунолошки одговор поради својствата на имунолошката евазија на LOIS може да ги реши несаканите ефекти по имплантацијата, како што е прекумерниот имунолошки одговор по пластична хирургија.
(А) Шематски дијаграм на механизмот на формирање и ширење на биофилм на површината на заразениот ортопедски имплант.еДНК, екстрацелуларна ДНК.(Б) Шематски дијаграм на имунолошкиот одговор по ортопедско вметнување имплант.(В) боење H&E и (Д) MT боење на околните ткива на ортопедски импланти со голи позитивни и LOIS.IHC на имуно-поврзани цитокини (E) TNF-α и (F) IL-6 се обоени слики на голо-негативни и LOIS-имплантирани зајаци.(Г) Квантификација на изразот на цитокин со мерење на покриеноста на областа (** P <0,01).
Биокомпатибилноста на LOIS и нејзиниот ефект врз процесот на заздравување на коските беа испитувани in vivo со помош на дијагностичка слика [х-зраци и микро-компјутерска томографија (КТ)] и остеокласт IHC.Слика 6А го прикажува процесот на заздравување на коските кој вклучува три различни фази: воспаление, поправка и ремоделирање.Кога ќе се случи фрактура, воспалителните клетки и фибробластите ќе навлезат во скршената коска и ќе почнат да растат во васкуларното ткиво.За време на фазата на поправка, растењето на васкуларното ткиво се шири во близина на местото на фрактурата.Васкуларното ткиво обезбедува хранливи материи за формирање на нова коска, која се нарекува калус.Последната фаза од процесот на заздравување на коските е фазата на ремоделирање, во која големината на калусот се намалува до големината на нормалната коска со помош на зголемување на нивото на активираните остеокласти (59).Беше изведена тридимензионална (3Д) реконструкција на местото на фрактурата со помош на микро-КТ скенови за да се набљудуваат разликите во нивото на формирање на калус во секоја група.Набљудувајте го пресекот на бедрената коска за да ја набљудувате дебелината на калусот што ја опкружува скршената коска (Слика 6, Б и В).Рендгенските снимки, исто така, беа користени за испитување на местата на фрактура на сите групи секоја недела за да се набљудуваат различните процеси на регенерација на коските во секоја група (Слика S9).Калусот и зрелите коски се прикажани во сина/зелена и слонова коска, соодветно.Повеќето меки ткива се филтрираат со претходно поставен праг.Акт позитивни и SHP потврдија формирање на мала количина на калус околу местото на фрактурата.Од друга страна, изложениот негатив на LOIS и местото на фрактура се опкружени со густ калус.Сликите со микро-КТ покажаа дека формирањето на калус е попречено од бактериска инфекција и воспаление поврзано со инфекција.Тоа е затоа што на имунолошкиот систем му дава приоритет на заздравувањето на септичките повреди предизвикани од воспаление поврзано со инфекција, наместо обновување на коските (60).Беше изведено боење со IHC и тартрат-отпорна кисела фосфатаза (TRAP) за да се набљудува активноста на остеокластите и коскената ресорпција (Слика 6Д) (61).Само неколку активирани остеокласти обоени во виолетова боја беа пронајдени во голи позитиви и SHP.Од друга страна, многу активирани остеокласти беа забележани во близина на голите позитивни и зрели коски на LOIS.Овој феномен покажува дека во присуство на остеокласти, калусот околу местото на фрактура е подложен на насилен процес на ремоделирање (62).Волуменот на коските и областа на изразување на остеокластите на калусот беа измерени за да се спореди нивото на формирање на калус околу местото на фрактура во сите групи, за да се квантифицираат резултатите од микро-КТ скен и IHC (слика 6E, 1 и 2).Како што се очекуваше, голите негативи и формирањето на калус во LOIS беа значително повисоки отколку во другите групи, што укажува дека се случи позитивно ремоделирање на коските (63).Сликата S10 ја прикажува оптичката слика на хируршкото место, резултатот од боење MT на ткивото собрано во близина на завртката и резултатот од боењето TRAP што ја истакнува интерфејсот на шраф-коска.Во голиот супстрат, забележано е формирање на силен калус и фиброза, додека имплантот третиран со LOIS покажа релативно нелепена површина.Слично на тоа, во споредба со голите негативи, пониска фиброза е забележана кај зајаците имплантирани со LOIS, како што е наведено со белите стрелки.Дополнително, цврстиот едем (сина стрелка) може да се припише на својствата на имунолошката евазија на LOIS, со што се намалува тешкото воспаление.Нелепливата површина околу имплантот и намалената фиброза сугерираат дека процесот на отстранување е полесен, што обично резултира со други фрактури или воспаление.Процесот на заздравување на коските по отстранувањето на завртката беше оценет со активноста на остеокластите на интерфејсот на шраф-коска.И голата коска и интерфејсот на имплантот LOIS апсорбираа слични нивоа на остеокласти за понатамошно заздравување на коските, што покажува дека облогата LOIS нема негативен ефект врз заздравувањето на коските или имунолошкиот одговор.Со цел да се потврди дека модификацијата на површината извршена на LOIS не го попречува процесот на заздравување на коските, се користеше рендгенски преглед за да се спореди заздравувањето на коските на зајаците со изложени негативни јони и 6 недели од имплантација на LOIS (Слика 6F).Резултатите покажаа дека во споредба со неинфицираната гола позитивна група, LOIS покажа ист степен на заздравување на коските и немаше очигледни знаци на фрактура (континуирана линија на остеолиза) во двете групи.
(А) Шематски дијаграм на процесот на заздравување на коските по фрактура.(Б) Разликата во степенот на формирање на калус на секоја површинска група и (В) сликата на напречниот пресек на местото на фрактурата.(Г) TRAP боење за да се визуелизира активноста на остеокластите и коскената ресорпција.Врз основа на активноста на TRAP, формирањето на надворешен калус на кортикалната коска беше квантитативно анализирано со (Е) (1) микро-КТ и (2) активност на остеокластите.(F) 6 недели по имплантацијата, рендгенски снимки на скршената коска на изложениот негатив (нагласен со црвениот испрекинат правоаголник) и LOIS (нагласен со синиот испрекинат правоаголник).Статистичката анализа беше направена со еднонасочна анализа на варијанса (АНОВА).* P <0,05.** P <0,01.
Накратко, LOIS обезбедува нов тип на стратегија за антибактериска инфекција и имунолошка обвивка за ортопедски импланти.Конвенционалните ортопедски импланти со функционализација на SHP покажуваат краткорочни анти-бионасипни својства, но не можат да ги задржат своите својства долго време.Суперхидрофобноста на подлогата ги заробува воздушните меури помеѓу бактериите и подлогата, со што се формираат воздушни џебови, со што се спречува бактериска инфекција.Меѓутоа, поради дифузијата на воздухот, овие воздушни џебови лесно се отстрануваат.Од друга страна, LOIS добро ја докажа својата способност да ги спречи инфекциите поврзани со биофилмот.Затоа, поради својствата против отфрлање на слојот за подмачкување вбризгуван во слојната површина на микро/нано структурата, воспалението поврзано со инфекција може да се спречи.Различни методи на карактеризација, вклучувајќи мерења SEM, AFM, XPS и CA се користат за да се оптимизираат условите за производство на LOIS.Покрај тоа, LOIS може да се примени и на различни биолошки материјали кои вообичаено се користат во опремата за ортопедска фиксација, како што се PLGA, Ti, PE, POM и PPSU.Потоа, LOIS беше тестиран ин витро за да ги докаже неговите анти-бионасипни својства против бактерии и биолошки супстанции поврзани со имунолошкиот одговор.Резултатите покажуваат дека има одлични антибактериски и антибионасипни ефекти во споредба со голиот имплант.Дополнително, LOIS покажува механичка сила дури и по примена на механички стрес, што е неизбежно во пластичната хирургија.Поради самолекувачките својства на лубрикантот на површината на микро/нано структурата, LOIS успешно ги задржа своите антибиолошки својства на валкање.Со цел да се проучат биокомпатибилноста и антибактериските својства на LOIS in vivo, LOIS беше имплантирана во бедрената коска на зајакот 4 недели.Не е забележана бактериска инфекција кај зајаци имплантирани со LOIS.Дополнително, употребата на IHC покажа намалено ниво на локален имунолошки одговор, што покажува дека LOIS не го инхибира процесот на заздравување на коските.LOIS покажува одлични антибактериски и имунолошка евазија својства и докажано е дека ефикасно го спречува создавањето на биофилм пред и за време на ортопедската хирургија, особено за синтеза на коските.Со користење на модел на инфламаторна фрактура на коскена срцевина на зајак, ефектот на инфекциите поврзани со биофилмот врз процесот на заздравување на коските предизвикани од претходно инкубирани импланти беше длабоко проучен.Како идна студија, потребен е нов in vivo модел за проучување на можните инфекции по имплантацијата за целосно разбирање и спречување на инфекции поврзани со биофилмот во текот на целиот процес на заздравување.Дополнително, остеоиндукцијата сè уште е нерешен предизвик во интеграцијата со LOIS.Потребни се дополнителни истражувања за да се комбинира селективна адхезија на остеоиндуктивните клетки или регенеративната медицина со LOIS за да се надмине предизвикот.Севкупно, LOIS претставува ветувачка обвивка за ортопедски имплант со механичка робусност и одлични својства против бионасипување, што може да ги намали SSI и имунолошките несакани ефекти.
Измијте ја 15mm x 15mm x 1mm 304 SS подлогата (Dong Kang M-Tech Co., Кореја) во ацетон, EtOH и DI вода 15 минути за да ги отстраните загадувачите.Со цел да се формира структура на микро/нано ниво на површината, исчистената подлога се потопува во раствор од 48% до 51% HF (DUKSAN Corp., Јужна Кореја) на 50°C.Времето на офорт варира од 0 до 60 минути.Потоа, гравираната подлога беше исчистена со дејонизирана вода и ставена во 65% раствор HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) на 50°C 30 минути за да се формира слој за пасивација на хром оксид на површината.По пасивацијата, подлогата се мие со дејонизирана вода и се суши за да се добие подлога со слоевита структура.Потоа, подлогата беше изложена на кислородна плазма (100 W, 3 минути) и веднаш потопена во раствор од 8,88 mM POTS (Сигма-Олдрич, Германија) во толуен на собна температура 12 часа.Потоа, подлогата обложена со POTS беше исчистена со EtOH и жарена на 150°C 2 часа за да се добие густ POTS SAM.По SAM облогата, на подлогата се формираше лубрикантски слој со нанесување на лубрикант за перфлуорополиетер (Krytox 101; DuPont, САД) со волумен на полнење од 20 μm/cm 2. Пред употреба, филтрирајте го лубрикантот преку филтер од 0,2 микрони.Отстранете го вишокот лубрикант со навалување под агол од 45° 15 минути.Истата производна процедура се користеше за ортопедски импланти направени од 304 SS (плоча за заклучување и кортикална завртка за заклучување; Dong Kang M-Tech Co., Кореја).Сите ортопедски импланти се дизајнирани да одговараат на геометријата на бедрената коска на зајакот.
Морфологијата на површината на подлогата и ортопедските импланти беше проверена со теренска емисија SEM (Inspect F50, FEI, USA) и AFM (XE-100, Park Systems, Јужна Кореја).Грубоста на површината (Ra, Rq) се мери со множење на површината од 20 μm со 20 μm (n=4).За анализа на хемискиот состав на површината се користеше систем XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Јапонија) опремен со извор на Х-зраци Al Kα со големина на точка од 100μm2.Систем за мерење CA опремен со динамична камера за снимање слики (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Јужна Кореја) се користеше за мерење на течни CA и SA.За секое мерење, 6 до 10 μl капки (деионизирана вода, коњска крв, ЕГ, 30% етанол и HD) се ставаат на површината за да се измери CA.Кога аголот на наклон на подлогата се зголемува со брзина од 2°/s (n = 4), SA се мери кога капката паѓа.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] и MRSA (ATCC 25923) беа купени од ATCC (Manassas, Вирџинија, САД), а сток културата се одржуваше на -80°C.Пред употреба, замрзнатата култура беше инкубирана во супа од соја одмрзната со трипсин (Комед, Кореја) на 37°C за 18 часа, а потоа двапати беше пренесена за да се активира.По инкубацијата, културата се центрифугира на 10.000 вртежи во минута 10 минути на 4°C и се изми двапати со раствор од PBS (pH 7,3).Центрифугираната култура потоа се субкултура на плочи со крвен агар (BAP).MRSA и Pseudomonas aeruginosa беа подготвени преку ноќ и култивирани во супа Лурија-Бертани.Концентрацијата на Pseudomonas aeruginosa и MRSA во инокулумот беше квантитативно одредена со CFU на суспензијата во сериски разредувања на агар.Потоа, прилагодете ја бактериската концентрација на 0,5 McFarland стандард, што е еквивалентно на 108 CFU/ml.Потоа разредете ја работната бактериска суспензија 100 пати до 106 CFU/ml.За тестирање на антибактериските својства на адхезија, подлогата беше стерилизирана на 121°C 15 минути пред употреба.Подлогата потоа беше пренесена во 25 ml бактериска суспензија и инкубирана на 37°C со силно протресување (200 вртежи во минута) 12 и 72 часа.По инкубацијата, секој супстрат беше отстранет од инкубаторот и измиен 3 пати со PBS за да се отстранат сите лебдечки бактерии на површината.Со цел да се набљудува биофилмот на подлогата, биофилмот се фиксира со метанол и се бојосува со 1 ml портокалова кримидин 2 минути.Потоа се користеше флуоресцентен микроскоп (BX51TR, Olympus, Јапонија) за фотографирање на обоениот биофилм.Со цел да се квантифицира биофилмот на подлогата, прикачените ќелии беа одвоени од подлогата со методот на вител на мониста, кој се сметаше за најсоодветен метод за отстранување на прикачените бактерии (n = 4).Со помош на стерилни форцепс, отстранете ја подлогата од медиумот за раст и допрете ја плочата за бунарот за да го отстраните вишокот течност.Лабаво прицврстените клетки беа отстранети со двапати миење со стерилен PBS.Секоја супстрат потоа беше префрлена во стерилна епрувета која содржи 9 ml 0,1% протеин ept солен раствор (PSW) и 2 g од 20 до 25 стерилни стаклени зрна (од 0,4 до 0,5 mm во дијаметар).Потоа се вртеше 3 минути за да се одвојат клетките од примерокот.По вртлогот, суспензијата беше сериски разредена 10 пати со 0,1% PSW, а потоа 0,1 ml од секое разредување беше инокулирана на BAP.По 24 часа инкубација на 37°C, CFU се броеше рачно.
За клетките, беа користени фибробласти на глувци NIH/3T3 (CRL-1658; американски ATCC) и макрофаги на глувци RAW 264.7 (TIB-71; американски ATCC).Користете го модифицираниот медиум Eagle на Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Кореја) за одгледување фибробласти од глушец и дополнете со 10% серум од телето (S103-01, Welgene) и 1% пеницилин-стрептомицин (PS ; LS202-02, Welgenel Користете DMEM за одгледување на макрофаги од глувци, дополнети со 10% говедски серум (S001-01, Welgene) и 1% PS. Клетките беа инкубирани во текот на ноќта на 37°C и 5% CO2 на 37°C за 30 минути , флуоресцеин, флуоресцеин изотиоцијанат-албумин (А9771, Сигма-Олдрич, Германија) и човечка плазма.Концентрациите на албумин и фибриноген беа 1 и 150 μg/ml, соодветно.По подлогата Пред да ги потопите во протеинскиот раствор, исплакнете ги со PBS за да се рехидрира површината.Потоа потопете ги сите подлоги во чинија со шест бунари што го содржи протеинскиот раствор и инкубирајте на 37°C 30 и 90 минути.По инкубацијата, супстратот потоа беше отстранет од протеинскиот раствор, нежно измиен со PBS 3 пати и фиксиран со 4% параформалдехид (n = 4 за секој протеин).За калциум, натриум хлорид (0,21 M) и калиум фосфат (3,77 mM) се растворени во дејонизирана вода.рН на растворот беше прилагоден на 2,0 со додавање на раствор на хидрохлорид (1 М).Потоа во растворот се раствори калциум хлорид (5,62 mM).Со додавање на 1M трис(хидроксиметил)-амино Метанот ја прилагодува pH вредноста на растворот на 7,4.Потопете ги сите подлоги во чинија со шест бунари исполнета со 1,5× раствор на калциум фосфат и отстранете ја од растворот по 30 минути.За боење, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) се меша со 100 ml дејонизирана вода.Потоа, употребете 10% амониум хидроксид за да ја прилагодите pH вредноста на 4. Обојте ја подлогата со растворот Alizarin Red 5 минути, а потоа истресете го вишокот боја и размачкајте.По процесот на тресење, отстранете ја подлогата.Материјалот се дехидрира, потоа се потопува во ацетон 5 минути, потоа се потопува во раствор од ацетон-ксилен (1:1) 5 минути и на крајот се мие со ксилен (n = 4).Се користи флуоресцентен микроскоп (Axio Imager) со објективи ×10 и ×20..A2m, Zeiss, Германија) ги прикажува сите подлоги.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) беше искористена за квантифицирање на податоците за адхезијата на биолошките супстанции на секоја група од четири различни области за сликање.Претворете ги сите слики во бинарни слики со фиксни прагови за споредба на подлогата.
За следење на стабилноста на слојот за подмачкување во PBS во режим на рефлексија се користеше конфокален микроскоп Zeiss LSM 700.Примерокот од стакло обложен со SAM на база на флуор со вбризгуван подмачкувачки слој беше потопен во раствор од PBS и беше тестиран со помош на орбитален шејкер (SHO-1D; Daihan Scientific, Јужна Кореја) под благи услови на тресење (120 вртежи во минута).Потоа земете го примерокот и следете ја загубата на лубрикантот со мерење на загубата на рефлектираната светлина.За да се добијат слики со флуоресценција во режим на рефлексија, примерокот се изложува на ласер од 633 nm и потоа се собира, бидејќи светлината ќе се рефлектира назад од примерокот.Примероците беа мерени во временски интервали од 0, 30, 60 и 120 часа.
Со цел да се утврди влијанието на процесот на модификација на површината врз наномеханичките својства на ортопедските импланти, наноиндентер (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) опремен со тристран врв на дијамант Беркович во облик на пирамида беше користен за мерење на наноиндендион.Врвното оптоварување е 10 mN, а површината е 100μmx 100μm.За сите мерења, времето на полнење и истовар е 10 секунди, а времето на задржување при максимално оптоварување со вдлабнување е 2 секунди.Земете мерења од пет различни локации и земете го просекот.Со цел да се оценат перформансите на механичката цврстина под оптоварување, беше извршен тест за попречно свиткување со три точки со помош на универзална машина за тестирање (Instron 5966, Instron, САД).Подлогата се компресира со константна брзина од 10 N/s со зголемено оптоварување.Софтверската програма Bluehill Universal (n = 3) беше искористена за пресметување на модулот на виткање и максималното напрегање на притисок.
Со цел да се симулира процесот на операција и поврзаните механички оштетувања предизвикани за време на операцијата, процесот на операција беше изведен ин витро.Фемурите се собрани од погубените новозеландски бели зајаци.Бутната коска беше исчистена и фиксирана во 4% параформалдехид за 1 недела.Како што е опишано во методот на експеримент со животни, фиксираната бедрена коска била оперирана хируршки.По операцијата, ортопедскиот имплант беше потопен во крв (коњска крв, KISAN, Кореја) 10 секунди за да се потврди дали се појавиле крвни адхезии по нанесувањето на механичката повреда (n = 3).
Вкупно 24 машки новозеландски бели зајаци (тежина од 3,0 до 3,5 кг, просечна возраст од 6 месеци) беа случајно поделени во четири групи: голи негативни, голи позитивни, SHP и LOIS.Сите процедури кои вклучуваат животни беа извршени во согласност со етичките стандарди на Комитетот за институционална нега и употреба на животните (Одобрено од IACUC, KOREA-2017-0159).Ортопедскиот имплант се состои од плоча за заклучување со пет отвори (должина 41 mm, ширина 7 mm и дебелина 2 mm) и кортикални завртки за заклучување (должина 12 mm, дијаметар 2,7 mm) за фиксација на фрактура.Освен оние плочи и завртки кои се користат во групата со голи негативни, сите плочи и завртки беа инкубирани во MRSA суспензија (106 CFU/ml) 12 часа.Голо-негативната група (n=6) беше третирана со голи површински импланти без изложување на бактериска суспензија, како негативна контрола за инфекција.Голата позитивна група (n = 6) беше третирана со имплант на гола површина изложена на бактерии како позитивна контрола за инфекција.Групата SHP (n = 6) беше третирана со бактериски изложени SHP импланти.Конечно, групата LOIS беше третирана со LOIS импланти изложени на бактерии (n = 6).Сите животни се чуваат во кафез, а обезбедена е и многу храна и вода.Пред операцијата, зајаците биле пости 12 часа.Животните беа анестезирани со интрамускулна инјекција на ксилазин (5 mg/kg) и интравенска инјекција на паклитаксел (3 mg/kg) за индукција.После тоа, доставете 2% изофлуран и 50% до 70% медицински кислород (брзина на проток 2 L/min) низ респираторниот систем за да се одржи анестезијата.Се вградува преку директен пристап до латералната бедрена коска.По отстранување на влакна и дезинфекција на кожата со повидон-јод, направен е засек долг околу 6 см од надворешната страна на левата средна бутна коска.Со отворање на јазот помеѓу мускулите што ја покриваат бедрената коска, бедрената коска е целосно изложена.Поставете ја плочата пред феморалната осовина и фиксирајте ја со четири завртки.По фиксирањето, употребете сечило за пила (дебелина 1 mm) за вештачки да создадете фрактура во областа помеѓу втората дупка и четвртата дупка.На крајот на операцијата, раната беше измиена со физиолошки раствор и затворена со конци.Секој зајак беше инјектиран субкутано со енрофлоксацин (5 mg/kg) разреден за една третина во солен раствор.Постоперативните рендгенски снимки на бедрената коска беа направени кај сите животни (0, 7, 14, 21, 28 и 42 дена) за да се потврди остеотомијата на коската.По длабока анестезија, сите животни беа убиени со интравенски KCl (2 mmol/kg) на 28 и 42 дена.По извршувањето, бедрената коска беше скенирана со микро-КТ за да се набљудува и спореди процесот на заздравување на коските и формирањето на нова коска помеѓу четирите групи.
По извршувањето, беа собрани меките ткива кои беа во директен контакт со ортопедските импланти.Ткивото беше фиксирано во 10% неутрален пуфериран формалин преку ноќ, а потоа дехидрирано во EtOH.Дехидрираното ткиво беше вградено во парафин и пресечено на дебелина од 40 μm со помош на микротом (400CS; EXAKT, Германија).Со цел да се визуелизира инфекцијата, беше извршено боење H&E и MT боење.Со цел да се провери одговорот на домаќинот, отсеченото ткиво беше инкубирано со примарно антитело зајачко анти-TNF-α (AB6671, Abcam, САД) и зајачко анти-IL-6 (AB6672; Abcam, САД), а потоа беше третирано со рен.Оксидаза.Нанесете го системот за боење авидин-биотин комплекс (ABC) на деловите според упатствата на производителот.Со цел да се појави како производ на кафеава реакција, 3,3-диаминобензидин беше користен во сите делови.Дигитален скенер за слајдови (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Унгарија) беше користен за визуелизација на сите парчиња, а најмалку четири супстрати во секоја група беа анализирани со софтверот ImageJ.
Рендгенски снимки беа направени кај сите животни по операцијата и секоја недела за да се следи заздравувањето на фрактурите (n=6 по група).По извршувањето, микро-КТ со висока резолуција беше користен за да се пресмета формирањето на калус околу бедрената коска по заздравувањето.Добиената бутна коска беше исчистена, фиксирана во 4% параформалдехид 3 дена и дехидрирана во 75% етанол.Дехидрираните коски потоа беа скенирани со помош на микро-КТ (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Белгија) за да се генерираат 3D вокселни слики (2240×2240 пиксели) од примерокот на коските.Користете 1,0 mm Al филтер за да го намалите шумот на сигналот и да примените висока резолуција на сите скенирања (E = 133 kVp, I = 60 μA, време на интеграција = 500 ms).Софтверот Nrecon (верзија 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Белгија) беше користен за генерирање на 3D волумен на скенираниот примерок од добиената 2D странична проекција.За анализа, 3D реконструираната слика е поделена на коцки 10mm×10mm×10mm според местото на фрактурата.Пресметајте го калусот надвор од кортикалната коска.Софтверот DataViewer (верзија 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Белгија) беше користен за дигитално пренасочување на скенираниот волумен на коските, а софтверот CT-Analyzer (верзија 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Белгија) за анализа.Релативните коефициенти на апсорпција на рендгенските зраци во зрелата коска и калус се разликуваат по нивната густина, а потоа се квантифицира волуменот на калусот (n = 4).Со цел да се потврди дека биокомпатибилноста на LOIS не го одложува процесот на заздравување на коските, беа направени дополнителни рендгенски и микро-КТ анализи кај два зајаци: голо-негативните и LOIS групите.Двете групи беа егзекутирани во 6-тата недела.
Фемурите од жртвуваните животни беа собрани и фиксирани во 4% параформалдехид за 3 дена.Ортопедскиот имплант потоа внимателно се отстранува од бедрената коска.Бутната коска беше декалцифицирана 21 ден со употреба на 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Потоа декалцифицираната бутна коска беше потопена во EtOH за да се дехидрира.Дехидрираната бутна коска беше отстранета во ксилен и вградена во парафин.Потоа примерокот беше исечен со автоматски ротационен микротом (Leica RM2255, Leica Biosystems, Германија) со дебелина од 3 μm.За боење TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Германија), исечените примероци беа депарафинирани, рехидрирани и инкубирани во TRAP реагенс на 37°C за 1 час.Сликите беа добиени со помош на скенер за слајдови (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Унгарија) и квантифицирани со мерење на покриеноста на површината на обоената површина.Во секој експеримент, најмалку четири супстрати во секоја група беа анализирани со софтверот ImageJ.
Беше направена статистичка значајна анализа со користење на GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., САД).За тестирање на разликите помеѓу групите за евалуација беа користени непарираниот t-тест и еднонасочната анализа на варијанса (ANOVA).Нивото на значајност е прикажано на сликата на следниот начин: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 и ****P<0,0001;НС, нема значајна разлика.
За дополнителни материјали за овој напис, видете http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Ова е напис со отворен пристап дистрибуиран под условите на Creative Commons Наведи извор-Некомерцијална лиценца, која дозволува употреба, дистрибуција и репродукција на кој било медиум, се додека употребата не е за комерцијална корист и премисата е дека оригиналот работата е точна.Референца.
Забелешка: Од вас бараме само да наведете адреса за е-пошта за да може лицето што го препорачувате на страницата да знае дека сакате да ја види е-поштата и дека е-поштата не е спам.Нема да фаќаме никакви адреси на е-пошта.
Ова прашање се користи за да се тестира дали сте човечки посетител и да се спречи автоматско поднесување спам.
Чое Кјунг Мин, О Јанг Јанг, Парк Џун Џун, Ли Џин Хјук, Ким Хјун Чеол, Ли Кјунг Мун, Ли Чанг Кју, Ли Јеон Таек, Ли Сун-ук, Џеонг Моруи
Антибактериските и имунолошките облоги на ортопедските импланти може да ги намалат инфекциите и имунолошките реакции предизвикани од инфекции.
Чое Кјунг Мин, О Јанг Јанг, Парк Џун Џун, Ли Џин Хјук, Ким Хјун Чеол, Ли Кјунг Мун, Ли Чанг Кју, Ли Јеон Таек, Ли Сун-ук, Џеонг Моруи
Антибактериските и имунолошките облоги на ортопедските импланти може да ги намалат инфекциите и имунолошките реакции предизвикани од инфекции.
©2021 Американско здружение за унапредување на науката.Сите права се задржани.AAAS е партнер на HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.