Pro pacienty podstupující operaci ortopedického implantátu byly bakteriální infekce a infekcí vyvolané imunitní reakce vždy život ohrožujícími riziky.Konvenční biologické materiály jsou náchylné k biologické kontaminaci, která způsobí, že bakterie napadnou poraněnou oblast a způsobí pooperační infekci.Proto existuje naléhavá potřeba vyvinout antiinfekční a imunitní únikové povlaky pro ortopedické implantáty.Zde jsme vyvinuli pokročilou technologii povrchové úpravy pro ortopedické implantáty nazvanou Lubricated Orthopedic Implant Surface (LOIS), která je inspirována hladkým povrchem láčkovek.LOIS má dlouhotrvající a silnou odpudivost tekutin vůči různým tekutinám a biologickým látkám (včetně buněk, bílkovin, vápníku a bakterií).Kromě toho jsme potvrdili mechanickou odolnost proti poškrábání a fixační sílu simulací nevyhnutelného poškození během in vitro operace.Model zánětlivé zlomeniny stehenní kosti králičí kostní dřeně byl použit k důkladnému studiu antibiologického škálování a protiinfekční schopnosti LOIS.Představujeme si, že LOIS, který má vlastnosti proti biologickému znečištění a mechanickou odolnost, je krokem vpřed v ortopedické chirurgii bez infekce.
V dnešní době se v důsledku celkového stárnutí výrazně zvýšil počet pacientů trpících ortopedickými onemocněními (jako jsou zlomeniny ve stáří, degenerativní onemocnění kloubů, osteoporóza) (1, 2).Zdravotnická zařízení proto přikládají velký význam ortopedické chirurgii, včetně ortopedických implantátů šroubů, dlahy, hřebů a umělých kloubů (3, 4).Bylo však popsáno, že tradiční ortopedické implantáty jsou citlivé na bakteriální adhezi a tvorbu biofilmu, což může po operaci způsobit infekci chirurgického místa (SSI) (5, 6).Jakmile se biofilm vytvoří na povrchu ortopedického implantátu, je odstranění biofilmu extrémně obtížné i při použití velkých dávek antibiotik.Proto obvykle vede k těžkým pooperačním infekcím (7, 8).Vzhledem k výše uvedeným problémům by léčba infikovaných implantátů měla zahrnovat reoperaci včetně odstranění všech implantátů a okolních tkání;proto bude pacient trpět silnou bolestí a určitými riziky (9, 10).
K vyřešení některých z těchto problémů byly vyvinuty ortopedické implantáty uvolňující léky, aby se zabránilo infekci eliminací bakterií připojených k povrchu (11, 12).Strategie však stále vykazuje několik omezení.Bylo hlášeno, že dlouhodobá implantace implantátů uvolňujících léky způsobila poškození okolních tkání a způsobila zánět, který může vést k nekróze (13, 14).Kromě toho organická rozpouštědla, která mohou existovat po výrobním procesu ortopedických implantátů uvolňujících léčiva, která jsou přísně zakázána americkým Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv, vyžadují další purifikační kroky, aby splňovaly jeho normy (15).Implantáty uvolňující léčivo jsou náročné pro řízené uvolňování léčiv a vzhledem k jejich omezenému obsahu léčiva není dlouhodobá aplikace léčiva proveditelná (16).
Další běžnou strategií je potažení implantátu antivegetativním polymerem, aby se zabránilo ulpívání biologické hmoty a bakterií na povrchu (17).Například zwitteriontové polymery přitahovaly pozornost díky svým neadhezivním vlastnostem při kontaktu s plazmatickými proteiny, buňkami a bakteriemi.Má však určitá omezení související s dlouhodobou stabilitou a mechanickou odolností, která brání jeho praktickému použití v ortopedických implantátech, zejména z důvodu mechanického škrábání při chirurgických zákrocích (18, 19).Kromě toho, kvůli své vysoké biokompatibilitě, nedostatku potřeby chirurgického odstranění a vlastnostem čištění povrchu prostřednictvím koroze, byly použity ortopedické implantáty vyrobené z biologicky rozložitelných materiálů (20, 21).Při korozi se chemické vazby mezi polymerní matricí rozruší a oddělí od povrchu a přilnavé látky povrch čistí.Antibiologické znečištění povrchovým čištěním je však účinné v krátké době.Většina absorbovatelných materiálů včetně kopolymeru kyseliny mléčné a kyseliny glykolové (PLGA), kyseliny polymléčné (PLA) a slitin na bázi hořčíku navíc podléhá nerovnoměrnému biologickému rozkladu a erozi v těle, což negativně ovlivní mechanickou stabilitu.(dvacet dva).Biodegradabilní fragmenty destiček navíc poskytují místo pro uchycení bakterií, což z dlouhodobého hlediska zvyšuje možnost infekce.Toto riziko mechanické degradace a infekce omezuje praktickou aplikaci plastické chirurgie (23).
Superhydrofobní (SHP) povrchy, které napodobují hierarchickou strukturu lotosových listů, se staly potenciálním řešením povrchů proti znečištění (24, 25).Když je povrch SHP ponořen do kapaliny, vzduchové bubliny se zachytí, čímž se vytvoří vzduchové kapsy a zabrání se ulpívání bakterií (26).Nedávné studie však ukázaly, že povrch SHP má nevýhody související s mechanickou odolností a dlouhodobou stabilitou, což brání jeho použití v lékařských implantátech.Kromě toho se vzduchové kapsy rozpustí a ztratí své vlastnosti proti usazování, což vede k širší adhezi bakterií díky velké ploše povrchu SHP (27, 28).Nedávno Aizenberg a kolegové představili inovativní metodu povrchové úpravy proti biologickému znečištění vyvinutím hladkého povrchu inspirovaného láčkovkou Nepenthes (29, 30).Hladký povrch vykazuje dlouhodobou stabilitu v hydraulických podmínkách, je extrémně tekutý odpuzující biologické kapaliny a má samoopravné vlastnosti.Neexistuje však ani způsob, jak aplikovat povlak na lékařský implantát složitého tvaru, ani není prokázáno, že by podporoval proces hojení poškozené tkáně po implantaci.
Zde představujeme lubrikovaný povrch ortopedického implantátu (LOIS), mikro/nanostrukturovaný povrch ortopedického implantátu a těsně spojený s tenkou lubrikační vrstvou, aby se zabránilo jeho spojení s plastickou chirurgií Bakteriální infekce, jako je fixace zlomeniny.Vzhledem k tomu, že fluorem funkcionalizovaná mikro/nano-struktura pevně fixuje mazivo na struktuře, vyvinutý LOIS může plně odpuzovat přilnavost různých kapalin a udržovat anti-vegetativní výkon po dlouhou dobu.Povlaky LOIS lze aplikovat na materiály různých tvarů určené pro syntézu kostí.Vynikající antibioznečišťující vlastnosti LOIS proti biofilmovým bakteriím [Pseudomonas aeruginosa a methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA)] a biologickým látkám (buňky, proteiny a vápník) byly potvrzeny in vitro.Míra přilnavosti rozsáhlé přilnavosti k podkladu je menší než 1 %.Navíc i po mechanickém namáhání, jako je poškrábání povrchu, samoléčení způsobené penetračním mazivem pomáhá udržovat jeho vlastnosti proti usazování.Výsledky zkoušek mechanické odolnosti ukazují, že ani po konstrukční a chemické úpravě nedojde k výraznému snížení celkové pevnosti.Kromě toho byl proveden in vitro experiment, který simuluje mechanické namáhání v chirurgickém prostředí, aby se prokázalo, že LOIS dokáže odolat různým mechanickým namáháním, ke kterým dochází během plastické chirurgie.Nakonec jsme použili králičí model zlomeniny stehenní kosti in vivo, který prokázal, že LOIS má vynikající antibakteriální vlastnosti a biokompatibilitu.Radiologické a histologické výsledky potvrdily, že stabilní lubrikační vlastnosti a vlastnosti proti biologickému znečištění během 4 týdnů po implantaci mohou dosáhnout účinného protiinfekčního a imunitního úniku bez zpomalení procesu hojení kosti.
Obrázek 1A ukazuje schematický diagram vyvinutého LOIS, kterému jsou implantovány mikro/nano-struktury v modelu zlomeniny králičího femuru, aby se potvrdily jeho vynikající vlastnosti proti biologickému znečištění a proti infekci.Biomimetická metoda se provádí za účelem simulace povrchu rostliny v květináči a pro zabránění biologickému znečištění začleněním lubrikační vrstvy do mikro/nano struktury povrchu.Povrch vstřikovaný lubrikantem může minimalizovat kontakt mezi biologickými látkami a povrchem.Díky vytvoření stabilních chemických vazeb na povrchu má proto vynikající antivegetativní vlastnosti a dlouhodobou stabilitu.V důsledku toho umožňují vlastnosti mazacího povrchu proti biologickému znečištění různé praktické aplikace v biomedicínském výzkumu.Rozsáhlý výzkum toho, jak tento speciální povrch interaguje v těle, však ještě nebyl dokončen.Srovnáním LOIS s nahými substráty in vitro pomocí albuminu a biofilmových bakterií lze potvrdit nepřilnavost LOIS (obrázek 1B).Navíc odvalováním kapiček vody na nakloněný holý substrát a substrát LOIS (obrázek S1 a film S1) lze prokázat účinnost biologické kontaminace.Jak ukazuje snímek fluorescenčního mikroskopu, exponovaný substrát inkubovaný v suspenzi proteinu a bakterií vykazoval velké množství biologického materiálu ulpívajícího na povrchu.Díky svým vynikajícím vlastnostem proti biologickému znečištění však LOIS téměř nevykazuje žádnou fluorescenci.Aby se potvrdily jeho vlastnosti proti biologickému znečištění a proti infekci, byl LOIS aplikován na povrch ortopedických implantátů pro syntézu kosti (dlahy a šrouby) a umístěn do modelu zlomeniny králíka.Před implantací byly nahý ortopedický implantát a LOIS inkubovány v bakteriální suspenzi po dobu 12 hodin.Předinkubace zajišťuje, že se na povrchu exponovaného implantátu vytvoří biofilm pro srovnání.Obrázek 1C ukazuje fotografii místa zlomeniny 4 týdny po implantaci.Vlevo králík s holým ortopedickým implantátem vykazoval závažný stupeň zánětu v důsledku tvorby biofilmu na povrchu implantátu.Opačný výsledek byl pozorován u králíků s implantovaným LOIS, to znamená, že okolní tkáně LOIS nevykazovaly ani známky infekce, ani známky zánětu.Kromě toho optický obraz vlevo ukazuje chirurgické místo králíka s exponovaným implantátem, což ukazuje, že na povrchu LOIS nebylo nalezeno více adheziv přítomných na povrchu exponovaného implantátu.To ukazuje, že LOIS má dlouhodobou stabilitu a má schopnost zachovat si své antibiologické znečištění a antiadhezní vlastnosti.
(A) Schematický diagram LOIS a jeho implantace do modelu zlomeniny stehenní kosti králíka.(B) Snímek proteinového a bakteriálního biofilmu na holém povrchu a substrátu LOIS z fluorescenční mikroskopie.4 týdny po implantaci (C) fotografický snímek místa zlomeniny a (D) rentgenový snímek (zvýrazněný červeným obdélníkem).Obrázek s laskavým svolením: Kyomin Chae, Univerzita Yonsei.
Sterilizovaní, vystavení negativně implantovaní králíci vykazovali normální proces hojení kostí bez jakýchkoli známek zánětu nebo infekce.Na druhé straně implantáty SHP preinkubované v bakteriální suspenzi vykazují zánět související s infekcí na okolních tkáních.To lze přičíst jeho neschopnosti dlouhodobě inhibovat adhezi bakterií (obrázek S2).Aby se prokázalo, že LOIS neovlivňuje proces hojení, ale inhibuje možné infekce související s implantací, byly porovnány rentgenové snímky exponované pozitivní matrice a LOIS v místě zlomeniny (obrázek 1D).Rentgenový snímek holého pozitivního implantátu ukázal přetrvávající linie osteolýzy, což naznačuje, že kost nebyla zcela zhojena.To naznačuje, že proces obnovy kosti může být značně zpožděn v důsledku zánětu souvisejícího s infekcí.Naopak se ukázalo, že králíci s implantovaným LOIS se uzdravili a nevykazovali žádné zjevné místo zlomeniny.
Aby bylo možné vyvinout lékařské implantáty s dlouhodobou stabilitou a funkčností (včetně odolnosti vůči biologickému znečištění), bylo vynaloženo mnoho úsilí.Přítomnost různých biologických látek a dynamika tkáňové adheze však omezuje vývoj jejich klinicky spolehlivých metod.Abychom tyto nedostatky překonali, vyvinuli jsme mikro/nano vrstvenou strukturu a chemicky upravený povrch, který je díky vysoké kapilární síle a chemické afinitě optimalizován tak, aby udržel co nejhladší mazivo v co největší míře.Obrázek 2A ukazuje celkový výrobní proces LOIS.Nejprve připravte substrát z nerezové oceli (SS) 304 pro lékařské účely.Za druhé, mikro/nano struktura je vytvořena na SS substrátu chemickým leptáním pomocí roztoku kyseliny fluorovodíkové (HF).Pro obnovení korozní odolnosti SS se ke zpracování leptaného substrátu používá roztok kyseliny dusičné (HNO3) (31).Pasivace zvyšuje odolnost SS substrátu proti korozi a výrazně zpomaluje proces koroze, který může snížit celkový výkon LOIS.Poté, vytvořením samonosné monovrstvy (SAM) s 1H, 1H, 2H, 2H-perfluoroktyltriethoxysilanem (POTS), je povrch chemicky modifikován, aby se zlepšila chemická interakce mezi povrchem a hladkým mazivem Affinity.Úprava povrchu výrazně snižuje povrchovou energii vyrobeného mikro/nano-strukturovaného povrchu, která odpovídá povrchové energii hladkého maziva.To umožňuje úplné smáčení maziva, čímž se na povrchu vytvoří stabilní vrstva maziva.Upravený povrch vykazuje zvýšenou hydrofobnost.Výsledky ukazují, že kluzné mazivo vykazuje stabilní chování na LOIS díky vysoké chemické afinitě a kapilární síle způsobené mikro/nano strukturou (32, 33).Byly studovány optické změny na povrchu SS po povrchové úpravě a nástřiku maziva.Mikro/nano vrstvená struktura vytvořená na povrchu může způsobit vizuální změny a ztmavit povrch.Tento jev je připisován zvýšenému efektu rozptylu světla na drsném povrchu, který zvyšuje difúzní odraz způsobený mechanismem zachycování světla (34).Navíc po vstříknutí lubrikantu LOIS ztmavne.Mazací vrstva způsobuje, že se od substrátu odráží méně světla, čímž dochází ke ztmavení LOIS.Aby se optimalizovala mikrostruktura/nanostruktura tak, aby vykazovala nejmenší úhel skluzu (SA) pro dosažení účinnosti proti biologickému znečištění, byly použity rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) a atomové páry k provedení různých časů HF leptání (0, 3)., 15 a 60 minut) Silový mikroskop (AFM) (obrázek 2B).Snímky SEM a AFM ukazují, že po krátké době leptání (3 minuty leptání) má holý substrát nerovnoměrnou drsnost v nanoměřítku.Drsnost povrchu se mění s dobou leptání (obrázek S3).Časově proměnná křivka ukazuje, že drsnost povrchu se stále zvyšuje a dosahuje vrcholu po 15 minutách leptání, a poté je pozorován pouze mírný pokles hodnoty drsnosti po 30 minutách leptání.V tomto bodě je drsnost na nanoúrovni odleptána, zatímco drsnost na mikroúrovni se prudce vyvíjí, takže změna drsnosti je stabilnější.Po leptání déle než 30 minut je pozorováno další zvýšení drsnosti, které je podrobně vysvětleno následovně: SS se skládá z oceli, legované prvky včetně železa, chrómu, niklu, molybdenu a mnoha dalších prvků.Mezi těmito prvky hrají důležitou roli železo, chrom a molybden při vytváření mikronové/nanoúrovňové drsnosti na SS pomocí HF leptání.V raných stádiích koroze dochází hlavně ke korozi železa a chrómu, protože molybden má vyšší odolnost proti korozi než molybden.Jak leptání postupuje, leptací roztok dosahuje místního přesycení, tvoří se fluoridy a oxidy způsobené leptáním.Fluorid a oxid se vysrážejí a nakonec se znovu ukládají na povrchu a vytvářejí drsnost povrchu v rozsahu mikronů/nano (31).Tato drsnost na mikro/nano úrovni hraje důležitou roli v samoopravných vlastnostech LOIS.Povrch se dvěma stupnicemi vytváří synergický efekt a výrazně zvyšuje kapilární sílu.Tento jev umožňuje lubrikantu stabilně pronikat povrchem a přispívá k samoléčivým vlastnostem (35).Vznik drsnosti závisí na době leptání.Po 10 minutách leptání obsahuje povrch pouze drsnost v nanoměřítku, která nestačí k udržení dostatečného množství maziva, aby byla odolná vůči biologickému znečištění (36).Na druhou stranu, pokud doba leptání přesáhne 30 minut, nanometrová drsnost vzniklá redepozicí železa a chromu zmizí a zůstane pouze mikrorovinková drsnost způsobená molybdenem.Přeleptaný povrch postrádá drsnost v nanoměřítku a ztrácí synergický efekt dvoustupňové drsnosti, což negativně ovlivňuje samoopravné vlastnosti LOIS.SA měření byla provedena na substrátech s různými dobami leptání, aby se prokázala účinnost proti zanášení.Na základě viskozity a povrchové energie byly vybrány různé typy kapalin, včetně deionizované (DI) vody, krve, ethylenglykolu (EG), ethanolu (EtOH) a hexadekanu (HD) (obrázek S4).Časově se měnící vzor leptání ukazuje, že pro různé kapaliny s různými povrchovými energiemi a viskozitami je SA LOIS po 15 minutách leptání nejnižší.Proto je LOIS optimalizován tak, aby leptal po dobu 15 minut, aby se vytvořila mikronová a nanoúrovňová drsnost, která je vhodná pro efektivní zachování trvanlivosti maziva a vynikajících vlastností proti usazování.
(A) Schematický diagram čtyřfázového výrobního procesu LOIS.Vložka ukazuje SAM vytvořený na substrátu.(B) SEM a AFM snímky, používané k optimalizaci mikro/nano struktury substrátu při různých dobách leptání.Rentgenová fotoelektronová spektroskopie (XPS) spektra (C) Cr2p a (D) F1s po povrchové pasivaci a potažení SAM.au, libovolná jednotka.(E) Reprezentativní snímky vodních kapiček na holých, leptaných, SHP a LOIS substrátech.(F) Kontaktní úhel (CA) a SA měření kapalin s různým povrchovým napětím na SHP a LOIS.Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD.
Poté, aby se potvrdila změna chemických vlastností povrchu, byla použita rentgenová fotoelektronová spektroskopie (XPS) ke studiu změny chemického složení povrchu substrátu po každém nátěru povrchu.Obrázek 2C ukazuje výsledky měření XPS HF leptaného povrchu a povrchu ošetřeného HN03.Dva hlavní píky při 587,3 a 577,7 eV lze připsat vazbě Cr-O existující ve vrstvě oxidu chrómu, což je hlavní rozdíl od HF leptaného povrchu.Je to dáno především spotřebou železa a fluoridu chromitého na povrchu HNO3.Leptání na bázi HNO3 umožňuje chromu vytvořit na povrchu pasivační oxidovou vrstvu, díky které je leptaný SS opět odolný vůči korozi.Na obrázku 2D byla získána spektra XPS, aby se potvrdilo, že se na povrchu po potažení SAM vytvořil silan na bázi fluorovaných uhlovodíků, který má extrémně vysokou odpuzování kapalin i pro EG, krev a EtOH.Povlak SAM je dokončen reakcí silanových funkčních skupin s hydroxylovými skupinami vytvořenými plazmovým zpracováním.V důsledku toho bylo pozorováno významné zvýšení píku CF2 a CF3.Vazebná energie mezi 286 a 296 eV ukazuje, že chemická modifikace byla úspěšně dokončena povlakem SAM.SHP vykazuje relativně velké píky CF2 (290,1 eV) a CF3 (293,3 eV), které jsou způsobeny silanem na bázi fluorovaných uhlovodíků vytvořeným na povrchu.Obrázek 2E ukazuje reprezentativní optické obrazy měření kontaktního úhlu (CA) pro různé skupiny deionizované vody v kontaktu s holou, leptanou, SHP a LOIS.Tyto snímky ukazují, že leptaný povrch se stává hydrofilním díky mikro/nano struktuře vytvořené chemickým leptáním, takže deionizovaná voda je absorbována do struktury.Když je však substrát potažen SAM, substrát vykazuje silnou vodoodpudivost, takže se vytvoří povrchový SHP a kontaktní plocha mezi vodou a povrchem je malá.Nakonec byl u LOIS pozorován pokles CA, který lze přičíst pronikání maziva do mikrostruktury, čímž se zvětšuje kontaktní plocha.Aby se prokázalo, že povrch má vynikající odpudivost kapalin a neadhezivní vlastnosti, byl LOIS porovnán se substrátem SHP měřením CA a SA pomocí různých kapalin (obrázek 2F).Na základě viskozity a povrchové energie byly vybrány různé typy kapalin, včetně deionizované vody, krve, EG, EtOH a HD (obrázek S4).Výsledky měření CA ukazují, že když CA má tendenci k HD, je hodnota redukce CA, kde CA má nejnižší povrchovou energii.Kromě toho je LOIS celkové CA nízká.Měření SA však ukazuje zcela jiný jev.Kromě ionizované vody všechny kapaliny ulpívají na substrátu SHP bez sklouznutí.Na druhou stranu, LOIS vykazuje velmi nízkou SA, kdy když je veškerá kapalina nakloněna pod úhlem menším než 10° až 15°, veškerá kapalina se odvaluje.To silně ukazuje, že nepřilnavost LOIS je lepší než u povrchu SHP.Kromě toho jsou povlaky LOIS také aplikovány na různé typy materiálů, včetně titanu (Ti), polyfenylsulfonu (PPSU), polyoxymethylenu (POM), polyetheretherketonu (PEEK) a bioabsorbovatelných polymerů (PLGA), jsou to implantovatelné ortopedické materiály (obr. S5)).Sekvenční snímky kapiček na materiálu ošetřeném LOIS ukazují, že vlastnosti LOIS proti biologickému znečištění jsou stejné na všech substrátech.Výsledky měření CA a SA navíc ukazují, že neadhezivní vlastnosti LOIS lze aplikovat i na jiné materiály.
Aby se potvrdily vlastnosti LOIS proti usazování, byly různé typy substrátů (včetně holých, leptaných, SHP a LOIS) inkubovány s Pseudomonas aeruginosa a MRSA.Tyto dvě bakterie byly vybrány jako reprezentativní nemocniční bakterie, které mohou vést k tvorbě biofilmů vedoucích k SSI (37).Obrázek 3 (A a B) ukazuje snímky fluorescenčního mikroskopu a výsledky měření jednotky tvořící kolonie (CFU) substrátů inkubovaných v bakteriální suspenzi krátkodobě (12 hodin), respektive dlouhodobě (72 hodin).Bakterie během krátké doby vytvoří shluky a zvětší se, pokrývají se látkami podobnými hlenu a brání jejich odstranění.Během 72hodinové inkubace však bakterie dozrají a snadno se rozptýlí, aby vytvořily více kolonií nebo shluků.Lze tedy uvažovat, že 72hodinová inkubace je dlouhodobá a je vhodnou inkubační dobou pro vytvoření silného biofilmu na povrchu (38).V krátké době vykazoval leptaný povrch a povrch SHP bakteriální adhezi, která byla snížena o cca 25 % až 50 % ve srovnání s holým substrátem.Nicméně, vzhledem ke svému vynikajícímu výkonu a stabilitě proti biologickému znečištění, LOIS nevykazoval adhezi bakteriálního biofilmu v krátkodobém a dlouhodobém horizontu.Schematický diagram (obrázek 3C) popisuje vysvětlení mechanismu proti biologickému znečištění leptacího roztoku, SHP a LOIS.Předpokladem je, že leptaný substrát s hydrofilními vlastnostmi bude mít větší povrch než holý substrát.Na leptaném substrátu tedy bude docházet k většímu ulpívání bakterií.Avšak ve srovnání s holým substrátem má leptaný substrát výrazně méně vytvořeného biofilmu na povrchu.Je to proto, že molekuly vody se pevně vážou na hydrofilní povrch a působí jako lubrikant vody, čímž krátkodobě narušují adhezi bakterií (39).Vrstva molekul vody je však velmi tenká a rozpustná v bakteriálních suspenzích.Proto molekulární vrstva vody na dlouhou dobu mizí, což vede k rozsáhlé adhezi a proliferaci bakterií.U SHP je díky svým krátkodobým nesmáčivým vlastnostem inhibována adheze bakterií.Sníženou bakteriální adhezi lze přičíst vzduchovým kapsám zachyceným ve vrstvené struktuře a nižší povrchové energii, čímž se minimalizuje kontakt mezi bakteriální suspenzí a povrchem.U SHP však byla pozorována rozsáhlá bakteriální adheze, protože na dlouhou dobu ztratila své vlastnosti proti usazování.Je to způsobeno především mizením vzduchových kapes vlivem hydrostatického tlaku a rozpouštěním vzduchu ve vodě.Je to způsobeno především vymizením vzduchových kapes v důsledku rozpuštění a vrstvené struktury, která poskytuje větší plochu pro adhezi (27, 40).Na rozdíl od těchto dvou substrátů, které mají důležitý vliv na dlouhodobou stabilitu, je lubrikační lubrikant obsažený v LOIS vstřikován do mikro/nano struktury a nezmizí ani v dlouhodobém horizontu.Maziva plněná mikro/nano strukturami jsou velmi stabilní a jsou silně přitahována k povrchu díky své vysoké chemické afinitě, čímž zabraňují ulpívání bakterií na dlouhou dobu.Obrázek S6 ukazuje snímek z reflexního konfokálního mikroskopu substrátu napuštěného lubrikantem ponořeného do fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS).Nepřetržité snímky ukazují, že i po 120 hodinách mírného protřepávání (120 otáček za minutu) zůstává vrstva maziva na LOIS nezměněna, což ukazuje na dlouhodobou stabilitu za podmínek proudění.To je způsobeno vysokou chemickou afinitou mezi povlakem SAM na bázi fluoru a lubrikantem na bázi perfluorokarbonu, takže lze vytvořit stabilní vrstvu lubrikantu.Proto je zachována odolnost proti znečištění.Kromě toho byl substrát testován proti reprezentativním proteinům (albumin a fibrinogen), které jsou v plazmě, buňkám úzce souvisejícím s imunitní funkcí (makrofágy a fibroblasty) a proteinům souvisejícím s tvorbou kostí.Obsah vápníku je velmi vysoký.(Obrázek 3D, 1 a 2 a Obrázek S7) (41, 42).Kromě toho snímky z fluorescenčního mikroskopu adhezního testu pro fibrinogen, albumin a vápník ukázaly různé adhezní charakteristiky každé skupiny substrátů (obrázek S8).Během tvorby kosti mohou nově vytvořené kostní a vápníkové vrstvy obklopovat ortopedický implantát, což nejen znesnadňuje odstranění, ale může také způsobit neočekávané poškození pacienta během procesu odstranění.Nízké hladiny vápníku na kostních destičkách a šroubech jsou proto výhodné pro ortopedické operace, které vyžadují odstranění implantátu.Na základě kvantifikace připojené oblasti na základě intenzity fluorescence a počtu buněk jsme potvrdili, že LOIS vykazuje vynikající vlastnosti proti biologickému znečištění pro všechny biologické látky ve srovnání s jinými substráty.Podle výsledků in vitro experimentů lze antibiologické znečištění LOIS aplikovat na ortopedické implantáty, které dokážou nejen inhibovat infekce způsobené biofilmovými bakteriemi, ale také redukovat záněty způsobené aktivním imunitním systémem těla.
(A) Obrázky z fluorescenčního mikroskopu každé skupiny (nahé, leptané, SHP a LOIS) inkubované v suspenzích Pseudomonas aeruginosa a MRSA po dobu 12 a 72 hodin.(B) Počet adherentních CFU Pseudomonas aeruginosa a MRSA na povrchu každé skupiny.(C) Schematický diagram mechanismu antibiologického znečištění krátkodobého a dlouhodobého leptání, SHP a LOIS.(D) (1) Počet fibroblastů přilnutých ke každému substrátu a snímky buněk přilnutých fluorescenčním mikroskopem k holé a LOIS.(2) Test adheze imunologicky podmíněných proteinů, albuminu a vápníku zapojených do procesu hojení kostí (* P < 0,05, ** P < 0,01, *** P < 0,001 a **** P < 0,0001).ns, není důležité.
V případě nevyhnutelných koncentrovaných namáhání byla mechanická odolnost vždy hlavní výzvou pro aplikaci antivegetativních nátěrů.Tradiční gelové metody proti splaškové vodě jsou založeny na polymerech s nízkou rozpustností ve vodě a křehkostí.Proto jsou obvykle náchylné k mechanickému namáhání v biomedicínských aplikacích.Proto mechanicky odolné antifoulingové povlaky zůstávají výzvou pro aplikace, jako jsou ortopedické implantáty (43, 44).Obrázek 4A(1) ukazuje dva hlavní typy namáhání aplikovaného na ortopedické implantáty, včetně poškrábání (smykové napětí) a stlačení s optickým obrazem poškozeného implantátu vytvořeným kleštěmi.Například, když je šroub utažen šroubovákem nebo když chirurg pevně drží kostní dlahu pinzetou a vyvíjí tlakovou sílu, dojde k poškození a poškrábání plastové kostní dlahy na makro i mikro/nano měřítku (obrázek 4A, 2).Aby bylo možné otestovat, zda vyrobený LOIS odolá těmto poškozením během plastické chirurgie, byla provedena nanoindentace, aby se porovnala tvrdost holého substrátu a LOIS na mikro/nano měřítku, aby se studovaly mechanické vlastnosti mikro/nano struktury Impact (obr. 4B).Schematický diagram ukazuje odlišné deformační chování LOIS v důsledku přítomnosti mikro/nano struktur.Na základě výsledků nanoindentace byla nakreslena křivka síla-posunutí (obrázek 4C).Modrý obrázek představuje holý substrát, který vykazuje pouze mírnou deformaci, jak je patrné z maximální hloubky vtisku 0,26 μm.Na druhou stranu postupné zvyšování nanoindentační síly a posunu pozorované v LOIS (červená křivka) může vykazovat známky snížených mechanických vlastností, což vede k hloubce nanoindentace 1,61 μm.Je to proto, že mikro/nano struktura přítomná v LOIS poskytuje hlubší prostor pro posun hrotu nanoindentoru, takže jeho deformace je větší než deformace holého substrátu.Konsta-Gdoutos a kol.(45) se domnívá, že v důsledku přítomnosti nanostruktur vede nanoindentace a mikro/nano drsnost k nepravidelným nanoindentačním křivkám.Stínovaná oblast odpovídá nepravidelné deformační křivce přisuzované nanostrukturě, zatímco nestínovaná oblast je připisována mikrostruktuře.Tato deformace může poškodit mikrostrukturu/nanostrukturu přidržovacího maziva a negativně ovlivnit jeho odolnost proti zanášení.Aby bylo možné studovat dopad poškození na LOIS, nevyhnutelné poškození mikro/nano struktur bylo replikováno v těle během plastické chirurgie.Pomocí testů adheze krve a proteinů lze určit stabilitu vlastností LOIS proti biologickému znečištění po in vitro (obrázek 4D).Série optických snímků ukazuje poškození, ke kterému došlo v blízkosti otvorů každého substrátu.Byl proveden krevní test přilnavosti, aby se prokázal účinek mechanického poškození na povlak proti biologickému znečištění (obrázek 4E).Stejně jako SHP se vlastnosti proti usazování ztrácejí v důsledku poškození a LOIS vykazuje vynikající vlastnosti proti usazování tím, že odpuzuje krev.Je tomu tak proto, že povrchová energie je poháněna kapilárním působením pokrývajícím poškozenou oblast, tok v mikrostrukturovaném lubrikačním lubrikantu obnovuje vlastnosti proti usazování (35).Stejný trend byl pozorován v testu adheze proteinu s použitím albuminu.V poškozené oblasti je adheze proteinu na povrchu SHP široce pozorována a měřením jejího plošného pokrytí ji lze kvantifikovat jako polovinu úrovně adheze holého substrátu.Na druhé straně si LOIS zachoval své vlastnosti proti biologickému znečištění, aniž by způsobil adhezi (obrázek 4, F a G).Kromě toho je povrch šroubu často vystaven silnému mechanickému namáhání, jako je vrtání, takže jsme studovali schopnost povlaku LOIS zůstat na šroubu in vitro neporušený.Obrázek 4H ukazuje optické obrazy různých šroubů, včetně holých, SHP a LOIS.Červený obdélník představuje cílovou oblast, kde dochází k silnému mechanickému namáhání během implantace kosti.Podobně jako u testu adheze proteinu na destičce se k zobrazení adheze proteinu a měření oblasti pokrytí používá fluorescenční mikroskop, aby se prokázala integrita povlaku LOIS, a to i při silném mechanickém namáhání (obrázek 4, I a J).Šrouby ošetřené LOIS vykazují vynikající účinnost proti znečištění a téměř žádný protein neulpívá na povrchu.Na druhé straně byla adheze proteinu pozorována u holých šroubů a šroubů SHP, kde plošné pokrytí šroubů SHP bylo třetinové ve srovnání s holých šroubů.Kromě toho musí být ortopedický implantát použitý k fixaci mechanicky pevný, aby vydržel namáhání působící na místo zlomeniny, jak je znázorněno na obrázku 4K.Proto byla provedena zkouška ohybem, aby se zjistil vliv chemické modifikace na mechanické vlastnosti.Navíc se to dělá pro udržení fixního napětí z implantátu.Aplikujte vertikální mechanickou sílu, dokud nebude implantát zcela složen a nezískáte křivku napětí-deformace (obrázek 4L, 1).Dvě vlastnosti včetně Youngova modulu a pevnosti v ohybu byly porovnány mezi holými a LOIS substráty jako indikátory jejich mechanické pevnosti (obrázek 4L, 2 a 3).Youngův modul udává schopnost materiálu odolávat mechanickým změnám.Youngův modul každého substrátu je 41,48±1,01 a 40,06±0,96 GPa;pozorovaný rozdíl je asi 3,4 %.Kromě toho se uvádí, že pevnost v ohybu, která určuje houževnatost materiálu, je 102,34±1,51 GPa pro holý substrát a 96,99±0,86 GPa pro SHP.Holý substrát je přibližně o 5,3 % vyšší.Mírné snížení mechanických vlastností může být způsobeno vrubovým efektem.Při vrubovém efektu může mikro/nano drsnost působit jako soubor vrubů, což vede k místní koncentraci napětí a ovlivňuje mechanické vlastnosti implantátu (46).Nicméně na základě skutečnosti, že tuhost lidské kortikální kosti je uváděna mezi 7,4 a 31,6 GPa a naměřený modul LOIS převyšuje modul lidské kortikální kosti (47), je LOIS dostatečná k podpoře zlomeniny a jejího celkového mechanické vlastnosti jsou minimálně ovlivněny úpravou povrchu.
(A) Schematický diagram (1) mechanického namáhání působícího na ortopedický implantát během operace a (2) optický obraz poškozeného ortopedického implantátu.(B) Schematický diagram měření nano-mechanických vlastností pomocí nanoindentace a LOIS na holém povrchu.(C) Nanoindentační křivka síla-posunutí holého povrchu a LOIS.(D) Po experimentech in vitro simulujte optické obrazy různých typů ortopedických dlahy (poškozená oblast je zvýrazněna červeným obdélníkem), abyste simulovali mechanické namáhání způsobené během operace.(E) Krevní test adheze a (F) test proteinové adheze skupiny poškozené ortopedické dlahy.(G) Změřte plošné pokrytí proteinem ulpívajícím na destičce.(H) Optické snímky různých typů ortopedických šroubů po experimentu in vitro.(I) Test přilnavosti proteinů ke studiu integrity různých povlaků.(J) Změřte plošné pokrytí proteinem ulpívajícím na šroubu.(K) Pohyb králíka je určen k vytvoření pevného napětí na zlomené kosti.(L) (1) Výsledky testu ohybu a optické snímky před a po ohnutí.Rozdíl v (2) Youngově modulu a (3) pevnosti v ohybu mezi holým implantátem a SHP.Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD (*P<0,05,**P<0,01,***P<0,001 a ****P<0,0001).Obrázek s laskavým svolením: Kyomin Chae, Univerzita Yonsei.
V klinických situacích pochází většina kontaktu bakterií s biologickými materiály a místy poranění ze zralých, zralých biofilmů (48).Americké centrum pro kontrolu a prevenci nemocí proto odhaduje, že 65 % všech lidských infekcí souvisí s biofilmy (49).V tomto případě je nutné poskytnout in vivo experimentální design, který zajistí konzistentní tvorbu biofilmu na povrchu implantátu.Proto jsme vyvinuli model zlomeniny králičího femuru, ve kterém byly ortopedické implantáty předem inkubovány v bakteriální suspenzi a poté implantovány do králičích stehenních kostí, aby se studovaly vlastnosti LOIS proti usazování in vivo.Kvůli následujícím třem důležitým faktům jsou bakteriální infekce vyvolány spíše předkultivací než přímou injekcí bakteriálních suspenzí: (i) Imunitní systém králíků je přirozeně silnější než imunitní systém lidí;proto je možná injekce bakteriálních suspenzí a planktonických bakterií Nemá vliv na tvorbu biofilmů.(Ii) Planktonické bakterie jsou citlivější na antibiotika a antibiotika se obvykle používají po operaci;konečně, (iii) suspenze planktonických bakterií může být zředěna tělesnými tekutinami zvířete (50).Předkultivací implantátu v bakteriální suspenzi před implantací můžeme důkladně prostudovat škodlivé účinky bakteriální infekce a reakce na cizí těleso (FBR) na proces hojení kosti.Králíci byli utraceni 4 týdny po implantaci, protože osseointegrace nezbytná pro proces hojení kosti bude dokončena během 4 týdnů.Poté byly králíkům vyjmuty implantáty pro následné studie.Obrázek 5A ukazuje mechanismus proliferace bakterií.Infikovaný ortopedický implantát je zaveden do těla.V důsledku preinkubace v bakteriální suspenzi bylo infikováno šest ze šesti králíků s implantovanými nahými implantáty, zatímco žádný z králíků s implantovanými implantáty ošetřenými LOIS nebyl infikován.Bakteriální infekce probíhají ve třech krocích, včetně růstu, zrání a šíření (51).Nejprve se přichycené bakterie rozmnožují a rostou na povrchu a poté bakterie vytvářejí biofilm, když vylučují extracelulární polymer (EPS), amyloid a extracelulární DNA.Biofilm nejen interferuje s penetrací antibiotik, ale také podporuje akumulaci enzymů degradujících antibiotika (jako je β-laktamáza) (52).Nakonec biofilm šíří zralé bakterie do okolních tkání.Proto dochází k infekci.Navíc, když se do těla dostane cizí těleso, infekce, která může způsobit silnou imunitní odpověď, může způsobit silný zánět, bolest a snížení imunity.Obrázek 5B poskytuje přehled FBR způsobených vložením ortopedického implantátu spíše než imunitní odpověď způsobenou bakteriální infekcí.Imunitní systém rozpozná vložený implantát jako cizí těleso a poté způsobí reakci buněk a tkání tak, že cizí těleso zapouzdří (53).V počátcích FBR se na povrchu ortopedických implantátů vytvořila zásobní matrice, která měla za následek adsorpci fibrinogenu.Adsorbovaný fibrinogen pak vytváří vysoce hustou fibrinovou síť, která podporuje připojení leukocytů (54).Jakmile se vytvoří fibrinová síť, dojde k akutnímu zánětu v důsledku infiltrace neutrofilů.V tomto kroku se uvolňují různé cytokiny, jako je tumor nekrotizující faktor-a (TNF-a), interleukin-4 (IL-4) a IL-p a monocyty začnou infiltrovat do místa implantace a diferencovat se do obrovských buněk.Fág (41, 55, 56).Snížení FBR bylo vždy výzvou, protože nadměrné FBR může způsobit akutní a chronický zánět, který může vést k fatálním komplikacím.K posouzení dopadu bakteriálních infekcí na tkáně obklopující holý implantát a LOIS bylo použito barvení hematoxylinem a eosinem (H&E) a Massonovým trichromem (MT).U králíků s implantovanými holými substráty došlo k progresi závažných bakteriálních infekcí a sklíčka tkání H&E jasně vykazovala abscesy a nekrózu způsobenou zánětem.Na druhou stranu extrémně silný povrch LOIS proti biologickému znečištění inhibuje ulpívání bakterií, takže nevykazuje žádné známky infekce a snižuje zánět (obrázek 5C).Výsledky barvení MT vykazovaly stejný trend.Barvení MT však také ukázalo edém u králíků s implantovaným LOIS, což naznačuje, že brzy dojde k zotavení (obrázek 5D).Za účelem studia stupně imunitní odpovědi bylo provedeno imunohistochemické (IHC) barvení pomocí cytokinů TNF-a a IL-6 souvisejících s imunitní odpovědí.Nahý negativní implantát, který nebyl vystaven bakteriím, byl porovnán s LOIS, který byl vystaven bakteriím, ale nebyl infikován, aby se studoval proces hojení v nepřítomnosti bakteriální infekce.Obrázek 5E ukazuje optický obraz IHC sklíčka, které exprimuje TNF-a.Hnědá oblast představuje imunitní odpověď, což naznačuje, že imunitní odpověď v LOIS je mírně snížena.Kromě toho byla exprese IL-6 v LOIS významně nižší než negativní exprese sterilních nahých (obrázek 5F).Exprese cytokinu byla kvantifikována měřením oblasti barvení protilátky odpovídající cytokinu (obrázek 5G).Ve srovnání s králíky vystavenými negativním implantátům byly hladiny exprese králíků s implantovaným LOIS nižší, což ukazuje významný rozdíl.Pokles exprese cytokinů ukazuje, že dlouhodobé, stabilní vlastnosti LOIS proti usazování nesouvisí pouze s inhibicí bakteriálních infekcí, ale také se snížením FBR, které je indukováno makrofágy adherujícími na substrát (53, 57, 58).Snížená imunitní odpověď v důsledku imunitních únikových vlastností LOIS tedy může vyřešit vedlejší účinky po implantaci, jako je nadměrná imunitní odpověď po plastické operaci.
(A) Schematický diagram mechanismu tvorby a šíření biofilmu na povrchu infikovaného ortopedického implantátu.eDNA, extracelulární DNA.(B) Schematický diagram imunitní odpovědi po zavedení ortopedického implantátu.(C) H&E barvení a (D) MT barvení okolních tkání ortopedických implantátů s holým pozitivem a LOIS.IHC imunitně příbuzných cytokinů (E) TNF-a a (F) IL-6 jsou obarvené obrázky nahých negativních králíků a králíků s implantovaným LOIS.(G) Kvantifikace exprese cytokinů měřením plošného pokrytí (** P <0,01).
Biokompatibilita LOIS a jeho vliv na proces hojení kosti byly zkoumány in vivo pomocí diagnostického zobrazování [rentgenová a mikropočítačová tomografie (CT)] a osteoklastů IHC.Obrázek 6A ukazuje proces hojení kosti zahrnující tři různé fáze: zánět, opravu a remodelaci.Když dojde ke zlomenině, zánětlivé buňky a fibroblasty proniknou do zlomené kosti a začnou růst do vaskulární tkáně.Během reparační fáze se vrůstání cévní tkáně šíří v blízkosti místa zlomeniny.Cévní tkáň poskytuje živiny pro tvorbu nové kosti, která se nazývá kalus.Konečnou fází procesu hojení kosti je fáze remodelace, kdy se velikost kalusu redukuje na velikost normální kosti pomocí zvýšení hladiny aktivovaných osteoklastů (59).Trojrozměrná (3D) rekonstrukce místa zlomeniny byla provedena pomocí mikro-CT skenů, aby byly pozorovány rozdíly v úrovni tvorby kalusu v každé skupině.Sledujte příčný řez stehenní kostí a sledujte tloušťku kalusu obklopujícího zlomenou kost (obrázek 6, B a C).Rentgenové paprsky byly také používány ke zkoumání míst zlomenin u všech skupin každý týden, aby byly pozorovány různé procesy regenerace kostí v každé skupině (obrázek S9).Kalus a zralé kosti jsou zobrazeny modro/zeleně a slonovinově.Většina měkkých tkání je odfiltrována s přednastaveným prahem.Nude pozitivní a SHP potvrdily tvorbu malého množství kalusu kolem místa zlomeniny.Na druhé straně, exponovaný negativ LOIS a místo zlomeniny jsou obklopeny tlustým kalusem.Mikro-CT snímky ukázaly, že tvorbě kalusu bránila bakteriální infekce a zánět související s infekcí.Je tomu tak proto, že imunitní systém upřednostňuje hojení septických poranění způsobených zánětem souvisejícím s infekcí před obnovou kostí (60).Bylo provedeno barvení IHC a kyselou fosfatázou rezistentní na tartrát (TRAP) za účelem pozorování aktivity osteoklastů a kostní resorpce (obrázek 6D) (61).V nahých pozitivech a SHP bylo nalezeno pouze několik aktivovaných osteoklastů zbarvených do fialova.Na druhé straně bylo pozorováno mnoho aktivovaných osteoklastů v blízkosti nahých pozitivních a zralých kostí LOIS.Tento jev ukazuje, že v přítomnosti osteoklastů prochází kalus kolem místa zlomeniny násilným procesem remodelace [62].Objem kosti a oblast exprese osteoklastů kalusu byly měřeny pro srovnání úrovně tvorby kalusu kolem místa zlomeniny ve všech skupinách, aby se kvantifikovaly výsledky mikro-CT skenu a IHC (obrázek 6E, 1 a 2).Jak se očekávalo, nahé negativity a tvorba kalusu v LOIS byly významně vyšší než v ostatních skupinách, což naznačuje, že došlo k pozitivní remodelaci kosti (63).Obrázek S10 ukazuje optický obraz místa chirurgického zákroku, výsledek barvení MT tkáně odebrané v blízkosti šroubu a výsledek barvení TRAP zvýrazňující rozhraní šroub-kost.V holém substrátu byl pozorován silný kalus a tvorba fibrózy, zatímco implantát ošetřený LOIS vykazoval relativně nepřilnavý povrch.Podobně ve srovnání s nahými negativy byla pozorována nižší fibróza u králíků s implantovaným LOIS, jak je naznačeno bílými šipkami.Kromě toho lze pevný edém (modrá šipka) připsat imunitním únikovým vlastnostem LOIS, čímž se snižuje závažný zánět.Nepřilnavý povrch kolem implantátu a snížená fibróza naznačují, že proces odstranění je jednodušší, což obvykle vede k dalším zlomeninám nebo zánětu.Proces hojení kosti po odstranění šroubu byl hodnocen aktivitou osteoklastů na rozhraní šroub-kost.Jak holá kost, tak rozhraní implantátu LOIS absorbovaly podobné hladiny osteoklastů pro další hojení kosti, což naznačuje, že povlak LOIS nemá žádný negativní vliv na hojení kosti nebo imunitní odpověď.Aby se potvrdilo, že povrchová modifikace provedená na LOIS neinterferuje s procesem hojení kostí, bylo použito rentgenové vyšetření k porovnání hojení kostí králíků s exponovanými negativními ionty a 6 týdnů implantace LOIS (obrázek 6F).Výsledky ukázaly, že ve srovnání s neinfikovanou nahou pozitivní skupinou vykazoval LOIS stejný stupeň hojení kosti a nebyly žádné zjevné známky zlomeniny (kontinuální linie osteolýzy) v obou skupinách.
(A) Schematický diagram procesu hojení kosti po zlomenině.(B) Rozdíl ve stupni tvorby kalusu každé povrchové skupiny a (C) zobrazení příčného řezu místa zlomeniny.(D) Barvení TRAP pro vizualizaci aktivity osteoklastů a kostní resorpce.Na základě aktivity TRAP byla kvantitativně analyzována tvorba zevního kalusu kortikální kosti pomocí (E) (1) mikro-CT a (2) aktivity osteoklastů.(F) 6 týdnů po implantaci, rentgenové snímky zlomeniny kosti exponovaného negativu (zvýrazněno červeným přerušovaným obdélníkem) a LOIS (zvýrazněno modrým přerušovaným obdélníkem).Statistická analýza byla provedena jednocestnou analýzou rozptylu (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Stručně řečeno, LOIS poskytuje nový typ strategie antibakteriální infekce a imunitního únikového povlaku pro ortopedické implantáty.Konvenční ortopedické implantáty s funkcionalizací SHP vykazují krátkodobé vlastnosti proti biologickému znečištění, ale nemohou si své vlastnosti udržet po dlouhou dobu.Superhydrofobicita substrátu zachycuje vzduchové bubliny mezi bakteriemi a substrátem, čímž vytváří vzduchové kapsy, čímž zabraňuje bakteriální infekci.Díky difúzi vzduchu se však tyto vzduchové kapsy snadno odstraní.Na druhou stranu LOIS dobře prokázal svou schopnost předcházet infekcím souvisejícím s biofilmem.Díky antirejekčním vlastnostem lubrikační vrstvy vstřikované do vrstveného povrchu mikro/nano struktury lze tedy předejít zánětu souvisejícímu s infekcí.K optimalizaci výrobních podmínek LOIS se používají různé charakterizační metody včetně měření SEM, AFM, XPS a CA.Kromě toho lze LOIS také aplikovat na různé biologické materiály běžně používané v ortopedických fixačních zařízeních, jako jsou PLGA, Ti, PE, POM a PPSU.Poté byl LOIS testován in vitro, aby se prokázaly jeho vlastnosti proti biologickému znečištění proti bakteriím a biologickým látkám souvisejícím s imunitní odpovědí.Výsledky ukazují, že ve srovnání s holým implantátem má vynikající antibakteriální a antibioznečišťující účinky.LOIS navíc vykazuje mechanickou pevnost i po aplikaci mechanického namáhání, které je v plastické chirurgii nevyhnutelné.Díky samoléčivým vlastnostem lubrikantu na povrchu mikro/nano struktury si LOIS úspěšně zachoval své vlastnosti proti biologickému znečištění.Za účelem studia biokompatibility a antibakteriálních vlastností LOIS in vivo byl LOIS implantován do králičího femuru po dobu 4 týdnů.U králíků s implantovaným LOIS nebyla pozorována žádná bakteriální infekce.Navíc použití IHC prokázalo sníženou úroveň lokální imunitní odpovědi, což ukazuje, že LOIS neinhibuje proces hojení kostí.LOIS vykazuje vynikající antibakteriální a imunitní únikové vlastnosti a bylo prokázáno, že účinně zabraňuje tvorbě biofilmu před a během ortopedických operací, zejména pro syntézu kostí.Pomocí modelu zánětlivé zlomeniny stehenní kosti králičí kostní dřeně byl hluboce studován účinek infekcí souvisejících s biofilmem na proces hojení kosti indukovaný předinkubovanými implantáty.Jako budoucí studie je zapotřebí nový model in vivo pro studium možných infekcí po implantaci, aby bylo možné plně pochopit a zabránit infekcím souvisejícím s biofilmem během celého procesu hojení.Kromě toho je osteoindukce stále nevyřešeným problémem při integraci s LOIS.K překonání tohoto problému je zapotřebí dalšího výzkumu pro kombinaci selektivní adheze osteoindukčních buněk nebo regenerativní medicíny s LOIS.Celkově LOIS představuje slibný povlak ortopedického implantátu s mechanickou robustností a vynikajícími vlastnostmi proti biologickému znečištění, které mohou snížit vedlejší účinky SSI a imunitního systému.
Promyjte substrát 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS (Dong Kang M-Tech Co., Korea) v acetonu, EtOH a DI vodě po dobu 15 minut, abyste odstranili kontaminanty.Aby se na povrchu vytvořila mikro/nano struktura, vyčištěný substrát se ponoří do 48% až 51% roztoku HF (DUKSAN Corp., Jižní Korea) při 50 °C.Doba leptání se pohybuje od 0 do 60 minut.Poté byl leptaný substrát vyčištěn deionizovanou vodou a umístěn do 65% roztoku HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) při 50 °C po dobu 30 minut, aby se na povrchu vytvořila pasivační vrstva oxidu chromitého.Po pasivaci se substrát promyje deionizovanou vodou a vysuší, čímž se získá substrát s vrstvenou strukturou.Dále byl substrát vystaven kyslíkové plazmě (100 W, 3 minuty) a okamžitě ponořen do roztoku 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Německo) v toluenu při teplotě místnosti na 12 hodin.Poté byl substrát potažený POTS vyčištěn EtOH a žíhán při 150 °C po dobu 2 hodin, aby se získal hustý POTS SAM.Po potažení SAM se na substrátu vytvořila vrstva lubrikantu nanesením perfluorpolyetherového lubrikantu (Krytox 101; DuPont, USA) s objemem náplně 20 μm/cm 2. Před použitím lubrikant přefiltrujte přes 0,2 mikronový filtr.Odstraňte přebytečné mazivo nakláněním pod úhlem 45° po dobu 15 minut.Stejný výrobní postup byl použit pro ortopedické implantáty vyrobené z 304 SS (uzamykací dlaha a kortikální zajišťovací šroub; Dong Kang M-Tech Co., Korea).Všechny ortopedické implantáty jsou navrženy tak, aby odpovídaly geometrii králičího femuru.
Morfologie povrchu substrátu a ortopedických implantátů byla kontrolována metodou polní emise SEM (Inspect F50, FEI, USA) a AFM (XE-100, Park Systems, Jižní Korea).Drsnost povrchu (Ra, Rq) se měří vynásobením plochy 20 μm 20 μm (n=4).K analýze chemického složení povrchu byl použit systém XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japonsko) vybavený zdrojem Al Ka ​​X záření s velikostí skvrny 100 μm2.K měření kapalných CA a SA byl použit měřicí systém CA vybavený kamerou pro dynamické snímání obrazu (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Jižní Korea).Pro každé měření se na povrch umístí 6 až 10 μl kapiček (deionizovaná voda, koňská krev, EG, 30% etanol a HD) pro měření CA.Když se úhel sklonu substrátu zvyšuje rychlostí 2°/s (n = 4), měří se SA při pádu kapky.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] a MRSA (ATCC 25923) byly zakoupeny od ATCC (Manassas, Virginia, USA) a zásobní kultura byla udržována při -80 °C.Před použitím byla zmrazená kultura inkubována v trypsinem rozmraženém sójovém bujónu (Komed, Korea) při 37 °C po dobu 18 hodin a poté dvakrát přenesena, aby se aktivovala.Po inkubaci byla kultura centrifugována při 10 000 otáčkách za minutu po dobu 10 minut při 4 °C a dvakrát promyta roztokem PBS (pH 7,3).Odstředěná kultura se poté subkultivuje na krevních agarových plotnách (BAP).MRSA a Pseudomonas aeruginosa byly připraveny přes noc a kultivovány v bujónu Luria-Bertani.Koncentrace Pseudomonas aeruginosa a MRSA v inokulu byla kvantitativně stanovena pomocí CFU suspenze v sériových ředěních na agaru.Poté upravte koncentraci bakterií na 0,5 McFarlandova standardu, což odpovídá 108 CFU/ml.Poté zřeďte pracovní bakteriální suspenzi 100krát na 106 CFU/ml.Pro testování antibakteriálních adhezních vlastností byl substrát před použitím sterilizován při 121 °C po dobu 15 minut.Substrát byl poté přenesen do 25 ml bakteriální suspenze a inkubován při 37 °C za intenzivního třepání (200 otáček za minutu) po dobu 12 a 72 hodin.Po inkubaci byl každý substrát odstraněn z inkubátoru a 3krát promyt PBS, aby se odstranily veškeré plovoucí bakterie na povrchu.Aby bylo možné pozorovat biofilm na substrátu, byl biofilm fixován methanolem a obarven 1 ml crimidinové oranže po dobu 2 minut.Poté byl použit fluorescenční mikroskop (BX51TR, Olympus, Japonsko) k pořízení snímků obarveného biofilmu.Aby bylo možné kvantifikovat biofilm na substrátu, byly připojené buňky odděleny od substrátu metodou bead vortex, která byla považována za nejvhodnější metodu k odstranění připojených bakterií (n = 4).Pomocí sterilních kleští odstraňte substrát z růstového média a poklepáním na destičku s jamkami odstraňte přebytečnou tekutinu.Volně připojené buňky byly odstraněny promytím dvakrát sterilním PBS.Každý substrát byl poté přenesen do sterilní zkumavky obsahující 9 ml 0,1% proteinového ept fyziologického roztoku (PSW) a 2 g 20 až 25 sterilních skleněných kuliček (o průměru 0,4 až 0,5 mm).Poté byl 3 minuty vortexován, aby se buňky oddělily od vzorku.Po vortexování byla suspenze sériově 10krát zředěna 0,1% PSW a poté bylo 0,1 ml každého ředění naočkováno na BAP.Po 24 hodinách inkubace při 37 °C byla CFU spočítána ručně.
Pro buňky byly použity myší fibroblasty NIH/3T3 (CRL-1658; americký ATCC) a myší makrofágy RAW 264.7 (TIB-71; americký ATCC).Použijte Dulbeccovo modifikované Eagle médium (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) ke kultivaci myších fibroblastů a doplňte 10% telecím sérem (S103-01, Welgene) a 1% penicilin-streptomycinem (PS; LS202-02, Welgeneee Použijte DMEM ke kultivaci myších makrofágů, doplněných 10% fetálním bovinním sérem (S001-01, Welgene) a 1% PS Umístěte substrát do šestijamkové destičky pro kultivaci buněk a naočkujte buňky v množství 105 buněk/cm2. Buňky byly inkubovány přes noc při 37 °C a 5% C02. Pro barvení buněk byly buňky fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 20 minut a umístěny do 0,5% Triton X Inkubátu na 5 minut v -100 °C při 37 °C po dobu 30 minut Po inkubačním procesu použijte substrát s 4',6-diamino-2-fenylindolem (H-1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD fixačním médiem (n = 4 na buňku). fluorescein, fluorescein isothiokyanát-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Německo) a lidská plazma Fibrinogen konjugovaný s Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, USA) byl rozpuštěn v PBS (10 mM, pH 7,4).Koncentrace albuminu a fibrinogenu byly 1 a 150 μg/ml.Po substrátu Před ponořením do proteinového roztoku je opláchněte PBS, aby se povrch rehydratoval.Poté ponořte všechny substráty do šestijamkové destičky obsahující proteinový roztok a inkubujte při 37 °C po dobu 30 a 90 minut.Po inkubaci byl substrát odstraněn z proteinového roztoku, jemně promyt 3krát PBS a fixován 4% paraformaldehydem (n = 4 pro každý protein).V případě vápníku se chlorid sodný (0,21 M) a fosforečnan draselný (3,77 mM)) rozpustil v deionizované vodě.pH roztoku bylo upraveno na 2,0 přidáním roztoku hydrochloridu (1M).Poté byl v roztoku rozpuštěn chlorid vápenatý (5,62 mM).Přidáním 1M tris(hydroxymethyl)-aminomethanu se pH roztoku upraví na 7,4.Ponořte všechny substráty do šestijamkové destičky naplněné 1,5× roztokem fosforečnanu vápenatého a po 30 minutách z roztoku vyjměte.Pro barvení 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Smíchejte se 100 ml deionizované vody.Poté použijte 10% hydroxid amonný k úpravě pH na 4. Barvete substrát roztokem Alizarin Red po dobu 5 minut, poté setřeste přebytečné barvivo a osušte.Po procesu protřepání odstraňte substrát.Materiál se dehydratuje, poté se ponoří do acetonu na 5 minut, poté se ponoří do roztoku aceton-xylen (1:1) na 5 minut a nakonec se promyje xylenem (n = 4).Používá se fluorescenční mikroskop (Axio Imager) s čočkami objektivu ×10 a ×20..A2m, Zeiss, Německo) zobrazuje všechny substráty.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) byl použit ke kvantifikaci adhezních dat biologických látek na každé skupině čtyř různých zobrazovacích oblastí.Převeďte všechny obrázky na binární obrázky s pevnými prahovými hodnotami pro porovnání substrátu.
Ke sledování stability vrstvy maziva v PBS v reflexním režimu byl použit konfokální mikroskop Zeiss LSM 700.Vzorek skla potaženého SAM na bázi fluoru s injektovanou lubrikační vrstvou byl ponořen do roztoku PBS a testován pomocí orbitální třepačky (SHO-1D; Daihan Scientific, Jižní Korea) za mírných podmínek protřepávání (120 otáček za minutu).Poté odeberte vzorek a sledujte ztrátu maziva měřením ztráty odraženého světla.Pro získání fluorescenčních obrazů v reflexním režimu je vzorek vystaven laseru o vlnové délce 633 nm a poté shromážděn, protože světlo se bude odrážet zpět od vzorku.Vzorky byly měřeny v časových intervalech 0, 30, 60 a 120 hodin.
Pro stanovení vlivu procesu modifikace povrchu na nanomechanické vlastnosti ortopedických implantátů bylo k měření nanoindendionu použito nanoindentor (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) vybavený třístranným diamantovým hrotem Berkovich ve tvaru pyramidy.Špičkové zatížení je 10 mN a plocha je 100 μm x 100 μm.Pro všechna měření je doba nakládání a vyjímání 10 s a doba výdrže při špičkovém vtiskovém zatížení je 2 s.Proveďte měření z pěti různých míst a vezměte průměr.Aby se vyhodnotila mechanická pevnost při zatížení, byla provedena zkouška příčného tříbodového ohybu pomocí univerzálního zkušebního stroje (Instron 5966, Instron, USA).Substrát je stlačován konstantní rychlostí 10 N/s se zvýšeným zatížením.Pro výpočet modulu pružnosti v ohybu a maximálního tlakového napětí byl použit softwarový program Bluehill Universal (n = 3).
Za účelem simulace operačního procesu a souvisejícího mechanického poškození způsobeného během operace byl operační proces prováděn in vitro.Stehenní kosti byly odebrány z popravených novozélandských bílých králíků.Stehenní kost byla vyčištěna a fixována ve 4% paraformaldehydu po dobu 1 týdne.Jak je popsáno v experimentální metodě na zvířatech, fixní femur byl chirurgicky operován.Po operaci byl ortopedický implantát ponořen do krve (koňská krev, KISAN, Korea) na 10 s, aby se potvrdilo, zda po aplikaci mechanického poranění došlo k krevním srůstům (n = 3).
Celkem 24 samců novozélandských bílých králíků (váha 3,0 až 3,5 kg, průměrný věk 6 měsíců) bylo náhodně rozděleno do čtyř skupin: nahé negativní, nahé pozitivní, SHP a LOIS.Všechny postupy zahrnující zvířata byly provedeny v souladu s etickými standardy Institutional Animal Care and Use Committee (schváleno IACUC, KOREA-2017-0159).Ortopedický implantát se skládá z zajišťovací dlahy s pěti otvory (délka 41 mm, šířka 7 mm a tloušťka 2 mm) a kortikálních zajišťovacích šroubů (délka 12 mm, průměr 2,7 mm) pro fixaci zlomeniny.S výjimkou destiček a šroubů použitých ve skupině s holým negativním výsledkem byly všechny destičky a šrouby inkubovány v suspenzi MRSA (106 CFU/ml) po dobu 12 hodin.Nahá-negativní skupina (n=6) byla ošetřena implantáty s nahým povrchem bez expozice bakteriální suspenzi, jako negativní kontrola infekce.Holá pozitivní skupina (n = 6) byla ošetřena implantátem s holým povrchem vystaveným bakteriím jako pozitivní kontrola infekce.Skupina SHP (n = 6) byla léčena bakteriálně vystavenými implantáty SHP.Nakonec byla skupina LOIS léčena implantáty LOIS vystavenými bakteriím (n = 6).Všechna zvířata jsou držena v kleci a je jim poskytnuto hodně jídla a vody.Před operací byli králíci 12 hodin nalačno.Zvířata byla anestetizována intramuskulární injekcí xylazinu (5 mg/kg) a intravenózní injekcí paclitaxelu (3 mg/kg) pro indukci.Poté aplikujte 2 % isofluranu a 50 % až 70 % medicinálního kyslíku (průtok 2 l/min) přes dýchací systém, abyste udrželi anestezii.Implantuje se přímým přístupem do laterálního femuru.Po odstranění chloupků a povidon-jodové dezinfekci kůže byl proveden řez o délce asi 6 cm na vnější straně levého středního femuru.Otevřením mezery mezi svaly pokrývajícími stehenní kost se femur plně obnaží.Umístěte dlahu před diafýzu femuru a upevněte ji čtyřmi šrouby.Po fixaci pilovým kotoučem (tloušťka 1 mm) uměle vytvořte zlomeninu v oblasti mezi druhým otvorem a čtvrtým otvorem.Na konci operace byla rána omyta fyziologickým roztokem a uzavřena stehy.Každý králík dostal subkutánní injekci enrofloxacinu (5 mg/kg) zředěného z jedné třetiny ve fyziologickém roztoku.Pooperační rentgenové snímky stehenní kosti byly pořízeny u všech zvířat (0, 7, 14, 21, 28 a 42 dnů), aby se potvrdila osteotomie kosti.Po hluboké anestezii byla všechna zvířata usmrcena intravenózním KCl (2 mmol/kg) 28. a 42. den.Po provedení byla stehenní kost skenována pomocí mikro-CT, aby bylo možné pozorovat a porovnat proces hojení kosti a novotvorbu kosti mezi čtyřmi skupinami.
Po provedení byly odebrány měkké tkáně, které byly v přímém kontaktu s ortopedickými implantáty.Tkáň byla přes noc fixována v 10% neutrálním pufrovaném formalínu a poté dehydratována v EtOH.Dehydratovaná tkáň byla zalita do parafínu a nařezána na tloušťku 40 μm pomocí mikrotomu (400CS; EXAKT, Německo).Za účelem vizualizace infekce bylo provedeno barvení H&E a barvení MT.Za účelem kontroly reakce hostitele byla nařezaná tkáň inkubována s králičí anti-TNF-a primární protilátkou (AB6671, Abcam, USA) a králičí anti-IL-6 (AB6672; Abcam, USA) a poté ošetřena křenem.oxidáza.Aplikujte barvicí systém avidin-biotinový komplex (ABC) na řezy podle pokynů výrobce.Aby se objevil jako hnědý reakční produkt, byl ve všech částech použit 3,3-diaminobenzidin.K vizualizaci všech řezů byl použit digitální skener diapozitivů (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Maďarsko) a pomocí softwaru ImageJ byly analyzovány alespoň čtyři substráty v každé skupině.
Rentgenové snímky byly pořizovány u všech zvířat po operaci a každý týden pro sledování hojení zlomenin (n=6 na skupinu).Po provedení bylo použito mikro-CT s vysokým rozlišením k výpočtu tvorby kalusu kolem femuru po zhojení.Získaná femur byla vyčištěna, fixována ve 4% paraformaldehydu po dobu 3 dnů a dehydratována v 75% ethanolu.Dehydrované kosti byly poté skenovány pomocí micro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgie) pro vytvoření 3D voxelových obrázků (2240 ​​× 2240 pixelů) vzorku kosti.Použijte 1,0 mm Al filtr ke snížení šumu signálu a aplikujte vysoké rozlišení na všechna skenování (E = 133 kVp, I = 60 μA, integrační čas = 500 ms).Software Nrecon (verze 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgie) byl použit ke generování 3D objemu naskenovaného vzorku ze získané 2D laterální projekce.Pro analýzu je 3D rekonstruovaný obraz rozdělen na kostky 10 mm × 10 mm × 10 mm podle místa zlomeniny.Vypočítejte kalus mimo kortikální kost.K digitálnímu přesměrování naskenovaného objemu kosti byl použit software DataViewer (verze 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgie) a pro analýzu byl použit software CT-Analyzer (verze 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgie).Relativní koeficienty absorpce rentgenového záření ve zralé kosti a kalusu se rozlišují podle jejich hustoty a poté se kvantifikuje objem kalusu (n = 4).Aby se potvrdilo, že biokompatibilita LOIS nezpomaluje proces hojení kosti, byly provedeny další rentgenové a mikro-CT analýzy u dvou králíků: skupiny nahých negativních a LOIS.Obě skupiny byly popraveny v 6. týdnu.
Stehenní kosti z usmrcených zvířat byly odebrány a fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 3 dnů.Ortopedický implantát se poté opatrně vyjme z femuru.Stehenní kost byla dekalcifikována po dobu 21 dnů za použití 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Poté byla odvápněná stehenní kost ponořena do EtOH, aby byla dehydratována.Dehydratovaná stehenní kost byla odstraněna v xylenu a uložena do parafínu.Poté byl vzorek nakrájen automatickým rotačním mikrotomem (Leica RM2255, Leica Biosystems, Německo) o tloušťce 3 μm.Pro barvení TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Německo) byly nakrájené vzorky zbaveny parafinu, rehydratovány a inkubovány v TRAP činidle při 37 °C po dobu 1 hodiny.Snímky byly získány pomocí skeneru sklíček (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Maďarsko) a kvantifikovány měřením plošného pokrytí obarvené oblasti.V každém experimentu byly pomocí softwaru ImageJ analyzovány alespoň čtyři substráty v každé skupině.
Analýza statistické významnosti byla provedena pomocí GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).K testování rozdílů mezi hodnotícími skupinami byl použit nepárový t-test a jednocestná analýza rozptylu (ANOVA).Hladina významnosti je na obrázku označena následovně: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 a ****P<0,0001;NS, žádný významný rozdíl.
Doplňkové materiály k tomuto článku naleznete na adrese http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, která umožňuje použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu, pokud použití není pro komerční zisk a předpokladem je, že originál práce je správná.Odkaz.
Poznámka: Žádáme vás pouze o uvedení e-mailové adresy, aby osoba, kterou na stránku doporučujete, věděla, že chcete, aby e-mail viděla a že se nejedná o spam.Nebudeme zaznamenávat žádné e-mailové adresy.
Tato otázka se používá k testování, zda jste lidský návštěvník, a k zamezení automatického odesílání spamu.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Antibakteriální a imunitní únikové povlaky ortopedických implantátů mohou snížit infekce a imunitní reakce způsobené infekcemi.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Antibakteriální a imunitní únikové povlaky ortopedických implantátů mohou snížit infekce a imunitní reakce způsobené infekcemi.
©2021 American Association for the Advancement of Science.všechna práva vyhrazena.AAAS je partnerem HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef a COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.