Для пациентов, перенесших операцию по установке ортопедических имплантатов, бактериальные инфекции и иммунные реакции, вызванные инфекцией, всегда представляли угрозу для жизни.Обычные биологические материалы подвержены биологическому загрязнению, в результате чего бактерии проникают в поврежденную область и вызывают послеоперационную инфекцию.Поэтому существует острая необходимость в разработке противоинфекционных и иммунных покрытий для ортопедических имплантатов.Здесь мы разработали передовую технологию модификации поверхности ортопедических имплантатов под названием «Смазанная поверхность ортопедического имплантата» (LOIS), вдохновленную гладкой поверхностью кувшинов с растениями.LOIS обладает длительной и сильной водоотталкивающей способностью к различным жидкостям и биологическим веществам (включая клетки, белки, кальций и бактерии).Кроме того, мы подтвердили механическую стойкость к царапинам и силе фиксации, моделируя неизбежные повреждения во время операции in vitro.Модель воспалительного перелома бедренной кости костного мозга кролика использовалась для тщательного изучения антибиологического масштабирования и противоинфекционной способности LOIS.Мы полагаем, что LOIS, обладающий свойствами защиты от биообрастания и механической прочностью, станет шагом вперед в ортопедической хирургии, свободной от инфекций.
Сегодня из-за общего старения число пациентов, страдающих ортопедическими заболеваниями (такими как пожилые переломы, дегенеративные заболевания суставов и остеопороз), значительно увеличилось (1, 2).Поэтому в медицинских учреждениях большое значение придается ортопедической хирургии, в том числе ортопедической имплантации винтов, пластин, гвоздей и искусственных суставов (3, 4).Однако сообщалось, что традиционные ортопедические имплантаты подвержены бактериальной адгезии и образованию биопленок, что может вызвать инфекцию области хирургического вмешательства (ИОХВ) после операции (5, 6).После того как на поверхности ортопедического имплантата образуется биопленка, удаление биопленки становится крайне затруднительным даже при применении больших доз антибиотиков.Поэтому это обычно приводит к тяжелым послеоперационным инфекциям (7, 8).В связи с вышеуказанными проблемами лечение инфицированных имплантатов должно включать повторную операцию, включая удаление всех имплантатов и окружающих тканей;следовательно, пациент будет страдать от сильной боли и некоторых рисков (9, 10).
Чтобы решить некоторые из этих проблем, были разработаны ортопедические имплантаты с лекарственным покрытием для предотвращения инфекции путем уничтожения бактерий, прикрепленных к поверхности (11, 12).Однако стратегия по-прежнему имеет ряд ограничений.Сообщалось, что длительная имплантация имплантатов с лекарственным покрытием приводит к повреждению окружающих тканей и воспалению, которое может привести к некрозу (13, 14).Кроме того, органические растворители, которые могут существовать после процесса производства ортопедических имплантатов с лекарственным покрытием и которые строго запрещены Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США, требуют дополнительных стадий очистки для соответствия своим стандартам (15).Имплантаты с лекарственным покрытием затрудняют контролируемое высвобождение лекарств, а из-за их ограниченной лекарственной нагрузки долгосрочное применение препарата невозможно (16).
Другая распространенная стратегия — покрыть имплантат необрастающим полимером, чтобы предотвратить прилипание биологических веществ и бактерий к поверхности (17).Например, цвиттер-ионные полимеры привлекли внимание благодаря своим неадгезивным свойствам при контакте с белками плазмы, клетками и бактериями.Однако он имеет некоторые ограничения, связанные с долгосрочной стабильностью и механической прочностью, которые затрудняют его практическое применение в ортопедических имплантатах, особенно из-за механического соскабливания во время хирургических процедур (18, 19).Кроме того, из-за высокой биосовместимости, отсутствия необходимости хирургического удаления и свойств очистки поверхности от коррозии используются ортопедические имплантаты, изготовленные из биоразлагаемых материалов (20, 21).В процессе коррозии химические связи между полимерной матрицей разрушаются и отрываются от поверхности, а адгезивы очищают поверхность.Однако противобиологическое загрязнение путем очистки поверхности оказывается эффективным в течение короткого периода времени.Кроме того, большинство рассасывающихся материалов, включая сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), полимолочной кислоты (PLA) и сплавы на основе магния, подвергаются неравномерному биоразложению и эрозии в организме, что отрицательно влияет на механическую стабильность.(двадцать два).Кроме того, биоразлагаемые фрагменты пластин служат местом для прикрепления бактерий, что в долгосрочной перспективе увеличивает вероятность заражения.Этот риск механической деградации и инфекции ограничивает практическое применение пластической хирургии (23).
Супергидрофобные (SHP) поверхности, имитирующие иерархическую структуру листьев лотоса, стали потенциальным решением для противообрастающих поверхностей (24, 25).Когда поверхность SHP погружается в жидкость, пузырьки воздуха захватываются, тем самым образуя воздушные карманы и предотвращая бактериальную адгезию (26).Однако недавние исследования показали, что поверхность SHP имеет недостатки, связанные с механической прочностью и долговременной стабильностью, что затрудняет ее применение в медицинских имплантатах.Более того, воздушные карманы растворяются и теряют свои противообрастающие свойства, что приводит к более широкой адгезии бактерий из-за большой площади поверхности SHP (27, 28).Недавно Айзенберг и его коллеги представили инновационный метод покрытия поверхности против биообрастания, создав гладкую поверхность, вдохновленную кувшинным растением Непентес (29, 30).Гладкая поверхность демонстрирует долговременную стабильность в гидравлических условиях, обладает чрезвычайной водоотталкивающей способностью по отношению к биологическим жидкостям и обладает свойствами самовосстановления.Однако не существует метода нанесения покрытия на медицинский имплантат сложной формы, и не доказано, что он поддерживает процесс заживления поврежденных тканей после имплантации.
Здесь мы представляем смазанную поверхность ортопедического имплантата (LOIS), микро/наноструктурированную поверхность ортопедического имплантата, плотно объединенную с тонким слоем смазки, чтобы предотвратить ее связь с пластической хирургией. Бактериальные инфекции, такие как фиксация переломов.Поскольку фторсодержащая структура на микро/наноуровне прочно фиксирует смазку на конструкции, разработанный LOIS может полностью отталкивать прилипание различных жидкостей и сохранять противообрастающие свойства в течение длительного времени.Покрытия LOIS можно наносить на материалы различной формы, предназначенные для синтеза кости.Превосходные свойства LOIS против биообрастания против бактерий биопленки [Pseudomonas aeruginosa и метициллин-резистентного золотистого стафилококка (MRSA)] и биологических веществ (клеток, белков и кальция) были подтверждены in vitro.Коэффициент адгезии экстенсивной адгезии к основанию составляет менее 1%.Кроме того, даже после возникновения механического воздействия, такого как царапины на поверхности, самовосстановление, вызванное проникающей смазкой, помогает сохранить ее противообрастающие свойства.Результаты испытаний на механическую прочность показывают, что даже после структурной и химической модификации общая прочность существенно не снизится.Кроме того, был проведен эксперимент in vitro, имитирующий механическое воздействие в хирургической среде, чтобы доказать, что LOIS может противостоять различным механическим воздействиям, возникающим во время пластической хирургии.Наконец, мы использовали модель перелома бедренной кости in vivo на кроликах, которая доказала, что LOIS обладает превосходными антибактериальными свойствами и биосовместимостью.Рентгенологические и гистологические результаты подтвердили, что стабильное поведение смазки и свойства против биообрастания в течение 4 недель после имплантации позволяют добиться эффективной борьбы с инфекциями и защиты от иммунитета, не замедляя процесс заживления кости.
На рисунке 1А показана схематическая диаграмма разработанного LOIS, в который имплантированы микро/наноструктуры в модель перелома бедренной кости кролика, чтобы подтвердить его превосходные антибиологические и противоинфекционные свойства.Биомиметический метод используется для моделирования поверхности растения в горшке с водой и предотвращения биообрастания путем включения слоя смазки в микро/наноструктуру поверхности.Поверхность, на которую нанесена смазка, может минимизировать контакт между биологическими веществами и поверхностью.Таким образом, благодаря образованию стабильных химических связей на поверхности, он обладает отличными противообрастающими свойствами и долгосрочной стабильностью.В результате свойства смазывающей поверхности против биообрастания позволяют применять ее в различных практических целях в биомедицинских исследованиях.Однако обширные исследования того, как эта особая поверхность взаимодействует в организме, еще не завершены.Сравнивая LOIS с голыми субстратами in vitro с использованием альбумина и бактерий биопленки, можно подтвердить неадгезивность LOIS (рис. 1B).Кроме того, можно продемонстрировать эффективность биологического загрязнения, скатывая капли воды с наклонной голой подложки и подложки LOIS (рис. S1 и видеоролик S1).Как показано на изображении флуоресцентного микроскопа, экспонированный субстрат, инкубированный в суспензии белка и бактерий, показал большое количество биологического материала, прилипшего к поверхности.Однако из-за своих превосходных свойств против биообрастания LOIS практически не проявляет флуоресценции.Чтобы подтвердить свои противобиообрастанающие и противоинфекционные свойства, LOIS наносили на поверхность ортопедических имплантатов для синтеза кости (пластины и винты) и помещали в модель перелома кролика.Перед имплантацией голый ортопедический имплантат и LOIS инкубировали в бактериальной суспензии в течение 12 часов.Предварительная инкубация обеспечивает образование биопленки на поверхности обнаженного имплантата для сравнения.На рисунке 1С представлена ​​фотография места перелома через 4 недели после имплантации.Слева у кролика с голым ортопедическим имплантатом наблюдался тяжелый уровень воспаления из-за образования биопленки на поверхности имплантата.Противоположный результат наблюдался у кроликов, которым имплантировали LOIS, то есть в окружающих тканях LOIS не было ни признаков инфекции, ни признаков воспаления.Кроме того, оптическое изображение слева указывает на место операции кролика с обнаженным имплантатом, что указывает на то, что на поверхности LOIS не обнаружено множественных клеев, присутствующих на поверхности обнаженного имплантата.Это показывает, что LOIS обладает долговременной стабильностью и способностью сохранять свои свойства против биологического загрязнения и антиадгезии.
(A) Схематическая диаграмма LOIS и его имплантации в модели перелома бедренной кости кролика.(B) Изображение белка и бактериальной биопленки, полученное с помощью флуоресцентной микроскопии, на голой поверхности и подложке LOIS.Через 4 недели после имплантации (C) фотографическое изображение места перелома и (D) рентгеновское изображение (выделено красным прямоугольником).Изображение предоставлено: Кёмин Че, Университет Ёнсей.
У стерилизованных кроликов с отрицательными имплантатами наблюдался нормальный процесс заживления костей без каких-либо признаков воспаления или инфекции.С другой стороны, имплантаты SHP, предварительно инкубированные в бактериальной суспензии, вызывают инфекционное воспаление в окружающих тканях.Это можно объяснить его неспособностью ингибировать бактериальную адгезию в течение длительного времени (рис. S2).Чтобы доказать, что LOIS не влияет на процесс заживления, но подавляет возможные инфекции, связанные с имплантацией, сравнивали рентгеновские изображения обнаженного положительного матрикса и LOIS в месте перелома (рис. 1D).Рентгеновское изображение обнаженного положительного имплантата показало стойкие линии остеолиза, что указывает на то, что кость не зажила полностью.Это говорит о том, что процесс восстановления костей может быть значительно задержан из-за воспаления, связанного с инфекцией.Напротив, оно показало, что кролики, которым имплантировали LOIS, зажили и не показали каких-либо очевидных мест перелома.
Для разработки медицинских имплантатов с долгосрочной стабильностью и функциональностью (включая устойчивость к биообрастанию) было приложено много усилий.Однако наличие различных биологических веществ и динамика тканевой адгезии ограничивают разработку их клинически надежных методов.Чтобы преодолеть эти недостатки, мы разработали микро-/нано-слоистую структуру и химически модифицированную поверхность, которая оптимизирована за счет высокой капиллярной силы и химического сродства, чтобы максимально сохранять максимально гладкую смазку.На рисунке 2А показан общий процесс производства LOIS.Сначала подготовьте подложку из медицинской нержавеющей стали (SS) 304.Во-вторых, микро/наноструктура формируется на подложке из нержавеющей стали путем химического травления раствором плавиковой кислоты (HF).Для восстановления коррозионной стойкости нержавеющей стали для обработки протравленной подложки применяют раствор азотной кислоты (HNO3) (31).Пассивация повышает коррозионную стойкость подложки из нержавеющей стали и значительно замедляет процесс коррозии, что может снизить общие характеристики LOIS.Затем, образуя самоорганизующийся монослой (SAM) с 1H, 1H, 2H, 2H-перфтороктилтриэтоксисиланом (POTS), поверхность химически модифицируется для улучшения химического взаимодействия между поверхностью и гладкой смазкой Affinity.Модификация поверхности значительно снижает поверхностную энергию изготовленной микро/наноструктурированной поверхности, которая соответствует поверхностной энергии гладкой смазки.Это позволяет смазке полностью смачиваться, тем самым образуя устойчивый смазочный слой на поверхности.Модифицированная поверхность проявляет повышенную гидрофобность.Результаты показывают, что скользкая смазка демонстрирует стабильное поведение при LOIS благодаря высокому химическому сродству и капиллярной силе, обусловленной микро/наноструктурой (32, 33).Изучены оптические изменения на поверхности НС после модификации поверхности и введения смазки.Микро/нанослоистая структура, образующаяся на поверхности, может вызывать визуальные изменения и затемнять поверхность.Это явление объясняется усиленным эффектом рассеяния света на шероховатой поверхности, что увеличивает диффузное отражение, вызванное механизмом захвата света (34).Кроме того, после введения смазки LOIS становится темнее.Смазочный слой вызывает отражение меньшего количества света от подложки, тем самым затемняя LOIS.Чтобы оптимизировать микроструктуру/наноструктуру, чтобы показать наименьший угол скольжения (SA) для достижения характеристик защиты от биообрастания, использовалась сканирующая электронная микроскопия (SEM) и пары атомов для выполнения разного времени высокочастотного травления (0, 3)., 15 и 60 минут) Силовой микроскоп (АСМ) (рис. 2Б).Изображения СЭМ и АСМ показывают, что после короткого времени травления (3 минуты травления) на голой подложке образовалась неравномерная шероховатость наномасштаба.Шероховатость поверхности меняется со временем травления (рис. S3).Изменяющаяся во времени кривая показывает, что шероховатость поверхности продолжает увеличиваться и достигает максимума на 15 минуте травления, а затем лишь небольшое снижение значения шероховатости наблюдается на 30 минуте травления.На этом этапе шероховатость наноуровня вытравливается, в то время как шероховатость микроуровня активно развивается, делая изменение шероховатости более стабильным.После травления в течение более 30 минут наблюдается дальнейшее увеличение шероховатости, что подробно объясняется следующим: SS состоит из стали, легированной такими элементами, как железо, хром, никель, молибден и многие другие элементы.Среди этих элементов железо, хром и молибден играют важную роль в формировании шероховатости микронного/наномасштаба на нержавеющей стали путем высокочастотного травления.На ранних стадиях коррозии в основном подвергаются коррозии железо и хром, поскольку молибден обладает более высокой коррозионной стойкостью, чем молибден.По мере травления травильный раствор достигает локального пересыщения, образуя фториды и оксиды, вызванные травлением.Фториды и оксиды выпадают в осадок и в конечном итоге переотлагаются на поверхности, образуя шероховатость поверхности в микронном/нанодиапазоне (31).Эта шероховатость на микро/наноуровне играет важную роль в свойствах самовосстановления LOIS.Двойная поверхность обеспечивает синергетический эффект, значительно увеличивая капиллярную силу.Это явление позволяет смазке стабильно проникать в поверхность и способствует самовосстановлению (35).Образование шероховатости зависит от времени травления.За 10 минут травления поверхность содержит только наношероховатость, которой недостаточно для удержания достаточного количества смазки и устойчивости к биообрастанию (36).С другой стороны, если время травления превышает 30 минут, наноразмерная шероховатость, образовавшаяся в результате переосаждения железа и хрома, исчезнет, ​​и останется только микромасштабная шероховатость, обусловленная молибденом.Чрезмерно протравленная поверхность лишена наноразмерной шероховатости и теряет синергетический эффект двухступенчатой ​​шероховатости, что отрицательно влияет на характеристики самовосстановления LOIS.Измерения SA проводились на подложках с разным временем травления, чтобы доказать эффективность защиты от обрастания.В зависимости от вязкости и поверхностной энергии были выбраны различные типы жидкостей, включая деионизированную (DI) воду, кровь, этиленгликоль (EG), этанол (EtOH) и гексадекан (HD) (рис. S4).Изменяющаяся во времени картина травления показывает, что для различных жидкостей с различной поверхностной энергией и вязкостью SA LOIS после 15 минут травления является самой низкой.Таким образом, LOIS оптимизирован для травления в течение 15 минут с целью формирования микронной и наноразмерной шероховатости, которая подходит для эффективного поддержания долговечности смазочного материала и отличных свойств против обрастания.
(A) Принципиальная схема четырехэтапного производственного процесса LOIS.На вставке показан САМ, сформированный на подложке.(B) Изображения SEM и AFM, используемые для оптимизации микро/нано структуры подложки при разном времени травления.Спектры рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) (C) Cr2p и (D) F1s после пассивации поверхности и покрытия SAM.а.е., произвольная единица.(E) Репрезентативные изображения капель воды на голых, травленых подложках SHP и LOIS.(F) Угол контакта (CA) и измерение SA жидкостей с различным поверхностным натяжением на SHP и LOIS.Данные выражены как среднее ± SD.
Затем для подтверждения изменения химических свойств поверхности методом рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС) исследовали изменение химического состава поверхности подложки после каждого покрытия поверхности.На рисунке 2C показаны результаты измерений XPS поверхности, протравленной HF, и поверхности, обработанной HNO 3.Два основных пика при 587,3 и 577,7 эВ можно отнести к связи Cr-O, существующей в слое оксида хрома, что является основным отличием от поверхности, травленной ВЧ.В основном это связано с поглощением HNO3 фторидов железа и хрома на поверхности.Травление на основе HNO3 позволяет хрому образовывать на поверхности пассивирующий оксидный слой, что делает протравленную нержавеющую сталь снова устойчивой к коррозии.На рисунке 2D были получены спектры РФЭС для подтверждения того, что силан на основе фторуглерода образовался на поверхности после покрытия SAM, который обладает чрезвычайно высокой водоотталкивающей способностью даже для EG, крови и EtOH.Покрытие SAM завершается за счет реакции силановых функциональных групп с гидроксильными группами, образующимися в результате плазменной обработки.В результате наблюдалось значительное увеличение пиков CF2 и CF3.Энергия связи между 286 и 296 эВ указывает на то, что химическая модификация была успешно завершена покрытием SAM.SHP показывает относительно большие пики CF2 (290,1 эВ) и CF3 (293,3 эВ), которые вызваны образующимся на поверхности силаном на основе фторуглерода.На рисунке 2E показаны репрезентативные оптические изображения измерений угла смачивания (CA) для различных групп деионизированной воды, контактирующей с голой, травленой, SHP и LOIS.Эти изображения показывают, что протравленная поверхность становится гидрофильной благодаря микро/наноструктуре, образованной в результате химического травления, так что деионизированная вода впитывается в структуру.Однако когда подложка покрыта SAM, подложка проявляет сильную водоотталкивающую способность, поэтому образуется поверхностный SHP, а площадь контакта между водой и поверхностью мала.Наконец, в LOIS наблюдалось снижение CA, что можно объяснить проникновением смазки в микроструктуру, тем самым увеличивая площадь контакта.Чтобы доказать, что поверхность обладает превосходными водоотталкивающими и неадгезионными свойствами, LOIS сравнили с подложкой SHP путем измерения CA и SA с использованием различных жидкостей (рис. 2F).В зависимости от вязкости и поверхностной энергии были выбраны различные типы жидкостей, включая деионизированную воду, кровь, ЭГ, этанол и HD (рисунок S4).Результаты измерений СА показывают, что когда СА стремится к HD, снижается значение СА, где СА имеет наименьшую поверхностную энергию.Кроме того, LOIS общего CA низкий.Однако измерение SA показывает совершенно другое явление.За исключением ионизированной воды, все жидкости прилипают к подложке SHP, не соскальзывая.С другой стороны, LOIS показывает очень низкую SA, при которой, когда вся жидкость наклонена под углом менее 10–15°, вся жидкость скатывается.Это убедительно показывает, что неадгезивность LOIS лучше, чем у поверхности SHP.Кроме того, покрытия LOIS также наносятся на различные типы материалов, включая титан (Ti), полифенилсульфон (PPSU), полиоксиметилен (POM), полиэфирэфиркетон (PEEK) и биорассасывающиеся полимеры (PLGA). Они представляют собой имплантируемые ортопедические материалы (рисунок). С5)).Последовательные изображения капель на материале, обработанном LOIS, показывают, что свойства LOIS против биообрастания одинаковы на всех подложках.Кроме того, результаты измерений CA и SA показывают, что неклейкие свойства LOIS можно применять и к другим материалам.
Чтобы подтвердить противообрастающие свойства LOIS, различные типы субстратов (включая голые, протравленные, SHP и LOIS) инкубировали с Pseudomonas aeruginosa и MRSA.Эти две бактерии были выбраны в качестве репрезентативных больничных бактерий, которые могут приводить к образованию биопленок, приводящих к ИОХВ (37).На рисунке 3 (А и Б) показаны изображения флуоресцентного микроскопа и результаты измерения колониеобразующей единицы (КОЕ) субстратов, инкубированных в бактериальной суспензии в течение краткосрочного (12 часов) и длительного (72 часа) времени соответственно.За короткий промежуток времени бактерии образуют скопления и увеличиваются в размерах, покрываясь слизеподобными веществами и препятствуя их удалению.Однако в течение 72 часов инкубации бактерии созреют и станут легко рассеиваться, образуя новые колонии или кластеры.Таким образом, можно считать, что 72-часовая инкубация является долгосрочной и является подходящим временем инкубации для образования прочной биопленки на поверхности (38).За короткий период времени на протравленной поверхности и поверхности SHP проявилась бактериальная адгезия, которая снизилась примерно на 25–50% по сравнению с голой подложкой.Однако благодаря своим превосходным характеристикам и стабильности против биообрастания LOIS не продемонстрировал адгезию бактериальной биопленки в краткосрочной и долгосрочной перспективе.Схематическая диаграмма (рис. 3C) описывает объяснение механизма антибиологического загрязнения травильного раствора, SHP и LOIS.Предполагается, что протравленная подложка с гидрофильными свойствами будет иметь большую площадь поверхности, чем голая подложка.Следовательно, на протравленной подложке будет наблюдаться большая адгезия бактерий.Однако по сравнению с голой подложкой на протравленной подложке образуется значительно меньше биопленки.Это связано с тем, что молекулы воды прочно связываются с гидрофильной поверхностью и действуют как смазка для воды, тем самым препятствуя адгезии бактерий в краткосрочной перспективе (39).Однако слой молекул воды очень тонкий и растворим в бактериальных суспензиях.Поэтому молекулярный слой воды исчезает на длительное время, что приводит к обширной адгезии и пролиферации бактерий.Для SHP из-за его кратковременных несмачивающих свойств подавляется бактериальная адгезия.Уменьшение бактериальной адгезии можно объяснить наличием воздушных карманов в слоистой структуре и более низкой поверхностной энергией, что сводит к минимуму контакт между бактериальной суспензией и поверхностью.Однако в SHP наблюдалась обширная бактериальная адгезия, поскольку он на длительное время потерял свои противообрастающие свойства.В основном это связано с исчезновением воздушных карманов вследствие гидростатического давления и растворения воздуха в воде.В основном это связано с исчезновением воздушных карманов вследствие растворения и слоистой структурой, обеспечивающей большую площадь поверхности для адгезии (27, 40).В отличие от этих двух субстратов, которые оказывают важное влияние на долговременную стабильность, смазка, содержащаяся в LOIS, впрыскивается в микро/наноструктуру и не исчезает даже в долгосрочной перспективе.Смазки, наполненные микро/наноструктурами, очень стабильны и сильно притягиваются к поверхности благодаря высокому химическому сродству, тем самым предотвращая бактериальную адгезию на длительное время.На рисунке S6 показано изображение конфокального микроскопа в отраженном свете пропитанного смазкой субстрата, погруженного в фосфатно-солевой буферный раствор (PBS).Непрерывные изображения показывают, что даже после 120 часов легкого встряхивания (120 об/мин) слой смазки на LOIS остается неизменным, что указывает на долговременную стабильность в условиях потока.Это связано с высоким химическим сродством между SAM-покрытием на основе фтора и смазкой на основе перфторуглерода, что позволяет сформировать стабильный смазочный слой.Таким образом, сохраняются противообрастающие характеристики.Кроме того, субстрат тестировали на репрезентативных белках (альбумин и фибриноген), которые находятся в плазме, клетках, тесно связанных с иммунной функцией (макрофаги и фибробласты), а также белках, связанных с костеобразованием.Содержание кальция очень высокое.(Рис. 3D, 1 и 2 и рисунок S7) (41, 42).Кроме того, изображения флуоресцентного микроскопа теста на адгезию фибриногена, альбумина и кальция показали разные характеристики адгезии каждой группы субстратов (рис. S8).Во время формирования костной ткани ортопедический имплантат может окружать вновь образованные слои кости и кальция, что не только затрудняет его удаление, но и может нанести неожиданный вред пациенту во время процесса удаления.Таким образом, низкий уровень отложений кальция на костных пластинах и винтах полезен при ортопедической хирургии, требующей удаления имплантата.На основе количественной оценки прикрепленной площади на основе интенсивности флуоресценции и количества клеток мы подтвердили, что LOIS демонстрирует превосходные свойства против биообрастания для всех биологических веществ по сравнению с другими субстратами.Согласно результатам экспериментов in vitro, антибиологическое обрастание LOIS может быть применено к ортопедическим имплантатам, что может не только подавлять инфекции, вызванные биопленочными бактериями, но и уменьшать воспаление, вызванное активной иммунной системой организма.
(A) Изображения флуоресцентного микроскопа каждой группы (голые, протравленные, SHP и LOIS), инкубированные в суспензиях Pseudomonas aeruginosa и MRSA в течение 12 и 72 часов.(B) Количество прикрепившихся КОЕ Pseudomonas aeruginosa и MRSA на поверхности каждой группы.(C) Схематическая диаграмма механизма защиты от биологического загрязнения при кратковременном и долговременном травлении, SHP и LOIS.(D) (1) Количество фибробластов, прикрепленных к каждому субстрату, и изображения флуоресцентного микроскопа клеток, прикрепленных к голому и LOIS.(2) Тест на адгезию белков, связанных с иммунной системой, альбумина и кальция, участвующих в процессе заживления костей (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 и **** P <0,0001).нс, не важно.
В случае неизбежных концентрированных напряжений механическая долговечность всегда была основной проблемой при нанесении противообрастающих покрытий.Традиционные методы защиты от нечистот с использованием гелей основаны на полимерах с низкой растворимостью в воде и хрупкостью.Поэтому они обычно чувствительны к механическому воздействию в биомедицинских приложениях.Таким образом, механически прочные противообрастающие покрытия остаются проблемой для таких применений, как ортопедические имплантаты (43, 44).На рисунке 4А(1) показаны два основных типа нагрузки на ортопедические имплантаты, включая царапание (напряжение сдвига) и сжатие, с оптическим изображением поврежденного имплантата, создаваемым щипцами.Например, когда винт затягивается отверткой или когда хирург плотно удерживает костную пластину пинцетом и применяет сжимающую силу, пластиковая костная пластина будет повреждена и поцарапана как на макро-, так и на микро/нано-масштабе (рис. 4А, 2) .Чтобы проверить, может ли изготовленный LOIS противостоять этим повреждениям во время пластической хирургии, было проведено наноиндентирование для сравнения твердости голой подложки и LOIS в микро/наномасштабе для изучения механических свойств микро/наноструктуры. Удар (рис. 4Б).На схематической диаграмме показано различное деформационное поведение LOIS из-за присутствия микро/наноструктур.Кривая сила-смещение была построена на основе результатов наноиндентирования (рис. 4C).Голубое изображение представляет собой голую подложку, на которой наблюдается лишь незначительная деформация, о чем свидетельствует максимальная глубина вдавливания 0,26 мкм.С другой стороны, постепенное увеличение силы и смещения наноиндентирования, наблюдаемое в LOIS (красная кривая), может демонстрировать признаки снижения механических свойств, что приводит к глубине наноиндентирования 1,61 мкм.Это связано с тем, что микро/наноструктура, присутствующая в LOIS, обеспечивает более глубокое пространство для продвижения кончика наноиндентора, поэтому его деформация больше, чем у голой подложки.Конста-Гдутос и др.(45) считает, что из-за присутствия наноструктур наноиндентирование и микро/наношероховатость приводят к нерегулярным кривым наноиндентирования.Заштрихованная область соответствует неравномерной кривой деформации, приписываемой наноструктуре, а незаштрихованная область соответствует микроструктуре.Эта деформация может повредить микроструктуру/наноструктуру удерживающей смазки и отрицательно повлиять на ее противообрастающие свойства.Чтобы изучить влияние повреждений на LOIS, неизбежное повреждение микро/наноструктур было воспроизведено в организме во время пластической хирургии.С помощью тестов на адгезию крови и белков можно определить стабильность свойств LOIS против биообрастания после in vitro (рис. 4D).Серия оптических изображений показывает повреждения, произошедшие возле отверстий каждой подложки.Был проведен тест на адгезию крови, чтобы продемонстрировать влияние механического повреждения на покрытие, препятствующее биологическому обрастанию (рис. 4E).Как и SHP, противообрастающие свойства теряются из-за повреждений, а LOIS демонстрирует превосходные противообрастающие свойства за счет отталкивания крови.Это связано с тем, что поверхностная энергия создается за счет капиллярного действия, охватывающего поврежденную область, поток микроструктурированной смазочной жидкости восстанавливает противообрастающие свойства (35).Та же тенденция наблюдалась и в тесте на адгезию белка с использованием альбумина.В поврежденной области широко наблюдается адгезия белка к поверхности SHP, и, измеряя площадь ее покрытия, ее можно количественно оценить как половину уровня адгезии голой подложки.С другой стороны, LOIS сохранил свои свойства против биообрастания, не вызывая прилипания (рис. 4, F и G).Кроме того, поверхность винта часто подвергается сильным механическим воздействиям, например при сверлении, поэтому мы изучали способность LOIS-покрытия оставаться неповрежденным на винте in vitro.На рисунке 4H показаны оптические изображения различных винтов, включая голые, SHP и LOIS.Красный прямоугольник представляет целевую область, где во время костной имплантации возникает сильное механическое напряжение.Подобно тесту на адгезию белка на пластине, флуоресцентный микроскоп используется для изображения адгезии белка и измерения площади покрытия, чтобы доказать целостность покрытия LOIS даже при сильном механическом воздействии (рис. 4, I и J).Винты, обработанные LOIS, демонстрируют превосходные характеристики защиты от обрастания, и белок почти не прилипает к поверхности.С другой стороны, адгезия белка наблюдалась у винтов без покрытия и винтов SHP, где площадь покрытия винтов SHP составляла одну треть от площади покрытия винтов без покрытия.Кроме того, ортопедический имплантат, используемый для фиксации, должен быть механически прочным, чтобы выдерживать нагрузку, приложенную к месту перелома, как показано на рисунке 4K.Поэтому было проведено испытание на изгиб, чтобы определить влияние химической модификации на механические свойства.Кроме того, это делается для поддержания фиксированного напряжения от имплантата.Применяйте вертикальную механическую силу до тех пор, пока имплантат не будет полностью сложен и не будет получена кривая растяжения-деформации (рис. 4L, 1).Два свойства, включая модуль Юнга и прочность на изгиб, сравнивались между голыми подложками и подложками LOIS в качестве показателей их механической прочности (рис. 4L, 2 и 3).Модуль Юнга указывает на способность материала противостоять механическим изменениям.Модуль Юнга каждой подложки составляет 41,48±1,01 и 40,06±0,96 ГПа соответственно;наблюдаемая разница составляет около 3,4%.Кроме того, сообщается, что прочность на изгиб, определяющая ударную вязкость материала, составляет 102,34±1,51 ГПа для голой подложки и 96,99±0,86 ГПа для SHP.Голая подложка примерно на 5,3% выше.Небольшое снижение механических свойств может быть вызвано эффектом надреза.При эффекте надреза микро/наношероховатость может действовать как набор насечек, приводя к локальной концентрации напряжений и влияя на механические свойства имплантата (46).Однако, учитывая тот факт, что жесткость кортикальной кости человека, как сообщается, составляет от 7,4 до 31,6 ГПа, а измеренный модуль LOIS превышает модуль кортикальной кости человека (47), LOIS достаточен для поддержки перелома и его общего состояния. Механические свойства минимально зависят от модификации поверхности.
(A) Схематическая диаграмма (1) механического напряжения, приложенного к ортопедическому имплантату во время операции, и (2) оптического изображения поврежденного ортопедического имплантата.(B) Принципиальная схема измерения наномеханических свойств путем наноиндентирования и LOIS на голой поверхности.(C) Кривая силы-перемещения наноиндентирования обнаженной поверхности и LOIS.(D) После экспериментов in vitro смоделируйте оптические изображения различных типов ортопедических пластин (поврежденная область выделена красным прямоугольником), чтобы имитировать механическое напряжение, вызванное во время операции.(E) Тест на адгезию крови и (F) тест на адгезию белка поврежденной группы ортопедических пластин.(G) Измерьте площадь покрытия белка, прилипшего к пластине.(H) Оптические изображения различных типов ортопедических винтов после эксперимента in vitro.(I) Тест на адгезию белка для изучения целостности различных покрытий.(J) Измерьте площадь покрытия белка, прилипшего к винту.(K) Движение кролика направлено на создание фиксированной нагрузки на сломанную кость.(L) (1) Результаты испытаний на изгиб и оптические изображения до и после изгиба.Разница в (2) модуле Юнга и (3) прочности на изгиб между голым имплантатом и SHP.Данные выражены как среднее значение ± стандартное отклонение (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 и ****P<0,0001).Изображение предоставлено: Кёмин Че, Университет Ёнсей.
В клинических ситуациях большая часть бактериального контакта с биологическими материалами и местами ран происходит со зрелыми, зрелыми биопленками (48).Таким образом, по оценкам Центров по контролю и профилактике заболеваний США, 65% всех инфекций человека связаны с биопленками (49).В этом случае необходимо обеспечить схему эксперимента in vivo, обеспечивающую последовательное образование биопленки на поверхности имплантата.Поэтому мы разработали модель перелома бедренной кости кролика, в которой ортопедические имплантаты предварительно инкубировали в бактериальной суспензии, а затем имплантировали в бедренные кости кролика для изучения противообрастающих свойств LOIS in vivo.Ввиду следующих трех важных фактов бактериальные инфекции индуцируются предварительным культивированием, а не прямым введением бактериальных суспензий: (i) иммунная система кроликов естественно сильнее, чем человеческая;поэтому возможно введение бактериальных суспензий и планктонных бактерий. На образование биопленок не влияет.(Ii) Планктонные бактерии более чувствительны к антибиотикам, и антибиотики обычно используются после операции;наконец, (iii) суспензия планктонных бактерий может быть разбавлена ​​жидкостями организма животного (50).Предварительно культивируя имплантат в бактериальной суспензии перед имплантацией, мы можем тщательно изучить вредное влияние бактериальной инфекции и реакции на инородное тело (FBR) на процесс заживления кости.Кроликов умерщвляли через 4 недели после имплантации, поскольку остеоинтеграция, необходимая для процесса заживления кости, будет завершена в течение 4 недель.Затем имплантаты удалили у кроликов для последующих исследований.На рисунке 5А показан механизм пролиферации бактерий.Инфицированный ортопедический имплантат вводится в организм.В результате предварительной инкубации в бактериальной суспензии шесть из шести кроликов, которым были имплантированы голые имплантаты, были инфицированы, тогда как ни один из кроликов, которым имплантировали обработанные LOIS имплантаты, не был инфицирован.Бактериальные инфекции протекают в три этапа: рост, созревание и распространение (51).Сначала прикрепленные бактерии размножаются и растут на поверхности, а затем бактерии образуют биопленку, выделяя внеклеточный полимер (ЭПС), амилоид и внеклеточную ДНК.Биопленка не только препятствует проникновению антибиотиков, но также способствует накоплению ферментов, разрушающих антибиотики (таких как β-лактамазы) (52).Наконец, биопленка распространяет зрелые бактерии в окружающие ткани.Поэтому происходит заражение.Кроме того, при попадании в организм инородного тела инфекция, способная вызвать сильный иммунный ответ, может вызвать сильное воспаление, боль и снижение иммунитета.На рисунке 5B представлен обзор FBR, вызванного установкой ортопедического имплантата, а не иммунного ответа, вызванного бактериальной инфекцией.Иммунная система распознает вставленный имплантат как инородное тело, а затем заставляет клетки и ткани реагировать на инкапсуляцию инородного тела (53).На заре FBR на поверхности ортопедических имплантатов формировалась питающая матрица, что приводило к адсорбции фибриногена.Адсорбированный фибриноген затем образует очень плотную фибриновую сеть, которая способствует прикреплению лейкоцитов (54).Как только фибриновая сеть формируется, возникает острое воспаление из-за инфильтрации нейтрофилов.На этом этапе высвобождаются различные цитокины, такие как фактор некроза опухоли-α (TNF-α), интерлейкин-4 (IL-4) и IL-β, а моноциты начинают проникать в место имплантации и дифференцироваться в гигантские клетки.Фаг (41, 55, 56).Снижение FBR всегда было проблемой, поскольку чрезмерное FBR может вызвать острое и хроническое воспаление, что может привести к фатальным осложнениям.Для оценки влияния бактериальных инфекций на ткани, окружающие голый имплантат и LOIS, использовали окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и трихромом по Массону (MT).У кроликов, которым имплантировали голые субстраты, прогрессировали тяжелые бактериальные инфекции, а на слайдах тканей H&E четко наблюдались абсцессы и некрозы, вызванные воспалением.С другой стороны, чрезвычайно прочная поверхность LOIS, препятствующая биообрастанию, подавляет адгезию бактерий, поэтому на ней не появляются признаки инфекции и уменьшается воспаление (рис. 5C).Результаты окрашивания МТ показали ту же тенденцию.Однако окрашивание МТ также показало отек у кроликов, которым был имплантирован LOIS, что указывает на то, что выздоровление вот-вот произойдет (рис. 5D).Чтобы изучить степень иммунного ответа, проводили иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание с использованием цитокинов TNF-α и IL-6, связанных с иммунным ответом.Голый негативный имплантат, не подвергавшийся воздействию бактерий, сравнивали с LOIS, подвергшимся воздействию бактерий, но не инфицированным, для изучения процесса заживления в отсутствие бактериальной инфекции.На рисунке 5E показано оптическое изображение предметного стекла ИГХ, экспрессирующего TNF-α.Коричневая область представляет иммунный ответ, указывая на то, что иммунный ответ при LOIS немного снижен.Кроме того, экспрессия IL-6 в LOIS была значительно меньше, чем отрицательная экспрессия в стерильных обнаженных клетках (рис. 5F).Экспрессию цитокина определяли количественно путем измерения площади окрашивания антител, соответствующей цитокину (рис. 5G).По сравнению с кроликами, подвергшимися негативным имплантатам, уровни экспрессии у кроликов, которым имплантировали LOIS, были ниже, демонстрируя значимую разницу.Снижение экспрессии цитокинов указывает на то, что долгосрочные стабильные противообрастающие свойства LOIS связаны не только с ингибированием бактериальных инфекций, но также и со снижением FBR, которое индуцируется макрофагами, прилипающими к субстрату (53, 57, 58).Таким образом, снижение иммунного ответа из-за свойств LOIS уклоняться от иммунитета может решить побочные эффекты после имплантации, такие как чрезмерный иммунный ответ после пластической хирургии.
(А) Схематическая диаграмма механизма образования и распространения биопленки на поверхности инфицированного ортопедического имплантата.эДНК, внеклеточная ДНК.(B) Схематическая диаграмма иммунного ответа после установки ортопедического имплантата.(C) Окрашивание H&E и (D) Окрашивание MT окружающих тканей ортопедических имплантатов с голым положительным результатом и LOIS.ИГХ иммуносвязанных цитокинов (E) TNF-α и (F) IL-6 представляет собой окрашенные изображения голых отрицательных кроликов и кроликов с имплантацией LOIS.(G) Количественная оценка экспрессии цитокинов путем измерения площади покрытия (** P <0,01).
Биосовместимость LOIS и ее влияние на процесс заживления костей исследовали in vivo с использованием диагностической визуализации (рентгеновской и микрокомпьютерной томографии (КТ)) и ИГХ остеокластов.На рисунке 6А показан процесс заживления кости, включающий три различных этапа: воспаление, восстановление и ремоделирование.При переломе воспалительные клетки и фибробласты проникают в сломанную кость и начинают прорастать в сосудистую ткань.На этапе восстановления врастание сосудистой ткани распространяется вблизи места перелома.Сосудистая ткань обеспечивает питательные вещества для формирования новой кости, которая называется костной мозолью.Заключительной стадией процесса заживления кости является стадия ремоделирования, на которой размер костной мозоли уменьшается до размера нормальной кости за счет увеличения уровня активированных остеокластов (59).Трехмерную (3D) реконструкцию места перелома проводили с помощью микроКТ, чтобы наблюдать различия в уровне образования костной мозоли в каждой группе.Посмотрите на поперечное сечение бедренной кости, чтобы оценить толщину мозоли, окружающей сломанную кость (рис. 6, B и C).Рентгеновские лучи также использовались для исследования мест переломов во всех группах каждую неделю, чтобы наблюдать различные процессы регенерации кости в каждой группе (рис. S9).Мозоль и зрелые кости показаны синим/зеленым цветом и цветом слоновой кости соответственно.Большинство мягких тканей отфильтровываются с заданным порогом.Обнаженный положительный результат и SHP подтвердили образование небольшого количества костной мозоли вокруг места перелома.С другой стороны, обнаженный отрицательный результат LOIS и место перелома окружены толстой мозолью.Изображения микроКТ показали, что образованию костной мозоли препятствует бактериальная инфекция и воспаление, связанное с инфекцией.Это связано с тем, что иммунная система отдает приоритет заживлению гнойных повреждений, вызванных инфекционным воспалением, а не восстановлению костей (60).Окраску ИГХ и тартрат-резистентной кислой фосфатазой (TRAP) проводили для наблюдения за активностью остеокластов и резорбцией кости (рис. 6D) (61).Лишь несколько активированных остеокластов, окрашенных в фиолетовый цвет, были обнаружены в голых позитивах и SHP.С другой стороны, множество активированных остеокластов наблюдалось вблизи обнаженных положительных и зрелых костей LOIS.Этот феномен указывает на то, что в присутствии остеокластов мозоль вокруг места перелома подвергается бурному процессу ремоделирования (62).Объем кости и площадь экспрессии остеокластов в костной мозоли измеряли для сравнения уровня образования костной мозоли вокруг места перелома во всех группах, чтобы количественно оценить результаты микроКТ и ИГХ (рис. 6E, 1 и 2).Как и ожидалось, голые негативы и образование костных мозолей в LOIS были значительно выше, чем в других группах, что указывает на положительное ремоделирование кости (63).На рисунке S10 показано оптическое изображение операционного поля, результат окрашивания МТ ткани, собранной рядом с винтом, и результат окрашивания TRAP, подчеркивающий границу раздела винт-кость.На голом субстрате наблюдалось сильное образование костной мозоли и фиброза, тогда как поверхность имплантата, обработанного LOIS, имела относительно неадгезивную поверхность.Аналогичным образом, по сравнению с голыми негативами, у кроликов, которым имплантировали LOIS, наблюдался меньший фиброз, как показано белыми стрелками.Кроме того, устойчивый отек (синяя стрелка) можно объяснить способностью LOIS уклоняться от иммунитета, тем самым уменьшая тяжелое воспаление.Антипригарная поверхность вокруг имплантата и уменьшенный фиброз позволяют предположить, что процесс удаления облегчается, что обычно приводит к другим переломам или воспалению.Процесс заживления кости после удаления винта оценивали по активности остеокластов на границе винт-кость.Как голая кость, так и интерфейс имплантата LOIS абсорбировали одинаковые уровни остеокластов для дальнейшего заживления кости, что указывает на то, что покрытие LOIS не оказывает негативного влияния на заживление кости или иммунный ответ.Чтобы подтвердить, что модификация поверхности, выполненная с помощью LOIS, не мешает процессу заживления кости, было использовано рентгеновское исследование для сравнения заживления костей кроликов при воздействии отрицательных ионов и 6-недельной имплантации LOIS (рис. 6F).Результаты показали, что по сравнению с группой неинфицированных обнаженных пациентов, LOIS показал одинаковую степень заживления костей, и в обеих группах не было очевидных признаков перелома (непрерывная линия остеолиза).
(А) Схематическая диаграмма процесса заживления кости после перелома.(B) Разница в степени образования костной мозоли каждой группы поверхностей и (C) изображение поперечного сечения места перелома.(D) Окрашивание TRAP для визуализации активности остеокластов и резорбции кости.На основании активности TRAP количественно анализировали образование внешней костной мозоли кортикальной кости с помощью (E) (1) микро-КТ и (2) активности остеокластов.(F) через 6 недель после имплантации, рентгеновские снимки сломанной кости обнаженного негатива (выделены красным пунктирным прямоугольником) и LOIS (выделены синим пунктирным прямоугольником).Статистический анализ проводился методом однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA).* Р <0,05.** Р <0,01.
Короче говоря, LOIS обеспечивает новый тип стратегии борьбы с бактериальными инфекциями и покрытие, предотвращающее иммунную защиту, для ортопедических имплантатов.Обычные ортопедические имплантаты с функционализацией SHP проявляют кратковременные свойства против биообрастания, но не могут сохранять свои свойства в течение длительного времени.Супергидрофобность субстрата удерживает пузырьки воздуха между бактериями и субстратом, тем самым образуя воздушные карманы и тем самым предотвращая бактериальную инфекцию.Однако благодаря диффузии воздуха эти воздушные карманы легко удаляются.С другой стороны, LOIS хорошо доказал свою способность предотвращать инфекции, связанные с биопленками.Таким образом, благодаря свойствам предотвращения отторжения слоя смазки, введенного в поверхность многослойной микро/наноструктуры, можно предотвратить воспаление, связанное с инфекцией.Для оптимизации производственных условий LOIS используются различные методы определения характеристик, включая измерения SEM, AFM, XPS и CA.Кроме того, LOIS также можно применять к различным биологическим материалам, обычно используемым в ортопедическом фиксирующем оборудовании, таким как PLGA, Ti, PE, POM и PPSU.Затем LOIS был протестирован in vitro, чтобы доказать его противообрастающие свойства против бактерий и биологических веществ, связанных с иммунным ответом.Результаты показывают, что он обладает превосходным антибактериальным действием и действием против биообрастания по сравнению с голым имплантатом.Кроме того, LOIS демонстрирует механическую прочность даже после механического воздействия, неизбежного в пластической хирургии.Благодаря свойствам самовосстановления смазки на поверхности микро/наноструктуры LOIS успешно сохраняет свои свойства против биологического загрязнения.Для изучения биосовместимости и антибактериальных свойств LOIS in vivo LOIS имплантировали в бедренную кость кролика на 4 недели.У кроликов, которым имплантировали LOIS, бактериальной инфекции не наблюдалось.Кроме того, использование ИГХ продемонстрировало снижение уровня местного иммунного ответа, что указывает на то, что ЛОИС не ингибирует процесс заживления костей.LOIS демонстрирует превосходные антибактериальные и противоиммунные свойства и, как было доказано, эффективно предотвращает образование биопленок до и во время ортопедической хирургии, особенно при синтезе кости.Используя модель воспалительного перелома бедренной кости костного мозга кролика, было глубоко изучено влияние инфекций, связанных с биопленками, на процесс заживления кости, вызванный предварительно инкубированными имплантатами.В качестве будущего исследования необходима новая модель in vivo для изучения возможных инфекций после имплантации, чтобы полностью понять и предотвратить инфекции, связанные с биопленками, в течение всего процесса заживления.Кроме того, остеоиндукция все еще остается нерешенной проблемой в интеграции с LOIS.Необходимы дальнейшие исследования, чтобы объединить селективную адгезию остеоиндуктивных клеток или регенеративную медицину с LOIS для решения этой проблемы.В целом, LOIS представляет собой многообещающее покрытие для ортопедических имплантатов, обладающее механической прочностью и превосходными свойствами против биообрастания, что может уменьшить побочные эффекты SSI и иммунного характера.
Промойте подложку из нержавеющей стали 304 размером 15 x 15 x 1 мм (Dong Kang M-Tech Co., Корея) в ацетоне, EtOH и деионизированной воде в течение 15 минут, чтобы удалить загрязнения.Для формирования на поверхности структуры микро/наноуровня очищенную подложку погружают в 48-51% раствор HF (DUKSAN Corp., Южная Корея) при температуре 50°С.Время травления варьируется от 0 до 60 минут.Затем протравленную подложку очищали деионизированной водой и помещали в 65% раствор HNO3 (Корея DUKSAN Corp.) при температуре 50°C на 30 минут для формирования на поверхности пассивирующего слоя оксида хрома.После пассивации подложку промывают деионизированной водой и сушат до получения подложки со слоистой структурой.Далее подложку подвергали воздействию кислородной плазмы (100 Вт, 3 минуты) и сразу погружали в раствор 8,88 мМ ПОТС (Sigma-Aldrich, Германия) в толуоле при комнатной температуре на 12 часов.Затем подложку, покрытую POTS, очищали EtOH и отжигали при 150°C в течение 2 часов для получения плотного POTS SAM.После покрытия САМ на подложке формировали смазочный слой путем нанесения перфторполиэфирной смазки (Krytox 101; DuPont, США) с объемом загрузки 20 мкм/см 2 . Перед использованием смазку фильтруют через фильтр 0,2 микрона.Удалите излишки смазки, наклонив под углом 45° в течение 15 минут.Та же процедура изготовления использовалась для ортопедических имплантатов из нержавеющей стали 304 (фиксирующая пластина и кортикальный стопорный винт; Dong Kang M-Tech Co., Корея).Все ортопедические имплантаты разработаны с учетом геометрии бедренной кости кролика.
Морфологию поверхности подложки и ортопедических имплантатов проверяли с помощью полевой эмиссионной электронной микроскопии (Inspect F50, FEI, США) и АСМ (XE-100, Park Systems, Южная Корея).Шероховатость поверхности (Ra, Rq) измеряется путем умножения площади 20 мкм на 20 мкм (n=4).Для анализа химического состава поверхности использовали систему XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Япония), оснащенную источником рентгеновского излучения Al Kα с размером пятна 100 мкм2.Для измерения жидких CA и SA использовали систему измерения CA, оснащенную камерой захвата динамического изображения (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Южная Корея).Для каждого измерения на поверхность для измерения CA наносят от 6 до 10 мкл капель (деионизированная вода, лошадиная кровь, ЭГ, 30% этанол и HD).При увеличении угла наклона подложки со скоростью 2°/с (n = 4) измеряется СА при падении капли.
Pseudomonas aeruginosa [Американская коллекция типовых культур (ATCC) 27853] и MRSA (ATCC 25923) были приобретены у ATCC (Манассас, Вирджиния, США), а исходную культуру поддерживали при -80°C.Перед использованием замороженную культуру инкубировали в размороженном трипсином соевом бульоне («Комед», Корея) при 37°С в течение 18 часов, а затем дважды переносили для ее активации.После инкубации культуру центрифугировали при 10000 об/мин в течение 10 минут при 4°С и дважды промывали раствором PBS (рН 7,3).Центрифугированную культуру затем субкультивируют на чашках с кровяным агаром (BAP).MRSA и Pseudomonas aeruginosa готовили в течение ночи и культивировали в бульоне Лурии-Бертани.Концентрацию Pseudomonas aeruginosa и MRSA в инокуляте количественно определяли по КОЕ суспензии в серийных разведениях на агаре.Затем доведите концентрацию бактерий до 0,5 стандарта МакФарланда, что эквивалентно 108 КОЕ/мл.Затем рабочую бактериальную суспензию разводят в 100 раз до 106 КОЕ/мл.Для проверки антибактериальных адгезионных свойств подложку перед использованием стерилизовали при 121°С в течение 15 минут.Затем субстрат переносили в 25 мл бактериальной суспензии и инкубировали при 37°С при энергичном встряхивании (200 об/мин) в течение 12 и 72 часов.После инкубации каждый субстрат вынимали из инкубатора и трижды промывали PBS для удаления любых плавающих бактерий на поверхности.Чтобы наблюдать биопленку на подложке, биопленку фиксировали метанолом и окрашивали 1 мл криминдинового оранжевого в течение 2 минут.Затем флуоресцентный микроскоп (BX51TR, Olympus, Япония) использовали для фотографирования окрашенной биопленки.Для количественной оценки биопленки на подложке прикрепленные клетки отделяли от подложки методом вихревого шарика, который считался наиболее подходящим методом удаления прикрепленных бактерий (n = 4).Используя стерильные щипцы, удалите субстрат из питательной среды и постучите по луночному планшету, чтобы удалить лишнюю жидкость.Слабо прикрепленные клетки удаляли двукратным промыванием стерильным PBS.Затем каждый субстрат переносили в стерильную пробирку, содержащую 9 мл 0,1% физиологического раствора белка (PSW) и 2 г 20–25 стерильных стеклянных шариков (диаметром 0,4–0,5 мм).Затем его встряхивали в течение 3 минут для отделения клеток от образца.После встряхивания суспензию серийно разбавляли в 10 раз 0,1% PSW, а затем по 0,1 мл каждого разведения инокулировали на BAP.Через 24 часа инкубации при 37°С подсчитывали КОЕ вручную.
В качестве клеток использовали мышиные фибробласты NIH/3T3 (CRL-1658; американский ATCC) и мышиные макрофаги RAW 264.7 (TIB-71; американский ATCC).Используйте модифицированную среду Игла Дульбекко (DMEM; LM001-05, Welgene, Корея) для культивирования фибробластов мыши и добавляйте 10% телячьей сыворотки (S103-01, Welgene) и 1% пенициллин-стрептомицина (PS; LS202-02, Welgene (Welgene) ). Используйте DMEM для культивирования макрофагов мыши, дополненных 10% фетальной бычьей сывороткой (S001-01, Welgene) и 1% PS. Поместите субстрат в шестилуночный планшет для культуры клеток и инокулируйте клетки в концентрации 105 клеток/см2. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°C и 5% CO2. Для окрашивания клеток клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 минут и помещали в 0,5% Triton X. Инкубируйте на 5 минут в -100°С. Погрузите субстрат в 50 нМ тетраметилродамина. при 37°C в течение 30 минут. После процесса инкубации используйте субстрат с фиксирующей средой VECTASHIELD 4',6-диамино-2-фенилиндола (H-1200) (n = 4 на клетку). , флуоресцеин, изотиоцианат-альбумин флуоресцеина (A9771, Sigma-Aldrich, Германия) и человеческая плазма. Фибриноген, конъюгированный с Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, США), растворяли в PBS (10 мМ, pH 7,4).Концентрации альбумина и фибриногена составляли 1 и 150 мкг/мл соответственно.После субстрата. Перед погружением в белковый раствор промойте их PBS для регидратации поверхности.Затем погрузите все субстраты в шестилуночный планшет, содержащий раствор белка, и инкубируйте при 37°С в течение 30 и 90 минут.После инкубации субстрат удаляли из раствора белка, аккуратно промывали PBS 3 раза и фиксировали 4% параформальдегидом (n = 4 для каждого белка).Для кальция хлорид натрия (0,21 М) и фосфат калия (3,77 мМ) растворяли в деионизированной воде.pH раствора доводили до 2,0 добавлением раствора гидрохлорида (1М).Затем в растворе растворяли хлорид кальция (5,62 мМ).Добавление 1М трис(гидроксиметил)аминометана доводит pH раствора до 7,4.Погрузите все субстраты в шестилуночный планшет, наполненный 1,5-кратным раствором фосфата кальция, и извлеките из раствора через 30 минут.Для окрашивания 2 г ализарина красного S (CI 58005) смешать со 100 мл деионизированной воды.Затем с помощью 10%-ного гидроксида аммония доведите pH до 4. Окрасьте субстрат раствором Ализарина красного в течение 5 минут, затем стряхните излишки красителя и промокните.После процесса встряхивания удалите подложку.Материал обезвоживают, затем погружают в ацетон на 5 минут, затем погружают в раствор ацетон-ксилол (1:1) на 5 минут и окончательно промывают ксилолом (n = 4).Используют флуоресцентный микроскоп (Axio Imager) с объективами ×10 и ×20..A2m, Zeiss, Германия) отображает все подложки.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) использовался для количественной оценки данных адгезии биологических веществ на каждой группе из четырех различных областей визуализации.Преобразуйте все изображения в двоичные изображения с фиксированными порогами для сравнения подложек.
Для контроля стабильности смазочного слоя в PBS в режиме отражения использовали конфокальный микроскоп Zeiss LSM 700.Образец стекла с SAM-покрытием на основе фтора и инжектированным смазочным слоем был погружен в раствор PBS и испытан с использованием орбитального шейкера (SHO-1D; Daihan Scientific, Южная Корея) в условиях мягкого встряхивания (120 об/мин).Затем возьмите образец и контролируйте потерю смазки, измеряя потерю отраженного света.Чтобы получить изображения флуоресценции в режиме отражения, образец подвергается воздействию лазера с длиной волны 633 нм, а затем собирается, поскольку свет будет отражаться обратно от образца.Образцы измерялись через временные интервалы 0, 30, 60 и 120 часов.
Для определения влияния процесса модификации поверхности на наномеханические свойства ортопедических имплантатов для измерения наноиндендиона использовали наноиндентор (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, США), оснащенный трехгранным алмазным наконечником Берковича пирамидальной формы.Пиковая нагрузка составляет 10 мН, а площадь — 100×100 мкм.Для всех измерений время нагружения и разгрузки составляет 10 с, а время выдержки при пиковой нагрузке на вдавливание — 2 с.Проведите измерения в пяти разных местах и ​​возьмите среднее значение.Для оценки показателей механической прочности под нагрузкой было проведено испытание на поперечный трехточечный изгиб на универсальной испытательной машине (Instron 5966, Instron, США).Подложку сжимают с постоянной скоростью 10 Н/с при увеличении нагрузки.Программное обеспечение Bluehill Universal (n = 3) использовалось для расчета модуля упругости при изгибе и максимального напряжения сжатия.
С целью моделирования процесса операции и связанных с ней механических повреждений, возникающих в ходе операции, процесс операции проводили in vitro.Бедренные кости были собраны у казненных новозеландских белых кроликов.Бедренную кость очищали и фиксировали в 4% параформальдегиде на 1 неделю.Как описано в методе эксперимента на животных, фиксированную бедренную кость оперировали хирургическим путем.После операции ортопедический имплантат погружали в кровь (лошадиную кровь, KISAN, Корея) на 10 с для подтверждения наличия спаек крови после нанесения механической травмы (n = 3).
Всего 24 новозеландских белых кролика-самца (весом от 3,0 до 3,5 кг, средний возраст 6 месяцев) были случайным образом разделены на четыре группы: голые негативные, голые позитивные, SHP и LOIS.Все процедуры с участием животных проводились в соответствии с этическими стандартами Институционального комитета по уходу и использованию животных (одобрено IACUC, КОРЕЯ-2017-0159).Ортопедический имплантат состоит из фиксирующей пластины с пятью отверстиями (длина 41 мм, ширина 7 мм и толщина 2 мм) и кортикальных фиксирующих винтов (длина 12 мм, диаметр 2,7 мм) для фиксации перелома.За исключением тех планшетов и винтов, которые использовались в группе с голыми отрицательными результатами, все планшеты и винты инкубировали в суспензии MRSA (106 КОЕ/мл) в течение 12 часов.Группу голых отрицательных пациентов (n=6) лечили имплантатами с обнаженной поверхностью без воздействия бактериальной суспензии в качестве отрицательного контроля на инфекцию.Группу с голым положительным результатом (n = 6) лечили имплантатом с голой поверхностью, подвергавшимся воздействию бактерий, в качестве положительного контроля инфекции.Группу SHP (n = 6) лечили имплантатами SHP, подвергшимися воздействию бактерий.Наконец, группе LOIS применяли имплантаты LOIS, подвергшиеся воздействию бактерий (n = 6).Все животные содержатся в клетках, им предоставляется много еды и воды.Перед операцией кроликов голодали в течение 12 часов.Животных анестезировали внутримышечной инъекцией ксилазина (5 мг/кг) и внутривенной инъекцией паклитаксела (3 мг/кг) для индукции.После этого доставьте 2% изофлурана и от 50% до 70% медицинского кислорода (скорость потока 2 л/мин) через дыхательную систему для поддержания анестезии.Его имплантируют прямым доступом к латеральной поверхности бедренной кости.После эпиляции и дезинфекции кожи повидон-йодом производили разрез длиной около 6 см на внешней стороне левого среднего бедра.При открытии щели между мышцами, покрывающими бедренную кость, бедренная кость полностью обнажается.Поместите пластину перед диафизом бедренной кости и зафиксируйте ее четырьмя винтами.После фиксации с помощью пильного полотна (толщиной 1 мм) искусственно создайте перелом в области между вторым и четвертым отверстиями.По окончании операции рану промывали физиологическим раствором и закрывали швами.Каждому кролику подкожно вводили энрофлоксацин (5 мг/кг), разведенный на одну треть в физиологическом растворе.Всем животным (на 0, 7, 14, 21, 28 и 42 сутки) были сделаны послеоперационные рентгенограммы бедренной кости для подтверждения остеотомии кости.После глубокой анестезии всех животных забивали внутривенным введением KCl (2 ммоль/кг) на 28 и 42 сутки.После казни бедренную кость сканировали с помощью микроКТ, чтобы наблюдать и сравнивать процесс заживления кости и формирования новой кости между четырьмя группами.
После выполнения были собраны мягкие ткани, непосредственно контактировавшие с ортопедическими имплантатами.Ткань фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине на ночь, а затем обезвоживали в EtOH.Обезвоженную ткань заливали в парафин и делали срезы толщиной 40 мкм с помощью микротома (400CS; EXAKT, Германия).Чтобы визуализировать инфекцию, проводили окрашивание H&E и окрашивание MT.Чтобы проверить реакцию хозяина, срез ткани инкубировали с первичным кроличьим антителом против TNF-α (AB6671, Abcam, США) и кроличьим анти-IL-6 (AB6672; Abcam, США), а затем обрабатывали хреном.Оксидаза.Нанесите на срезы систему окрашивания авидин-биотинового комплекса (ABC) в соответствии с инструкциями производителя.Чтобы продукт реакции выглядел коричневым, во всех частях использовали 3,3-диаминобензидин.Для визуализации всех срезов использовали цифровой слайд-сканер (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Венгрия), и по меньшей мере четыре субстрата в каждой группе анализировали с помощью программного обеспечения ImageJ.
Рентгеновские изображения получали у всех животных после операции и каждую неделю для контроля заживления переломов (n=6 на группу).После выполнения микроКТ высокого разрешения использовалась для расчета образования костной мозоли вокруг бедренной кости после заживления.Полученную бедренную кость очищали, фиксировали в 4%-ном параформальдегиде в течение 3 дней и обезвоживали в 75%-м этаноле.Затем обезвоженные кости сканировали с помощью микроКТ (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Канди, Бельгия) для создания 3D-воксельных изображений (2240×2240 пикселей) образца кости.Используйте алюминиевый фильтр толщиной 1,0 мм, чтобы уменьшить шум сигнала и применить высокое разрешение ко всем сканированиям (E = 133 кВпик, I = 60 мкА, время интегрирования = 500 мс).Программное обеспечение Nrecon (версия 1.6.9.8, Bruker microCT, Контич, Бельгия) использовалось для создания трехмерного объема отсканированного образца на основе полученной двумерной боковой проекции.Для анализа 3D-реконструированное изображение делится на кубики размером 10×10×10 мм в зависимости от места перелома.Рассчитайте мозоль вне кортикальной кости.Программное обеспечение DataViewer (версия 1.5.1.2; Bruker microCT, Контич, Бельгия) использовалось для цифрового перенаправления отсканированного объема кости, а для анализа использовалось программное обеспечение CT-Analyzer (версия 1.14.4.1; Bruker microCT, Контич, Бельгия).Относительные коэффициенты поглощения рентгеновских лучей в зрелой кости и костной мозоли различают по их плотности, а затем количественно определяют объем костной мозоли (n = 4).Чтобы подтвердить, что биосовместимость LOIS не замедляет процесс заживления костей, дополнительный рентгенологический и микроКТ-анализ был проведен у двух кроликов: группы голых отрицательных пациентов и группы LOIS.Обе группы были казнены на 6-й неделе.
Бедренные кости умерщвленных животных собирали и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 3 дней.Затем ортопедический имплантат осторожно извлекают из бедренной кости.Бедренную кость декальцинировали в течение 21 дня с использованием 0,5 М ЭДТА (EC-900, National Diagnostics Corporation).Затем декальцинированную бедренную кость погружали в EtOH для ее обезвоживания.Обезвоженную бедренную кость извлекали в ксилоле и заливали в парафин.Затем на автоматическом ротационном микротоме (Leica RM2255, Leica Biosystems, Германия) образец нарезали срезы толщиной 3 мкм.Для окрашивания TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Германия) срезы депарафинизировали, регидратировали и инкубировали в реагенте TRAP при 37°C в течение 1 часа.Изображения были получены с помощью слайд-сканера (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Венгрия) и количественно оценены путем измерения площади покрытия окрашенной области.В каждом эксперименте с помощью программного обеспечения ImageJ анализировали не менее четырех субстратов в каждой группе.
Статистический анализ значимости проводили с использованием GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., США).Непарный t-критерий и однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) использовались для проверки различий между группами оценки.Уровень значимости обозначен на рисунке следующим образом: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 и ****P<0,0001;Н.С., существенной разницы нет.
Дополнительные материалы к этой статье можно найти по адресу http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1.
Это статья с открытым доступом, распространяемая на условиях некоммерческой лицензии Creative Commons с указанием авторства, которая разрешает использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что использование не преследует коммерческих целей и предполагается, что оригинал работа правильная.Ссылка.
Примечание. Мы просим вас указать адрес электронной почты только для того, чтобы человек, которого вы рекомендуете на странице, знал, что вы хотите, чтобы он увидел это письмо, и что это письмо не является спамом.Мы не будем захватывать адреса электронной почты.
Этот вопрос используется для проверки того, являетесь ли вы посетителем-человеком, и для предотвращения автоматической рассылки спама.
Чхве Гён Мин, О Ён Чан, Пак Чжун Джун, Ли Джин Хёк, Ким Хён Чхоль, Ли Кён Мун, Ли Чан Гю, Ли Ён Тэк, Ли Сон Ук, Чон Моруи
Антибактериальные и иммунные покрытия ортопедических имплантатов могут уменьшить инфекции и иммунные реакции, вызванные инфекциями.
Чхве Гён Мин, О Ён Чан, Пак Чжун Джун, Ли Джин Хёк, Ким Хён Чхоль, Ли Кён Мун, Ли Чан Гю, Ли Ён Тэк, Ли Сон Ук, Чон Моруи
Антибактериальные и иммунные покрытия ортопедических имплантатов могут уменьшить инфекции и иммунные реакции, вызванные инфекциями.
©2021 Американская ассоциация содействия развитию науки.все права защищены.AAAS является партнером HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef и COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.