Patsientide jaoks, kellele tehakse ortopeedilise implantaadi operatsioon, on bakteriaalsed infektsioonid ja infektsioonist tingitud immuunvastused alati olnud eluohtlikud riskid.Tavapärased bioloogilised materjalid on vastuvõtlikud bioloogilisele saastumisele, mis põhjustab bakterite tungimist kahjustatud piirkonda ja põhjustab operatsioonijärgset infektsiooni.Seetõttu on tungiv vajadus välja töötada ortopeediliste implantaatide infektsioonivastased ja immuunkaitsekatted.Siin oleme välja töötanud ortopeediliste implantaatide jaoks täiustatud pinna modifitseerimise tehnoloogia nimega Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), mis on inspireeritud kannikute kannude siledast pinnast.LOIS-il on pikaajaline ja tugev vedelike tõrjuvus erinevate vedelike ja bioloogiliste ainete (sh rakud, valgud, kaltsium ja bakterid) suhtes.Lisaks kinnitasime mehaanilist vastupidavust kriimustuste ja kinnitusjõu vastu, simuleerides vältimatuid kahjustusi in vitro operatsiooni ajal.Küüliku luuüdi põletikulise reieluumurru mudelit kasutati LOIS-i antibioloogilise tagumise ja infektsioonivastase võime põhjalikuks uurimiseks.Näeme, et LOIS, millel on biomäärdumisvastased omadused ja mehaaniline vastupidavus, on samm edasi infektsioonivaba ortopeedilise kirurgia vallas.
Tänapäeval on üldise vananemise tõttu ortopeedilisi haigusi (nagu eakate luumurrud, degeneratiivsed liigesehaigused ja osteoporoos) põdevate patsientide arv oluliselt suurenenud (1, 2).Seetõttu peavad meditsiiniasutused väga tähtsaks ortopeedilist kirurgiat, sealhulgas kruvide, plaatide, küünte ja kunstliigeste ortopeedilisi implantaate (3, 4).Siiski on teatatud, et traditsioonilised ortopeedilised implantaadid on vastuvõtlikud bakteriaalsele adhesioonile ja biokile moodustumisele, mis võib pärast operatsiooni põhjustada kirurgilise koha infektsiooni (SSI) (5, 6).Kui biokile on ortopeedilise implantaadi pinnale moodustunud, muutub biokile eemaldamine äärmiselt keeruliseks isegi suurte antibiootikumide annuste kasutamisel.Seetõttu põhjustab see tavaliselt raskeid postoperatiivseid infektsioone (7, 8).Eeltoodud probleemide tõttu peaks nakatunud implantaatide ravi hõlmama kordusoperatsiooni, sealhulgas kõigi implantaatide ja ümbritsevate kudede eemaldamist;seetõttu kannatab patsient tugevat valu ja mõningaid riske (9, 10).
Mõnede nende probleemide lahendamiseks on välja töötatud ravimeid elueerivad ortopeedilised implantaadid, et vältida nakatumist, kõrvaldades pinnale kinnitunud bakterid (11, 12).Strateegia näitab siiski mitmeid piiranguid.On teatatud, et ravimit elueerivate implantaatide pikaajaline implanteerimine on kahjustanud ümbritsevaid kudesid ja põhjustanud põletikku, mis võib viia nekroosini (13, 14).Lisaks vajavad orgaanilised lahustid, mis võivad eksisteerida pärast ravimeid elueerivate ortopeediliste implantaatide tootmisprotsessi, mis on USA Toidu- ja Ravimiameti poolt rangelt keelatud, selle standardite täitmiseks täiendavaid puhastamisetappe (15).Ravimeid elueerivad implantaadid on ravimite kontrollitud vabanemise jaoks keerulised ja nende piiratud ravimikoormuse tõttu ei ole ravimi pikaajaline kasutamine teostatav (16).
Teine levinud strateegia on implantaadi katmine saastumisvastase polümeeriga, et vältida bioloogiliste ainete ja bakterite pinnale kleepumist (17).Näiteks on tsvitterioonsed polümeerid äratanud tähelepanu nende mittekleepuvate omaduste tõttu kokkupuutel plasmavalkude, rakkude ja bakteritega.Siiski on sellel mõned piirangud, mis on seotud pikaajalise stabiilsuse ja mehaanilise vastupidavusega, mis takistavad selle praktilist kasutamist ortopeedilistes implantaatides, eriti mehaanilise kraapimise tõttu kirurgiliste protseduuride ajal (18, 19).Lisaks on selle kõrge biosobivuse, eemaldamisoperatsiooni vajaduse puudumise ja pinna puhastamise omaduste tõttu läbi korrosiooni kasutatud biolagunevatest materjalidest ortopeedilisi implantaate (20, 21).Korrosiooni käigus polümeermaatriksi vahelised keemilised sidemed lagunevad ja eralduvad pinnast ning kleepuvad ained puhastavad pinda.Pinna puhastamisega bioloogiline saastumisvastane toime on aga efektiivne lühikese aja jooksul.Lisaks toimub enamik imenduvaid materjale, sealhulgas polü(piimhappe-glükoolhappe kopolümeer) (PLGA), polüpiimhapet (PLA) ja magneesiumipõhiseid sulamid, organismis ebaühtlaselt biolagunemas ja erosioonis, mis mõjutab negatiivselt mehaanilist stabiilsust.(kakskümmend kaks).Lisaks pakuvad biolagunevad plaadifragmendid bakteritele kinnitumiskohta, mis suurendab pikemas perspektiivis nakatumise võimalust.See mehaanilise lagunemise ja nakatumise oht piirab plastilise kirurgia praktilist rakendamist (23).
Superhüdrofoobsed (SHP) pinnad, mis jäljendavad lootoselehtede hierarhilist struktuuri, on muutunud saastumisvastaste pindade potentsiaalseks lahenduseks (24, 25).Kui SHP pind on vedelikku sukeldatud, jäävad õhumullid kinni, moodustades seeläbi õhutaskuid ja takistades bakterite adhesiooni (26).Hiljutised uuringud on aga näidanud, et SHP pinnal on puudusi, mis on seotud mehaanilise vastupidavuse ja pikaajalise stabiilsusega, mis takistab selle kasutamist meditsiinilistes implantaatides.Veelgi enam, õhutaskud lahustuvad ja kaotavad oma saastumisvastased omadused, mille tulemuseks on bakterite laiem adhesioon SHP pinna suure pindala tõttu (27, 28).Hiljuti võtsid Aizenberg ja tema kolleegid kasutusele uuendusliku meetodi biomäärdumisvastase pinnakatmiseks, töötades välja sileda pinna, mis on inspireeritud Nepenthesi kanntaimedest (29, 30).Sile pind näitab pikaajalist stabiilsust hüdraulilistes tingimustes, on äärmiselt vedelikku tõrjuv bioloogiliste vedelike suhtes ja sellel on iseparanevad omadused.Siiski ei ole meetodit katte pealekandmiseks keerulise kujuga meditsiinilisele implantaadile ega ole tõestatud, et see toetaks kahjustatud koe paranemisprotsessi pärast implanteerimist.
Siin tutvustame määritud ortopeedilist implantaadi pinda (LOIS), mikro-/nanostruktuuriga ortopeedilist implantaadi pinda, mis on tihedalt ühendatud õhukese määrdekihiga, et vältida selle seostamist plastilise kirurgiaga Bakteriaalsed infektsioonid, näiteks luumurdude fikseerimine.Kuna fluoriga funktsionaliseeritud mikro-/nanotaseme struktuur kinnitab määrdeaine kindlalt konstruktsioonile, suudab välja töötatud LOIS täielikult tõrjuda erinevate vedelike nakkumist ja säilitada saastumisvastase toime pikka aega.LOIS katteid saab kanda erineva kujuga materjalidele, mis on ette nähtud luu sünteesiks.LOIS-i suurepärased biosaastevastased omadused biokilebakterite [Pseudomonas aeruginosa ja metitsilliiniresistentse Staphylococcus aureus (MRSA)] ja bioloogiliste ainete (rakud, valgud ja kaltsium) vastu on leidnud kinnitust in vitro.Ulatusliku nakkumise määr aluspinnaga on alla 1%.Lisaks aitab läbitungiva määrdeaine põhjustatud iseparanemine säilitada selle saastumisvastaseid omadusi isegi pärast mehaanilist pinget, näiteks pinna kriimustamist.Mehaanilise vastupidavuse testi tulemused näitavad, et isegi pärast struktuurset ja keemilist muutmist ei vähene kogutugevus oluliselt.Lisaks viidi läbi in vitro katse, mis simuleerib mehaanilist pinget kirurgilises keskkonnas, tõestamaks, et LOIS suudab taluda erinevaid mehaanilisi pingeid, mis tekivad plastilise kirurgia käigus.Lõpuks kasutasime küülikupõhist in vivo reieluumurru mudelit, mis tõestas, et LOIS-il on suurepärased antibakteriaalsed omadused ja biosobivus.Radioloogilised ja histoloogilised tulemused kinnitasid, et määrdeaine stabiilne käitumine ja biomäärdevastased omadused 4 nädala jooksul pärast implanteerimist võivad saavutada tõhusa infektsioonivastase ja immuunsüsteemi põgenemise, ilma luude paranemisprotsessi edasi lükkamata.
Joonisel fig 1A on kujutatud skemaatiline diagramm arendatud LOIS-ist, mis on implanteeritud küüliku reieluumurru mudelisse mikro-/nanomastaabis struktuuridega, et kinnitada selle suurepäraseid bioloogilisi saastumis- ja infektsioonivastaseid omadusi.Biomimeetiline meetod viiakse läbi, et simuleerida veepoti taime pinda ja vältida biomäärdumist, lisades pinna mikro-/nanostruktuuri määrdeainekihi.Määrdeainega süstitud pind võib minimeerida kokkupuute bioloogiliste ainete ja pinna vahel.Seetõttu on pinnale stabiilsete keemiliste sidemete moodustumise tõttu suurepärane saastumisvastane toime ja pikaajaline stabiilsus.Tänu sellele võimaldavad määrdepinna biomäärdumisvastased omadused kasutada erinevaid praktilisi rakendusi biomeditsiinilistes uuringutes.Kuid ulatuslikud uuringud selle erilise pinna vastastikusest mõjust organismis pole veel lõppenud.Võrreldes LOIS-i paljaste substraatidega in vitro, kasutades albumiini ja biokile baktereid, saab kinnitada LOIS-i mittekleepuvust (joonis 1B).Lisaks saab veepiiskade veeremisega kaldpinnal ja LOIS-i substraadil (joonis S1 ja film S1) näidata bioloogilist saastumist.Nagu on näidatud fluorestsentsmikroskoobi kujutisel, näitas valgu ja bakterite suspensioonis inkubeeritud eksponeeritud substraadi pinnale suurt hulka bioloogilist materjali.Kuid tänu oma suurepärastele biomäärdumisvastastele omadustele ei näita LOIS peaaegu üldse fluorestsentsi.Selle biosaaste- ja infektsioonivastaste omaduste kinnitamiseks kanti LOIS luu sünteesiks mõeldud ortopeediliste implantaatide pinnale (plaadid ja kruvid) ning asetati küüliku luumurru mudelisse.Enne implanteerimist inkubeeriti paljast ortopeedilist implantaati ja LOIS-i bakterisuspensioonis 12 tundi.Eelinkubatsioon tagab, et eksponeeritud implantaadi pinnale moodustub võrdluseks biokile.Joonisel fig 1C on kujutatud foto murrukohast 4 nädalat pärast implanteerimist.Vasakul palja ortopeedilise implantaadiga küülik näitas tõsist põletikku, mis oli tingitud biokile moodustumisest implantaadi pinnale.LOIS-iga siirdatud küülikutel täheldati vastupidist tulemust, see tähendab, et LOIS-i ümbritsevatel kudedel ei ilmnenud infektsiooni ega põletiku tunnuseid.Lisaks näitab vasakpoolne optiline kujutis eksponeeritud implantaadiga küüliku operatsioonikohta, mis näitab, et LOIS-i pinnal ei leitud mitut eksponeeritud implantaadi pinnal olevat liimi.See näitab, et LOISil on pikaajaline stabiilsus ja see suudab säilitada oma bioloogilise saastumise ja nakkumise vastased omadused.
(A) LOIS-i ja selle implanteerimise skemaatiline diagramm küüliku reieluu murru mudelis.(B) Valgu ja bakteriaalse biokile fluorestsentsmikroskoopiline pilt paljal pinnal ja LOIS-i substraadil.4 nädalat pärast implanteerimist (C) fotokujutis murrukohast ja (D) röntgenpilt (esile tõstetud punase ristkülikuga).Pilt: Kyomin Chae, Yonsei ülikool.
Steriliseeritud, eksponeeritud negatiivselt implanteeritud küülikutel ilmnes normaalne luu paranemisprotsess ilma põletiku või infektsiooni tunnusteta.Teisest küljest näitavad bakterisuspensioonis eelnevalt inkubeeritud SHP implantaadid ümbritsevates kudedes infektsiooniga seotud põletikku.Selle põhjuseks võib olla selle võimetus takistada bakterite adhesiooni pikka aega (joonis S2).Tõestamaks, et LOIS ei mõjuta paranemisprotsessi, vaid pärsib võimalikke implantatsiooniga seotud infektsioone, võrreldi eksponeeritud positiivse maatriksi ja LOIS-i röntgenipilte murdekohas (joonis 1D).Palja positiivse implantaadi röntgenipilt näitas püsivaid osteolüüsi jooni, mis näitab, et luu ei olnud täielikult paranenud.See viitab sellele, et luu taastumise protsess võib infektsiooniga seotud põletiku tõttu oluliselt edasi lükata.Vastupidi, see näitas, et LOIS-iga siirdatud küülikud olid paranenud ja neil ei olnud ilmset murdumiskohta.
Pikaajalise stabiilsuse ja funktsionaalsusega (sealhulgas vastupidavuse biomäärdumisele) meditsiiniliste implantaatide väljatöötamiseks on tehtud palju jõupingutusi.Erinevate bioloogiliste ainete olemasolu ja kudede adhesiooni dünaamika piirab aga nende kliiniliselt usaldusväärsete meetodite väljatöötamist.Nende puuduste ületamiseks oleme välja töötanud mikro/nanokihilise struktuuri ja keemiliselt modifitseeritud pinna, mis on tänu suurele kapillaarjõule ja keemilisele afiinsusele optimeeritud hoidma võimalikult sileda määrdeainet.Joonisel fig 2A on näidatud LOISi üldine tootmisprotsess.Esmalt valmistage ette meditsiinilise kvaliteediga roostevabast terasest (SS) 304 põhimik.Teiseks moodustatakse mikro- / nanostruktuur SS-substraadile keemilise söövitamise teel, kasutades vesinikfluoriidhappe (HF) lahust.SS-i korrosioonikindluse taastamiseks kasutatakse söövitatud substraadi töötlemiseks lämmastikhappe (HNO3) lahust (31).Passiveerimine suurendab SS-substraadi korrosioonikindlust ja aeglustab oluliselt korrosiooniprotsessi, mis võib vähendada LOIS-i üldist jõudlust.Seejärel, moodustades 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktüültrietoksüsilaaniga (POTS) isekoostatud monokihi (SAM), muudetakse pinda keemiliselt, et parandada pinna ja sileda määrdeaine afiinsuse vahelist keemilist koostoimet.Pinna modifikatsioon vähendab oluliselt valmistatud mikro-/nanomastaabis struktureeritud pinna pinnaenergiat, mis ühtib sileda määrdeaine pinnaenergiaga.See võimaldab määrdeainel täielikult märjaks saada, moodustades seeläbi pinnale stabiilse määrdeainekihi.Modifitseeritud pinnal on suurenenud hüdrofoobsus.Tulemused näitavad, et libe määrdeaine käitub LOIS-is stabiilselt tänu kõrgele keemilisele afiinsusele ja kapillaarjõule, mis on põhjustatud mikro-/nanostruktuurist (32, 33).Uuriti optilisi muutusi SS-i pinnal pärast pinna modifitseerimist ja määrdeaine süstimist.Pinnale moodustunud mikro/nanokihiline struktuur võib põhjustada visuaalseid muutusi ja pinda tumendada.Selle nähtuse põhjuseks on suurenenud valguse hajumise efekt karedal pinnal, mis suurendab valguse püüdmise mehhanismi (34) põhjustatud hajusat peegeldust.Lisaks muutub LOIS pärast määrdeaine süstimist tumedamaks.Määrdekiht peegeldub aluspinnalt vähem valgust, muutes seeläbi LOIS-i tumedamaks.Mikrostruktuuri/nanostruktuuri optimeerimiseks, et näidata väikseimat libisemisnurka (SA), et saavutada biomäärdumisvastane jõudlus, kasutati skaneerivat elektronmikroskoopiat (SEM) ja aatompaare erinevate HF söövitusaegade (0, 3) teostamiseks., 15 ja 60 minutit) Jõumikroskoop (AFM) (joonis 2B).SEM- ja AFM-pildid näitavad, et pärast lühikest söövitamist (3-minutilist söövitamist) on tühi substraat moodustanud ebaühtlase nanomõõtmelise kareduse.Pinna karedus muutub söövitusajaga (joonis S3).Ajaliselt muutuv kõver näitab, et pinna karedus jätkab suurenemist ja saavutab haripunkti 15-minutise söövitamise järel ning seejärel täheldatakse 30-minutise söövitamise järel vaid kerget kareduse väärtuse langust.Sel hetkel söövitatakse nanotaseme karedus ära, samal ajal kui mikrotaseme karedus areneb jõuliselt, muutes kareduse muutumise stabiilsemaks.Pärast enam kui 30-minutilist söövitamist täheldatakse kareduse edasist suurenemist, mida selgitatakse üksikasjalikult järgmiselt: SS koosneb terasest, mis on legeeritud selliste elementidega nagu raud, kroom, nikkel, molübdeen ja paljud muud elemendid.Nende elementide hulgas mängivad raud, kroom ja molübdeen HF-söövitamise teel olulist rolli SS-i mikroni-/nanomastaabi kareduse moodustamisel.Korrosiooni varases staadiumis on raud ja kroom peamiselt korrodeerunud, kuna molübdeenil on suurem korrosioonikindlus kui molübdeenil.Söövitamise edenedes jõuab söövituslahus kohaliku üleküllastumiseni, moodustades söövitusest põhjustatud fluoriide ja oksiide.Fluoriid ja oksiid sadestuvad ja sadestuvad lõpuks uuesti pinnale, moodustades pinna kareduse mikroni/nano vahemikus (31).Sellel mikro-/nanotasemel karedusel on oluline roll LOIS-i iseparanevates omadustes.Kahe skaala pind tekitab sünergilise efekti, suurendades oluliselt kapillaarjõudu.See nähtus võimaldab määrdeainel stabiilselt pinnale tungida ja aitab kaasa iseparanevatele omadustele (35).Kareduse teke sõltub söövitamise ajast.10-minutilise söövitamise ajal sisaldab pind ainult nanomõõtmelist karedust, millest ei piisa, et hoida piisavalt määrdeainet, et tagada biomäärdumiskindlus (36).Teisest küljest, kui söövitusaeg ületab 30 minutit, kaob raua ja kroomi ümberladestumisel tekkiv nanomõõtmeline karedus ning molübdeeni tõttu jääb alles vaid mikroskaala karedus.Ülesöövitatud pinnal puudub nanomõõtmeline karedus ja see kaotab kaheastmelise kareduse sünergilise efekti, mis mõjutab negatiivselt LOIS-i iseparanevaid omadusi.SA-mõõtmised viidi läbi erineva söövitusajaga substraatidel, et tõestada saastumisevastast toimet.Viskoossuse ja pinnaenergia põhjal valiti erinevat tüüpi vedelikke, sealhulgas deioniseeritud (DI) vesi, veri, etüleenglükool (EG), etanool (EtOH) ja heksadekaan (HD) (joonis S4).Ajaliselt muutuv söövitusmuster näitab, et erinevate vedelike puhul, millel on erinev pinnaenergia ja viskoossus, on LOIS-i SA pärast 15-minutilist söövitamist madalaim.Seetõttu on LOIS optimeeritud söövitama 15 minutit, et moodustada mikroni- ja nanoskaala karedus, mis sobib tõhusalt määrdeaine vastupidavuse ja suurepäraste saastumisvastaste omaduste säilitamiseks.
(A) LOIS-i neljaetapilise tootmisprotsessi skemaatiline diagramm.Sisend näitab substraadile moodustunud SAM-i.(B) SEM- ja AFM-kujutised, mida kasutatakse substraadi mikro-/nanostruktuuri optimeerimiseks erinevatel söövitusaegadel.(C) Cr2p ja (D) F1 röntgenkiirguse fotoelektronspektroskoopia (XPS) spektrid pärast pinna passiveerimist ja SAM katmist.au, suvaline ühik.(E) Tüüpilised kujutised veepiiskadest paljadel, söövitatud, SHP- ja LOIS-alustel.(F) SHP ja LOIS erineva pindpinevusega vedelike kontaktnurga (CA) ja SA mõõtmine.Andmed on väljendatud keskmisena ± SD.
Seejärel uuriti pinna keemiliste omaduste muutumise kinnitamiseks röntgenfotoelektronspektroskoopiat (XPS), et uurida substraadi pinna keemilise koostise muutust pärast iga pinnakatmist.Joonisel 2C on näidatud HF-söövitatud pinna ja HNO3-ga töödeldud pinna XPS-i mõõtmistulemused.Kaks peamist piiki 587, 3 ja 577, 7 eV juures võivad olla tingitud kroomoksiidi kihis olevast Cr-O sidemest, mis on peamine erinevus HF söövitatud pinnast.See on peamiselt tingitud raua ja kroomfluoriidi tarbimisest HNO3 pinnal.HNO3-põhine söövitus võimaldab kroomil moodustada pinnale passiveeriva oksiidikihi, mis muudab söövitatud SS-i taas korrosioonikindlaks.Joonisel fig 2D saadi XPS-spektrid kinnitamaks, et pärast SAM-katet tekkis pinnale fluorosüsinikul põhinev silaan, millel on äärmiselt kõrge vedelike tõrjuvus isegi EG, vere ja EtOH puhul.SAM-i kate viiakse lõpule silaani funktsionaalrühmade reageerimisel plasma töötlemisel moodustunud hüdroksüülrühmadega.Selle tulemusena täheldati CF2 ja CF3 piikide olulist suurenemist.Sidumisenergia vahemikus 286–296 eV näitab, et SAM-kattega on keemiline modifikatsioon edukalt lõpule viidud.SHP-l on suhteliselt suured CF2 (290,1 ​​eV) ja CF3 (293,3 eV) piigid, mis on põhjustatud pinnale moodustunud fluorosüsinikupõhisest silaanist.Joonisel 2E on kujutatud tüüpilised optilised kujutised kontaktnurga (CA) mõõtmistest erinevate deioniseeritud vee rühmade jaoks, mis puutuvad kokku palja, söövitatud, SHP ja LOISiga.Need pildid näitavad, et söövitatud pind muutub keemilise söövitamise teel moodustunud mikro-/nanostruktuuri tõttu hüdrofiilseks, nii et deioniseeritud vesi imendub struktuuri.Kui aga aluspind kaetakse SAM-iga, on substraadil tugev vetthülgavus, mistõttu moodustub pind SHP ning vee ja pinna vaheline kontaktpind on väike.Lõpuks täheldati LOIS-is CA vähenemist, mida võib seostada määrdeaine tungimisega mikrostruktuuri, suurendades seeläbi kontaktpinda.Selleks, et tõestada, et pinnal on suurepärane vedelikku tõrjuv ja mittekleepuvad omadused, võrreldi LOIS-i SHP substraadiga, mõõtes CA ja SA, kasutades erinevaid vedelikke (joonis 2F).Viskoossuse ja pinnaenergia põhjal valiti erinevat tüüpi vedelikke, sealhulgas deioniseeritud vesi, veri, EG, EtOH ja HD (joonis S4).CA mõõtmistulemused näitavad, et kui CA kaldub HD-le, siis CA redutseerimisväärtus, kus CA-l on madalaim pinnaenergia.Lisaks on üldise CA LOIS madal.SA mõõtmine näitab aga hoopis teistsugust nähtust.Kõik vedelikud, välja arvatud ioniseeritud vesi, kinnituvad SHP substraadile ilma maha libisemata.Teisest küljest näitab LOIS väga madalat SA-d, kus kogu vedeliku kallutamisel alla 10° kuni 15° nurga all veereb kogu vedelik maha.See näitab tugevalt, et LOIS-i mittenakkuvus on parem kui SHP pinna oma.Lisaks kantakse LOIS-katteid ka erinevat tüüpi materjalidele, sealhulgas titaanile (Ti), polüfenüülsulfoonile (PPSU), polüoksümetüleenile (POM), polüeeterketoonile (PEEK) ja bioabsorbeeruvatele polümeeridele (PLGA). Need on implanteeritavad ortopeedilised materjalid (joonis). S5)).LOIS-iga töödeldud materjalil olevate tilkade järjestikused kujutised näitavad, et LOIS-i biomäärdumisvastased omadused on kõigil substraatidel ühesugused.Lisaks näitavad CA ja SA mõõtmistulemused, et LOIS-i mittekleepuvaid omadusi saab rakendada ka teistele materjalidele.
LOIS-i saastumisvastaste omaduste kinnitamiseks inkubeeriti erinevat tüüpi substraate (sealhulgas paljad, söövitatud, SHP ja LOIS) Pseudomonas aeruginosa ja MRSA-ga.Need kaks bakterit valiti tüüpilisteks haiglabakteriteks, mis võivad viia biokilede moodustumiseni, mis viib SSI-ni (37).Joonisel 3 (A ja B) on näidatud lühiajaliselt (12 tundi) ja pikaajaliselt (72 tundi) bakterisuspensioonis inkubeeritud substraatide fluorestsentsmikroskoobi kujutised ja kolooniat moodustava ühiku (CFU) mõõtmistulemused.Lühikese aja jooksul moodustavad bakterid kobaraid ja kasvavad, kattes end limalaadsete ainetega ja takistades nende eemaldamist.Kuid 72-tunnise inkubeerimise ajal küpsevad bakterid ja neid on lihtne hajutada, moodustades rohkem kolooniaid või kobaraid.Seetõttu võib arvata, et 72-tunnine inkubeerimine on pikaajaline ja on sobiv inkubatsiooniaeg pinnale tugeva biokile moodustamiseks (38).Lühikese aja jooksul ilmnes söövitatud pinnal ja SHP pinnal bakteriaalne adhesioon, mis vähenes palja substraadiga võrreldes umbes 25% kuni 50%.Kuid tänu oma suurepärasele biomäärdumisvastasele jõudlusele ja stabiilsusele ei näidanud LOIS lühikeses ega pikaajalises perspektiivis bakteriaalset biokile adhesiooni.Skemaatiline diagramm (joonis 3C) kirjeldab söövituslahuse SHP ja LOIS bioloogilise saastumise vastase mehhanismi selgitust.Eelduseks on, et hüdrofiilsete omadustega söövitatud substraadi pindala on suurem kui paljal substraadil.Seetõttu tekib söövitatud substraadile rohkem bakterite adhesiooni.Võrreldes palja substraadiga on söövitatud substraadi pinnale moodustunud oluliselt vähem biokilet.Seda seetõttu, et veemolekulid seonduvad kindlalt hüdrofiilse pinnaga ja toimivad vee määrdeainena, häirides seega lühiajaliselt bakterite adhesiooni (39).Veemolekulide kiht on aga väga õhuke ja lahustub bakterisuspensioonides.Seetõttu kaob vee molekulaarne kiht pikaks ajaks, mis toob kaasa ulatusliku bakterite adhesiooni ja vohamise.SHP puhul on selle lühiajaliste mittemärgutavate omaduste tõttu bakterite adhesioon pärsitud.Bakterite vähenenud adhesiooni võib seostada õhutaskutega, mis on lõksus kihilises struktuuris ja madalamal pinnaenergial, minimeerides seeläbi kontakti bakterisuspensiooni ja pinna vahel.SHP puhul täheldati aga ulatuslikku bakterite adhesiooni, kuna see kaotas pikaks ajaks oma saastumisvastased omadused.Selle põhjuseks on peamiselt õhutaskute kadumine hüdrostaatilise rõhu tõttu ja õhu lahustumine vees.Selle põhjuseks on peamiselt õhutaskute kadumine lahustumise tõttu ja kihiline struktuur, mis tagab suurema nakkepinna (27, 40).Erinevalt nendest kahest aluspinnast, millel on oluline mõju pikaajalisele stabiilsusele, süstitakse LOIS-is sisalduv määrdeaine mikro-/nanostruktuuri ja see ei kao isegi pikas perspektiivis.Mikro/nanostruktuuridega täidetud määrdeained on väga stabiilsed ja tõmbuvad oma kõrge keemilise afiinsuse tõttu tugevalt pinnale, vältides seeläbi bakterite kleepumist pikaks ajaks.Joonis S6 näitab peegelduskonfokaalse mikroskoobi kujutist määrdeainega infundeeritud substraadist, mis on sukeldatud fosfaatpuhverdatud soolalahusesse (PBS).Pidevad pildid näitavad, et isegi pärast 120 tundi kestnud kerget raputamist (120 p/min) jääb LOIS-i määrdekiht muutumatuks, mis näitab pikaajalist stabiilsust voolutingimustes.Selle põhjuseks on kõrge keemiline afiinsus fluoripõhise SAM-katte ja perfluorosüsinikupõhise määrdeaine vahel, nii et saab moodustada stabiilse määrdeainekihi.Seetõttu säilib saastumisvastane jõudlus.Lisaks testiti substraati tüüpiliste valkude (albumiin ja fibrinogeen) suhtes, mis on plasmas, immuunfunktsiooniga tihedalt seotud rakkudes (makrofaagid ja fibroblastid) ja luude moodustumisega seotud valkude suhtes.Kaltsiumi sisaldus on väga kõrge.(Joonis 3D, 1 ja 2 ning joonis S7) (41, 42).Lisaks näitasid fibrinogeeni, albumiini ja kaltsiumi adhesioonitesti fluorestsentsmikroskoobi kujutised iga substraadirühma erinevaid adhesiooniomadusi (joonis S8).Luu moodustumise ajal võivad äsja moodustunud luu- ja kaltsiumikihid ümbritseda ortopeedilist implantaati, mis mitte ainult ei raskenda eemaldamist, vaid võib põhjustada ka patsiendile eemaldamisprotsessi käigus ootamatuid kahjustusi.Seetõttu on madala kaltsiumisisaldusega luuplaatidel ja kruvidel kasulikud ortopeedilised operatsioonid, mis nõuavad implantaadi eemaldamist.Fluorestsentsi intensiivsusel ja rakkude arvul põhineva lisatud ala kvantifitseerimise põhjal kinnitasime, et LOIS-il on kõigi bioloogiliste ainete jaoks suurepärased biomäärdumisvastased omadused võrreldes teiste substraatidega.In vitro katsete tulemuste kohaselt saab ortopeedilistele implantaatidele kanda bioloogilist saastumisvastast LOIS-i, mis ei suuda mitte ainult pärssida biokilebakterite põhjustatud infektsioone, vaid vähendada ka organismi aktiivsest immuunsüsteemist põhjustatud põletikku.
(A) Iga rühma (paljalt, söövitatud, SHP ja LOIS) fluorestsentsmikroskoobi kujutised, mida inkubeeriti Pseudomonas aeruginosa ja MRSA suspensioonides 12 ja 72 tundi.(B) Pseudomonas aeruginosa ja MRSA kleepunud CFU arv iga rühma pinnal.(C) Lühiajalise ja pikaajalise söövitamise, SHP ja LOIS bioloogilise saastumise mehhanismi skemaatiline diagramm.(D) (1) Igale substraadile kleepunud fibroblastide arv ja fluorestsentsmikroskoobi kujutised rakkudest, mis on kleepunud paljale ja LOIS-ile.(2) Luude paranemisprotsessis osalevate immuunsüsteemiga seotud valkude, albumiini ja kaltsiumi adhesioonitest (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ja **** P <0,0001).ns, pole oluline.
Vältimatute kontsentreeritud pingete korral on saastumisvastaste katete pealekandmisel alati olnud peamiseks väljakutseks mehaaniline vastupidavus.Traditsioonilised kanalisatsioonivastased geelimeetodid põhinevad polümeeridel, millel on madal vees lahustuvus ja haprus.Seetõttu on need biomeditsiinilistes rakendustes tavaliselt vastuvõtlikud mehaanilisele stressile.Seetõttu on mehaaniliselt vastupidavad saastumisvastased katted endiselt väljakutseks selliste rakenduste puhul nagu ortopeedilised implantaadid (43, 44).Joonisel 4A(1) on näidatud kaks peamist ortopeedilistele implantaatidele rakendatavat pingetüüpi, sealhulgas kriimustus (nihkepinge) ja kokkusurumine tangide tekitatud kahjustatud implantaadi optilise kujutisega.Näiteks kui kruvi keerata kruvikeerajaga kinni või kui kirurg hoiab luuplaati pintsettidega tugevalt kinni ja rakendab survejõudu, saab plastikust luuplaat vigastada ja kriimustada nii makro- kui ka mikro-/nanokaalul (joonis 4A, 2) .Testimaks, kas toodetud LOIS talub neid kahjustusi plastilise kirurgia käigus, viidi läbi nanoindentatsioon, et võrrelda palja aluspinna kõvadust ja LOIS-i mikro/nano skaalal, et uurida mikro/nanostruktuuri mehaanilisi omadusi Impact (joonis 4B).Skemaatiline diagramm näitab LOIS-i erinevat deformatsioonikäitumist mikro- / nanostruktuuride olemasolu tõttu.Jõu-nihke kõver koostati nanoindentatsiooni tulemuste põhjal (joonis 4C).Sinine pilt kujutab paljast substraati, mis näitab ainult väikest deformatsiooni, mida näitab maksimaalne süvendi sügavus 0, 26 μm.Teisest küljest võib LOIS-is (punane kõver) täheldatud nanoindentatsioonijõu ja nihke järkjärguline suurenemine näidata mehaaniliste omaduste vähenemise märke, mille tulemuseks on nanoindentatsiooni sügavus 1, 61 μm.Selle põhjuseks on asjaolu, et LOIS-is olev mikro-/nano-struktuur annab nanoindenteri otsale sügavama edasiliikumisruumi, seega on selle deformatsioon suurem kui palja substraadi oma.Konsta-Gdoutos jt.(45) usub, et nanostruktuuride olemasolu tõttu põhjustavad nanoindentatsioon ja mikro/nanokaredus ebakorrapäraseid nanoindentatsioonikõveraid.Varjutatud ala vastab nanostruktuurile omistatud ebakorrapärasele deformatsioonikõverale, varjutamata ala aga mikrostruktuurile.See deformatsioon võib kahjustada hoidemäärdeaine mikrostruktuuri/nanostruktuuri ja mõjutada negatiivselt selle saastumisvastast toimet.Selleks, et uurida kahjustuste mõju LOIS-ile, korrati plastilise kirurgia käigus kehas mikro-/nanostruktuuride vältimatuid kahjustusi.Vere ja valgu adhesioonitestide abil saab määrata LOIS-i biomäärdumisvastaste omaduste stabiilsust pärast in vitro (joonis 4D).Optiliste kujutiste seeria näitab kahjustusi, mis tekkisid iga substraadi aukude lähedal.Viidi läbi vere adhesioonitest, et näidata mehaaniliste kahjustuste mõju biomäärdumisvastasele kattele (joonis 4E).Sarnaselt SHP-ga kaovad saastumisvastased omadused kahjustuste tõttu ja LOISil on suurepärased saastumisvastased omadused, tõrjudes verd.Selle põhjuseks on asjaolu, et kuna pinnaenergiat juhib kahjustatud piirkonda kattev kapillaartegevus, taastab mikrostruktureeritud määrdeaine vool saastumisvastased omadused (35).Sama suundumust täheldati ka valkude adhesioonitestis, kasutades albumiini.Kahjustatud piirkonnas on laialdaselt jälgitav valgu adhesioon SHP pinnal ja selle pindala katvust mõõtes saab selle kvantifitseerida pooleks palja aluspinna nakketasemest.Teisest küljest säilitas LOIS oma biomäärdumisvastased omadused ilma adhesiooni põhjustamata (joonis 4, F ja G).Lisaks on kruvi pind sageli allutatud tugevale mehaanilisele pingele, näiteks puurimisele, mistõttu uurisime LOIS-katte võimet püsida kruvil in vitro puutumatuna.Joonisel 4H on kujutatud erinevate kruvide, sealhulgas tühjade, SHP ja LOIS kruvide optilisi kujutisi.Punane ristkülik tähistab sihtpiirkonda, kus luu implanteerimise ajal tekib tugev mehaaniline pinge.Sarnaselt plaadi valgu adhesioonikatsega kasutatakse valgu adhesiooni pildistamiseks ja katteala mõõtmiseks fluorestsentsmikroskoopi, et tõestada LOIS-katte terviklikkust isegi tugeva mehaanilise pinge korral (joonis 4, I ja J).LOIS-iga töödeldud kruvidel on suurepärane saastumisvastane jõudlus ja pinnale ei kleepu peaaegu üldse valku.Teisest küljest täheldati valgu adhesiooni paljaste kruvide ja SHP-kruvide puhul, kus SHP-kruvide pindala oli kolmandik paljaste kruvide omast.Lisaks peab fikseerimiseks kasutatav ortopeediline implantaat olema mehaaniliselt tugev, et taluda murdumiskohale rakendatavat pinget, nagu on näidatud joonisel 4K.Seetõttu viidi läbi paindekatse, et teha kindlaks keemilise modifitseerimise mõju mehaanilistele omadustele.Lisaks tehakse seda implantaadi fikseeritud pinge säilitamiseks.Rakendage vertikaalset mehaanilist jõudu, kuni implantaat on täielikult volditud ja saadakse pinge-deformatsiooni kõver (joonis 4L, 1).Kahte omadust, sealhulgas Youngi moodulit ja paindetugevust, võrreldi paljaste ja LOIS-i substraatide kui nende mehaanilise tugevuse näitajate vahel (joonis 4L, 2 ja 3).Youngi moodul näitab materjali võimet taluda mehaanilisi muutusi.Iga substraadi Youngi moodul on vastavalt 41,48±1,01 ja 40,06±0,96 GPa;täheldatud erinevus on umbes 3,4%.Lisaks teatatakse, et paindetugevus, mis määrab materjali sitkuse, on palja aluspinna puhul 102,34 ± 1,51 GPa ja SHP puhul 96,99 ± 0,86 GPa.Paljas aluspind on ligikaudu 5,3% kõrgem.Mehaaniliste omaduste kerge languse põhjuseks võib olla sälguefekt.Sälguefektis võib mikro-/nanokaredus toimida sälkude kogumina, mis viib kohaliku pinge kontsentratsioonini ja mõjutab implantaadi mehaanilisi omadusi (46).Kuid lähtudes tõsiasjast, et inimese kortikaalse luu jäikus on väidetavalt vahemikus 7,4–31,6 GPa ja mõõdetud LOIS-i moodul ületab inimese ajukoore luu oma (47), on LOIS piisav luumurru ja selle üldise luumurru toetamiseks. mehaanilisi omadusi mõjutab pinna modifitseerimine minimaalselt.
(A) Skemaatiline diagramm, mis kujutab (1) ortopeedilisele implantaadile operatsiooni ajal rakendatud mehaanilist pinget ja (2) kahjustatud ortopeedilise implantaadi optilist kujutist.(B) Nano-mehaaniliste omaduste mõõtmise skemaatiline diagramm nanoindentatsiooni ja LOIS-i abil paljal pinnal.(C) Nanoindentation jõu-nihke kõver palja pinna ja LOIS.(D) Pärast in vitro katseid simuleerige erinevat tüüpi ortopeediliste plaatide optilisi kujutisi (kahjustatud ala on esile tõstetud punase ristkülikuga), et simuleerida operatsiooni ajal tekkivat mehaanilist pinget.(E) Kahjustatud ortopeedilise plaadi rühma vere adhesioonitest ja (F) valgu adhesioonitest.(G) Mõõtke plaadile kleepunud valgu pindala.(H) Erinevat tüüpi ortopeediliste kruvide optilised kujutised pärast in vitro katset.(I) Valkude adhesioonikatse erinevate katete terviklikkuse uurimiseks.(J) Mõõtke kruvi külge kleepunud valgu pindala.(K) Küüliku liikumise eesmärk on tekitada luumurrule fikseeritud pinge.(L) (1) Paindekatse tulemused ja optilised kujutised enne ja pärast painutamist.(2) Youngi mooduli ja (3) paindetugevuse erinevus palja implantaadi ja SHP vahel.Andmed on väljendatud keskmisena ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 ja ****P<0,0001).Pilt: Kyomin Chae, Yonsei ülikool.
Kliinilistes olukordades pärineb enamik bakterite kokkupuutest bioloogiliste materjalide ja haavakohtadega küpsetest ja küpsetest biofilmidest (48).Seetõttu on USA haiguste tõrje ja ennetamise keskuste hinnangul 65% kõigist inimeste nakatumistest seotud biofilmidega (49).Sel juhul on vaja luua in vivo eksperimentaalne disain, mis tagab järjepideva biokile moodustumise implantaadi pinnal.Seetõttu töötasime välja küüliku reieluumurru mudeli, milles ortopeedilisi implantaate inkubeeriti eelnevalt bakterisuspensioonis ja seejärel implanteeriti küüliku reieluudesse, et uurida LOIS-i saastumisvastaseid omadusi in vivo.Järgmise kolme olulise asjaolu tõttu kutsutakse bakteriaalseid infektsioone esile pigem eelkultuuri kui bakterisuspensioonide otsese süstimise teel: (i) küülikute immuunsüsteem on loomulikult tugevam kui inimestel;seetõttu on võimalik bakterisuspensioonide ja planktonibakterite süstimine Biokilede moodustumist ei mõjuta.(Ii) Planktoni bakterid on antibiootikumidele vastuvõtlikumad ja antibiootikume kasutatakse tavaliselt pärast operatsiooni;lõpuks, (iii) planktonibakterite suspensiooni võib lahjendada looma kehavedelikega (50).Implantaati enne implanteerimist bakterisuspensioonis eelkultiveerides saame põhjalikult uurida bakteriaalse infektsiooni ja võõrkehareaktsiooni (FBR) kahjulikku mõju luu paranemisprotsessile.Küülikud ohverdati 4 nädalat pärast implanteerimist, kuna luude paranemise protsessi jaoks oluline luuintegratsioon viiakse lõpule 4 nädala jooksul.Seejärel eemaldati implantaadid küülikutelt allavoolu uuringute jaoks.Joonisel 5A on näidatud bakterite proliferatsioonimehhanism.Nakatunud ortopeediline implantaat sisestatakse kehasse.Bakterisuspensioonis eelinkubeerimise tulemusena nakatusid kuuest palja implantaadiga implanteeritud küülikust kuus, samas kui ükski LOIS-iga töödeldud implantaatidega implanteeritud küülik ei nakatunud.Bakteriaalsed infektsioonid kulgevad kolmes etapis, sealhulgas kasv, küpsemine ja hajumine (51).Esiteks paljunevad ja kasvavad pinnal kinnitunud bakterid ning seejärel moodustavad bakterid ekstratsellulaarse polümeeri (EPS), amüloidi ja ekstratsellulaarse DNA väljutamisel biokile.Biofilm mitte ainult ei takista antibiootikumide tungimist, vaid soodustab ka antibiootikume lagundavate ensüümide (nt β-laktamaas) akumuleerumist (52).Lõpuks levib biokile küpsed bakterid ümbritsevatesse kudedesse.Seetõttu tekib infektsioon.Lisaks, kui võõrkeha siseneb kehasse, võib infektsioon, mis võib põhjustada tugevat immuunvastust, põhjustada tõsist põletikku, valu ja immuunsuse vähenemist.Joonis 5B annab ülevaate ortopeedilise implantaadi sisestamisest põhjustatud FBR-ist, mitte bakteriaalse infektsiooni põhjustatud immuunvastusest.Immuunsüsteem tunneb sisestatud implantaadi ära võõrkehana ja paneb seejärel rakud ja koed reageerima võõrkeha kapseldamiseks (53).FBR algusaegadel moodustati ortopeediliste implantaatide pinnale toitemaatriks, mille tulemuseks oli fibrinogeeni adsorptsioon.Adsorbeeritud fibrinogeen moodustab seejärel ülitiheda fibriinivõrgustiku, mis soodustab leukotsüütide kinnitumist (54).Kui fibriinivõrk on moodustunud, tekib neutrofiilide infiltratsiooni tõttu äge põletik.Selles etapis vabanevad mitmesugused tsütokiinid, nagu kasvaja nekroosifaktor-α (TNF-α), interleukiin-4 (IL-4) ja IL-β, ning monotsüüdid hakkavad implantatsioonikohta imbuma ja diferentseeruma hiiglaslikeks rakkudeks.Faag (41, 55, 56).FBR vähendamine on alati olnud väljakutse, sest liigne FBR võib põhjustada ägedat ja kroonilist põletikku, mis võib põhjustada surmavaid tüsistusi.Bakteriaalsete infektsioonide mõju hindamiseks palja implantaadi ja LOIS-i ümbritsevates kudedes kasutati hematoksüliini ja eosiini (H&E) ning Massoni trikroomi (MT) värvimist.Paljaste substraatidega siirdatud küülikutel progresseerusid rasked bakteriaalsed infektsioonid ning H&E koeslaididel oli selgelt näha põletikust põhjustatud abstsessid ja nekroos.Teisest küljest pärsib ülitugev biomäärdumisvastane pind LOIS bakterite adhesiooni, seega ei näita see nakkuse märke ja vähendab põletikku (joonis 5C).MT värvimise tulemused näitasid sama suundumust.Kuid MT värvimine näitas ka LOIS-iga siirdatud küülikutel turset, mis näitab, et taastumine on toimumas (joonis 5D).Immuunvastuse astme uurimiseks viidi läbi immunohistokeemiline (IHC) värvimine, kasutades immuunvastusega seotud tsütokiine TNF-α ja IL-6.Palja negatiivset implantaati, mis ei puutunud kokku bakteritega, võrreldi LOIS-iga, mis puutus kokku bakteritega, kuid ei olnud nakatunud, et uurida paranemisprotsessi bakteriaalse infektsiooni puudumisel.Joonisel 5E on kujutatud TNF-α ekspresseeriva IHC slaidi optiline kujutis.Pruun ala tähistab immuunvastust, mis näitab, et LOIS-i immuunvastus on veidi vähenenud.Lisaks oli IL-6 ekspressioon LOIS-is oluliselt väiksem kui steriilse alasti negatiivne ekspressioon (joonis 5F).Tsütokiini ekspressioon kvantifitseeriti, mõõtes tsütokiinile vastava antikeha värvumise pindala (joonis 5G).Võrreldes negatiivsete implantaatidega kokku puutunud küülikutega, olid LOIS-iga siirdatud küülikute ekspressioonitasemed madalamad, mis näitab olulist erinevust.Tsütokiinide ekspressiooni vähenemine näitab, et LOIS-i pikaajalised stabiilsed saastumisvastased omadused ei ole seotud ainult bakteriaalsete infektsioonide pärssimisega, vaid ka FBR vähenemisega, mis on põhjustatud substraadile kleepunud makrofaagidest (53, 57, 58).Seetõttu võib LOIS-i immuunvastusest tingitud vähenenud immuunvastus lahendada implantatsioonijärgsed kõrvalnähud, nagu ülemäärane immuunvastus pärast plastilist kirurgiat.
(A) Skemaatiline diagramm biokile moodustumise ja leviku mehhanismist nakatunud ortopeedilise implantaadi pinnal.eDNA, ekstratsellulaarne DNA.(B) Immuunvastuse skemaatiline diagramm pärast ortopeedilise implantaadi sisestamist.(C) Ortopeediliste implantaatide ümbritsevate kudede H&E värvimine ja (D) MT värvimine palja positiivse ja LOIS-iga.Immuunsüsteemiga seotud tsütokiinide (E) TNF-α ja (F) IL-6 IHC on paljaste negatiivsete ja LOIS-implanteeritud küülikute värvitud kujutised.(G) Tsütokiini ekspressiooni kvantifitseerimine pindala katvuse mõõtmise teel (** P <0,01).
LOIS-i biosobivust ja selle mõju luude paranemisprotsessile uuriti in vivo diagnostilise kujutise [röntgen- ja mikrokompuutertomograafia (CT)] ja osteoklastide IHC abil.Joonisel 6A on kujutatud luu paranemisprotsess, mis hõlmab kolme erinevat etappi: põletik, paranemine ja ümberkujunemine.Kui luumurd tekib, tungivad põletikulised rakud ja fibroblastid murtud luusse ja hakkavad kasvama veresoonte kudedesse.Remondifaasis levib vaskulaarkoe sissekasv murrukoha lähedale.Vaskulaarne kude annab toitaineid uue luu moodustamiseks, mida nimetatakse kalluseks.Luu paranemisprotsessi viimane etapp on remodelleerumise etapp, mille käigus aktiveeritud osteoklastide taseme tõusu abil vähendatakse kalluse suurus normaalse luu suuruseks (59).Murdekoha kolmemõõtmeline (3D) rekonstrueerimine viidi läbi mikro-CT-skaneeringute abil, et jälgida kalluse moodustumise taseme erinevusi igas rühmas.Jälgige reieluu ristlõiget, et jälgida murtud luu ümbritseva kalluse paksust (joonis 6, B ja C).Röntgenikiirgust kasutati ka kõigi rühmade murdumiskohtade uurimiseks igal nädalal, et jälgida igas rühmas erinevaid luu regeneratsiooniprotsesse (joonis S9).Kallus ja küpsed luud on näidatud vastavalt sinise/rohelise ja elevandiluuga.Enamik pehmeid kudesid filtreeritakse eelseadistatud lävega.Nudepositiivne ja SHP kinnitasid väikese koguse kalluse moodustumist murrukoha ümber.Teisest küljest on LOIS-i paljastatud negatiiv ja murdumiskoht ümbritsetud paksu kallusega.Mikro-CT-pildid näitasid, et kalluse teket takistasid bakteriaalne infektsioon ja infektsiooniga seotud põletik.Selle põhjuseks on asjaolu, et immuunsüsteem seab esikohale infektsiooniga seotud põletikust põhjustatud septiliste vigastuste paranemise, mitte luu taastumise (60).Osteoklastide aktiivsuse ja luu resorptsiooni jälgimiseks viidi läbi IHC ja tartraadiresistentse happefosfataasi (TRAP) värvimine (joonis 6D) (61).Paljalt positiivsetes ja SHP-s leiti ainult mõned aktiveeritud, lillaks värvunud osteoklastid.Teisest küljest täheldati LOIS-i paljaste positiivsete ja küpsete luude läheduses palju aktiveeritud osteoklaste.See nähtus näitab, et osteoklastide juuresolekul toimub luumurru ümber paiknevas kalluses vägivaldne remodelleerumisprotsess (62).Mõõdeti kalluse luumahtu ja osteoklastide ekspressiooniala, et võrrelda kalluse moodustumise taset murrukoha ümber kõigis rühmades, et kvantifitseerida mikro-CT-skannimist ja IHC tulemusi (joonis 6E, 1 ja 2).Ootuspäraselt olid alasti negatiivsed ja kalluse moodustumine LOIS-is oluliselt kõrgem kui teistes rühmades, mis näitab, et toimus positiivne luu ümberkujunemine (63).Joonisel S10 on näidatud kirurgilise koha optiline kujutis, kruvi lähedal kogutud koe MT-värvimise tulemus ja TRAP-värvimise tulemus, mis tõstab esile kruvi-luu liidese.Paljas substraadis täheldati tugevat kalluse ja fibroosi moodustumist, samas kui LOIS-iga töödeldud implantaadil oli suhteliselt kleepumata pind.Sarnaselt, võrreldes paljaste negatiividega, täheldati LOIS-iga siirdatud küülikutel madalamat fibroosi, nagu näitavad valged nooled.Lisaks võib tugevat turset (sinine nool) seostada LOIS-i immuunsüsteemi vältimise omadustega, vähendades seeläbi tõsist põletikku.Mittekleepuv pind implantaadi ümber ja vähenenud fibroos viitavad sellele, et eemaldamisprotsess on lihtsam, mille tagajärjeks on tavaliselt muud luumurrud või põletikud.Luu paranemisprotsessi pärast kruvi eemaldamist hinnati osteoklastide aktiivsuse järgi kruvi-luu liideses.Nii paljas luu kui ka LOIS-i implantaadi liides neelasid sarnasel tasemel osteoklaste, et luu edasi paraneda, mis näitab, et LOIS-kattel ei ole luude paranemisele ega immuunvastusele negatiivset mõju.Kinnitamaks, et LOIS-iga tehtud pinnamodifikatsioon ei häiri luu paranemisprotsessi, kasutati röntgenuuringut, et võrrelda küülikute luude paranemist avatud negatiivsete ioonidega ja 6-nädalast LOIS-i implantatsiooni (joonis 6F).Tulemused näitasid, et võrreldes nakatamata alasti positiivse rühmaga näitas LOIS samasugust luude paranemist ja mõlemas rühmas ei olnud ilmseid luumurdude tunnuseid (pidev osteolüüsijoon).
(A) Luude paranemisprotsessi skemaatiline diagramm pärast luumurdu.(B) iga pinnarühma kalluse moodustumise astme erinevus ja (C) murdekoha ristlõike kujutis.(D) TRAP-värvimine, et visualiseerida osteoklastide aktiivsust ja luu resorptsiooni.TRAP aktiivsuse põhjal analüüsiti kortikaalse luu välise kalluse moodustumist kvantitatiivselt (E) (1) mikro-CT ja (2) osteoklastide aktiivsusega.(F) 6 nädalat pärast implanteerimist röntgenpildid eksponeeritud negatiivse luumurru (esile tõstetud punase katkendliku ristkülikuga) ja LOIS-i (esile tõstetud sinise katkendliku ristkülikuga).Statistiline analüüs viidi läbi ühesuunalise dispersioonanalüüsi (ANOVA) abil.* P <0,05.** P <0,01.
Lühidalt öeldes pakub LOIS uut tüüpi antibakteriaalset infektsioonistrateegiat ja immuunkaitsekatet ortopeediliste implantaatide jaoks.Tavalistel SHP funktsionaliseerimisega ortopeedilistel implantaatidel on lühiajalised biomäärdumisvastased omadused, kuid need ei suuda oma omadusi pikka aega säilitada.Substraadi superhüdrofoobsus püüab õhumullid bakterite ja substraadi vahele, moodustades seeläbi õhutaskuid, hoides seeläbi ära bakteriaalse infektsiooni.Kuid õhu difusiooni tõttu on need õhutaskud kergesti eemaldatavad.Teisest küljest on LOIS hästi tõestanud oma võimet ennetada biofilmiga seotud nakkusi.Seetõttu saab kihilisele mikro-/nanostruktuuri pinnale süstitud määrdekihi äratõukereaktsioonivastaste omaduste tõttu ära hoida infektsiooniga seotud põletikke.LOIS-i tootmistingimuste optimeerimiseks kasutatakse erinevaid iseloomustamismeetodeid, sealhulgas SEM-, AFM-, XPS- ja CA-mõõtmisi.Lisaks saab LOIS-i rakendada ka erinevatele bioloogilistele materjalidele, mida tavaliselt kasutatakse ortopeedilistes fikseerimisseadmetes, nagu PLGA, Ti, PE, POM ja PPSU.Seejärel testiti LOIS-i in vitro, et tõestada selle biomäärdumisvastaseid omadusi bakterite ja immuunvastusega seotud bioloogiliste ainete vastu.Tulemused näitavad, et sellel on palja implantaadiga võrreldes suurepärane antibakteriaalne ja biomäärdumisvastane toime.Lisaks näitab LOIS mehaanilist tugevust ka pärast mehaanilise pinge rakendamist, mis on plastilise kirurgia puhul vältimatu.Tänu määrdeaine iseparanevatele omadustele mikro/nanostruktuuri pinnal säilitas LOIS edukalt oma bioloogilise saastumisevastased omadused.LOIS-i biosobivuse ja antibakteriaalsete omaduste uurimiseks in vivo implanteeriti LOIS küüliku reieluusse 4 nädalaks.LOIS-iga siirdatud küülikutel bakteriaalset infektsiooni ei täheldatud.Lisaks näitas IHC kasutamine kohaliku immuunvastuse vähenemist, mis näitab, et LOIS ei inhibeeri luu paranemisprotsessi.LOIS-il on suurepärased antibakteriaalsed ja immuunsüsteemi vältimise omadused ning on tõestatud, et see takistab tõhusalt biokile moodustumist enne ortopeedilist operatsiooni ja selle ajal, eriti luusünteesi puhul.Kasutades küüliku luuüdi põletikulise reieluumurru mudelit, uuriti põhjalikult biokilega seotud infektsioonide mõju eelinkubeeritud implantaatide poolt indutseeritud luu paranemisprotsessile.Tulevase uuringuna on vaja uut in vivo mudelit, et uurida võimalikke infektsioone pärast implanteerimist, et täielikult mõista ja ennetada biofilmiga seotud infektsioone kogu paranemisprotsessi ajal.Lisaks on osteoinduktsioon LOIS-iga integreerimisel endiselt lahendamata väljakutse.Väljakutse ületamiseks on vaja täiendavaid uuringuid, et kombineerida osteoinduktiivsete rakkude selektiivset adhesiooni või regeneratiivset meditsiini LOIS-iga.Üldiselt kujutab LOIS endast paljulubavat ortopeedilist implantaadi katet, millel on mehaaniline vastupidavus ja suurepärased biomäärdumisvastased omadused, mis võivad vähendada SSI- ja immuunsüsteemi kõrvalmõjusid.
Peske saasteainete eemaldamiseks 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS substraati (Dong Kang M-Tech Co., Korea) atsetoonis, EtOH-s ja DI vees 15 minutit.Pinnale mikro/nanotaseme struktuuri moodustamiseks kastetakse puhastatud aluspind 48% kuni 51% HF lahusesse (DUKSAN Corp., Lõuna-Korea) temperatuuril 50°C.Söövitusaeg varieerub vahemikus 0 kuni 60 minutit.Seejärel puhastati söövitatud substraat deioniseeritud veega ja asetati 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) lahusesse temperatuuril 50 °C 30 minutiks, et moodustada pinnale kroomoksiidi passiveerimiskiht.Pärast passiveerimist pestakse substraat deioniseeritud veega ja kuivatatakse, et saada kihilise struktuuriga substraat.Järgmisena eksponeeriti substraat hapnikuplasmaga (100 W, 3 minutit) ja sukeldati kohe 8,88 mM POTS-i (Sigma-Aldrich, Saksamaa) lahusesse tolueenis toatemperatuuril 12 tunniks.Seejärel puhastati POTS-iga kaetud substraat EtOH-ga ja lõõmutati 150 °C juures 2 tundi, et saada tihe POTS-SAM.Pärast SAM katmist moodustati aluspinnale määrdekiht, kandes peale perfluoropolüeeter määrdeainet (Krytox 101; DuPont, USA) laadimismahuga 20 μm/cm 2. Enne kasutamist filtreerige määrdeaine läbi 0,2 mikroni filtri.Eemaldage liigne määrdeaine, kallutades seda 15 minuti jooksul 45° nurga all.Sama tootmisprotseduuri kasutati 304 SS-st (lukustusplaat ja kortikaalne lukustuskruvi; Dong Kang M-Tech Co., Korea) valmistatud ortopeediliste implantaatide puhul.Kõik ortopeedilised implantaadid on loodud sobima küüliku reieluu geomeetriaga.
Substraadi ja ortopeediliste implantaatide pinnamorfoloogiat kontrolliti väliemissiooni SEM (Inspect F50, FEI, USA) ja AFM (XE-100, Park Systems, Lõuna-Korea) abil.Pinna karedust (Ra, Rq) mõõdetakse, korrutades 20 μm pindala 20 μm-ga (n = 4).Pinna keemilise koostise analüüsimiseks kasutati XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Jaapan) süsteemi, mis oli varustatud Al Kα röntgenikiirgusallikaga, mille täpi suurus oli 100 μm2.Vedelate CA ja SA mõõtmiseks kasutati CA mõõtmissüsteemi, mis oli varustatud dünaamilise pildikaameraga (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Lõuna-Korea).Iga mõõtmise jaoks asetatakse CA mõõtmiseks pinnale 6–10 μl tilka (deioniseeritud vesi, hobuseveri, EG, 30% etanool ja HD).Kui substraadi kaldenurk suureneb kiirusega 2°/s (n = 4), mõõdetakse SA tilga langemisel.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] ja MRSA (ATCC 25923) osteti ATCC-st (Manassas, Virginia, USA) ja põhikultuuri hoiti -80 °C juures.Enne kasutamist inkubeeriti külmutatud kultuuri 18 tundi trüpsiiniga sulatatud sojaoa puljongis (Komed, Korea) temperatuuril 37 °C ja seejärel kanti kaks korda üle selle aktiveerimiseks.Pärast inkubeerimist tsentrifuugiti kultuuri kiirusel 10 000 p/min 10 minutit temperatuuril 4 °C ja pesti kaks korda PBS (pH 7,3) lahusega.Tsentrifuugitud kultuuri subkultuuritakse seejärel vereagarplaatidel (BAP).MRSA ja Pseudomonas aeruginosa valmistati üleöö ja kultiveeriti Luria-Bertani puljongis.Pseudomonas aeruginosa ja MRSA kontsentratsioon inokulaadis määrati kvantitatiivselt suspensiooni CFU abil agari seerialahjendustes.Seejärel reguleerige bakterite kontsentratsioon 0,5 McFarlandi standardile, mis vastab 108 CFU/ml.Seejärel lahjendage töötav bakteriaalne suspensioon 100 korda kuni 106 CFU/ml.Antibakteriaalsete adhesiooniomaduste testimiseks steriliseeriti substraati enne kasutamist 121 °C juures 15 minutit.Seejärel kanti substraat 25 ml bakterisuspensiooni ja inkubeeriti 12 ja 72 tundi 37 °C juures tugeva loksutamise ajal (200 p/min).Pärast inkubeerimist eemaldati iga substraat inkubaatorist ja pesti kolm korda PBS-ga, et eemaldada pinnal hõljuvad bakterid.Substraadil oleva biokile jälgimiseks fikseeriti biokile metanooliga ja värviti 2 minutiks 1 ml krimidiinoranžiga.Seejärel kasutati värvitud biofilmi pildistamiseks fluorestsentsmikroskoopi (BX51TR, Olympus, Jaapan).Substraadil oleva biokile kvantifitseerimiseks eraldati kinnitatud rakud substraadist bead vortex meetodil, mida peeti kõige sobivamaks meetodiks kinnitunud bakterite eemaldamiseks (n = 4).Steriilsete tangide abil eemaldage kasvusöötmest substraat ja koputage süvendi plaati, et eemaldada liigne vedelik.Lõdvalt kinnitatud rakud eemaldati, pestes kaks korda steriilse PBS-iga.Seejärel viidi iga substraat steriilsesse katseklaasi, mis sisaldas 9 ml 0,1% proteiini ept soolalahust (PSW) ja 2 g 20 kuni 25 steriilset klaashelmest (läbimõõt 0,4 kuni 0,5 mm).Seejärel segati seda 3 minutit, et rakud proovist eraldada.Pärast vorteksiga segamist lahjendati suspensioon 10-kordselt 0, 1% PSW-ga ja seejärel 0, 1 ml igast lahjendusest inokuleeriti BAP-i.Pärast 24-tunnist inkubeerimist 37 °C juures loendati CFU käsitsi.
Rakkude jaoks kasutati hiire fibroblaste NIH/3T3 (CRL-1658; Ameerika ATCC) ja hiire makrofaage RAW 264.7 (TIB-71; Ameerika ATCC).Kasutage Dulbecco modifitseeritud Eagle söödet (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) hiire fibroblastide kasvatamiseks ja lisage 10% vasika seerumit (S103-01, Welgene) ja 1% penitsilliini-streptomütsiini (PS ; LS202-02, Welgene (Welgen). ). Rakke inkubeeriti üle öö temperatuuril 37 °C ja 5% CO2. Rakkude värvimiseks fikseeriti rakud 20 minutiks 4% paraformaldehüüdiga ja asetati 5 minutiks 0,5% Triton X inkubatsioonilahusesse. Kastke substraat 50 nM tetrametüülrodamiini 37 °C juures 30 minutit. Pärast inkubeerimist kasutage substraati 4',6-diamino-2-fenüülindooliga (H-1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD fikseerimissöötmega (n = 4 raku kohta). , fluorestseiin, fluorestseiini isotiotsüanaat-albumiin (A9771, Sigma-Aldrich, Saksamaa) ja inimese plasma Alexa Fluor 488-ga konjugeeritud fibrinogeen (F13191, Invitrogen, USA) lahustati PBS-s (10 mM, pH 7,4).Albumiini ja fibrinogeeni kontsentratsioonid olid vastavalt 1 ja 150 μg/ml.Pärast substraati Enne valgulahusesse kastmist loputage neid PBS-iga, et pind uuesti niisutada.Seejärel sukeldage kõik substraadid kuue süvendiga plaadile, mis sisaldab valgulahust, ja inkubeerige 37 °C juures 30 ja 90 minutit.Pärast inkubeerimist eemaldati substraat valgulahusest, pesti õrnalt 3 korda PBS-ga ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdiga (n = 4 iga valgu kohta).Kaltsiumi jaoks lahustati naatriumkloriid (0,21 M) ja kaaliumfosfaat (3,77 mM) deioniseeritud vees.Lahuse pH reguleeriti 2,0-ni vesinikkloriidi lahuse (1 M) lisamisega.Seejärel lahustati lahuses kaltsiumkloriid (5,62 mM).1 M tris(hüdroksümetüül)amino lisamisega reguleerib metaan lahuse pH väärtuseni 7,4.Kastke kõik substraadid kuue süvendiga plaadile, mis on täidetud 1,5 × kaltsiumfosfaadi lahusega, ja eemaldage lahusest 30 minuti pärast.Värvimiseks 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Segage 100 ml deioniseeritud veega.Seejärel kasutage 10% ammooniumhüdroksiidi, et reguleerida pH väärtuseni 4. Värvige substraati Alizarin Redi lahusega 5 minutit, seejärel raputage liigne värv maha ja bloteerige.Pärast loksutamist eemaldage substraat.Materjal veetustatakse, seejärel sukeldatakse 5 minutiks atsetooni, seejärel sukeldatakse 5 minutiks atsetooni-ksüleeni (1:1) lahusesse ja lõpuks pestakse ksüleeniga (n = 4).Kasutatakse ×10 ja ×20 objektiividega fluorestsentsmikroskoopi (Axio Imager)..A2m, Zeiss, Saksamaa) pildistab kõiki substraate.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) kasutati bioloogiliste ainete adhesiooniandmete kvantifitseerimiseks nelja erineva pildistamispiirkonna iga rühma kohta.Teisendage kõik pildid substraadi võrdlemiseks fikseeritud lävedega binaarpiltideks.
PBS-i määrdekihi stabiilsuse jälgimiseks peegeldusrežiimis kasutati Zeiss LSM 700 konfokaalset mikroskoopi.Süstitud määrdekihiga fluoripõhine SAM-kattega klaasiproov sukeldati PBS-i lahusesse ja testiti orbitaalseksguriga (SHO-1D; Daihan Scientific, Lõuna-Korea) kergetes loksutamistingimustes (120 pööret minutis).Seejärel võtke proov ja jälgige määrdeaine kadu, mõõtes peegeldunud valguse kadu.Fluorestsentspiltide saamiseks peegeldusrežiimis eksponeeritakse proov 633 nm laseriga ja seejärel kogutakse, kuna valgus peegeldub proovilt tagasi.Proove mõõdeti ajavahemike järel 0, 30, 60 ja 120 tundi.
Pinna modifitseerimise protsessi mõju ortopeediliste implantaatide nanomehaanilistele omadustele väljaselgitamiseks kasutati nanoindeendiooni mõõtmiseks kolmepoolse püramiidikujulise Berkovichi teemantotsikuga varustatud nanoindentterit (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA).Tippkoormus on 10 mN ja pindala on 100 μm x 100 μm.Kõikide mõõtmiste puhul on laadimis- ja mahalaadimisaeg 10 s ja hoidmisaeg tippkoormuse all 2 s.Tehke mõõtmised viiest erinevast kohast ja võtke keskmine.Selleks, et hinnata mehaanilist tugevust koormuse all, viidi läbi universaalse testimismasina (Instron 5966, Instron, USA) abil põiksuunaline kolmepunktiline paindekatse.Substraat surutakse kokku konstantsel kiirusel 10 N/s suurenenud koormusega.Paindemooduli ja maksimaalse survepinge arvutamiseks kasutati tarkvaraprogrammi Bluehill Universal (n = 3).
Operatsiooniprotsessi ja sellega seotud operatsiooni käigus tekkivate mehaaniliste kahjustuste simuleerimiseks viidi operatsiooniprotsess läbi in vitro.Reieluud koguti hukatud Uus-Meremaa valgetelt küülikutelt.Reieluu puhastati ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 1 nädal.Nagu loomkatsemeetodis kirjeldatud, opereeriti fikseeritud reieluu kirurgiliselt.Pärast operatsiooni kasteti ortopeediline implantaat 10 sekundiks verre (hobuseveri, KISAN, Korea), et kontrollida, kas pärast mehaanilise vigastuse rakendamist tekkisid vere adhesioonid (n = 3).
Kokku 24 isast Uus-Meremaa valget küülikut (kaal 3,0–3,5 kg, keskmine vanus 6 kuud) jagati juhuslikult nelja rühma: alasti negatiivsed, alasti positiivsed, SHP ja LOIS.Kõik loomadega seotud protseduurid viidi läbi vastavalt institutsionaalse loomade hooldamise ja kasutamise komitee eetikastandarditele (IACUC heaks kiidetud, KOREA-2017-0159).Ortopeediline implantaat koosneb viie auguga lukustusplaadist (pikkus 41 mm, laius 7 mm ja paksus 2 mm) ja kortikaalsetest lukustuskruvidest (pikkus 12 mm, läbimõõt 2,7 mm) luumurru fikseerimiseks.Kõiki plaate ja kruvisid, välja arvatud need plaadid ja kruvid, mida kasutati tühjade negatiivsete rühmas, inkubeeriti MRSA suspensioonis (106 CFU/ml) 12 tundi.Paljas-negatiivset rühma (n = 6) töödeldi nakkuse negatiivse kontrollina palja pinnaga implantaatidega ilma bakterisuspensiooni kokkupuuteta.Paljalt positiivset rühma (n = 6) töödeldi infektsiooni positiivse kontrollina palja pinna implantaadiga, mis oli avatud bakteritele.SHP rühma (n = 6) töödeldi bakterite poolt eksponeeritud SHP implantaatidega.Lõpuks töödeldi LOIS-rühma bakteritega eksponeeritud LOIS-i implantaatidega (n = 6).Kõiki loomi peetakse puuris, antakse palju toitu ja vett.Enne operatsiooni paastus küülikuid 12 tundi.Loomad anesteseeriti ksülasiini (5 mg/kg) intramuskulaarse süstimisega ja induktsiooniks paklitakseeli (3 mg/kg) intravenoosse süstimisega.Seejärel manustage anesteesia säilitamiseks hingamisteede kaudu 2% isofluraani ja 50% kuni 70% meditsiinilist hapnikku (voolukiirus 2 l/min).See implanteeritakse otsese lähenemise kaudu külgmisele reieluule.Pärast karvade eemaldamist ja naha desinfitseerimist povidoon-joodiga tehti vasaku keskmise reieluu välisküljele umbes 6 cm pikkune sisselõige.Avades reieluu katvate lihaste vahe, paljastatakse reieluu täielikult.Asetage plaat reieluu võlli ette ja kinnitage see nelja kruviga.Pärast fikseerimist kasutage saelehte (paksus 1 mm), et tekitada kunstlikult murde teise ja neljanda augu vahele jäävale alale.Operatsiooni lõpus pesti haav soolalahusega ja suleti õmblustega.Igale küülikule süstiti subkutaanselt enrofloksatsiini (5 mg/kg), mis oli lahjendatud kolmandiku võrra soolalahusega.Luu osteotoomia kinnitamiseks tehti kõigil loomadel (0, 7, 14, 21, 28 ja 42 päeva) operatsioonijärgsed röntgenpildid reieluust.Pärast sügavat anesteesiat tapeti kõik loomad intravenoosse KCl-ga (2 mmol/kg) 28. ja 42. päeval.Pärast hukkamist skaneeriti reieluu mikro-CT-ga, et jälgida ja võrrelda luu paranemisprotsessi ja uue luu moodustumist nelja rühma vahel.
Pärast hukkamist koguti pehmed koed, mis olid ortopeediliste implantaatidega otseses kontaktis.Kude fikseeriti 10% neutraalses puhverdatud formaliinis üleöö ja seejärel dehüdreeriti EtOH-s.Dehüdreeritud kude sisestati parafiini ja lõigati mikrotoomi (400CS; EXAKT, Saksamaa) abil paksusega 40 μm.Nakkuse visualiseerimiseks viidi läbi H&E värvimine ja MT värvimine.Peremehe vastuse kontrollimiseks inkubeeriti lõigatud kude küüliku TNF-α-vastase primaarse antikehaga (AB6671, Abcam, USA) ja küüliku anti-IL-6-ga (AB6672; Abcam, USA) ning seejärel töödeldi mädarõigaga.Oksüdaas.Kandke sektsioonidele avidiin-biotiini kompleksi (ABC) värvimissüsteem vastavalt tootja juhistele.Pruuni reaktsiooniproduktina esinemiseks kasutati kõigis osades 3,3-diaminobensidiini.Kõigi viilude visualiseerimiseks kasutati digitaalset slaidiskannerit (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungari) ja igas rühmas analüüsiti ImageJ tarkvara abil vähemalt nelja substraati.
Kõigil loomadel tehti pärast operatsiooni ja igal nädalal röntgenpildid, et jälgida luumurdude paranemist (n = 6 rühma kohta).Pärast teostamist kasutati kõrge eraldusvõimega mikro-CT-d, et arvutada pärast paranemist reieluu ümber kalluse moodustumine.Saadud reieluu puhastati, fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 3 päeva ja dehüdreeriti 75% etanoolis.Seejärel skaneeriti dehüdreeritud luid mikro-CT-ga (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgia), et luua luuproovist 3D-vokslikujutised (2240 ​​× 2240 pikslit).Kasutage signaali müra vähendamiseks 1,0 mm Al-filtrit ja rakendage kõikidele skaneeringutele kõrget eraldusvõimet (E = 133 kVp, I = 60 μA, integreerimisaeg = 500 ms).Nreconi tarkvara (versioon 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgia) kasutati skaneeritud proovi 3D-mahu genereerimiseks omandatud 2D-külgprojektsioonist.Analüüsiks jagatakse 3D-rekonstrueeritud pilt vastavalt murdumiskohale 10mm×10mm×10mm kuubikuteks.Arvutage kallus väljaspool kortikaalset luud.Skaneeritud luumahu digitaalseks ümbersuunamiseks kasutati tarkvara DataViewer (versioon 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgia) ja analüüsiks CT-Analyzer (versioon 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgia).Suhtelisi röntgenikiirguse neeldumiskoefitsiente küpses luus ja kalluses eristatakse nende tiheduse järgi ning seejärel kvantifitseeritakse kalluse maht (n = 4).Kinnitamaks, et LOIS-i biosobivus ei lükka edasi luude paranemisprotsessi, viidi läbi täiendav röntgen- ja mikro-CT analüüs kahel küülikul: alasti-negatiivsel ja LOIS-i rühmal.Mõlemad rühmad hukati 6. nädalal.
Ohverdatud loomade reieluud koguti ja fikseeriti 4% paraformaldehüüdis 3 päeva.Seejärel eemaldatakse ortopeediline implantaat ettevaatlikult reieluust.Reieluu katlakivi eemaldati 21 päeva, kasutades 0,5 M EDTA-d (EC-900, National Diagnostics Corporation).Seejärel kasteti katlakivi eemaldatud reieluu EtOH-sse, et muuta see dehüdratsiooniks.Dehüdreeritud reieluu eemaldati ksüleenis ja sisestati parafiini.Seejärel viilutati proov automaatse pöörleva mikrotoomiga (Leica RM2255, Leica Biosystems, Saksamaa) paksusega 3 μm.TRAP-värvimiseks (F6760, Sigma-Aldrich, Saksamaa) lõigatud proovid deparafineeriti, rehüdreeriti ja inkubeeriti TRAP-reagendis temperatuuril 37 °C 1 tund.Pildid saadi slaidi skanneriga (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungari) ja kvantifitseeriti, mõõtes värvitud ala katvust.Igas katses analüüsiti ImageJ tarkvaraga igas rühmas vähemalt nelja substraati.
Statistiline olulisuse analüüs viidi läbi kasutades GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Hindamisrühmade vaheliste erinevuste testimiseks kasutati paaristamata t-testi ja ühesuunalist dispersioonanalüüsi (ANOVA).Olulisuse tase on näidatud joonisel järgmiselt: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 ja ****P<0,0001;NS, olulist erinevust pole.
Selle artikli täiendavaid materjale leiate aadressilt http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
See on avatud juurdepääsuga artikkel, mida levitatakse Creative Commonsi omistamise-mitteärilise litsentsi tingimuste alusel, mis lubab kasutada, levitada ja reprodutseerida mis tahes kandjatel, tingimusel et kasutamine ei ole ärilise kasu saamise eesmärgil ja eelduseks on, et originaal töö on korrektne.Viide.
Märkus. Palume teil sisestada ainult e-posti aadress, et lehele soovitav inimene teaks, et soovite, et ta seda meili näeks ja et meil pole rämpspost.Me ei jäädvusta ühtegi meiliaadressi.
Seda küsimust kasutatakse selleks, et testida, kas olete inimesest külastaja ja vältida automaatset rämpsposti saatmist.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Ortopeediliste implantaatide antibakteriaalsed ja immuunkaitsekatted võivad vähendada infektsioonide põhjustatud infektsioone ja immuunvastuseid.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Ortopeediliste implantaatide antibakteriaalsed ja immuunkaitsekatted võivad vähendada infektsioonide põhjustatud infektsioone ja immuunvastuseid.
©2021 American Association for the Advanced of Science of Science.kõik õigused kaitstud.AAAS on HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ja COUNTER partner.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.