Pre pacientov podstupujúcich ortopedický implantát boli bakteriálne infekcie a infekciou vyvolané imunitné reakcie vždy život ohrozujúcim rizikom.Bežné biologické materiály sú náchylné na biologickú kontamináciu, ktorá spôsobuje, že baktérie prenikajú do poranenej oblasti a spôsobujú pooperačnú infekciu.Preto existuje naliehavá potreba vyvinúť antiinfekčné a imúnne únikové povlaky pre ortopedické implantáty.Tu sme vyvinuli pokročilú technológiu povrchovej úpravy ortopedických implantátov s názvom Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), ktorá je inšpirovaná hladkým povrchom džbánov.LOIS má dlhotrvajúcu a silnú odpudivosť tekutín voči rôznym tekutinám a biologickým látkam (vrátane buniek, bielkovín, vápnika a baktérií).Okrem toho sme potvrdili mechanickú odolnosť proti poškriabaniu a fixačnú silu simuláciou nevyhnutného poškodenia počas operácie in vitro.Model zápalovej zlomeniny stehennej kosti králičej kostnej drene sa použil na dôkladné štúdium antibiologického škálovania a protiinfekčnej schopnosti LOIS.Predstavujeme si, že LOIS, ktorý má vlastnosti proti biologickému znečisteniu a mechanickú odolnosť, je krokom vpred v ortopedickej chirurgii bez infekcie.
V súčasnosti sa v dôsledku celkového starnutia výrazne zvýšil počet pacientov trpiacich ortopedickými ochoreniami (ako sú zlomeniny starších ľudí, degeneratívne ochorenia kĺbov, osteoporóza) (1, 2).Zdravotnícke zariadenia preto pripisujú veľký význam ortopedickej chirurgii, vrátane ortopedických implantátov skrutiek, platničiek, nechtov a umelých kĺbov (3, 4).Uvádza sa však, že tradičné ortopedické implantáty sú citlivé na bakteriálnu adhéziu a tvorbu biofilmu, čo môže po operácii spôsobiť infekciu chirurgického miesta (SSI) (5, 6).Akonáhle sa biofilm vytvorí na povrchu ortopedického implantátu, odstránenie biofilmu sa stáva mimoriadne náročným aj pri použití veľkých dávok antibiotík.Preto zvyčajne vedie k závažným pooperačným infekciám (7, 8).Vzhľadom na vyššie uvedené problémy by liečba infikovaných implantátov mala zahŕňať reoperáciu vrátane odstránenia všetkých implantátov a okolitých tkanív;preto bude pacient trpieť silnými bolesťami a určitými rizikami (9, 10).
Na vyriešenie niektorých z týchto problémov boli vyvinuté ortopedické implantáty uvoľňujúce lieky, aby sa zabránilo infekcii elimináciou baktérií pripojených k povrchu (11, 12).Stratégia však stále vykazuje niekoľko obmedzení.Uvádza sa, že dlhodobá implantácia implantátov uvoľňujúcich liečivo spôsobila poškodenie okolitých tkanív a spôsobila zápal, ktorý môže viesť k nekróze (13, 14).Okrem toho organické rozpúšťadlá, ktoré môžu existovať po výrobnom procese ortopedických implantátov uvoľňujúcich liečivo, ktoré sú prísne zakázané americkým úradom pre potraviny a liečivá, vyžadujú dodatočné purifikačné kroky, aby splnili jeho štandardy (15).Implantáty uvoľňujúce liečivo sú náročné na kontrolované uvoľňovanie liečiv a vzhľadom na ich obmedzené množstvo liečiva nie je možné dlhodobé podávanie liečiva (16).
Ďalšou bežnou stratégiou je potiahnutie implantátu antivegetačným polymérom, aby sa zabránilo priľnutiu biologickej hmoty a baktérií na povrchu (17).Napríklad zwitteriónové polyméry pritiahli pozornosť vďaka svojim neadhezívnym vlastnostiam pri kontakte s plazmatickými proteínmi, bunkami a baktériami.Má však určité obmedzenia súvisiace s dlhodobou stabilitou a mechanickou odolnosťou, ktoré bránia jeho praktickej aplikácii v ortopedických implantátoch, najmä z dôvodu mechanického zoškrabovania pri chirurgických výkonoch (18, 19).Okrem toho sa kvôli svojej vysokej biokompatibilite, nedostatku potreby chirurgického odstránenia a vlastnostiam povrchového čistenia prostredníctvom korózie používali ortopedické implantáty vyrobené z biologicky odbúrateľných materiálov (20, 21).Počas korózie sa chemické väzby medzi polymérnou matricou rozbijú a oddelia od povrchu a priľnavé látky povrch čistia.Antibiologické znečistenie povrchovým čistením je však účinné v krátkom čase.Navyše väčšina absorbovateľných materiálov vrátane kopolyméru kyseliny mliečnej a kyseliny glykolovej (PLGA), kyseliny polymliečnej (PLA) a zliatin na báze horčíka bude podliehať nerovnomernej biodegradácii a erózii v tele, čo negatívne ovplyvní mechanickú stabilitu.(dvadsaťdva).Biodegradovateľné fragmenty platní navyše poskytujú miesto pre uchytenie baktérií, čo z dlhodobého hľadiska zvyšuje možnosť infekcie.Toto riziko mechanickej degradácie a infekcie obmedzuje praktickú aplikáciu plastickej chirurgie (23).
Superhydrofóbne (SHP) povrchy, ktoré napodobňujú hierarchickú štruktúru lotosových listov, sa stali potenciálnym riešením pre povrchy proti znečisteniu (24, 25).Keď je povrch SHP ponorený do kvapaliny, vzduchové bubliny sa zachytia, čím sa vytvoria vzduchové vrecká a zabráni sa priľnutiu baktérií (26).Nedávne štúdie však ukázali, že povrch SHP má nevýhody súvisiace s mechanickou odolnosťou a dlhodobou stabilitou, čo bráni jeho aplikácii v lekárskych implantátoch.Okrem toho sa vzduchové vrecká rozpustia a stratia svoje vlastnosti proti zanášaniu, čo vedie k širšej adhézii baktérií v dôsledku veľkej plochy povrchu SHP (27, 28).Nedávno Aizenberg a kolegovia predstavili inovatívnu metódu povrchovej úpravy proti biologickému znečisteniu vyvinutím hladkého povrchu inšpirovaného džbánom Nepenthes (29, 30).Hladký povrch vykazuje dlhodobú stabilitu v hydraulických podmienkach, extrémne odpudzuje tekutiny voči biologickým tekutinám a má samoopravné vlastnosti.Neexistuje však ani spôsob nanášania povlaku na medicínsky implantát zložitého tvaru a nie je dokázané, že by podporoval proces hojenia poškodeného tkaniva po implantácii.
Tu predstavujeme lubrikovaný povrch ortopedického implantátu (LOIS), mikro/nano-štruktúrovaný povrch ortopedického implantátu a pevne spojený s tenkou vrstvou lubrikantu, aby sa zabránilo jeho spojeniu s plastickou chirurgiou Bakteriálne infekcie, ako je fixácia zlomeniny.Pretože mikro/nano-úroveň funkcionalizovaná fluórom pevne fixuje mazivo na štruktúre, vyvinutý LOIS dokáže plne odpudzovať priľnavosť rôznych kvapalín a dlhodobo udržiavať účinnosť proti znečisteniu.Povlaky LOIS je možné aplikovať na materiály rôznych tvarov určené na syntézu kostí.Vynikajúce vlastnosti LOIS proti biofilmovým baktériám [Pseudomonas aeruginosa a meticilín-rezistentný Staphylococcus aureus (MRSA)] a biologickým látkam (bunky, proteíny a vápnik) boli potvrdené in vitro.Miera priľnavosti rozsiahlej priľnavosti k podkladu je menšia ako 1 %.Navyše aj po mechanickom namáhaní, ako je poškriabanie povrchu, samoliečenie spôsobené penetračným mazivom pomáha udržiavať jeho vlastnosti proti zanášaniu.Výsledky testu mechanickej odolnosti ukazujú, že ani po konštrukčnej a chemickej úprave sa celková pevnosť výrazne nezníži.Okrem toho bol vykonaný in vitro experiment, ktorý simuluje mechanické namáhanie v chirurgickom prostredí, aby sa dokázalo, že LOIS dokáže vydržať rôzne mechanické namáhania, ku ktorým dochádza počas plastickej chirurgie.Nakoniec sme použili in vivo model zlomeniny stehennej kosti založený na králikoch, ktorý dokázal, že LOIS má vynikajúce antibakteriálne vlastnosti a biokompatibilitu.Rádiologické a histologické výsledky potvrdili, že stabilné lubrikačné vlastnosti a vlastnosti proti biologickému znečisteniu do 4 týždňov po implantácii môžu dosiahnuť účinnú protiinfekčnú a imunitnú únikovú účinnosť bez oneskorenia procesu hojenia kosti.
Obrázok 1A ukazuje schematický diagram vyvinutého LOIS, ktorému sú implantované mikro/nano-štruktúry v modeli zlomeniny stehennej kosti králika, aby sa potvrdili jeho vynikajúce antibiologické zanášanie a antiinfekčné vlastnosti.Biomimetická metóda sa vykonáva na simuláciu povrchu rastliny v kvetináči a na zabránenie biologického znečistenia začlenením lubrikačnej vrstvy do mikro/nano štruktúry povrchu.Povrch vstreknutý lubrikantom môže minimalizovať kontakt medzi biologickými látkami a povrchom.Vďaka vytvoreniu stabilných chemických väzieb na povrchu má preto vynikajúci antivegetačný výkon a dlhodobú stabilitu.Výsledkom je, že vlastnosti mazacieho povrchu proti biologickému znečisteniu umožňujú rôzne praktické aplikácie v biomedicínskom výskume.Rozsiahly výskum toho, ako tento špeciálny povrch interaguje v tele, však ešte nebol ukončený.Porovnaním LOIS s nahými substrátmi in vitro pomocou albumínu a biofilmových baktérií možno potvrdiť nepriľnavosť LOIS (obrázok 1B).Okrem toho odvalením kvapiek vody na naklonený holý substrát a substrát LOIS (obrázok S1 a film S1) možno preukázať účinnosť biologickej kontaminácie.Ako je znázornené na obrázku fluorescenčného mikroskopu, exponovaný substrát inkubovaný v suspenzii proteínu a baktérií vykazoval veľké množstvo biologického materiálu priľnutého k povrchu.Avšak vďaka svojim vynikajúcim vlastnostiam proti biologickému znečisteniu LOIS takmer nevykazuje žiadnu fluorescenciu.Aby sa potvrdili jeho vlastnosti proti biologickému znečisteniu a proti infekcii, LOIS sa aplikoval na povrch ortopedických implantátov na syntézu kostí (doštičky a skrutky) a umiestnil sa do modelu zlomeniny králika.Pred implantáciou sa nahý ortopedický implantát a LOIS inkubovali v bakteriálnej suspenzii počas 12 hodín.Predinkubácia zaisťuje, že sa na povrchu exponovaného implantátu vytvorí biofilm na porovnanie.Obrázok 1C ukazuje fotografiu miesta zlomeniny 4 týždne po implantácii.Vľavo králik s holým ortopedickým implantátom vykazoval závažnú úroveň zápalu v dôsledku tvorby biofilmu na povrchu implantátu.Opačný výsledok bol pozorovaný u králikov s implantovaným LOIS, to znamená, že okolité tkanivá LOIS nevykazovali ani známky infekcie, ani známky zápalu.Okrem toho optický obraz vľavo ukazuje miesto chirurgického zákroku králika s exponovaným implantátom, čo naznačuje, že na povrchu LOIS sa nenašli žiadne viaceré adhezíva prítomné na povrchu exponovaného implantátu.To ukazuje, že LOIS má dlhodobú stabilitu a má schopnosť zachovať si svoje antibiologické znečistenie a antiadhézne vlastnosti.
(A) Schematický diagram LOIS a jeho implantácie do modelu zlomeniny stehennej kosti králika.(B) Fluorescenčný mikroskopický obraz proteínového a bakteriálneho biofilmu na holom povrchu a substráte LOIS.4 týždne po implantácii (C) fotografická snímka miesta zlomeniny a (D) röntgenová snímka (zvýraznená červeným obdĺžnikom).S láskavým dovolením: Kyomin Chae, Univerzita Yonsei.
Sterilizované, vystavené negatívne implantované králiky vykazovali normálny proces hojenia kostí bez akýchkoľvek známok zápalu alebo infekcie.Na druhej strane implantáty SHP predinkubované v bakteriálnej suspenzii vykazujú zápal súvisiaci s infekciou na okolitých tkanivách.To možno pripísať jeho neschopnosti dlhodobo inhibovať adhéziu baktérií (obrázok S2).Aby sa dokázalo, že LOIS neovplyvňuje proces hojenia, ale inhibuje možné infekcie súvisiace s implantáciou, porovnávali sa röntgenové snímky exponovanej pozitívnej matrice a LOIS v mieste zlomeniny (obrázok 1D).Röntgenový obraz holého pozitívneho implantátu ukázal pretrvávajúce línie osteolýzy, čo naznačuje, že kosť nebola úplne zahojená.To naznačuje, že proces obnovy kostí môže byť značne oneskorený v dôsledku zápalu súvisiaceho s infekciou.Naopak, ukázalo sa, že králiky s implantovaným LOIS sa zahojili a nevykazovali žiadne zjavné miesto zlomeniny.
Na vývoj lekárskych implantátov s dlhodobou stabilitou a funkčnosťou (vrátane odolnosti voči biologickému znečisteniu) sa vynaložilo veľa úsilia.Prítomnosť rôznych biologických látok a dynamika tkanivovej adhézie však obmedzuje vývoj ich klinicky spoľahlivých metód.Aby sme tieto nedostatky prekonali, vyvinuli sme mikro/nano vrstvenú štruktúru a chemicky upravený povrch, ktorý je vďaka vysokej kapilárnej sile a chemickej afinite optimalizovaný na udržanie čo najhladšieho maziva v čo najväčšej miere.Obrázok 2A znázorňuje celkový výrobný proces LOIS.Najprv pripravte substrát z nehrdzavejúcej ocele (SS) 304 lekárskej kvality.Po druhé, mikro/nano štruktúra sa vytvorí na substráte SS chemickým leptaním pomocou roztoku kyseliny fluorovodíkovej (HF).Na obnovenie koróznej odolnosti SS sa na spracovanie leptaného substrátu používa roztok kyseliny dusičnej (HNO3) (31).Pasivácia zvyšuje odolnosť substrátu SS proti korózii a výrazne spomaľuje proces korózie, ktorý môže znížiť celkový výkon LOIS.Potom vytvorením samostatne zostavenej monovrstvy (SAM) s 1H, 1H, 2H, 2H-perfluóroktyltrietoxysilánom (POTS) sa povrch chemicky upraví, aby sa zlepšila chemická interakcia medzi povrchom a afinitou hladkého lubrikantu.Úprava povrchu výrazne znižuje povrchovú energiu vyrobeného mikro/nano-štruktúrovaného povrchu, čo zodpovedá povrchovej energii hladkého maziva.To umožňuje úplné zmáčanie maziva, čím sa na povrchu vytvorí stabilná vrstva maziva.Upravený povrch vykazuje zvýšenú hydrofóbnosť.Výsledky ukazujú, že klzké mazivo vykazuje stabilné správanie na LOIS v dôsledku vysokej chemickej afinity a kapilárnej sily spôsobenej mikro/nano štruktúrou (32, 33).Študovali sa optické zmeny na povrchu SS po modifikácii povrchu a vstreknutí maziva.Mikro/nano vrstvená štruktúra vytvorená na povrchu môže spôsobiť vizuálne zmeny a stmaviť povrch.Tento jav sa pripisuje zvýšenému efektu rozptylu svetla na drsnom povrchu, ktorý zvyšuje difúzny odraz spôsobený mechanizmom zachytávania svetla (34).Navyše, po vstreknutí lubrikantu sa LOIS stmavne.Mazacia vrstva spôsobuje, že sa od podkladu odráža menej svetla, čím sa LOIS stmavuje.Aby sa optimalizovala mikroštruktúra / nanoštruktúra, aby sa ukázal najmenší uhol kĺzania (SA), aby sa dosiahol výkon proti biologickému znečisteniu, na vykonanie rôznych časov HF leptania sa použila skenovacia elektrónová mikroskopia (SEM) a atómové páry (0, 3).15 a 60 minút) Silový mikroskop (AFM) (obrázok 2B).Obrázky SEM a AFM ukazujú, že po krátkom čase leptania (3 minúty leptania) sa na holom substráte vytvorila nerovnomerná drsnosť nanometrov.Drsnosť povrchu sa mení s časom leptania (obrázok S3).Časovo sa meniaca krivka ukazuje, že drsnosť povrchu sa naďalej zvyšuje a dosahuje vrchol po 15 minútach leptania, a potom sa pozoruje len mierny pokles hodnoty drsnosti po 30 minútach leptania.V tomto bode sa drsnosť na nanoúrovni odleptá, zatiaľ čo drsnosť na mikroúrovni sa prudko rozvíja, čím sa zmena drsnosti stáva stabilnejšou.Po leptaní trvajúcom viac ako 30 minút sa pozoruje ďalší nárast drsnosti, ktorý je podrobne vysvetlený nasledovne: SS sa skladá z ocele, legovanej prvkami vrátane železa, chrómu, niklu, molybdénu a mnohých ďalších prvkov.Spomedzi týchto prvkov zohrávajú dôležitú úlohu železo, chróm a molybdén pri vytváraní mikrónovej/nanoúrovňovej drsnosti na SS pomocou HF leptania.V skorých štádiách korózie dochádza k korózii hlavne železa a chrómu, pretože molybdén má vyššiu odolnosť proti korózii ako molybdén.Ako leptanie postupuje, leptací roztok dosiahne lokálne presýtenie, čím sa vytvárajú fluoridy a oxidy spôsobené leptaním.Fluorid a oxid sa vyzrážajú a prípadne sa znovu usadia na povrchu, čím sa vytvorí drsnosť povrchu v rozsahu mikrónov/nano (31).Táto drsnosť na mikro/nano úrovni hrá dôležitú úlohu v samoliečivých vlastnostiach LOIS.Dvojitý povrch vytvára synergický efekt, ktorý výrazne zvyšuje kapilárnu silu.Tento jav umožňuje lubrikantu stabilne prenikať na povrch a prispieva k samoliečivým vlastnostiam (35).Vznik drsnosti závisí od doby leptania.Po 10 minútach leptania obsahuje povrch iba drsnosť nanometrov, čo nestačí na to, aby udržalo dostatok maziva na to, aby bol odolný voči biologickému znečisteniu (36).Na druhej strane, ak doba leptania presiahne 30 minút, drsnosť nanometrov vytvorená redepozíciou železa a chrómu zmizne a zostane len drsnosť v mikroúrovni v dôsledku molybdénu.Preleptanému povrchu chýba drsnosť nanometrov a stráca synergický efekt dvojstupňovej drsnosti, čo negatívne ovplyvňuje samoliečiace vlastnosti LOIS.Merania SA sa uskutočňovali na substrátoch s rôznymi časmi leptania, aby sa preukázala účinnosť proti znečisteniu.Na základe viskozity a povrchovej energie boli vybrané rôzne typy kvapalín, vrátane deionizovanej (DI) vody, krvi, etylénglykolu (EG), etanolu (EtOH) a hexadekánu (HD) (obrázok S4).Časovo sa meniaci vzor leptania ukazuje, že pre rôzne kvapaliny s rôznymi povrchovými energiami a viskozitami je SA LOIS po 15 minútach leptania najnižšia.Preto je LOIS optimalizovaný na leptanie po dobu 15 minút, aby sa vytvorila mikrónová a nanoúrovňová drsnosť, ktorá je vhodná na efektívne udržanie trvanlivosti maziva a vynikajúcich vlastností proti zanášaniu.
(A) Schematický diagram štvorstupňového výrobného procesu LOIS.Vložka zobrazuje SAM vytvorený na substráte.(B) Obrázky SEM a AFM, používané na optimalizáciu mikro/nano štruktúry substrátu pri rôznych časoch leptania.Röntgenové fotoelektrónové spektroskopické (XPS) spektrá (C) Cr2p a (D) F1s po povrchovej pasivácii a potiahnutí SAM.au, ľubovoľná jednotka.(E) Reprezentatívne obrázky kvapiek vody na holých, leptaných substrátoch SHP a LOIS.(F) Kontaktný uhol (CA) a SA meranie kvapalín s rôznym povrchovým napätím na SHP a LOIS.Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD.
Potom, aby sa potvrdila zmena chemických vlastností povrchu, bola použitá röntgenová fotoelektrónová spektroskopia (XPS) na štúdium zmeny chemického zloženia povrchu substrátu po každom povrchovom nátere.Obrázok 2C ukazuje výsledky merania XPS HF leptaného povrchu a povrchu ošetreného HN03.Dva hlavné píky pri 587,3 a 577,7 eV možno pripísať Cr-O väzbe existujúcej vo vrstve oxidu chrómu, čo je hlavný rozdiel od HF leptaného povrchu.Je to spôsobené najmä spotrebou železa a fluoridu chrómu na povrchu HNO3.Leptanie na báze HNO3 umožňuje chrómu vytvárať na povrchu pasivujúcu vrstvu oxidu, vďaka čomu je leptaný SS opäť odolný voči korózii.Na obrázku 2D sa získali spektrá XPS, aby sa potvrdilo, že silán na báze fluórovaných uhľovodíkov sa vytvoril na povrchu po potiahnutí SAM, ktorý má extrémne vysokú odpudivosť tekutín dokonca aj pre EG, krv a EtOH.Povlak SAM je dokončený reakciou silánových funkčných skupín s hydroxylovými skupinami vytvorenými plazmovým spracovaním.V dôsledku toho bolo pozorované výrazné zvýšenie píkov CF2 a CF3.Väzbová energia medzi 286 a 296 eV naznačuje, že chemická modifikácia bola úspešne dokončená povlakom SAM.SHP vykazuje relatívne veľké píky CF2 (290,1 eV) a CF3 (293,3 eV), ktoré sú spôsobené silánom na báze fluórovaných uhľovodíkov vytvoreným na povrchu.Obrázok 2E ukazuje reprezentatívne optické obrazy meraní kontaktného uhla (CA) pre rôzne skupiny deionizovanej vody v kontakte s holou, leptanou, SHP a LOIS.Tieto obrázky ukazujú, že leptaný povrch sa stáva hydrofilným vďaka mikro/nano štruktúre vytvorenej chemickým leptaním, takže deionizovaná voda je absorbovaná do štruktúry.Keď je však substrát potiahnutý SAM, substrát vykazuje silnú vodoodpudivosť, takže sa vytvorí povrchový SHP a kontaktná plocha medzi vodou a povrchom je malá.Nakoniec bol v LOIS pozorovaný pokles CA, ktorý možno pripísať prieniku maziva do mikroštruktúry, čím sa zväčšila kontaktná plocha.Aby sa dokázalo, že povrch má vynikajúcu odpudivosť kvapalín a nelepivé vlastnosti, LOIS sa porovnal so substrátom SHP meraním CA a SA s použitím rôznych kvapalín (obrázok 2F).Na základe viskozity a povrchovej energie boli vybrané rôzne typy kvapalín, vrátane deionizovanej vody, krvi, EG, EtOH a HD (obrázok S4).Výsledky merania CA ukazujú, že keď CA má tendenciu k HD, hodnota redukcie CA, kde CA má najnižšiu povrchovú energiu.Okrem toho je LOIS celkovej CA nízka.Meranie SA však ukazuje úplne iný jav.Okrem ionizovanej vody všetky kvapaliny priľnú k substrátu SHP bez toho, aby skĺzli.Na druhej strane, LOIS vykazuje veľmi nízku SA, kde keď je všetka kvapalina naklonená pod uhlom menším ako 10° až 15°, všetka kvapalina sa valí.To silne ukazuje, že nepriľnavosť LOIS je lepšia ako priľnavosť povrchu SHP.Okrem toho sa povlaky LOIS aplikujú aj na rôzne typy materiálov vrátane titánu (Ti), polyfenylsulfónu (PPSU), polyoxymetylénu (POM), polyéteréterketónu (PEEK) a bioabsorbovateľných polymérov (PLGA), sú to implantovateľné ortopedické materiály (obrázok S5)).Sekvenčné snímky kvapiek na materiáli ošetrenom LOIS ukazujú, že vlastnosti LOIS proti biologickému znečisteniu sú rovnaké na všetkých substrátoch.Okrem toho výsledky meraní CA a SA ukazujú, že neadhézne vlastnosti LOIS možno aplikovať aj na iné materiály.
Aby sa potvrdili vlastnosti LOIS proti znečisteniu, rôzne typy substrátov (vrátane holých, leptaných, SHP a LOIS) sa inkubovali s Pseudomonas aeruginosa a MRSA.Tieto dve baktérie boli vybrané ako reprezentatívne nemocničné baktérie, ktoré môžu viesť k tvorbe biofilmov, čo vedie k SSI (37).Obrázok 3 (A a B) ukazuje snímky fluorescenčného mikroskopu a výsledky merania jednotky tvoriacej kolónie (CFU) substrátov inkubovaných v bakteriálnej suspenzii krátkodobo (12 hodín) a dlhodobo (72 hodín).V krátkom čase baktérie vytvoria zhluky a zväčšia sa, pokrývajú sa látkami podobnými hlienu a bránia ich odstráneniu.Počas 72-hodinovej inkubácie však baktérie dospejú a ľahko sa rozptýlia, aby vytvorili ďalšie kolónie alebo zhluky.Preto možno uvažovať o tom, že 72-hodinová inkubácia je dlhodobá a je vhodným inkubačným časom na vytvorenie silného biofilmu na povrchu (38).V krátkom čase leptaný povrch a povrch SHP vykazovali bakteriálnu adhéziu, ktorá bola znížená asi o 25 % až 50 % v porovnaní s holým substrátom.Avšak vďaka svojej vynikajúcej účinnosti a stabilite proti biologickému znečisteniu, LOIS nevykazoval priľnavosť bakteriálneho biofilmu v krátkodobom a dlhodobom horizonte.Schematický diagram (obrázok 3C) opisuje vysvetlenie mechanizmu proti biologickému znečisteniu leptacieho roztoku, SHP a LOIS.Predpokladom je, že leptaný substrát s hydrofilnými vlastnosťami bude mať väčší povrch ako holý substrát.Preto na leptanom substráte dôjde k väčšej adhézii baktérií.Avšak v porovnaní s holým substrátom má leptaný substrát výrazne menej vytvoreného biofilmu na povrchu.Je to preto, že molekuly vody sa pevne viažu na hydrofilný povrch a pôsobia ako lubrikant vody, čím krátkodobo interferujú s priľnavosťou baktérií (39).Vrstva molekúl vody je však veľmi tenká a rozpustná v bakteriálnych suspenziách.Preto molekulárna vrstva vody na dlhú dobu mizne, čo vedie k rozsiahlej adhézii a množeniu baktérií.Pri SHP je vďaka svojim krátkodobým nezmáčavostiam inhibovaná priľnavosť baktérií.Zníženú priľnavosť baktérií možno pripísať vzduchovým vreckám zachyteným vo vrstvenej štruktúre a nižšej povrchovej energii, čím sa minimalizuje kontakt medzi suspenziou baktérií a povrchom.Pri SHP však bola pozorovaná rozsiahla adhézia baktérií, pretože na dlhý čas stratila svoje antivegetatívne vlastnosti.Je to spôsobené najmä zmiznutím vzduchových vreciek v dôsledku hydrostatického tlaku a rozpustením vzduchu vo vode.Je to hlavne kvôli vymiznutiu vzduchových vreciek v dôsledku rozpustenia a vrstvenej štruktúry, ktorá poskytuje väčšiu plochu pre adhéziu (27, 40).Na rozdiel od týchto dvoch substrátov, ktoré majú dôležitý vplyv na dlhodobú stabilitu, je lubrikačný lubrikant obsiahnutý v LOIS vstrekovaný do mikro/nano štruktúry a nezmizne ani z dlhodobého hľadiska.Mazivá plnené mikro/nano štruktúrami sú veľmi stabilné a sú silne priťahované k povrchu vďaka svojej vysokej chemickej afinite, čím zabraňujú priľnavosti baktérií na dlhú dobu.Obrázok S6 ukazuje obraz z reflexného konfokálneho mikroskopu substrátu naplneného lubrikantom ponoreného do fyziologického roztoku pufrovaného fosfátmi (PBS).Nepretržité obrázky ukazujú, že aj po 120 hodinách mierneho pretrepávania (120 otáčok za minútu) zostáva vrstva maziva na LOIS nezmenená, čo naznačuje dlhodobú stabilitu v podmienkach prietoku.Je to spôsobené vysokou chemickou afinitou medzi povlakom SAM na báze fluóru a lubrikantom na báze perfluorokarbónu, takže je možné vytvoriť stabilnú vrstvu lubrikantu.Preto je zachovaná účinnosť proti zanášaniu.Okrem toho bol substrát testovaný proti reprezentatívnym proteínom (albumín a fibrinogén), ktoré sú v plazme, bunkám úzko súvisiacim s imunitnou funkciou (makrofágy a fibroblasty) a tým, ktoré súvisia s tvorbou kostí.Obsah vápnika je veľmi vysoký.(Obrázok 3D, 1 a 2 a obrázok S7) (41, 42).Okrem toho snímky z fluorescenčného mikroskopu adhézneho testu na fibrinogén, albumín a vápnik ukázali rôzne adhézne charakteristiky každej skupiny substrátov (obrázok S8).Počas tvorby kosti môžu novovytvorené kostné a vápenaté vrstvy obklopiť ortopedický implantát, čo nielen sťažuje odstránenie, ale môže tiež spôsobiť neočakávané poškodenie pacienta počas procesu odstraňovania.Nízke hladiny vápnikových usadenín na kostných doštičkách a skrutkách sú preto prospešné pre ortopedickú chirurgiu, ktorá si vyžaduje odstránenie implantátu.Na základe kvantifikácie pripojenej oblasti na základe intenzity fluorescencie a počtu buniek sme potvrdili, že LOIS vykazuje vynikajúce vlastnosti proti biologickému znečisteniu pre všetky biologické látky v porovnaní s inými substrátmi.Podľa výsledkov in vitro experimentov je možné antibiologické znečistenie LOIS aplikovať na ortopedické implantáty, ktoré dokážu nielen inhibovať infekcie spôsobené biofilmovými baktériami, ale aj redukovať zápaly spôsobené aktívnym imunitným systémom organizmu.
(A) Obrázky z fluorescenčného mikroskopu každej skupiny (nahé, leptané, SHP a LOIS) inkubované v suspenziách Pseudomonas aeruginosa a MRSA počas 12 a 72 hodín.(B) Počet adherentných CFU Pseudomonas aeruginosa a MRSA na povrchu každej skupiny.(C) Schematický diagram mechanizmu proti biologickému znečisteniu krátkodobého a dlhodobého leptania, SHP a LOIS.(D) (1) Počet fibroblastov priľnutých ku každému substrátu a snímky buniek z fluorescenčného mikroskopu priľnuté na holé a LOIS.(2) Test adhézie imunitne podmienených proteínov, albumínu a vápnika zapojených do procesu hojenia kostí (* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 a **** P < 0,0001).ns, nie je dôležité.
V prípade nevyhnutného koncentrovaného namáhania bola mechanická odolnosť vždy hlavnou výzvou pre aplikáciu náterov proti znečisteniu.Tradičné gélové metódy proti splaškovej vode sú založené na polyméroch s nízkou rozpustnosťou vo vode a krehkosťou.Preto sú zvyčajne náchylné na mechanické namáhanie v biomedicínskych aplikáciách.Preto mechanicky odolné povlaky proti znečisteniu zostávajú výzvou pre aplikácie, ako sú ortopedické implantáty (43, 44).Obrázok 4A(1) znázorňuje dva hlavné typy namáhania aplikovaného na ortopedické implantáty, vrátane poškriabania (šmykového napätia) a stláčania s optickým obrazom poškodeného implantátu vytváraným kliešťami.Napríklad, keď je skrutka utiahnutá skrutkovačom alebo keď chirurg pevne drží kostnú platničku pinzetou a vyvíja tlakovú silu, plastová kostná platnička sa poškodí a poškriabe na makro aj mikro/nano stupnici (obrázok 4A, 2).Aby sa otestovalo, či vyrobený LOIS dokáže odolať týmto poškodeniam počas plastickej chirurgie, vykonala sa nanoindentácia na porovnanie tvrdosti holého substrátu a LOIS na mikro/nano mierke, aby sa študovali mechanické vlastnosti mikro/nano štruktúry Impact (obrázok 4B).Schematický diagram ukazuje rôzne deformačné správanie LOIS v dôsledku prítomnosti mikro/nano štruktúr.Na základe výsledkov nanoindentácie bola nakreslená krivka sila-posunutie (obrázok 4C).Modrý obrázok predstavuje holý substrát, ktorý vykazuje iba miernu deformáciu, ako je vidieť z maximálnej hĺbky vtlačenia 0, 26 μm.Na druhej strane postupné zvyšovanie nanoindentačnej sily a posunu pozorované v LOIS (červená krivka) môže vykazovať známky znížených mechanických vlastností, čo vedie k hĺbke nanoindentácie 1,61 μm.Je to preto, že mikro/nano štruktúra prítomná v LOIS poskytuje hlbší priestor pre posun hrotu nanoindentoru, takže jeho deformácia je väčšia ako deformácia holého substrátu.Konsta-Gdoutos a kol.(45) sa domnieva, že v dôsledku prítomnosti nanoštruktúr vedie nanoindentácia a mikro/nano drsnosť k nepravidelným krivkám nanoindentácie.Tieňovaná oblasť zodpovedá nepravidelnej deformačnej krivke pripisovanej nanoštruktúre, zatiaľ čo netienená oblasť je pripisovaná mikroštruktúre.Táto deformácia môže poškodiť mikroštruktúru/nanoštruktúru pridržiavacieho maziva a negatívne ovplyvniť jeho vlastnosti proti zanášaniu.Aby bolo možné študovať vplyv poškodenia na LOIS, nevyhnutné poškodenie mikro/nano štruktúr sa replikovalo v tele počas plastickej chirurgie.Použitím krvných a proteínových adhéznych testov je možné určiť stabilitu vlastností LOIS proti biologickému znečisteniu po in vitro (obrázok 4D).Séria optických snímok ukazuje poškodenie, ku ktorému došlo v blízkosti otvorov každého substrátu.Uskutočnil sa krvný test priľnavosti, aby sa preukázal účinok mechanického poškodenia na povlak proti biologickému znečisteniu (obrázok 4E).Rovnako ako SHP, vlastnosti proti znečisteniu sa stratia v dôsledku poškodenia a LOIS vykazuje vynikajúce vlastnosti proti znečisteniu tým, že odpudzuje krv.Je to preto, lebo povrchová energia je poháňaná kapilárnym pôsobením pokrývajúcim poškodenú oblasť, tok v mikroštruktúrovanom lubrikante obnovuje vlastnosti proti zanášaniu (35).Rovnaký trend bol pozorovaný v teste adhézie proteínov s použitím albumínu.V poškodenej oblasti je adhézia proteínu na povrchu SHP široko pozorovaná a meraním jej plošného pokrytia ju možno kvantifikovať ako polovicu úrovne adhézie holého substrátu.Na druhej strane si LOIS zachoval svoje vlastnosti proti biologickému znečisteniu bez spôsobenia adhézie (obrázok 4, F a G).Okrem toho je povrch skrutky často vystavený silnému mechanickému namáhaniu, ako je vŕtanie, takže sme študovali schopnosť povlaku LOIS zostať neporušený na skrutke in vitro.Obrázok 4H ukazuje optické obrazy rôznych skrutiek, vrátane holých, SHP a LOIS.Červený obdĺžnik predstavuje cieľovú oblasť, kde dochádza k silnému mechanickému namáhaniu počas implantácie kosti.Podobne ako pri teste priľnavosti proteínu na platni sa na zobrazenie priľnavosti proteínu a meranie oblasti pokrytia používa fluorescenčný mikroskop, aby sa dokázala integrita povlaku LOIS, a to aj pri silnom mechanickom namáhaní (obrázok 4, I a J).Skrutky ošetrené LOIS vykazujú vynikajúci výkon proti zanášaniu a na povrchu sa neprichytáva takmer žiadny proteín.Na druhej strane, adhézia proteínov bola pozorovaná u holých skrutiek a SHP skrutiek, kde plošné pokrytie SHP skrutiek bolo tretinové v porovnaní s holých skrutiek.Okrem toho musí byť ortopedický implantát použitý na fixáciu mechanicky pevný, aby vydržal namáhanie aplikované na miesto zlomeniny, ako je znázornené na obrázku 4K.Preto bola vykonaná skúška ohybom na zistenie vplyvu chemickej modifikácie na mechanické vlastnosti.Okrem toho sa to robí na udržanie pevného napätia z implantátu.Aplikujte vertikálnu mechanickú silu, kým sa implantát úplne nezloží a nezíska sa krivka napätia a deformácie (obrázok 4L, 1).Dve vlastnosti vrátane Youngovho modulu a pevnosti v ohybe sa porovnávali medzi holými a LOIS substrátmi ako indikátory ich mechanickej pevnosti (obrázok 4L, 2 a 3).Youngov modul udáva schopnosť materiálu odolávať mechanickým zmenám.Youngov modul každého substrátu je 41,48 ± 1,01 a 40,06 ± 0,96 GPa;pozorovaný rozdiel je asi 3,4 %.Okrem toho sa uvádza, že pevnosť v ohybe, ktorá určuje húževnatosť materiálu, je 102,34±1,51 GPa pre holý substrát a 96,99±0,86 GPa pre SHP.Holý substrát je približne o 5,3 % vyšší.Mierne zníženie mechanických vlastností môže byť spôsobené vrubovým efektom.Pri vrubovom efekte môže mikro/nano drsnosť pôsobiť ako súbor vrubov, čo vedie k lokálnej koncentrácii napätia a ovplyvňuje mechanické vlastnosti implantátu (46).Avšak na základe skutočnosti, že tuhosť ľudskej kortikálnej kosti sa uvádza medzi 7,4 a 31,6 GPa a nameraný modul LOIS prevyšuje modul ľudskej kortikálnej kosti (47), je LOIS dostatočná na podporu zlomeniny a jej celkovej mechanické vlastnosti sú minimálne ovplyvnené úpravou povrchu.
(A) Schematický diagram (1) mechanického namáhania aplikovaného na ortopedický implantát počas operácie a (2) optický obraz poškodeného ortopedického implantátu.(B) Schematický diagram merania nano-mechanických vlastností pomocou nanoindentácie a LOIS na holom povrchu.(C) Krivka nanoindentačnej sily-posunu holého povrchu a LOIS.(D) Po experimentoch in vitro simulujte optické obrazy rôznych typov ortopedických platní (poškodená oblasť je zvýraznená červeným obdĺžnikom), aby sa simulovalo mechanické namáhanie spôsobené počas operácie.(E) Krvný test adhézie a (F) test proteínovej adhézie skupiny poškodenej ortopedickej platničky.(G) Zmerajte plošné pokrytie proteínom priľnutým na platni.(H) Optické obrazy rôznych typov ortopedických skrutiek po experimente in vitro.(I) Test adhézie proteínov na štúdium integrity rôznych povlakov.(J) Zmerajte plošné pokrytie proteínom priľnutým na skrutke.(K) Pohyb králika je určený na vytvorenie pevného napätia na zlomenej kosti.(L) (1) Výsledky testu ohybu a optické snímky pred a po ohnutí.Rozdiel v (2) Youngovom module a (3) pevnosti v ohybe medzi holým implantátom a SHP.Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SD (*P<0,05,**P<0,01,***P<0,001 a ****P<0,0001).S láskavým dovolením: Kyomin Chae, Univerzita Yonsei.
V klinických situáciách väčšina bakteriálneho kontaktu s biologickými materiálmi a miestami rany pochádza zo zrelých, zrelých biofilmov (48).Americké centrum pre kontrolu a prevenciu chorôb preto odhaduje, že 65 % všetkých ľudských infekcií súvisí s biofilmami (49).V tomto prípade je potrebné poskytnúť in vivo experimentálny dizajn, ktorý poskytuje konzistentnú tvorbu biofilmu na povrchu implantátu.Preto sme vyvinuli model zlomeniny stehennej kosti králika, v ktorom sa ortopedické implantáty predinkubovali v bakteriálnej suspenzii a potom sa implantovali do králičích stehenných kostí, aby sa študovali vlastnosti LOIS proti znečisteniu in vivo.Kvôli nasledujúcim trom dôležitým skutočnostiam sú bakteriálne infekcie vyvolané skôr predkultiváciou než priamou injekciou bakteriálnych suspenzií: (i) Imunitný systém králikov je prirodzene silnejší ako u ľudí;preto je možná injekcia bakteriálnych suspenzií a planktonických baktérií Nemá vplyv na tvorbu biofilmov.(Ii) Planktonické baktérie sú citlivejšie na antibiotiká a antibiotiká sa zvyčajne používajú po operácii;nakoniec, (iii) suspenzia planktonických baktérií môže byť zriedená telesnými tekutinami zvieraťa (50).Predkultiváciou implantátu v bakteriálnej suspenzii pred implantáciou môžeme dôkladne študovať škodlivé účinky bakteriálnej infekcie a reakcie na cudzie teleso (FBR) na proces hojenia kosti.Králiky boli usmrtené 4 týždne po implantácii, pretože osseointegrácia nevyhnutná pre proces hojenia kosti bude dokončená do 4 týždňov.Potom boli králikom odstránené implantáty na následné štúdie.Obrázok 5A ukazuje mechanizmus proliferácie baktérií.Infikovaný ortopedický implantát sa zavedie do tela.V dôsledku predinkubácie v bakteriálnej suspenzii bolo infikovaných šesť zo šiestich králikov s implantovanými holými implantátmi, zatiaľ čo žiadny z králikov s implantovanými implantátmi ošetrenými LOIS nebol infikovaný.Bakteriálne infekcie prebiehajú v troch krokoch, vrátane rastu, dozrievania a rozptylu (51).Najprv sa prichytené baktérie rozmnožujú a rastú na povrchu a potom baktérie vytvárajú biofilm, keď vylučujú extracelulárny polymér (EPS), amyloid a extracelulárnu DNA.Biofilm nielenže interferuje s penetráciou antibiotík, ale podporuje aj akumuláciu enzýmov degradujúcich antibiotiká (ako je β-laktamáza) (52).Nakoniec biofilm rozšíri zrelé baktérie do okolitých tkanív.Preto dochádza k infekcii.Navyše, keď sa do tela dostane cudzie teleso, infekcia, ktorá môže spôsobiť silnú imunitnú odpoveď, môže spôsobiť silný zápal, bolesť a zníženú imunitu.Obrázok 5B poskytuje prehľad FBR spôsobenej vložením ortopedického implantátu, a nie imunitnej odpovede spôsobenej bakteriálnou infekciou.Imunitný systém rozpozná vložený implantát ako cudzie teleso a potom spôsobí reakciu buniek a tkanív na zapuzdrenie cudzieho telesa (53).V prvých dňoch FBR sa na povrchu ortopedických implantátov vytvorila zásobná matrica, čo malo za následok adsorpciu fibrinogénu.Adsorbovaný fibrinogén potom vytvára vysoko hustú fibrínovú sieť, ktorá podporuje prichytenie leukocytov (54).Po vytvorení fibrínovej siete dôjde k akútnemu zápalu v dôsledku infiltrácie neutrofilov.V tomto kroku sa uvoľňujú rôzne cytokíny, ako je tumor nekrotizujúci faktor-a (TNF-a), interleukín-4 (IL-4) a IL-p a monocyty začnú infiltrovať miesto implantácie a diferencovať sa na obrovské bunky.Fág (41, 55, 56).Zníženie FBR bolo vždy výzvou, pretože nadmerné FBR môže spôsobiť akútny a chronický zápal, ktorý môže viesť k smrteľným komplikáciám.Na posúdenie vplyvu bakteriálnych infekcií v tkanivách obklopujúcich holý implantát a LOIS sa použilo farbenie hematoxylínom a eozínom (H&E) a Massonovým trichrómom (MT).U králikov, ktorým boli implantované holé substráty, progredovali závažné bakteriálne infekcie a sklíčka tkaniva H&E jasne vykazovali abscesy a nekrózu spôsobenú zápalom.Na druhej strane extrémne silný povrch LOIS proti biologickému znečisteniu inhibuje priľnavosť baktérií, takže nevykazuje žiadne známky infekcie a znižuje zápal (obrázok 5C).Výsledky farbenia MT vykazovali rovnaký trend.Farbenie MT však tiež ukázalo edém u králikov s implantovaným LOIS, čo naznačuje, že čoskoro dôjde k zotaveniu (obrázok 5D).Aby sa študoval stupeň imunitnej odpovede, uskutočnilo sa imunohistochemické (IHC) farbenie s použitím cytokínov TNF-a a IL-6 súvisiacich s imunitnou odpoveďou.Nahý negatívny implantát, ktorý nebol vystavený baktériám, sa porovnal s LOIS, ktorý bol vystavený baktériám, ale nebol infikovaný, aby sa študoval proces hojenia v neprítomnosti bakteriálnej infekcie.Obrázok 5E ukazuje optický obraz IHC sklíčka, ktoré exprimuje TNF-a.Hnedá oblasť predstavuje imunitnú odpoveď, čo naznačuje, že imunitná odpoveď v LOIS je mierne znížená.Okrem toho expresia IL-6 v LOIS bola významne nižšia ako negatívna expresia sterilných nahých (obrázok 5F).Expresia cytokínu bola kvantifikovaná meraním oblasti zafarbenia protilátky zodpovedajúcej cytokínu (obrázok 5G).V porovnaní s králikmi vystavenými negatívnym implantátom boli hladiny expresie králikov s implantovaným LOIS nižšie, čo ukazuje významný rozdiel.Zníženie expresie cytokínov naznačuje, že dlhodobé stabilné vlastnosti LOIS proti znečisteniu nesúvisia len s inhibíciou bakteriálnych infekcií, ale aj so znížením FBR, ktoré je indukované makrofágmi adherujúcimi na substrát (53, 57, 58).Preto znížená imunitná odpoveď v dôsledku imunitných únikových vlastností LOIS môže vyriešiť vedľajšie účinky po implantácii, ako je nadmerná imunitná odpoveď po plastickej chirurgii.
(A) Schematický diagram mechanizmu tvorby a šírenia biofilmu na povrchu infikovaného ortopedického implantátu.eDNA, extracelulárna DNA.(B) Schematický diagram imunitnej odpovede po zavedení ortopedického implantátu.(C) farbenie H&E a (D) farbenie MT okolitých tkanív ortopedických implantátov s holým pozitívom a LOIS.IHC imunitne príbuzných cytokínov (E) TNF-a a (F) IL-6 sú zafarbené obrázky nahých negatívnych králikov a králikov s implantovaným LOIS.(G) Kvantifikácia expresie cytokínov meraním plošného pokrytia (** P <0,01).
Biokompatibilita LOIS a jeho vplyv na proces hojenia kostí sa skúmali in vivo pomocou diagnostického zobrazovania [röntgenová a mikropočítačová tomografia (CT)] a osteoklastovej IHC.Obrázok 6A ukazuje proces hojenia kosti zahŕňajúci tri rôzne štádiá: zápal, reparáciu a prestavbu.Keď dôjde k zlomenine, zápalové bunky a fibroblasty preniknú do zlomenej kosti a začnú rásť do cievneho tkaniva.Počas fázy opravy sa vrastanie cievneho tkaniva šíri v blízkosti miesta zlomeniny.Cievne tkanivo poskytuje živiny na tvorbu novej kosti, ktorá sa nazýva kalus.Konečným štádiom procesu hojenia kosti je štádium remodelácie, v ktorom sa veľkosť kalusu redukuje na veľkosť normálnej kosti pomocou zvýšenia hladiny aktivovaných osteoklastov (59).Trojrozmerná (3D) rekonštrukcia miesta zlomeniny sa uskutočnila pomocou mikro-CT skenov, aby sa pozorovali rozdiely v úrovni tvorby kalusu v každej skupine.Pozorujte prierez stehennou kosťou a sledujte hrúbku kalusu obklopujúceho zlomenú kosť (obrázok 6, B a C).Röntgenové lúče sa tiež použili na vyšetrenie miest zlomenín všetkých skupín každý týždeň, aby sa pozorovali rôzne procesy regenerácie kostí v každej skupine (obrázok S9).Kalus a zrelé kosti sú zobrazené modrou/zelenou farbou a slonovinou.Väčšina mäkkých tkanív sa odfiltruje s vopred nastaveným prahom.Nude pozitívny a SHP potvrdili tvorbu malého množstva kalusu okolo miesta zlomeniny.Na druhej strane, exponovaný negatív LOIS a miesto zlomeniny sú obklopené hustým kalusom.Mikro-CT snímky ukázali, že tvorbe kalusu bránila bakteriálna infekcia a zápal súvisiaci s infekciou.Je to preto, že imunitný systém uprednostňuje hojenie septických poranení spôsobených zápalom súvisiacim s infekciou pred obnovou kostí (60).Na pozorovanie aktivity osteoklastov a kostnej resorpcie sa uskutočnilo farbenie IHC a tartrát-rezistentná kyslá fosfatáza (TRAP) (obrázok 6D) (61).V nahých pozitívoch a SHP sa našlo iba niekoľko aktivovaných osteoklastov sfarbených do fialova.Na druhej strane bolo pozorovaných veľa aktivovaných osteoklastov v blízkosti nahých pozitívnych a zrelých kostí LOIS.Tento jav naznačuje, že v prítomnosti osteoklastov kalus okolo miesta zlomeniny prechádza násilným procesom remodelácie (62).Objem kosti a oblasť expresie osteoklastov kalusu sa merali na porovnanie úrovne tvorby kalusu okolo miesta zlomeniny vo všetkých skupinách, aby sa kvantifikovali výsledky mikro-CT skenovania a IHC (obrázok 6E, 1 a 2).Ako sa očakávalo, nahé negatívy a tvorba kalusu v LOIS boli významne vyššie ako v iných skupinách, čo naznačuje, že došlo k pozitívnej remodelácii kosti (63).Obrázok S10 ukazuje optický obraz miesta chirurgického zákroku, výsledok farbenia MT tkaniva zhromaždeného v blízkosti skrutky a výsledok farbenia TRAP zvýrazňujúci rozhranie skrutky a kosti.V holom substráte sa pozoroval silný kalus a tvorba fibrózy, zatiaľ čo implantát ošetrený LOIS vykazoval relatívne nepriľnutý povrch.Podobne v porovnaní s nahými negatívami sa pozorovala nižšia fibróza u králikov s implantovaným LOIS, ako je naznačené bielymi šípkami.Okrem toho, pevný edém (modrá šípka) možno pripísať vlastnostiam LOIS pri úniku imunity, čím sa znižuje závažný zápal.Nepriľnavý povrch okolo implantátu a znížená fibróza naznačujú, že proces odstránenia je jednoduchší, čo zvyčajne vedie k ďalším zlomeninám alebo zápalom.Proces hojenia kosti po odstránení skrutky bol hodnotený aktivitou osteoklastov na rozhraní skrutky a kosti.Holá kosť aj rozhranie implantátu LOIS absorbovali podobné hladiny osteoklastov ako ďalšie hojenie kosti, čo naznačuje, že povlak LOIS nemá žiadny negatívny vplyv na hojenie kostí alebo imunitnú odpoveď.Aby sa potvrdilo, že povrchová modifikácia vykonaná na LOIS nezasahuje do procesu hojenia kostí, röntgenové vyšetrenie sa použilo na porovnanie hojenia kostí králikov s exponovanými negatívnymi iónmi a 6 týždňov implantácie LOIS (obrázok 6F).Výsledky ukázali, že v porovnaní s neinfikovanou nahou pozitívnou skupinou, LOIS vykazoval rovnaký stupeň hojenia kostí a neboli žiadne zjavné známky zlomeniny (kontinuálna línia osteolýzy) v oboch skupinách.
(A) Schematický diagram procesu hojenia kosti po zlomenine.(B) Rozdiel v stupni tvorby kalusu každej povrchovej skupiny a (C) obraz prierezu miesta zlomeniny.(D) Farbenie TRAP na vizualizáciu aktivity osteoklastov a kostnej resorpcie.Na základe aktivity TRAP bola tvorba vonkajšieho kalusu kortikálnej kosti kvantitatívne analyzovaná pomocou (E) (1) mikro-CT a (2) aktivity osteoklastov.(F) 6 týždňov po implantácii röntgenové snímky zlomenej kosti exponovaného negatívu (zvýraznené červeným prerušovaným obdĺžnikom) a LOIS (zvýraznené modrým prerušovaným obdĺžnikom).Štatistická analýza sa uskutočnila jednosmernou analýzou rozptylu (ANOVA).* P < 0,05.** P <0,01.
Stručne povedané, LOIS poskytuje nový typ antibakteriálnej infekčnej stratégie a ochranného povlaku imunitného úniku pre ortopedické implantáty.Bežné ortopedické implantáty s funkcionalizáciou SHP vykazujú krátkodobé vlastnosti proti bioznečisteniu, ale nedokážu si udržať svoje vlastnosti po dlhú dobu.Superhydrofóbnosť substrátu zachytáva vzduchové bubliny medzi baktériami a substrátom, čím vytvára vzduchové vrecká, čím zabraňuje bakteriálnej infekcii.V dôsledku difúzie vzduchu sa však tieto vzduchové vrecká ľahko odstránia.Na druhej strane LOIS dobre preukázal svoju schopnosť predchádzať infekciám súvisiacim s biofilmom.Preto vďaka antirejekčným vlastnostiam lubrikačnej vrstvy vstreknutej do vrstveného povrchu mikro/nano štruktúry je možné zabrániť zápalu súvisiacemu s infekciou.Na optimalizáciu výrobných podmienok LOIS sa používajú rôzne charakterizačné metódy vrátane meraní SEM, AFM, XPS a CA.Okrem toho možno LOIS aplikovať aj na rôzne biologické materiály bežne používané v ortopedických fixačných zariadeniach, ako sú PLGA, Ti, PE, POM a PPSU.Potom bol LOIS testovaný in vitro, aby sa preukázali jeho vlastnosti proti biologickému znečisteniu proti baktériám a biologickým látkam súvisiacim s imunitnou odpoveďou.Výsledky ukazujú, že v porovnaní s holým implantátom má vynikajúce antibakteriálne a antibioznečisťujúce účinky.Navyše LOIS vykazuje mechanickú pevnosť aj po aplikovaní mechanického namáhania, ktorému sa v plastickej chirurgii nedá vyhnúť.Vďaka samoliečiacim vlastnostiam lubrikantu na povrchu mikro/nano štruktúry si LOIS úspešne zachoval svoje antibiologické znečistenie.Aby sa študovala biokompatibilita a antibakteriálne vlastnosti LOIS in vivo, LOIS sa implantoval do králičej stehennej kosti počas 4 týždňov.U králikov s implantovaným LOIS nebola pozorovaná žiadna bakteriálna infekcia.Okrem toho použitie IHC preukázalo zníženú úroveň lokálnej imunitnej odpovede, čo naznačuje, že LOIS neinhibuje proces hojenia kostí.LOIS vykazuje vynikajúce antibakteriálne a imunitné únikové vlastnosti a bolo preukázané, že účinne bráni tvorbe biofilmu pred a počas ortopedických operácií, najmä pri syntéze kostí.Použitím modelu zápalovej zlomeniny stehennej kosti králičej kostnej drene sa podrobne študoval účinok infekcií súvisiacich s biofilmom na proces hojenia kostí indukovaný predinkubovanými implantátmi.Ako budúca štúdia je potrebný nový model in vivo na štúdium možných infekcií po implantácii, aby sa úplne porozumeli a zabránili infekciám súvisiacim s biofilmom počas celého procesu hojenia.Okrem toho je osteoindukcia stále nevyriešenou výzvou v integrácii s LOIS.Na prekonanie tejto výzvy je potrebný ďalší výskum na kombináciu selektívnej adhézie osteoindukčných buniek alebo regeneračnej medicíny s LOIS.Celkovo LOIS predstavuje sľubný ortopedický povlak implantátu s mechanickou robustnosťou a vynikajúcimi vlastnosťami proti biologickému znečisteniu, ktorý môže znížiť vedľajšie účinky SSI a imunity.
Umývajte 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS substrát (Dong Kang M-Tech Co., Kórea) v acetóne, EtOH a DI vode počas 15 minút, aby ste odstránili kontaminanty.Aby sa na povrchu vytvorila mikro/nano štruktúra, očistený substrát sa ponorí do 48% až 51% roztoku HF (DUKSAN Corp., Južná Kórea) pri 50°C.Doba leptania sa pohybuje od 0 do 60 minút.Potom sa leptaný substrát vyčistil deionizovanou vodou a umiestnil sa do roztoku 65 % HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) pri 50 °C na 30 minút, aby sa na povrchu vytvorila pasivačná vrstva oxidu chrómu.Po pasivácii sa substrát premyje deionizovanou vodou a vysuší, čím sa získa substrát s vrstvenou štruktúrou.Potom sa substrát vystavil kyslíkovej plazme (100 W, 3 minúty) a okamžite sa ponoril do roztoku 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Nemecko) v toluéne pri teplote miestnosti na 12 hodín.Potom sa substrát potiahnutý POTS vyčistil EtOH a žíhal pri 150 °C počas 2 hodín, aby sa získal hustý POTS SAM.Po nanesení SAM sa na substráte vytvorila vrstva lubrikantu nanesením perfluórpolyéterového lubrikantu (Krytox 101; DuPont, USA) s objemom náplne 20 μm/cm 2. Pred použitím prefiltrujte lubrikant cez 0,2 mikrónový filter.Odstráňte prebytočné mazivo naklonením pod uhlom 45° počas 15 minút.Rovnaký výrobný postup bol použitý pre ortopedické implantáty vyrobené z 304 SS (uzamykacia platnička a kortikálna zaisťovacia skrutka; Dong Kang M-Tech Co., Kórea).Všetky ortopedické implantáty sú navrhnuté tak, aby zodpovedali geometrii králičej stehennej kosti.
Morfológia povrchu substrátu a ortopedických implantátov bola kontrolovaná metódou poľnej emisie SEM (Inspect F50, FEI, USA) a AFM (XE-100, Park Systems, Južná Kórea).Drsnosť povrchu (Ra, Rq) sa meria vynásobením plochy 20 μm 20 μm (n=4).Na analýzu chemického zloženia povrchu sa použil systém XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japonsko) vybavený röntgenovým zdrojom Al Ka ​​s veľkosťou bodu 100 μm2.Na meranie tekutého CA a SA sa použil merací systém CA vybavený kamerou na dynamické snímanie obrazu (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Južná Kórea).Pre každé meranie sa na povrch umiestni 6 až 10 μl kvapiek (deionizovaná voda, konská krv, EG, 30 % etanol a HD) na meranie CA.Keď sa uhol sklonu substrátu zvyšuje rýchlosťou 2°/s (n = 4), meria sa SA, keď kvapka padá.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] a MRSA (ATCC 25923) boli zakúpené od ATCC (Manassas, Virginia, USA) a zásobná kultúra bola udržiavaná pri -80 °C.Pred použitím sa zmrazená kultúra inkubovala v sójovom bujóne rozmrazenom trypsínom (Komed, Kórea) pri 37 °C počas 18 hodín a potom sa dvakrát preniesla, aby sa aktivovala.Po inkubácii sa kultúra centrifugovala pri 10 000 ot./min. počas 10 minút pri 4 °C a dvakrát sa premyla roztokom PBS (pH 7,3).Odstredená kultúra sa potom subkultivuje na krvných agarových platniach (BAP).MRSA a Pseudomonas aeruginosa boli pripravené cez noc a kultivované v bujóne Luria-Bertani.Koncentrácia Pseudomonas aeruginosa a MRSA v inokule bola kvantitatívne stanovená pomocou CFU suspenzie v sériovom riedení na agare.Potom upravte koncentráciu baktérií na 0,5 McFarlandovho štandardu, čo zodpovedá 108 CFU/ml.Potom zrieďte pracovnú bakteriálnu suspenziu 100-krát na 106 CFU/ml.Na testovanie antibakteriálnych adhéznych vlastností sa substrát pred použitím sterilizoval pri 121 °C počas 15 minút.Substrát sa potom preniesol do 25 ml bakteriálnej suspenzie a inkuboval sa pri 37 °C za intenzívneho trepania (200 otáčok za minútu) počas 12 a 72 hodín.Po inkubácii bol každý substrát odstránený z inkubátora a premytý 3-krát PBS, aby sa odstránili všetky plávajúce baktérie na povrchu.Aby bolo možné pozorovať biofilm na substráte, bol biofilm fixovaný metanolom a zafarbený 1 ml crimidínovej oranže počas 2 minút.Potom sa použil fluorescenčný mikroskop (BX51TR, Olympus, Japonsko) na zhotovenie snímok zafarbeného biofilmu.Aby sa kvantifikoval biofilm na substráte, pripojené bunky sa oddelili od substrátu guľôčkovou vortexovou metódou, ktorá sa považovala za najvhodnejšiu metódu na odstránenie pripojených baktérií (n = 4).Pomocou sterilných klieští odstráňte substrát z rastového média a poklepaním na platňu s jamkami odstráňte prebytočnú tekutinu.Voľne pripojené bunky sa odstránili dvojitým premytím sterilným PBS.Každý substrát sa potom preniesol do sterilnej skúmavky obsahujúcej 9 ml 0,1 % proteínového ept fyziologického roztoku (PSW) a 2 g 20 až 25 sterilných sklenených guľôčok (priemer 0,4 až 0,5 mm).Potom sa vortexoval 3 minúty, aby sa bunky oddelili od vzorky.Po premiešaní sa suspenzia sériovo 10-násobne zriedila s 0,1 % PSW a potom sa 0,1 ml každého riedenia naočkovalo na BAP.Po 24 hodinách inkubácie pri 37 °C sa CFU spočítali manuálne.
Pre bunky sa použili myšacie fibroblasty NIH/3T3 (CRL-1658; americký ATCC) a myšie makrofágy RAW 264.7 (TIB-71; americký ATCC).Na kultiváciu myších fibroblastov použite Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM; LM001-05, Welgene, Kórea) a doplňte 10% teľacím sérom (S103-01, Welgene) a 1% penicilín-streptomycínom (PS; LS202-02, Welgenee Použije sa DMEM na kultiváciu myších makrofágov doplnených 10 % fetálnym hovädzím sérom (S001-01, Welgene) a 1 % PS. Substrát sa umiestni do šesťjamkovej doštičky na kultiváciu buniek a bunky sa naočkujú pri 105 bunkách/cm2. Bunky sa inkubovali cez noc pri 37 °C a 5 % C02. Na farbenie buniek sa bunky fixovali 4 % paraformaldehydom na 20 minút a umiestnili sa do 0,5 % Triton X Inkubátu na 5 minút v -100 °C pri 37 °C po dobu 30 minút, použite substrát s 4',6-diamino-2-fenylindolom (H-1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD fixačným médiom (n = 4 na bunku). fluoresceín, fluoresceín izotiokyanát-albumín (A9771, Sigma-Aldrich, Nemecko) a ľudská plazma Alexa Fluor 488-konjugovaný fibrinogén (F13191, Invitrogen, USA) sa rozpustil v PBS (10 mM, pH 7,4).Koncentrácie albumínu a fibrinogénu boli 1 a 150 μg/ml.Po substráte Pred ponorením do proteínového roztoku ich opláchnite PBS, aby sa povrch rehydratoval.Potom ponorte všetky substráty do šesťjamkovej platne obsahujúcej proteínový roztok a inkubujte pri teplote 37 °C počas 30 a 90 minút.Po inkubácii bol substrát odstránený z proteínového roztoku, jemne premytý 3-krát PBS a fixovaný 4 % paraformaldehydom (n = 4 pre každý proteín).Pre vápnik sa chlorid sodný (0,21 M) a fosforečnan draselný (3,77 mM)) rozpustil v deionizovanej vode.pH roztoku sa upravilo na 2,0 pridaním roztoku hydrochloridu (1 M).Potom sa v roztoku rozpustil chlorid vápenatý (5,62 mM).Pridaním 1M tris(hydroxymetyl)-aminometánu sa upraví pH roztoku na 7,4.Všetky substráty ponorte do šesťjamkovej platne naplnenej 1,5× roztokom fosforečnanu vápenatého a po 30 minútach z roztoku vyberte.Na farbenie 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Zmiešajte so 100 ml deionizovanej vody.Potom použite 10% hydroxid amónny na úpravu pH na 4. Farbite substrát roztokom alizarínovej červene počas 5 minút a potom pretrepte prebytočné farbivo a osušte.Po procese pretrepania odstráňte substrát.Materiál sa dehydratuje, potom sa ponorí do acetónu na 5 minút, potom sa ponorí do roztoku acetón-xylén (1:1) na 5 minút a nakoniec sa premyje xylénom (n = 4).Používa sa fluorescenčný mikroskop (Axio Imager) s objektívmi ×10 a ×20..A2m, Zeiss, Nemecko) zobrazuje všetky substráty.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) sa použil na kvantifikáciu adhéznych údajov biologických látok na každej skupine štyroch rôznych oblastí zobrazenia.Preveďte všetky obrázky na binárne obrázky s pevnými prahovými hodnotami na porovnanie substrátu.
Konfokálny mikroskop Zeiss LSM 700 sa použil na monitorovanie stability vrstvy lubrikantu v PBS v reflexnom režime.Vzorka skla potiahnutá SAM na báze fluóru so vstreknutou lubrikačnou vrstvou bola ponorená do roztoku PBS a testovaná pomocou orbitálnej trepačky (SHO-1D; Daihan Scientific, Južná Kórea) za podmienok mierneho pretrepávania (120 otáčok za minútu).Potom odoberte vzorku a monitorujte stratu maziva meraním straty odrazeného svetla.Na získanie fluorescenčných obrazov v režime odrazu sa vzorka vystaví 633 nm laseru a potom sa zozbiera, pretože svetlo sa bude odrážať späť od vzorky.Vzorky boli merané v časových intervaloch 0, 30, 60 a 120 hodín.
Na zistenie vplyvu procesu povrchovej úpravy na nanomechanické vlastnosti ortopedických implantátov sa na meranie nanoindendiónu použil nanoindentor (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) vybavený trojstranným diamantovým hrotom Berkovich v tvare pyramídy.Špičkové zaťaženie je 10 mN a plocha je 100 μm x 100 μm.Pre všetky merania je čas nakladania a vykladania 10 s a čas zdržania pri špičkovom zaťažení vtlačením je 2 s.Vykonajte merania z piatich rôznych miest a urobte priemer.Aby sa vyhodnotila mechanická pevnosť pri zaťažení, vykonal sa priečny trojbodový ohybový test s použitím univerzálneho testovacieho stroja (Instron 5966, Instron, USA).Substrát je stláčaný konštantnou rýchlosťou 10 N/s pri zvýšenom zaťažení.Na výpočet modulu pružnosti v ohybe a maximálneho napätia v tlaku sa použil softvérový program Bluehill Universal (n = 3).
Za účelom simulácie operačného procesu a súvisiaceho mechanického poškodenia spôsobeného počas operácie bol operačný proces vykonaný in vitro.Stehenné kosti boli odobraté z popravených novozélandských bielych králikov.Stehenná kosť bola vyčistená a fixovaná v 4% paraformaldehyde počas 1 týždňa.Ako je opísané v metóde experimentu na zvieratách, fixná stehenná kosť bola chirurgicky operovaná.Po operácii bol ortopedický implantát ponorený do krvi (konská krv, KISAN, Kórea) na 10 s, aby sa potvrdilo, či po aplikácii mechanického poranenia nastali krvné zrasty (n = 3).
Celkom 24 samcov novozélandských bielych králikov (hmotnosť 3,0 až 3,5 kg, priemerný vek 6 mesiacov) bolo náhodne rozdelených do štyroch skupín: nahí negatívni, nahí pozitívni, SHP a LOIS.Všetky postupy zahŕňajúce zvieratá boli vykonané v súlade s etickými štandardmi Inštitucionálneho výboru pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie (schválené IACUC, KOREA-2017-0159).Ortopedický implantát pozostáva z uzamykacej dlahy s piatimi otvormi (dĺžka 41 mm, šírka 7 mm a hrúbka 2 mm) a kortikálnych uzamykacích skrutiek (dĺžka 12 mm, priemer 2,7 mm) na fixáciu zlomeniny.Okrem platní a skrutiek použitých v skupine s holým negatívom boli všetky platne a skrutky inkubované v suspenzii MRSA (106 CFU/ml) počas 12 hodín.Nahá-negatívna skupina (n=6) bola liečená implantátmi s nahým povrchom bez vystavenia bakteriálnej suspenzii ako negatívna kontrola infekcie.Holá pozitívna skupina (n = 6) bola ošetrená implantátom s holým povrchom vystaveným baktériám ako pozitívna kontrola infekcie.Skupina SHP (n = 6) bola liečená implantátmi SHP vystavenými baktériám.Nakoniec bola skupina LOIS liečená implantátmi LOIS vystavenými baktériám (n = 6).Všetky zvieratá sú držané v klietke a poskytuje sa im veľa potravy a vody.Pred operáciou boli králiky 12 hodín nalačno.Zvieratá boli anestetizované intramuskulárnou injekciou xylazínu (5 mg/kg) a intravenóznou injekciou paklitaxelu (3 mg/kg) na indukciu.Potom dodajte 2 % izofluranu a 50 % až 70 % medicinálneho kyslíka (prietok 2 l/min) cez dýchací systém, aby ste udržali anestéziu.Implantuje sa priamym prístupom k laterálnej stehennej kosti.Po odstránení chĺpkov a povidón-jódovej dezinfekcii kože sa na vonkajšej strane ľavej strednej časti stehennej kosti urobil rez dlhý asi 6 cm.Otvorením medzery medzi svalmi pokrývajúcimi stehennú kosť sa stehenná kosť úplne odkryje.Umiestnite dlahu pred femorálny hriadeľ a upevnite ju štyrmi skrutkami.Po fixácii pomocou pílového kotúča (hrúbka 1 mm) umelo vytvorte zlomeninu v oblasti medzi druhým otvorom a štvrtým otvorom.Na konci operácie bola rana premytá fyziologickým roztokom a uzavretá stehmi.Každému králikovi sa subkutánne injikoval enrofloxacín (5 mg/kg) zriedený z jednej tretiny vo fyziologickom roztoku.Pooperačné röntgenové snímky stehennej kosti boli urobené u všetkých zvierat (0, 7, 14, 21, 28 a 42 dní), aby sa potvrdila osteotómia kosti.Po hlbokej anestézii boli všetky zvieratá usmrtené intravenóznym KCl (2 mmol/kg) 28. a 42. deň.Po vykonaní bola stehenná kosť naskenovaná pomocou mikro-CT, aby sa pozoroval a porovnal proces hojenia kostí a tvorba novej kosti medzi týmito štyrmi skupinami.
Po vykonaní boli odobraté mäkké tkanivá, ktoré boli v priamom kontakte s ortopedickými implantátmi.Tkanivo sa fixovalo v 10% neutrálnom pufrovanom formalíne cez noc a potom sa dehydratovalo v EtOH.Dehydrované tkanivo bolo zaliate do parafínu a narezané na hrúbku 40 μm pomocou mikrotómu (400CS; EXAKT, Nemecko).Na vizualizáciu infekcie sa uskutočnilo farbenie H&E a farbenie MT.Aby sa skontrolovala odpoveď hostiteľa, narezané tkanivo sa inkubovalo s králičou anti-TNF-a primárnou protilátkou (AB6671, Abcam, USA) a králičou anti-IL-6 (AB6672; Abcam, USA) a potom sa ošetrilo chrenom.oxidáza.Aplikujte systém farbenia komplexu avidín-biotín (ABC) na rezy podľa pokynov výrobcu.Aby sa objavil ako hnedý reakčný produkt, bol vo všetkých častiach použitý 3,3-diaminobenzidín.Na vizualizáciu všetkých rezov sa použil digitálny skener diapozitívov (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Maďarsko) a pomocou softvéru ImageJ sa analyzovali aspoň štyri substráty v každej skupine.
Röntgenové snímky sa robili u všetkých zvierat po chirurgickom zákroku a každý týždeň na monitorovanie hojenia zlomenín (n=6 na skupinu).Po vykonaní sa mikro-CT s vysokým rozlíšením použilo na výpočet tvorby kalusu okolo stehennej kosti po zahojení.Získaná stehenná kosť bola vyčistená, fixovaná v 4% paraformaldehyde počas 3 dní a dehydratovaná v 75% etanole.Dehydrované kosti sa potom skenovali pomocou mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgicko) na vytvorenie 3D voxelových obrazov (2240 ​​× 2240 pixelov) vzorky kosti.Použite 1,0 mm Al filter na zníženie šumu signálu a aplikujte vysoké rozlíšenie na všetky skenovania (E = 133 kVp, I = 60 μA, integračný čas = 500 ms).Softvér Nrecon (verzia 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgicko) sa použil na vytvorenie 3D objemu naskenovanej vzorky zo získanej 2D laterálnej projekcie.Na analýzu sa 3D rekonštruovaný obraz rozdelí na kocky 10 mm × 10 mm × 10 mm podľa miesta zlomeniny.Vypočítajte kalus mimo kortikálnej kosti.Na digitálne presmerovanie naskenovaného objemu kosti sa použil softvér DataViewer (verzia 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgicko) a na analýzu sa použil softvér CT-Analyzer (verzia 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgicko).Relatívne koeficienty absorpcie röntgenového žiarenia v zrelej kosti a kaluse sa rozlišujú podľa ich hustoty a potom sa kvantifikuje objem kalusu (n = 4).Aby sa potvrdilo, že biokompatibilita LOIS neodďaľuje proces hojenia kostí, vykonali sa ďalšie röntgenové a mikro-CT analýzy u dvoch králikov: skupiny nahých negatívnych a LOIS.Obe skupiny boli popravené v 6. týždni.
Stehenné kosti z usmrtených zvierat boli odobraté a fixované v 4% paraformaldehyde počas 3 dní.Potom sa ortopedický implantát opatrne vyberie zo stehennej kosti.Stehenná kosť bola odvápňovaná počas 21 dní použitím 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Potom sa odvápnená stehenná kosť ponorila do EtOH, aby sa dehydratovala.Dehydrovaná stehenná kosť sa odstránila v xyléne a zaliala sa do parafínu.Potom bola vzorka narezaná pomocou automatického rotačného mikrotómu (Leica RM2255, Leica Biosystems, Nemecko) s hrúbkou 3 μm.Na farbenie TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Nemecko) boli narezané vzorky zbavené parafínu, rehydratované a inkubované v TRAP činidle pri 37 °C počas 1 hodiny.Obrázky sa získali pomocou skenera sklíčok (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Maďarsko) a kvantifikovali sa meraním plošného pokrytia zafarbenej oblasti.V každom experimente boli pomocou softvéru ImageJ analyzované aspoň štyri substráty v každej skupine.
Analýza štatistickej významnosti sa uskutočnila pomocou GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Na testovanie rozdielov medzi hodnotenými skupinami sa použili nepárový t-test a jednosmerná analýza rozptylu (ANOVA).Hladina významnosti je na obrázku vyznačená nasledovne: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 a ****P<0,0001;NS, žiadny významný rozdiel.
Doplnkové materiály k tomuto článku nájdete na http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný v súlade s podmienkami Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, ktorý umožňuje použitie, distribúciu a reprodukciu na akomkoľvek médiu, pokiaľ použitie nie je na komerčný zisk a predpokladom je, že originál práca je správna.Odkaz.
Poznámka: Žiadame vás, aby ste uviedli iba e-mailovú adresu, aby osoba, ktorú odporúčate na stránku, vedela, že chcete, aby videla e-mail a že e-mail nie je spam.Nebudeme zachytávať žiadne e-mailové adresy.
Táto otázka sa používa na testovanie, či ste ľudský návštevník a na zabránenie automatickým odosielaním spamu.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Antibakteriálne a imunitné únikové povlaky ortopedických implantátov môžu znížiť infekcie a imunitné reakcie spôsobené infekciami.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Antibakteriálne a imunitné únikové povlaky ortopedických implantátov môžu znížiť infekcie a imunitné reakcie spôsobené infekciami.
©2021 American Association for the Advancement of Science.všetky práva vyhradené.AAAS je partnerom HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.