Bagi pesakit yang menjalani pembedahan implan ortopedik, jangkitan bakteria dan tindak balas imun yang disebabkan oleh jangkitan sentiasa menjadi risiko yang mengancam nyawa.Bahan biologi konvensional mudah terdedah kepada pencemaran biologi, yang menyebabkan bakteria menyerang kawasan yang cedera dan menyebabkan jangkitan selepas pembedahan.Oleh itu, terdapat keperluan mendesak untuk membangunkan salutan anti-jangkitan dan pelepasan imun untuk implan ortopedik.Di sini, kami telah membangunkan teknologi pengubahsuaian permukaan termaju untuk implan ortopedik yang dipanggil Permukaan Implan Ortopedik Pelincir (LOIS), yang diilhamkan oleh permukaan licin periuk kera tumbuhan.LOIS mempunyai penolak cecair yang tahan lama dan kuat kepada pelbagai cecair dan bahan biologi (termasuk sel, protein, kalsium dan bakteria).Di samping itu, kami mengesahkan ketahanan mekanikal terhadap calar dan daya penetapan dengan mensimulasikan kerosakan yang tidak dapat dielakkan semasa pembedahan in vitro.Model patah tulang femur radang sumsum tulang arnab digunakan untuk mengkaji secara menyeluruh keupayaan penskalaan anti-biologi dan anti-jangkitan LOIS.Kami membayangkan bahawa LOIS, yang mempunyai ciri anti-biofouling dan ketahanan mekanikal, adalah satu langkah ke hadapan dalam pembedahan ortopedik tanpa jangkitan.
Hari ini, disebabkan oleh penuaan keseluruhan, bilangan pesakit yang menderita penyakit ortopedik (seperti patah tulang warga tua, penyakit sendi degeneratif, dan osteoporosis) telah meningkat dengan banyak (1, 2).Oleh itu, institusi perubatan mementingkan pembedahan ortopedik, termasuk implan ortopedik skru, plat, paku dan sendi tiruan (3, 4).Walau bagaimanapun, implan ortopedik tradisional telah dilaporkan terdedah kepada lekatan bakteria dan pembentukan biofilm, yang boleh menyebabkan jangkitan tapak pembedahan (SSI) selepas pembedahan (5, 6).Sebaik sahaja biofilm terbentuk pada permukaan implan ortopedik, penyingkiran biofilm menjadi sangat sukar walaupun dengan penggunaan antibiotik dalam dos yang besar.Oleh itu, ia biasanya membawa kepada jangkitan pasca operasi yang teruk (7, 8).Disebabkan masalah di atas, rawatan implan yang dijangkiti harus termasuk operasi semula, termasuk penyingkiran semua implan dan tisu sekeliling;oleh itu, pesakit akan mengalami kesakitan yang teruk dan beberapa risiko (9, 10).
Untuk menyelesaikan beberapa masalah ini, implan ortopedik yang mengeluarkan ubat telah dibangunkan untuk mencegah jangkitan dengan menghapuskan bakteria yang melekat pada permukaan (11, 12).Walau bagaimanapun, strategi masih menunjukkan beberapa batasan.Telah dilaporkan bahawa implantasi jangka panjang implan pengelupasan dadah telah menyebabkan kerosakan pada tisu sekeliling dan menyebabkan keradangan, yang boleh menyebabkan nekrosis (13, 14).Di samping itu, pelarut organik yang mungkin wujud selepas proses pengilangan implan ortopedik yang mengeluarkan ubat, yang dilarang sama sekali oleh Pentadbiran Makanan dan Ubat-ubatan AS, memerlukan langkah penulenan tambahan untuk memenuhi piawaiannya (15).Implan pengelupasan dadah adalah mencabar untuk pelepasan terkawal ubat, dan disebabkan pemuatan ubat yang terhad, penggunaan ubat jangka panjang tidak dapat dilaksanakan (16).
Satu lagi strategi biasa ialah menyalut implan dengan polimer antifouling untuk mengelakkan bahan biologi dan bakteria daripada melekat pada permukaan (17).Sebagai contoh, polimer zwitterionik telah menarik perhatian kerana sifat bukan pelekatnya apabila bersentuhan dengan protein plasma, sel dan bakteria.Walau bagaimanapun, ia mempunyai beberapa batasan yang berkaitan dengan kestabilan jangka panjang dan ketahanan mekanikal, yang menghalang penggunaan praktikalnya dalam implan ortopedik, terutamanya kerana pengikisan mekanikal semasa prosedur pembedahan (18, 19).Di samping itu, disebabkan oleh biokompatibiliti yang tinggi, kekurangan keperluan untuk pembedahan pembuangan, dan sifat pembersihan permukaan melalui kakisan, implan ortopedik yang diperbuat daripada bahan terbiodegradasi telah digunakan (20, 21).Semasa kakisan, ikatan kimia antara matriks polimer dipecahkan dan dipisahkan dari permukaan, dan perekat membersihkan permukaan.Walau bagaimanapun, kekotoran anti-biologi melalui pembersihan permukaan berkesan dalam tempoh yang singkat.Di samping itu, kebanyakan bahan yang boleh diserap termasuk poli (kopolimer asid laktik-asid glikolik) (PLGA), asid polilaktik (PLA) dan aloi berasaskan magnesium akan mengalami biodegradasi dan hakisan yang tidak sekata dalam badan, yang akan menjejaskan kestabilan mekanikal secara negatif.(dua puluh dua).Di samping itu, serpihan plat biodegradasi menyediakan tempat untuk bakteria melekat, yang meningkatkan peluang jangkitan dalam jangka panjang.Risiko degradasi mekanikal dan jangkitan ini mengehadkan penggunaan praktikal pembedahan plastik (23).
Permukaan superhydrophobic (SHP) yang meniru struktur hierarki daun teratai telah menjadi penyelesaian yang berpotensi untuk permukaan anti-kotoran (24, 25).Apabila permukaan SHP direndam dalam cecair, gelembung udara akan terperangkap, dengan itu membentuk poket udara dan menghalang lekatan bakteria (26).Walau bagaimanapun, kajian terbaru menunjukkan bahawa permukaan SHP mempunyai kelemahan yang berkaitan dengan ketahanan mekanikal dan kestabilan jangka panjang, yang menghalang penggunaannya dalam implan perubatan.Selain itu, poket udara akan larut dan kehilangan sifat anti-kotorannya, dengan itu mengakibatkan lekatan bakteria yang lebih luas disebabkan oleh luas permukaan permukaan SHP yang besar (27, 28).Baru-baru ini, Aizenberg dan rakan sekerja memperkenalkan kaedah inovatif salutan permukaan anti-biofouling dengan membangunkan permukaan licin yang diilhamkan oleh tumbuhan periuk kera Nepenthes (29, 30).Permukaan licin menunjukkan kestabilan jangka panjang di bawah keadaan hidraulik, adalah penghalau cecair yang sangat cair kepada cecair biologi, dan mempunyai sifat baik pulih sendiri.Walau bagaimanapun, tiada kaedah untuk menggunakan salutan pada implan perubatan berbentuk kompleks, dan ia juga tidak terbukti menyokong proses penyembuhan tisu yang rosak selepas implantasi.
Di sini, kami memperkenalkan permukaan implan ortopedik yang dilincirkan (LOIS), permukaan implan ortopedik berstruktur mikro/nano dan digabungkan rapat dengan lapisan pelincir nipis untuk mengelakkannya daripada dikaitkan dengan pembedahan plastik Jangkitan bakteria, seperti penetapan patah tulang.Oleh kerana struktur tahap mikro/nano yang berfungsi dengan fluorin membetulkan pelincir pada struktur dengan kukuh, LOIS yang dibangunkan boleh menangkis sepenuhnya lekatan pelbagai cecair dan mengekalkan prestasi anti-kotoran untuk jangka masa yang lama.Salutan LOIS boleh digunakan pada bahan pelbagai bentuk yang bertujuan untuk sintesis tulang.Sifat anti-biofouling yang sangat baik LOIS terhadap bakteria biofilm [Pseudomonas aeruginosa dan Staphylococcus aureus (MRSA) yang tahan methicillin] dan bahan biologi (sel, protein dan kalsium) telah disahkan secara in vitro.Kadar lekatan lekatan meluas pada substrat adalah kurang daripada 1%.Di samping itu, walaupun selepas tekanan mekanikal seperti calar permukaan berlaku, penyembuhan diri yang disebabkan oleh pelincir yang menembusi membantu mengekalkan sifat anti-kotorannya.Keputusan ujian ketahanan mekanikal menunjukkan bahawa walaupun selepas pengubahsuaian struktur dan kimia, jumlah kekuatan tidak akan berkurangan dengan ketara.Di samping itu, eksperimen in vitro yang menyerupai tekanan mekanikal dalam persekitaran pembedahan telah dijalankan untuk membuktikan bahawa LOIS boleh menahan pelbagai tekanan mekanikal yang berlaku semasa pembedahan plastik.Akhir sekali, kami menggunakan model patah tulang femoral in vivo berasaskan arnab, yang membuktikan bahawa LOIS mempunyai ciri antibakteria dan biokompatibiliti yang unggul.Keputusan radiologi dan histologi mengesahkan bahawa tingkah laku pelincir yang stabil dan sifat anti-biofouling dalam tempoh 4 minggu selepas implantasi boleh mencapai prestasi anti-jangkitan dan pelepasan imun yang berkesan tanpa melengahkan proses penyembuhan tulang.
Rajah 1A menunjukkan gambarajah skematik LOIS yang dibangunkan, yang ditanam dengan struktur skala mikro/nano dalam model patah tulang paha arnab untuk mengesahkan sifat pengotoran anti-biologi dan anti-jangkitannya yang sangat baik.Kaedah biomimetik dijalankan untuk mensimulasikan permukaan loji pasu air, dan untuk mengelakkan biofouling dengan memasukkan lapisan pelincir dalam struktur mikro/nano permukaan.Permukaan yang disuntik dengan pelincir boleh meminimumkan sentuhan antara bahan biologi dan permukaan.Oleh itu, disebabkan oleh pembentukan ikatan kimia yang stabil di permukaan, ia mempunyai prestasi antifouling yang sangat baik dan kestabilan jangka panjang.Akibatnya, sifat anti-biofouling permukaan pelincir membolehkan pelbagai aplikasi praktikal dalam penyelidikan bioperubatan.Walau bagaimanapun, penyelidikan meluas tentang bagaimana permukaan khas ini berinteraksi dalam badan masih belum selesai.Dengan membandingkan LOIS dengan substrat telanjang secara in vitro menggunakan bakteria albumin dan biofilm, ketidaklekatan LOIS boleh disahkan (Rajah 1B).Di samping itu, dengan melancarkan titisan air pada substrat terdedah condong dan substrat LOIS (Rajah S1 dan Filem S1), prestasi pencemaran biologi boleh ditunjukkan.Seperti yang ditunjukkan dalam imej mikroskop pendarfluor, substrat terdedah yang diinkubasi dalam penggantungan protein dan bakteria menunjukkan sejumlah besar bahan biologi melekat pada permukaan.Walau bagaimanapun, disebabkan sifat anti-biofouling yang sangat baik, LOIS hampir tidak memaparkan sebarang pendarfluor.Untuk mengesahkan sifat anti-biofouling dan anti-jangkitannya, LOIS telah digunakan pada permukaan implan ortopedik untuk sintesis tulang (plat dan skru) dan diletakkan dalam model patah arnab.Sebelum implantasi, implan ortopedik telanjang dan LOIS diinkubasi dalam penggantungan bakteria selama 12 jam.Pra-inkubasi memastikan bahawa biofilm terbentuk pada permukaan implan terdedah untuk perbandingan.Rajah 1C menunjukkan foto tapak patah 4 minggu selepas implantasi.Di sebelah kiri, seekor arnab dengan implan ortopedik yang terdedah menunjukkan tahap keradangan yang teruk akibat pembentukan biofilm pada permukaan implan.Keputusan sebaliknya diperhatikan pada arnab yang ditanam dengan LOIS, iaitu, tisu sekeliling LOIS tidak menunjukkan tanda-tanda jangkitan mahupun tanda-tanda keradangan.Di samping itu, imej optik di sebelah kiri menunjukkan tapak pembedahan arnab dengan implan terdedah, menunjukkan bahawa tiada pelekat berbilang yang terdapat pada permukaan implan terdedah ditemui pada permukaan LOIS.Ini menunjukkan bahawa LOIS mempunyai kestabilan jangka panjang dan mempunyai keupayaan untuk mengekalkan sifat anti-biologi fouling dan anti-lekatannya.
(A) Gambar rajah skema LOIS dan implantasinya dalam model patah tulang paha arnab.(B) Imej mikroskop pendarfluor protein dan biofilm bakteria pada permukaan terdedah dan substrat LOIS.4 minggu selepas implantasi, (C) imej fotografi tapak patah dan (D) imej X-ray (diserlahkan oleh segi empat tepat merah).Ihsan gambar: Kyomin Chae, Universiti Yonsei.
Arnab yang disterilkan dan diimplan secara negatif menunjukkan proses penyembuhan tulang yang normal tanpa sebarang tanda keradangan atau jangkitan.Sebaliknya, implan SHP yang telah diinkubasi dalam suspensi bakteria mempamerkan keradangan berkaitan jangkitan pada tisu sekeliling.Ini boleh dikaitkan dengan ketidakupayaannya untuk menghalang lekatan bakteria untuk masa yang lama (Rajah S2).Untuk membuktikan bahawa LOIS tidak menjejaskan proses penyembuhan, tetapi menghalang kemungkinan jangkitan yang berkaitan dengan implantasi, imej X-ray matriks positif terdedah dan LOIS di tapak patah telah dibandingkan (Rajah 1D).Imej X-ray bagi implan positif terdedah menunjukkan garisan osteolisis yang berterusan, menunjukkan bahawa tulang tidak sembuh sepenuhnya.Ini menunjukkan bahawa proses pemulihan tulang mungkin sangat tertangguh disebabkan oleh keradangan yang berkaitan dengan jangkitan.Sebaliknya, ia menunjukkan bahawa arnab yang ditanam dengan LOIS telah sembuh dan tidak menunjukkan sebarang tapak patah yang jelas.
Untuk membangunkan implan perubatan dengan kestabilan dan kefungsian jangka panjang (termasuk ketahanan terhadap biofouling), banyak usaha telah dilakukan.Walau bagaimanapun, kehadiran pelbagai bahan biologi dan dinamik lekatan tisu mengehadkan perkembangan kaedah klinikal yang boleh dipercayai.Untuk mengatasi kelemahan ini, kami telah membangunkan struktur berlapis mikro/nano dan permukaan yang diubah suai secara kimia, yang dioptimumkan disebabkan oleh daya kapilari yang tinggi dan pertalian kimia untuk mengekalkan pelincir yang paling licin pada tahap yang terbaik.Rajah 2A menunjukkan keseluruhan proses pembuatan LOIS.Pertama, sediakan substrat keluli tahan karat (SS) 304 gred perubatan.Kedua, struktur mikro/nano terbentuk pada substrat SS melalui goresan kimia menggunakan larutan asid hidrofluorik (HF).Untuk memulihkan rintangan kakisan SS, larutan asid nitrik (HNO3) (31) digunakan untuk memproses substrat terukir.Pempasifan meningkatkan rintangan kakisan substrat SS dan melambatkan proses kakisan dengan ketara yang mungkin mengurangkan prestasi keseluruhan LOIS.Kemudian, dengan membentuk monolayer dipasang sendiri (SAM) dengan 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyltriethoxysilane (POTS), permukaan diubah suai secara kimia untuk meningkatkan interaksi kimia antara permukaan dan Afiniti pelincir licin.Pengubahsuaian permukaan dengan ketara mengurangkan tenaga permukaan permukaan berstruktur mikro/skala nano yang direka, yang sepadan dengan tenaga permukaan pelincir licin.Ini membolehkan pelincir dibasahi sepenuhnya, seterusnya membentuk lapisan pelincir yang stabil di permukaan.Permukaan yang diubah suai mempamerkan hidrofobisiti yang dipertingkatkan.Keputusan menunjukkan bahawa pelincir licin menunjukkan tingkah laku yang stabil pada LOIS disebabkan oleh pertalian kimia yang tinggi dan daya kapilari yang disebabkan oleh struktur mikro/nano (32, 33).Perubahan optik pada permukaan SS selepas pengubahsuaian permukaan dan suntikan pelincir telah dikaji.Struktur lapisan mikro/nano yang terbentuk pada permukaan boleh menyebabkan perubahan visual dan menggelapkan permukaan.Fenomena ini dikaitkan dengan kesan serakan cahaya yang dipertingkatkan pada permukaan kasar, yang meningkatkan pantulan meresap yang disebabkan oleh mekanisme perangkap cahaya (34).Selain itu, selepas pelincir disuntik, LOIS menjadi lebih gelap.Lapisan pelincir menyebabkan kurang cahaya dipantulkan dari substrat, dengan itu menggelapkan LOIS.Untuk mengoptimumkan struktur mikro/nano untuk menunjukkan sudut gelongsor (SA) terkecil untuk mencapai prestasi anti-biofouling, mikroskop elektron pengimbasan (SEM) dan pasangan atom digunakan untuk melakukan masa etsa HF yang berbeza (0, 3)., 15 dan 60 minit) Force Microscope (AFM) (Rajah 2B).Imej SEM dan AFM menunjukkan bahawa selepas masa goresan yang singkat (3 minit goresan), substrat kosong telah membentuk kekasaran skala nano yang tidak sekata.Kekasaran permukaan berubah mengikut masa etsa (Rajah S3).Keluk perubahan masa menunjukkan bahawa kekasaran permukaan terus meningkat dan mencapai kemuncak pada 15 minit etsa, dan kemudian hanya sedikit penurunan dalam nilai kekasaran diperhatikan pada 30 minit etsa.Pada ketika ini, kekasaran paras nano akan hilang, manakala kekasaran peringkat mikro berkembang dengan kuat, menjadikan perubahan kekasaran lebih stabil.Selepas etsa selama lebih daripada 30 minit, peningkatan selanjutnya dalam kekasaran diperhatikan, yang dijelaskan secara terperinci seperti berikut: SS terdiri daripada keluli, dialoi dengan unsur-unsur termasuk besi, kromium, nikel, molibdenum dan banyak unsur lain.Di antara unsur-unsur ini, besi, kromium dan molibdenum memainkan peranan penting dalam membentuk kekasaran mikron/skala nano pada SS oleh etsa HF.Pada peringkat awal kakisan, besi dan kromium terutamanya terhakis kerana molibdenum mempunyai rintangan kakisan yang lebih tinggi daripada molibdenum.Apabila goresan berlangsung, larutan etsa mencapai kejenuhan berlebihan setempat, membentuk fluorida dan oksida yang disebabkan oleh etsa.Fluorida dan oksida memendakan dan akhirnya memendap semula pada permukaan, membentuk kekasaran permukaan dalam julat mikron/nano (31).Kekasaran tahap mikro/nano ini memainkan peranan penting dalam sifat penyembuhan diri LOIS.Permukaan skala dwi menghasilkan kesan sinergistik, meningkatkan daya kapilari.Fenomena ini membolehkan pelincir untuk menembusi permukaan secara stabil dan menyumbang kepada sifat penyembuhan diri (35).Pembentukan kekasaran bergantung pada masa etsa.Di bawah 10 minit etsa, permukaan hanya mengandungi kekasaran skala nano, yang tidak mencukupi untuk menampung pelincir yang mencukupi untuk mempunyai rintangan biofouling (36).Sebaliknya, jika masa etsa melebihi 30 minit, kekasaran skala nano yang terbentuk oleh pemendapan semula besi dan kromium akan hilang, dan hanya kekasaran skala mikro akan kekal disebabkan oleh molibdenum.Permukaan yang terlalu terukir tidak mempunyai kekasaran skala nano dan kehilangan kesan sinergistik kekasaran dua peringkat, yang memberi kesan negatif kepada ciri penyembuhan diri LOIS.Pengukuran SA telah dilakukan pada substrat dengan masa etsa yang berbeza untuk membuktikan prestasi anti-kotoran.Pelbagai jenis cecair dipilih berdasarkan kelikatan dan tenaga permukaan, termasuk air ternyahiion (DI), darah, etilena glikol (EG), etanol (EtOH) dan heksadekana (HD) (Rajah S4).Corak goresan yang berubah-ubah masa menunjukkan bahawa untuk pelbagai cecair dengan tenaga permukaan dan kelikatan yang berbeza, SA LOIS selepas 15 minit goresan adalah yang paling rendah.Oleh itu, LOIS dioptimumkan untuk mengetsa selama 15 minit untuk membentuk kekasaran mikron dan skala nano, yang sesuai untuk mengekalkan ketahanan pelincir dengan berkesan dan sifat anti-kotoran yang sangat baik.
(A) Gambarajah skematik proses pembuatan empat langkah LOIS.Inset menunjukkan SAM yang terbentuk pada substrat.(B) Imej SEM dan AFM, digunakan untuk mengoptimumkan struktur mikro/nano substrat di bawah masa etsa yang berbeza.Spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) spektrum (C) Cr2p dan (D) F1s selepas pempasifan permukaan dan salutan SAM.au, unit sewenang-wenangnya.(E) Imej perwakilan titisan air pada substrat kosong, terukir, SHP dan LOIS.(F) Sudut sentuhan (CA) dan pengukuran SA bagi cecair dengan tegangan permukaan yang berbeza pada SHP dan LOIS.Data dinyatakan sebagai min ± SD.
Kemudian, untuk mengesahkan perubahan dalam sifat kimia permukaan, spektroskopi fotoelektron sinar-X (XPS) digunakan untuk mengkaji perubahan dalam komposisi kimia permukaan substrat selepas setiap lapisan permukaan.Rajah 2C menunjukkan hasil pengukuran XPS bagi permukaan terukir HF dan permukaan yang dirawat HNO 3.Dua puncak utama pada 587.3 dan 577.7 eV boleh dikaitkan dengan ikatan Cr-O yang wujud dalam lapisan kromium oksida, yang merupakan perbezaan utama daripada permukaan terukir HF.Ini disebabkan terutamanya oleh penggunaan besi dan kromium fluorida pada permukaan oleh HNO3.Goresan berasaskan HNO3 membolehkan kromium membentuk lapisan oksida pasif pada permukaan, yang menjadikan SS yang terukir sekali lagi tahan terhadap kakisan.Dalam Rajah 2D, spektrum XPS diperolehi untuk mengesahkan bahawa silan berasaskan fluorokarbon terbentuk di permukaan selepas salutan SAM, yang mempunyai penolak cecair yang sangat tinggi walaupun untuk EG, darah dan EtOH.Salutan SAM dilengkapkan dengan bertindak balas kumpulan berfungsi silane dengan kumpulan hidroksil yang dibentuk oleh rawatan plasma.Akibatnya, peningkatan ketara dalam puncak CF2 dan CF3 diperhatikan.Tenaga pengikat antara 286 dan 296 eV menunjukkan bahawa pengubahsuaian kimia telah berjaya diselesaikan oleh salutan SAM.SHP menunjukkan puncak CF2 (290.1 ​​​​eV) dan CF3 (293.3 eV) yang agak besar, yang disebabkan oleh silan berasaskan fluorokarbon yang terbentuk di permukaan.Rajah 2E menunjukkan imej optik perwakilan pengukuran sudut sentuhan (CA) untuk kumpulan air ternyahion yang berbeza yang bersentuhan dengan terdedah, terukir, SHP, dan LOIS.Imej-imej ini menunjukkan bahawa permukaan terukir menjadi hidrofilik disebabkan oleh struktur mikro/nano yang dibentuk oleh etsa kimia supaya air ternyahion diserap ke dalam struktur.Walau bagaimanapun, apabila substrat disalut dengan SAM, substrat mempamerkan penghalau air yang kuat, jadi permukaan SHP terbentuk dan kawasan sentuhan antara air dan permukaan adalah kecil.Akhirnya, penurunan CA telah diperhatikan dalam LOIS, yang boleh dikaitkan dengan penembusan pelincir ke dalam mikrostruktur, dengan itu meningkatkan kawasan sentuhan.Untuk membuktikan bahawa permukaan mempunyai sifat penolak cecair dan bukan pelekat yang sangat baik, LOIS telah dibandingkan dengan substrat SHP dengan mengukur CA dan SA menggunakan pelbagai cecair (Rajah 2F).Pelbagai jenis cecair dipilih berdasarkan kelikatan dan tenaga permukaan, termasuk air ternyahion, darah, EG, EtOH dan HD (Rajah S4).Keputusan pengukuran CA menunjukkan bahawa apabila CA cenderung kepada HD, nilai pengurangan CA, di mana CA mempunyai tenaga permukaan yang paling rendah.Di samping itu, LOIS keseluruhan CA adalah rendah.Walau bagaimanapun, pengukuran SA menunjukkan fenomena yang sama sekali berbeza.Kecuali air terion, semua cecair melekat pada substrat SHP tanpa tergelincir.Sebaliknya, LOIS menunjukkan SA yang sangat rendah, di mana apabila semua cecair dicondongkan pada sudut lebih rendah daripada 10° hingga 15°, semua cecair akan bergolek.Ini jelas menunjukkan bahawa ketaklekatan LOIS adalah lebih baik daripada permukaan SHP.Selain itu, salutan LOIS juga digunakan untuk pelbagai jenis bahan, termasuk titanium (Ti), polyphenylsulfone (PPSU), polyoxymethylene (POM), polyether ether ketone (PEEK) dan bioabsorbable polymers (PLGA), Mereka adalah bahan ortopedik yang boleh diimplan (Rajah). S5)).Imej berurutan titisan pada bahan yang dirawat oleh LOIS menunjukkan bahawa sifat anti-biofouling LOIS adalah sama pada semua substrat.Di samping itu, keputusan pengukuran CA dan SA menunjukkan bahawa sifat bukan pelekat LOIS boleh digunakan pada bahan lain.
Untuk mengesahkan sifat anti-kotoran LOIS, pelbagai jenis substrat (termasuk kosong, terukir, SHP dan LOIS) telah diinkubasi dengan Pseudomonas aeruginosa dan MRSA.Kedua-dua bakteria ini dipilih sebagai bakteria hospital perwakilan, yang boleh membawa kepada pembentukan biofilm, yang membawa kepada SSI (37).Rajah 3 (A dan B) menunjukkan imej mikroskop pendarfluor dan hasil pengukuran unit pembentuk koloni (CFU) bagi substrat yang diinkubasi dalam ampaian bakteria untuk jangka pendek (12 jam) dan jangka panjang (72 jam), masing-masing.Dalam tempoh yang singkat, bakteria akan membentuk kelompok dan membesar dalam saiz, menutup diri mereka dengan bahan seperti lendir dan menghalang penyingkirannya.Walau bagaimanapun, semasa pengeraman 72 jam, bakteria akan matang dan menjadi mudah tersebar untuk membentuk lebih banyak koloni atau kelompok.Oleh itu, boleh dianggap bahawa pengeraman 72 jam adalah jangka panjang dan merupakan masa pengeraman yang sesuai untuk membentuk biofilm yang kuat di permukaan (38).Dalam tempoh yang singkat, permukaan terukir dan permukaan SHP mempamerkan lekatan bakteria, yang dikurangkan kira-kira 25% hingga 50% berbanding substrat kosong.Walau bagaimanapun, disebabkan prestasi dan kestabilan anti-biofouling yang sangat baik, LOIS tidak menunjukkan lekatan biofilm bakteria dalam jangka pendek dan panjang.Gambarajah skematik (Rajah 3C) menerangkan penjelasan mekanisme pengotoran anti-biologi bagi larutan etsa, SHP dan LOIS.Andaian adalah bahawa substrat terukir dengan sifat hidrofilik akan mempunyai luas permukaan yang lebih besar daripada substrat kosong.Oleh itu, lebih banyak lekatan bakteria akan berlaku pada substrat yang terukir.Walau bagaimanapun, berbanding dengan substrat kosong, substrat terukir mempunyai lebih sedikit biofilm yang terbentuk di permukaan.Ini kerana molekul air mengikat kuat pada permukaan hidrofilik dan bertindak sebagai pelincir untuk air, sekali gus mengganggu lekatan bakteria dalam jangka pendek (39).Walau bagaimanapun, lapisan molekul air sangat nipis dan larut dalam ampaian bakteria.Oleh itu, lapisan molekul air hilang untuk masa yang lama, membawa kepada lekatan dan percambahan bakteria yang meluas.Untuk SHP, disebabkan sifat tidak membasahkan jangka pendeknya, lekatan bakteria dihalang.Lekatan bakteria yang berkurangan boleh dikaitkan dengan poket udara yang terperangkap dalam struktur berlapis dan tenaga permukaan yang lebih rendah, dengan itu meminimumkan sentuhan antara ampaian bakteria dan permukaan.Walau bagaimanapun, lekatan bakteria yang meluas diperhatikan dalam SHP kerana ia kehilangan sifat anti-kotorannya untuk masa yang lama.Ini disebabkan terutamanya oleh kehilangan poket udara akibat tekanan hidrostatik dan pelarutan udara di dalam air.Ini disebabkan terutamanya oleh kehilangan poket udara akibat pembubaran dan struktur berlapis yang menyediakan kawasan permukaan yang lebih besar untuk lekatan (27, 40).Tidak seperti dua substrat yang mempunyai kesan penting terhadap kestabilan jangka panjang, pelincir pelincir yang terkandung dalam LOIS disuntik ke dalam struktur mikro/nano dan tidak akan hilang walaupun dalam jangka panjang.Pelincir yang diisi dengan struktur mikro/nano sangat stabil dan sangat tertarik pada permukaan kerana pertalian kimia yang tinggi, dengan itu menghalang lekatan bakteria untuk jangka masa yang lama.Rajah S6 menunjukkan imej mikroskop confocal pantulan bagi substrat yang diselitkan pelincir yang direndam dalam salin buffer fosfat (PBS).Imej berterusan menunjukkan bahawa walaupun selepas 120 jam gegaran sedikit (120 rpm), lapisan pelincir pada LOIS kekal tidak berubah, menunjukkan kestabilan jangka panjang di bawah keadaan aliran.Ini disebabkan oleh pertalian kimia yang tinggi antara salutan SAM berasaskan fluorin dan pelincir berasaskan perfluorokarbon, supaya lapisan pelincir yang stabil boleh dibentuk.Oleh itu, prestasi anti-fouling dikekalkan.Di samping itu, substrat diuji terhadap protein perwakilan (albumin dan fibrinogen), yang berada dalam plasma, sel yang berkait rapat dengan fungsi imun (makrofaj dan fibroblas), dan yang berkaitan dengan pembentukan tulang.Kandungan kalsium sangat tinggi.(Rajah 3D, 1 dan 2, dan Rajah S7) (41, 42).Di samping itu, imej mikroskop pendarfluor ujian lekatan untuk fibrinogen, albumin dan kalsium menunjukkan ciri lekatan yang berbeza bagi setiap kumpulan substrat (Rajah S8).Semasa pembentukan tulang, lapisan tulang dan kalsium yang baru terbentuk mungkin mengelilingi implan ortopedik, yang bukan sahaja menyukarkan penyingkiran, tetapi juga boleh menyebabkan kemudaratan yang tidak dijangka kepada pesakit semasa proses penyingkiran.Oleh itu, tahap deposit kalsium yang rendah pada plat tulang dan skru bermanfaat untuk pembedahan ortopedik yang memerlukan penyingkiran implan.Berdasarkan kuantifikasi kawasan yang dilampirkan berdasarkan keamatan pendarfluor dan kiraan sel, kami mengesahkan bahawa LOIS menunjukkan sifat anti-biofouling yang sangat baik untuk semua bahan biologi berbanding dengan substrat lain.Mengikut keputusan eksperimen in vitro, LOIS anti-biologi pengotor boleh digunakan pada implan ortopedik, yang bukan sahaja boleh menghalang jangkitan yang disebabkan oleh bakteria biofilm, tetapi juga mengurangkan keradangan yang disebabkan oleh sistem imun badan yang aktif.
(A) Imej mikroskop pendarfluor setiap kumpulan (telanjang, terukir, SHP dan LOIS) diinkubasi dalam penggantungan Pseudomonas aeruginosa dan MRSA selama 12 dan 72 jam.(B) Bilangan CFU yang mematuhi Pseudomonas aeruginosa dan MRSA pada permukaan setiap kumpulan.(C) Gambarajah skematik mekanisme pengotoran anti-biologi goresan jangka pendek dan jangka panjang, SHP dan LOIS.(D) (1) Bilangan fibroblas yang melekat pada setiap substrat dan imej mikroskop pendarfluor sel yang melekat pada terdedah dan LOIS.(2) Ujian lekatan protein berkaitan imun, albumin dan kalsium yang terlibat dalam proses penyembuhan tulang (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 dan **** P <0.0001).ns, tidak penting.
Dalam kes tegasan pekat yang tidak dapat dielakkan, ketahanan mekanikal sentiasa menjadi cabaran utama untuk penggunaan salutan antifouling.Kaedah gel anti-kumbahan tradisional adalah berdasarkan polimer dengan keterlarutan air yang rendah dan kerapuhan.Oleh itu, mereka biasanya terdedah kepada tekanan mekanikal dalam aplikasi bioperubatan.Oleh itu, salutan antifouling tahan lama secara mekanikal kekal sebagai cabaran untuk aplikasi seperti implan ortopedik (43, 44).Rajah 4A(1) menunjukkan dua jenis tegasan utama yang dikenakan pada implan ortopedik, termasuk calar (tegasan ricih) dan mampatan dengan imej optik implan rosak yang dihasilkan oleh forsep.Sebagai contoh, apabila skru diketatkan dengan pemutar skru, atau apabila pakar bedah memegang plat tulang dengan ketat dengan pinset dan menggunakan daya mampatan, plat tulang plastik akan rosak dan tercalar pada kedua-dua skala makro dan mikro/nano (Rajah 4A, 2) .Untuk menguji sama ada LOIS yang dihasilkan boleh menahan kerosakan ini semasa pembedahan plastik, nanoindentation dilakukan untuk membandingkan kekerasan substrat kosong dan LOIS pada skala mikro/nano untuk mengkaji sifat mekanikal struktur mikro/nano Impak (Rajah). 4B).Gambarajah skematik menunjukkan tingkah laku ubah bentuk LOIS yang berbeza disebabkan oleh kehadiran struktur mikro/nano.Lengkung daya-anjakan telah dilukis berdasarkan keputusan nanoindentation (Rajah 4C).Imej biru mewakili substrat kosong, yang hanya menunjukkan sedikit ubah bentuk, seperti yang dilihat oleh kedalaman lekukan maksimum 0.26-μm.Sebaliknya, peningkatan beransur-ansur dalam daya indentasi nano dan anjakan yang diperhatikan dalam LOIS (lengkung merah) mungkin menunjukkan tanda-tanda sifat mekanikal yang berkurangan, menghasilkan kedalaman nanoindentation sebanyak 1.61μm.Ini kerana struktur mikro/nano yang terdapat dalam LOIS menyediakan ruang kemajuan yang lebih mendalam untuk hujung nanoinden, jadi ubah bentuknya lebih besar daripada substrat kosong.Konsta-Gdoutos et al.(45) percaya bahawa disebabkan oleh kehadiran struktur nano, nanoindentation dan mikro/nano kekasaran membawa kepada lengkung nanoindentation yang tidak teratur.Kawasan berlorek sepadan dengan lengkung ubah bentuk tidak sekata yang dikaitkan dengan struktur nano, manakala kawasan tidak berlorek dikaitkan dengan struktur mikro.Ubah bentuk ini boleh merosakkan struktur mikro/struktur nano pelincir pemegang dan menjejaskan prestasi anti-kotorannya secara negatif.Untuk mengkaji kesan kerosakan pada LOIS, kerosakan yang tidak dapat dielakkan pada struktur mikro/nano telah direplikasi dalam badan semasa pembedahan plastik.Dengan menggunakan ujian lekatan darah dan protein, kestabilan sifat anti-biofouling LOIS selepas in vitro boleh ditentukan (Rajah 4D).Satu siri imej optik menunjukkan kerosakan yang berlaku berhampiran lubang setiap substrat.Ujian lekatan darah telah dilakukan untuk menunjukkan kesan kerosakan mekanikal pada salutan anti-biofouling (Rajah 4E).Seperti SHP, sifat anti-kotoran hilang akibat kerosakan, dan LOIS mempamerkan sifat anti-kotoran yang sangat baik dengan menangkis darah.Ini kerana, kerana tenaga permukaan didorong oleh tindakan kapilari yang meliputi kawasan yang rosak, aliran dalam pelincir pelincir mikrostruktur memulihkan sifat anti-kotoran (35).Trend yang sama diperhatikan dalam ujian lekatan protein menggunakan albumin.Di kawasan yang rosak, lekatan protein pada permukaan SHP diperhatikan secara meluas, dan dengan mengukur liputan kawasannya, ia boleh dikira sebagai separuh daripada tahap lekatan substrat kosong.Sebaliknya, LOIS mengekalkan sifat anti-biofoulingnya tanpa menyebabkan lekatan (Rajah 4, F dan G).Di samping itu, permukaan skru sering mengalami tekanan mekanikal yang kuat, seperti penggerudian, jadi kami mengkaji keupayaan salutan LOIS untuk kekal utuh pada skru secara in vitro.Rajah 4H menunjukkan imej optik skru berbeza, termasuk terdedah, SHP dan LOIS.Segi empat tepat merah mewakili kawasan sasaran di mana tekanan mekanikal yang kuat berlaku semasa implantasi tulang.Sama seperti ujian lekatan protein plat, mikroskop pendarfluor digunakan untuk menggambarkan lekatan protein dan mengukur kawasan liputan untuk membuktikan integriti salutan LOIS, walaupun di bawah tekanan mekanikal yang kuat (Rajah 4, I dan J).Skru yang dirawat LOIS mempamerkan prestasi anti-kotoran yang sangat baik, dan hampir tiada protein melekat pada permukaan.Sebaliknya, lekatan protein diperhatikan dalam skru kosong dan skru SHP, di mana liputan kawasan skru SHP adalah satu pertiga daripada skru kosong.Di samping itu, implan ortopedik yang digunakan untuk penetapan mestilah kuat secara mekanikal untuk menahan tekanan yang dikenakan pada tapak patah, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 4K.Oleh itu, ujian lenturan dilakukan untuk menentukan kesan pengubahsuaian kimia terhadap sifat mekanikal.Di samping itu, ini dilakukan untuk mengekalkan tekanan tetap dari implan.Guna daya mekanikal menegak sehingga implan dilipat sepenuhnya dan lengkung tegasan-terikan diperolehi (Rajah 4L, 1).Dua sifat termasuk modulus Young dan kekuatan lentur telah dibandingkan antara substrat kosong dan LOIS sebagai penunjuk kekuatan mekanikalnya (Rajah 4L, 2 dan 3).Modulus Young menunjukkan keupayaan bahan untuk menahan perubahan mekanikal.Modulus Young bagi setiap substrat ialah 41.48±1.01 dan 40.06±0.96 GPa, masing-masing;perbezaan yang diperhatikan adalah kira-kira 3.4%.Di samping itu, dilaporkan bahawa kekuatan lenturan, yang menentukan keliatan bahan, ialah 102.34±1.51 GPa untuk substrat kosong dan 96.99±0.86 GPa untuk SHP.Substrat kosong adalah lebih kurang 5.3% lebih tinggi.Penurunan sedikit sifat mekanikal mungkin disebabkan oleh kesan takuk.Dalam kesan takuk, kekasaran mikro/nano boleh bertindak sebagai satu set takuk, membawa kepada kepekatan tegasan tempatan dan menjejaskan sifat mekanikal implan (46).Walau bagaimanapun, berdasarkan fakta bahawa kekakuan tulang kortikal manusia dilaporkan antara 7.4 dan 31.6 GPa, dan modulus LOIS yang diukur melebihi tulang kortikal manusia (47), LOIS adalah mencukupi untuk menyokong patah dan keseluruhannya. sifat mekanikal dipengaruhi secara minimum oleh pengubahsuaian permukaan.
(A) Gambarajah skematik (1) tekanan mekanikal yang dikenakan pada implan ortopedik semasa operasi, dan (2) imej optik implan ortopedik yang rosak.(B) Gambarajah skematik pengukuran sifat nano-mekanikal dengan nanoindentation dan LOIS pada permukaan kosong.(C) Lengkung daya-sesaran nano bagi permukaan terdedah dan LOIS.(D) Selepas eksperimen in vitro, simulasi imej optik pelbagai jenis plat ortopedik (kawasan yang rosak diserlahkan dengan segi empat tepat merah) untuk mensimulasikan tekanan mekanikal yang disebabkan semasa operasi.(E) Ujian lekatan darah dan (F) ujian lekatan protein kumpulan plat ortopedik yang rosak.(G) Ukur liputan kawasan protein yang melekat pada plat.(H) Imej optik pelbagai jenis skru ortopedik selepas eksperimen in vitro.(I) Ujian lekatan protein untuk mengkaji integriti salutan yang berbeza.(J) Ukur litupan kawasan protein yang melekat pada skru.(K) Pergerakan arnab bertujuan untuk menghasilkan tekanan tetap pada tulang yang patah.(L) (1) Bengkokkan keputusan ujian dan imej optik sebelum dan selepas lentur.Perbezaan dalam (2) modulus Young dan (3) kekuatan lenturan antara implan kosong dan SHP.Data dinyatakan sebagai min ± SD (* P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 dan ****P<0.0001).Ihsan gambar: Kyomin Chae, Universiti Yonsei.
Dalam situasi klinikal, kebanyakan sentuhan bakteria dengan bahan biologi dan tapak luka datang daripada biofilm matang dan matang (48).Oleh itu, Pusat Kawalan dan Pencegahan Penyakit AS menganggarkan bahawa 65% daripada semua jangkitan manusia adalah berkaitan dengan biofilm (49).Dalam kes ini, adalah perlu untuk menyediakan reka bentuk eksperimen in vivo yang menyediakan pembentukan biofilm yang konsisten pada permukaan implan.Oleh itu, kami membangunkan model patah tulang paha arnab di mana implan ortopedik telah diinkubasi terlebih dahulu dalam penggantungan bakteria dan kemudian ditanam dalam tulang paha arnab untuk mengkaji sifat anti-kotoran LOIS dalam vivo.Disebabkan oleh tiga fakta penting berikut, jangkitan bakteria disebabkan oleh pra-kultur dan bukannya suntikan langsung penggantungan bakteria: (i) Sistem imun arnab secara semula jadi lebih kuat daripada manusia;oleh itu, suntikan ampaian bakteria dan bakteria planktonik adalah mungkin Ia tidak mempunyai kesan ke atas pembentukan biofilm.(Ii) Bakteria planktonik lebih mudah terdedah kepada antibiotik, dan antibiotik biasanya digunakan selepas pembedahan;akhirnya, (iii) ampaian bakteria planktonik boleh dicairkan oleh cecair badan haiwan (50).Dengan pra-kultur implan dalam penggantungan bakteria sebelum implantasi, kita boleh mengkaji dengan teliti kesan berbahaya jangkitan bakteria dan tindak balas badan asing (FBR) pada proses penyembuhan tulang.Arnab dikorbankan 4 minggu selepas implantasi, kerana osseointegrasi yang penting untuk proses penyembuhan tulang akan selesai dalam masa 4 minggu.Kemudian, implan dikeluarkan daripada arnab untuk kajian hiliran.Rajah 5A menunjukkan mekanisme pembiakan bakteria.Implan ortopedik yang dijangkiti dimasukkan ke dalam badan.Hasil daripada pra-inkubasi dalam penggantungan bakteria, enam daripada enam arnab yang ditanam dengan implan telanjang telah dijangkiti, manakala tiada arnab yang ditanam dengan implan yang dirawat LOIS telah dijangkiti.Jangkitan bakteria diteruskan dalam tiga langkah, termasuk pertumbuhan, kematangan dan penyebaran (51).Pertama, bakteria yang melekat membiak dan tumbuh di permukaan, dan kemudian bakteria membentuk biofilm apabila mereka mengeluarkan polimer ekstraselular (EPS), amiloid dan DNA ekstraselular.Biofilm bukan sahaja mengganggu penembusan antibiotik, tetapi juga menggalakkan pengumpulan enzim pengurai antibiotik (seperti β-laktamase) (52).Akhirnya, biofilm menyebarkan bakteria matang ke dalam tisu sekeliling.Oleh itu, jangkitan berlaku.Di samping itu, apabila badan asing memasuki badan, jangkitan yang boleh menyebabkan tindak balas imun yang kuat boleh menyebabkan keradangan teruk, sakit, dan penurunan imuniti.Rajah 5B memberikan gambaran keseluruhan FBR yang disebabkan oleh pemasukan implan ortopedik, bukannya tindak balas imun yang disebabkan oleh jangkitan bakteria.Sistem imun mengiktiraf implan yang dimasukkan sebagai badan asing, dan kemudian menyebabkan sel dan tisu bertindak balas untuk membungkus badan asing (53).Pada hari-hari awal FBR, matriks bekalan telah terbentuk pada permukaan implan ortopedik, yang mengakibatkan penjerapan fibrinogen.Fibrinogen yang terserap kemudian membentuk rangkaian fibrin yang sangat padat, yang menggalakkan perlekatan leukosit (54).Sebaik sahaja rangkaian fibrin terbentuk, keradangan akut akan berlaku akibat penyusupan neutrofil.Dalam langkah ini, pelbagai sitokin seperti faktor nekrosis tumor-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) dan IL-β dikeluarkan, dan monosit mula menyusup ke tapak implantasi dan membezakan ke dalam sel gergasi.Phage (41, 55, 56).Mengurangkan FBR sentiasa menjadi cabaran kerana FBR yang berlebihan boleh menyebabkan keradangan akut dan kronik, yang boleh membawa kepada komplikasi yang membawa maut.Untuk menilai kesan jangkitan bakteria pada tisu yang mengelilingi implan kosong dan LOIS, pewarnaan hematoxylin dan eosin (H&E) dan Masson trichrome (MT) digunakan.Bagi arnab yang ditanam dengan substrat kosong, jangkitan bakteria yang teruk berkembang, dan slaid tisu H&E jelas menunjukkan abses dan nekrosis yang disebabkan oleh keradangan.Sebaliknya, permukaan anti-biofouling yang sangat kuat LOIS menghalang lekatan bakteria, jadi ia tidak menunjukkan tanda-tanda jangkitan dan mengurangkan keradangan (Rajah 5C).Keputusan pewarnaan MT menunjukkan trend yang sama.Walau bagaimanapun, pewarnaan MT juga menunjukkan edema pada arnab yang ditanam dengan LOIS, menunjukkan bahawa pemulihan akan berlaku (Rajah 5D).Untuk mengkaji tahap tindak balas imun, pewarnaan imunohistokimia (IHC) dilakukan menggunakan sitokin TNF-α dan IL-6 yang berkaitan dengan tindak balas imun.Implan negatif telanjang yang tidak terdedah kepada bakteria dibandingkan dengan LOIS yang terdedah kepada bakteria tetapi tidak dijangkiti untuk mengkaji proses penyembuhan jika tiada jangkitan bakteria.Rajah 5E menunjukkan imej optik slaid IHC yang menyatakan TNF-α.Kawasan coklat mewakili tindak balas imun, menunjukkan bahawa tindak balas imun dalam LOIS berkurangan sedikit.Di samping itu, ungkapan IL-6 dalam LOIS adalah jauh lebih rendah daripada ungkapan negatif telanjang steril (Rajah 5F).Ekspresi sitokin dikira dengan mengukur kawasan pewarnaan antibodi yang sepadan dengan sitokin (Rajah 5G).Berbanding dengan arnab yang terdedah kepada implan negatif, tahap ekspresi arnab yang diimplan dengan LOIS adalah lebih rendah, menunjukkan perbezaan yang bermakna.Pengurangan dalam ekspresi sitokin menunjukkan bahawa sifat anti-kotoran jangka panjang dan stabil LOIS bukan sahaja berkaitan dengan perencatan jangkitan bakteria, tetapi juga dengan penurunan FBR, yang disebabkan oleh makrofaj yang melekat pada substrat (53, 57, 58).Oleh itu, tindak balas imun yang berkurangan akibat sifat pengelakan imun LOIS boleh menyelesaikan kesan sampingan selepas implantasi, seperti tindak balas imun yang berlebihan selepas pembedahan plastik.
(A) Gambarajah skematik mekanisme pembentukan biofilm dan merebak pada permukaan implan ortopedik yang dijangkiti.eDNA, DNA ekstraselular.(B) Gambarajah skematik tindak balas imun selepas penyisipan implan ortopedik.(C) Pewarnaan H&E dan (D) Pewarnaan MT pada tisu sekeliling implan ortopedik dengan positif terdedah dan LOIS.IHC sitokin yang berkaitan dengan imun (E) TNF-α dan (F) IL-6 ialah imej bernoda arnab telanjang-negatif dan LOIS yang diimplan.(G) Kuantifikasi ekspresi sitokin mengikut ukuran liputan kawasan (** P <0.01).
Kesesuaian bio LOIS dan kesannya terhadap proses penyembuhan tulang telah diperiksa secara in vivo menggunakan pengimejan diagnostik [x-ray dan tomografi mikro-komputer (CT)] dan osteoklas IHC.Rajah 6A menunjukkan proses penyembuhan tulang yang melibatkan tiga peringkat berbeza: keradangan, pembaikan dan pembentukan semula.Apabila patah tulang berlaku, sel-sel radang dan fibroblas akan menembusi ke dalam tulang yang patah dan mula berkembang ke dalam tisu vaskular.Semasa fasa pembaikan, pertumbuhan tisu vaskular merebak berhampiran tapak patah.Tisu vaskular menyediakan nutrien untuk pembentukan tulang baru, yang dipanggil kalus.Peringkat akhir proses penyembuhan tulang adalah peringkat pembentukan semula, di mana saiz kalus dikurangkan kepada saiz tulang normal dengan bantuan peningkatan tahap osteoklas yang diaktifkan (59).Pembinaan semula tiga dimensi (3D) tapak patah dilakukan menggunakan imbasan mikro-CT untuk memerhatikan perbezaan tahap pembentukan kalus dalam setiap kumpulan.Perhatikan keratan rentas femur untuk melihat ketebalan kalus yang mengelilingi tulang yang patah (Rajah 6, B dan C).X-ray juga digunakan untuk memeriksa tapak patah semua kumpulan setiap minggu untuk memerhatikan proses penjanaan semula tulang yang berbeza dalam setiap kumpulan (Rajah S9).Kalus dan tulang matang ditunjukkan dalam warna biru/hijau dan gading, masing-masing.Kebanyakan tisu lembut ditapis dengan ambang pratetap.Positif bogel dan SHP mengesahkan pembentukan sedikit kalus di sekitar tapak patah.Sebaliknya, negatif terdedah LOIS dan tapak patah dikelilingi oleh kalus tebal.Imej mikro-CT menunjukkan bahawa pembentukan kalus dihalang oleh jangkitan bakteria dan keradangan berkaitan jangkitan.Ini kerana sistem imun mengutamakan penyembuhan kecederaan septik yang disebabkan oleh keradangan yang berkaitan dengan jangkitan, dan bukannya pemulihan tulang (60).Pewarnaan IHC dan Tartrate-resistant Acid Phosphatase (TRAP) dilakukan untuk memerhatikan aktiviti osteoklas dan penyerapan tulang (Rajah 6D) (61).Hanya beberapa osteoklas yang diaktifkan berwarna ungu ditemui dalam positif telanjang dan SHP.Sebaliknya, banyak osteoklas yang diaktifkan telah diperhatikan berhampiran tulang positif dan matang LOIS yang telanjang.Fenomena ini menunjukkan bahawa dengan kehadiran osteoklas, kalus di sekeliling tapak patah sedang menjalani proses pembentukan semula yang ganas (62).Isipadu tulang dan kawasan ekspresi osteoklas kalus diukur untuk membandingkan tahap pembentukan kalus di sekeliling tapak patah dalam semua kumpulan, supaya dapat mengukur hasil imbasan mikro-CT dan IHC (Rajah 6E, 1 dan 2).Seperti yang dijangkakan, negatif telanjang dan pembentukan kalus dalam LOIS adalah lebih tinggi daripada kumpulan lain, menunjukkan bahawa pembentukan semula tulang positif berlaku (63).Rajah S10 menunjukkan imej optik tapak pembedahan, hasil pewarnaan MT tisu yang dikumpulkan berhampiran skru, dan hasil pewarnaan TRAP yang menonjolkan antara muka tulang skru.Dalam substrat kosong, pembentukan kalus dan fibrosis yang kuat diperhatikan, manakala implan yang dirawat LOIS menunjukkan permukaan yang agak tidak dipatuhi.Begitu juga, berbanding dengan negatif telanjang, fibrosis yang lebih rendah diperhatikan pada arnab yang ditanam dengan LOIS, seperti yang ditunjukkan oleh anak panah putih.Di samping itu, edema firma (anak panah biru) boleh dikaitkan dengan sifat pengelakan imun LOIS, dengan itu mengurangkan keradangan teruk.Permukaan tidak melekat di sekeliling implan dan fibrosis yang berkurangan menunjukkan bahawa proses penyingkiran lebih mudah, yang biasanya mengakibatkan patah tulang atau keradangan lain.Proses penyembuhan tulang selepas penyingkiran skru dinilai oleh aktiviti osteoklas pada antara muka tulang skru.Kedua-dua tulang kosong dan antara muka implan LOIS menyerap tahap osteoklas yang serupa untuk penyembuhan tulang selanjutnya, menunjukkan bahawa salutan LOIS tidak mempunyai kesan negatif terhadap penyembuhan tulang atau tindak balas imun.Untuk mengesahkan bahawa pengubahsuaian permukaan yang dilakukan pada LOIS tidak mengganggu proses penyembuhan tulang, pemeriksaan X-ray digunakan untuk membandingkan penyembuhan tulang arnab dengan ion negatif terdedah dan 6 minggu implantasi LOIS (Rajah 6F).Keputusan menunjukkan bahawa berbanding dengan kumpulan positif bogel yang tidak dijangkiti, LOIS menunjukkan tahap penyembuhan tulang yang sama, dan tiada tanda-tanda patah tulang yang jelas (garisan osteolisis berterusan) dalam kedua-dua kumpulan.
(A) Gambarajah skematik proses penyembuhan tulang selepas patah tulang.(B) Perbezaan tahap pembentukan kalus setiap kumpulan permukaan dan (C) imej keratan rentas tapak patah.(D) Pewarnaan TRAP untuk menggambarkan aktiviti osteoklas dan penyerapan tulang.Berdasarkan aktiviti TRAP, pembentukan kalus luar tulang kortikal dianalisis secara kuantitatif oleh (E) (1) mikro-CT dan (2) aktiviti osteoklas.(F) 6 minggu selepas implantasi, imej X-ray bagi tulang patah negatif terdedah (diserlahkan oleh segi empat putus-putus merah) dan LOIS (diserlahkan oleh segi empat putus-putus biru).Analisis statistik dilakukan dengan analisis varians sehala (ANOVA).* P <0.05.** P <0.01.
Ringkasnya, LOIS menyediakan strategi jangkitan antibakteria jenis baharu dan salutan pelepasan imun untuk implan ortopedik.Implan ortopedik konvensional dengan kefungsian SHP mempamerkan sifat anti-biofouling jangka pendek, tetapi tidak dapat mengekalkan sifatnya untuk masa yang lama.Superhydrophobicity substrat memerangkap gelembung udara antara bakteria dan substrat, dengan itu membentuk poket udara, dengan itu menghalang jangkitan bakteria.Walau bagaimanapun, disebabkan oleh penyebaran udara, poket udara ini mudah dikeluarkan.Sebaliknya, LOIS telah membuktikan keupayaannya untuk mencegah jangkitan berkaitan biofilm.Oleh itu, disebabkan oleh sifat anti-penolakan lapisan pelincir yang disuntik ke dalam permukaan struktur mikro/nano berlapis, keradangan yang berkaitan dengan jangkitan boleh dicegah.Pelbagai kaedah pencirian termasuk pengukuran SEM, AFM, XPS dan CA digunakan untuk mengoptimumkan keadaan pembuatan LOIS.Selain itu, LOIS juga boleh digunakan untuk pelbagai bahan biologi yang biasa digunakan dalam peralatan penetapan ortopedik, seperti PLGA, Ti, PE, POM dan PPSU.Kemudian, LOIS telah diuji secara in vitro untuk membuktikan sifat anti-biofoulingnya terhadap bakteria dan bahan biologi yang berkaitan dengan tindak balas imun.Keputusan menunjukkan bahawa ia mempunyai kesan antibakteria dan anti-biofouling yang sangat baik berbanding dengan implan kosong.Di samping itu, LOIS menunjukkan kekuatan mekanikal walaupun selepas menggunakan tekanan mekanikal, yang tidak dapat dielakkan dalam pembedahan plastik.Oleh kerana sifat penyembuhan diri pelincir pada permukaan struktur mikro/nano, LOIS berjaya mengekalkan sifat pengotoran anti-biologinya.Untuk mengkaji biokompatibiliti dan sifat antibakteria LOIS dalam vivo, LOIS telah ditanamkan ke tulang paha arnab selama 4 minggu.Tiada jangkitan bakteria diperhatikan pada arnab yang ditanam dengan LOIS.Di samping itu, penggunaan IHC menunjukkan tahap penurunan tindak balas imun tempatan, menunjukkan bahawa LOIS tidak menghalang proses penyembuhan tulang.LOIS mempamerkan ciri antibakteria dan pengelakan imun yang sangat baik, dan telah terbukti berkesan menghalang pembentukan biofilm sebelum dan semasa pembedahan ortopedik, terutamanya untuk sintesis tulang.Dengan menggunakan model patah tulang femoral radang sumsum tulang arnab, kesan jangkitan berkaitan biofilm pada proses penyembuhan tulang yang disebabkan oleh implan pra-inkubasi telah dikaji dengan mendalam.Sebagai kajian masa depan, model in vivo baharu diperlukan untuk mengkaji kemungkinan jangkitan selepas implantasi untuk memahami sepenuhnya dan mencegah jangkitan berkaitan biofilm semasa keseluruhan proses penyembuhan.Di samping itu, osteoinduksi masih merupakan cabaran yang tidak dapat diselesaikan dalam integrasi dengan LOIS.Kajian lanjut diperlukan untuk menggabungkan lekatan terpilih sel osteoinduktif atau ubat regeneratif dengan LOIS untuk mengatasi cabaran.Secara keseluruhan, LOIS mewakili salutan implan ortopedik yang menjanjikan dengan keteguhan mekanikal dan sifat anti-biofouling yang sangat baik, yang boleh mengurangkan SSI dan kesan sampingan imun.
Basuh substrat 15mm x 15mm x 1mm 304 SS (Dong Kang M-Tech Co., Korea) dalam aseton, EtOH dan air DI selama 15 minit untuk membuang bahan cemar.Untuk membentuk struktur tahap mikro/nano pada permukaan, substrat yang telah dibersihkan direndam dalam larutan HF 48% hingga 51% (DUKSAN Corp., Korea Selatan) pada 50°C.Masa etsa berbeza dari 0 hingga 60 minit.Kemudian, substrat yang terukir dibersihkan dengan air ternyahion dan diletakkan dalam larutan 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) pada 50°C selama 30 minit untuk membentuk lapisan pempasifan kromium oksida pada permukaan.Selepas pempasifan, substrat dibasuh dengan air ternyahion dan dikeringkan untuk mendapatkan substrat dengan struktur berlapis.Seterusnya, substrat didedahkan kepada plasma oksigen (100 W, 3 minit), dan segera direndam dalam larutan 8.88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Jerman) dalam toluena pada suhu bilik selama 12 jam.Kemudian, substrat yang disalut dengan POTS dibersihkan dengan EtOH, dan disepuhlindapkan pada 150°C selama 2 jam untuk mendapatkan SAM POTS yang padat.Selepas salutan SAM, lapisan pelincir terbentuk pada substrat dengan menggunakan pelincir perfluoropolieter (Krytox 101; DuPont, USA) dengan isipadu pemuatan 20 μm/cm 2. Sebelum digunakan, tapis pelincir melalui penapis 0.2 mikron.Keluarkan pelincir berlebihan dengan mencondongkan pada sudut 45° selama 15 minit.Prosedur pembuatan yang sama digunakan untuk implan ortopedik yang diperbuat daripada 304 SS (plat pengunci dan skru pengunci kortikal; Dong Kang M-Tech Co., Korea).Semua implan ortopedik direka bentuk agar sesuai dengan geometri tulang paha arnab.
Morfologi permukaan substrat dan implan ortopedik telah diperiksa oleh pelepasan medan SEM (Periksa F50, FEI, Amerika Syarikat) dan AFM (XE-100, Park Systems, Korea Selatan).Kekasaran permukaan (Ra, Rq) diukur dengan mendarabkan luas 20 μm dengan 20 μm (n=4).Sistem XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Jepun) yang dilengkapi dengan sumber sinar-X Al Kα dengan saiz tempat 100μm2 digunakan untuk menganalisis komposisi kimia permukaan.Sistem pengukuran CA yang dilengkapi dengan kamera tangkapan imej dinamik (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Korea Selatan) digunakan untuk mengukur cecair CA dan SA.Untuk setiap pengukuran, 6 hingga 10 μl titisan (air ternyahiion, darah kuda, EG, 30% etanol dan HD) diletakkan di permukaan untuk mengukur CA.Apabila sudut kecondongan substrat meningkat pada kelajuan 2°/s (n = 4), SA diukur apabila titisan jatuh.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] dan MRSA (ATCC 25923) telah dibeli daripada ATCC (Manassas, Virginia, USA), dan budaya stok dikekalkan pada -80°C .Sebelum digunakan, kultur beku telah diinkubasi dalam sup kacang soya yang dicairkan trypsin (Komed, Korea) pada suhu 37°C selama 18 jam dan kemudian dipindahkan dua kali untuk mengaktifkannya.Selepas pengeraman, kultur disentrifugasi pada 10,000 rpm selama 10 minit pada suhu 4°C dan dibasuh dua kali dengan larutan PBS (pH 7.3).Kultur yang disentrifugasi kemudiannya disubkultur pada plat agar darah (BAP).MRSA dan Pseudomonas aeruginosa disediakan semalaman dan dikultur dalam sup Luria-Bertani.Kepekatan Pseudomonas aeruginosa dan MRSA dalam inokulum ditentukan secara kuantitatif oleh CFU penggantungan dalam pencairan bersiri pada agar.Kemudian, laraskan kepekatan bakteria kepada 0.5 piawai McFarland, yang bersamaan dengan 108 CFU/ml.Kemudian cairkan penggantungan bakteria yang berfungsi 100 kali kepada 106 CFU/ml.Untuk menguji sifat lekatan antibakteria, substrat disterilkan pada suhu 121°C selama 15 minit sebelum digunakan.Substrat kemudian dipindahkan ke 25 ml penggantungan bakteria dan diinkubasi pada 37 ° C dengan goncangan kuat (200 rpm) selama 12 dan 72 jam.Selepas pengeraman, setiap substrat dikeluarkan dari inkubator dan dibasuh 3 kali dengan PBS untuk membuang sebarang bakteria terapung di permukaan.Untuk memerhatikan biofilm pada substrat, biofilem itu difiksasi dengan metanol dan diwarnai dengan 1 ml oren krimidin selama 2 minit.Kemudian mikroskop pendarfluor (BX51TR, Olympus, Jepun) digunakan untuk mengambil gambar biofilem berwarna.Untuk mengukur biofilm pada substrat, sel yang melekat dipisahkan daripada substrat dengan kaedah pusaran manik, yang dianggap sebagai kaedah yang paling sesuai untuk membuang bakteria yang melekat (n = 4).Menggunakan forsep steril, keluarkan substrat daripada medium pertumbuhan dan ketuk plat perigi untuk mengeluarkan cecair yang berlebihan.Sel-sel yang melekat longgar dikeluarkan dengan mencuci dua kali dengan PBS steril.Setiap substrat kemudiannya dipindahkan ke tabung uji steril yang mengandungi 9 ml 0.1% protein ept saline (PSW) dan 2 g 20 hingga 25 manik kaca steril (diameter 0.4 hingga 0.5 mm).Ia kemudian dipusingkan selama 3 minit untuk memisahkan sel daripada sampel.Selepas vorteks, penggantungan dicairkan secara bersiri 10 kali ganda dengan 0.1% PSW, dan kemudian 0.1 ml setiap pencairan telah diinokulasi pada BAP.Selepas 24 jam pengeraman pada 37°C, CFU dikira secara manual.
Untuk sel, fibroblas tetikus NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) dan makrofaj tetikus RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC) telah digunakan.Gunakan medium Eagle yang diubah suai Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Korea) untuk menkultur fibroblas tikus dan menambah dengan 10% serum anak lembu (S103-01, Welgene) dan 1% penicillin-streptomycin (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene Gunakan DMEM untuk mengkultur makrofaj tikus, ditambah dengan 10% serum lembu janin (S001-01, Welgene) dan 1% PS Letakkan substrat dalam plat kultur sel enam telaga, Dan inokulasi sel pada 105 sel/cm2. Sel-sel telah diinkubasi semalaman pada suhu 37°C dan 5% CO2 Untuk pewarnaan sel, sel-sel telah difiksasi dengan 4% paraformaldehyde selama 20 minit dan diletakkan dalam 0.5% Triton X Incubate selama 5 minit dalam -100nM tetramethylrhodamine pada 37°C selama 30 minit Selepas proses pengeraman, gunakan substrat dengan 4′,6-diamino-2-phenylindole (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD medium fiksasi (n = 4 setiap sel). , fluorescein, fluorescein isothiocyanate-albumin (A9771, Sigma-Aldrich, Jerman) dan plasma manusia Fibrinogen terkonjugasi Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, Amerika Syarikat) telah dibubarkan dalam PBS (10 mM, pH 7.4).Kepekatan albumin dan fibrinogen ialah 1 dan 150 μg/ml, masing-masing.Selepas substrat Sebelum merendam dalam larutan protein, bilas dengan PBS untuk menghidrat semula permukaan.Kemudian rendam semua substrat dalam plat enam perigi yang mengandungi larutan protein dan eramkan pada suhu 37°C selama 30 dan 90 minit.Selepas pengeraman, Substrat kemudian dikeluarkan dari larutan protein, dibasuh perlahan-lahan dengan PBS 3 kali, dan difiksasi dengan 4% paraformaldehid (n = 4 untuk setiap protein).Untuk kalsium, natrium klorida (0.21 M) dan kalium fosfat (3.77 mM) ) Telah dilarutkan dalam air ternyahion.pH larutan diselaraskan kepada 2.0 dengan menambahkan larutan hidroklorida (1M).Kemudian kalsium klorida (5.62 mM) telah dilarutkan dalam larutan.Dengan menambahkan 1M tris(hydroxymethyl)-amino Methane melaraskan pH larutan kepada 7.4.Rendam semua substrat dalam plat enam perigi yang diisi dengan larutan kalsium fosfat 1.5× dan keluarkan daripada larutan selepas 30 minit.Untuk pewarnaan, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Campurkan dengan 100 ml air ternyahion.Kemudian, gunakan 10% ammonium hidroksida untuk melaraskan pH kepada 4. Pewarna substrat dengan larutan Alizarin Red selama 5 minit, dan kemudian goncangkan lebihan pewarna dan tampal.Selepas proses goncangan, keluarkan substrat.Bahan tersebut didehidrasi, kemudian direndam dalam aseton selama 5 minit, kemudian direndam dalam larutan aseton-xilena (1:1) selama 5 minit, dan akhirnya dibasuh dengan xilena (n = 4).Mikroskop pendarfluor (Axio Imager) dengan kanta objektif ×10 dan ×20 digunakan..A2m, Zeiss, Jerman) imej semua substrat.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) digunakan untuk mengukur data lekatan bahan biologi pada setiap kumpulan empat kawasan pengimejan yang berbeza.Tukar semua imej kepada imej binari dengan ambang tetap untuk perbandingan substrat.
Mikroskop confocal Zeiss LSM 700 digunakan untuk memantau kestabilan lapisan pelincir dalam PBS dalam mod pantulan.Sampel kaca bersalut SAM berasaskan fluorin dengan lapisan pelincir yang disuntik telah direndam dalam larutan PBS, dan diuji menggunakan penggoncang orbital (SHO-1D; Daihan Scientific, Korea Selatan) dalam keadaan gegaran ringan (120 rpm).Kemudian ambil sampel dan pantau kehilangan pelincir dengan mengukur kehilangan cahaya yang dipantulkan.Untuk memperoleh imej pendarfluor dalam mod pantulan, sampel didedahkan kepada laser 633 nm dan kemudian dikumpulkan, kerana cahaya akan dipantulkan kembali daripada sampel.Sampel diukur pada selang masa 0, 30, 60, dan 120 jam.
Untuk menentukan pengaruh proses pengubahsuaian permukaan ke atas sifat nanomekanikal implan ortopedik, nanoindentor (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) yang dilengkapi dengan hujung berlian Berkovich berbentuk piramid tiga sisi digunakan untuk mengukur nanoindenedione.Beban puncak ialah 10 mN dan luasnya ialah 100μmx 100μm.Untuk semua ukuran, masa pemuatan dan pemunggahan ialah 10 s, dan masa penahanan di bawah beban lekukan puncak ialah 2 s.Ambil ukuran dari lima lokasi berbeza dan ambil purata.Untuk menilai prestasi kekuatan mekanikal di bawah beban, ujian lenturan tiga titik melintang dilakukan menggunakan mesin ujian universal (Instron 5966, Instron, USA).Substrat dimampatkan pada kadar malar 10 N/s dengan peningkatan beban.Program perisian Bluehill Universal (n = 3) digunakan untuk mengira modulus lentur dan tegasan mampatan maksimum.
Untuk mensimulasikan proses operasi dan kerosakan mekanikal yang berkaitan yang disebabkan semasa operasi, proses operasi telah dilakukan secara in vitro.Femur telah dikumpulkan daripada arnab putih New Zealand yang dibunuh.Femur dibersihkan dan diperbaiki dalam 4% paraformaldehid selama 1 minggu.Seperti yang diterangkan dalam kaedah eksperimen haiwan, tulang paha tetap dikendalikan melalui pembedahan.Selepas pembedahan, implan ortopedik direndam dalam darah (darah kuda, KISAN, Korea) selama 10 saat untuk mengesahkan sama ada lekatan darah berlaku selepas kecederaan mekanikal digunakan (n = 3).
Sebanyak 24 arnab putih New Zealand jantan (berat 3.0 hingga 3.5kg, purata umur 6 bulan) dibahagikan secara rawak kepada empat kumpulan: negatif bogel, positif bogel, SHP dan LOIS.Semua prosedur yang melibatkan haiwan dilakukan mengikut piawaian etika Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi (IACUC diluluskan, KOREA-2017-0159).Implan ortopedik terdiri daripada plat pengunci dengan lima lubang (panjang 41 mm, lebar 7 mm dan ketebalan 2 mm) dan skru pengunci kortikal (panjang 12 mm, diameter 2.7 mm) untuk penetapan patah.Kecuali untuk plat dan skru yang digunakan dalam kumpulan kosong-negatif, semua plat dan skru diinkubasi dalam penggantungan MRSA (106 CFU/ml) selama 12 jam.Kumpulan negatif-telanjang (n=6) telah dirawat dengan implan permukaan telanjang tanpa pendedahan kepada penggantungan bakteria, sebagai kawalan negatif untuk jangkitan.Kumpulan positif kosong (n = 6) telah dirawat dengan implan permukaan kosong yang terdedah kepada bakteria sebagai kawalan positif untuk jangkitan.Kumpulan SHP (n = 6) telah dirawat dengan implan SHP yang terdedah kepada bakteria.Akhirnya, kumpulan LOIS telah dirawat dengan implan LOIS yang terdedah kepada bakteria (n = 6).Semua haiwan disimpan dalam sangkar, dan banyak makanan dan air disediakan.Sebelum pembedahan, arnab dipuasakan selama 12 jam.Haiwan telah dibius dengan suntikan intramuskular xylazine (5mg/kg) dan suntikan intravena paclitaxel (3mg/kg) untuk induksi.Selepas itu, hantarkan 2% isoflurane dan 50% hingga 70% oksigen perubatan (kadar aliran 2 L/min) melalui sistem pernafasan untuk mengekalkan bius.Ia ditanam melalui pendekatan langsung ke tulang paha sisi.Selepas penyingkiran rambut dan pembasmian kuman povidone-iodin pada kulit, hirisan kira-kira 6 cm panjang dibuat pada bahagian luar femur tengah kiri.Dengan membuka celah antara otot yang menutupi tulang paha, tulang paha terdedah sepenuhnya.Letakkan plat di hadapan aci femoral dan pasangkannya dengan empat skru.Selepas penetapan, gunakan mata gergaji (tebal 1 mm) untuk membuat rekahan buatan di kawasan antara lubang kedua dan lubang keempat.Pada akhir operasi, luka itu dibasuh dengan garam dan ditutup dengan jahitan.Setiap arnab disuntik secara subkutan dengan enrofloxacin (5 mg/kg) yang dicairkan satu pertiga dalam garam.X-ray pasca operasi femur diambil pada semua haiwan (0, 7, 14, 21, 28, dan 42 hari) untuk mengesahkan osteotomi tulang.Selepas anestesia dalam, semua haiwan dibunuh oleh KCl intravena (2 mmol/kg) pada 28 dan 42 hari.Selepas pelaksanaan, tulang paha telah diimbas oleh mikro-CT untuk memerhati dan membandingkan proses penyembuhan tulang dan pembentukan tulang baru antara empat kumpulan.
Selepas pelaksanaan, tisu lembut yang bersentuhan langsung dengan implan ortopedik dikumpulkan.Tisu telah ditetapkan dalam 10% formalin buffer neutral semalaman dan kemudian dehidrasi dalam EtOH.Tisu dehidrasi dibenamkan dalam parafin dan dipotong pada ketebalan 40 μm menggunakan mikrotom (400CS; EXAKT, Jerman).Untuk menggambarkan jangkitan, pewarnaan H&E dan pewarnaan MT dilakukan.Untuk menyemak tindak balas perumah, tisu yang dipotong telah diinkubasi dengan antibodi primer anti-TNF-α arnab (AB6671, Abcam, Amerika Syarikat) dan arnab anti-IL-6 (AB6672; Abcam, Amerika Syarikat), dan kemudian dirawat dengan lobak pedas.Oksidase.Sapukan sistem pewarnaan kompleks avidin-biotin (ABC) pada bahagian mengikut arahan pengilang.Untuk kelihatan sebagai produk tindak balas coklat, 3,3-diaminobenzidine digunakan di semua bahagian.Pengimbas slaid digital (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hungary) telah digunakan untuk menggambarkan semua kepingan, dan sekurang-kurangnya empat substrat dalam setiap kumpulan telah dianalisis oleh perisian ImageJ.
Imej X-ray diambil pada semua haiwan selepas pembedahan dan setiap minggu untuk memantau penyembuhan patah tulang (n=6 setiap kumpulan).Selepas pelaksanaan, mikro-CT resolusi tinggi digunakan untuk mengira pembentukan kalus di sekitar femur selepas penyembuhan.Femur yang diperolehi telah dibersihkan, difiksasi dalam 4% paraformaldehid selama 3 hari, dan dehidrasi dalam 75% etanol.Tulang dehidrasi kemudiannya diimbas dengan menggunakan mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgium) untuk menghasilkan imej voxel 3D (2240 ​​× 2240 piksel) sampel tulang.Gunakan penapis Al 1.0 mm untuk mengurangkan bunyi isyarat dan gunakan resolusi tinggi pada semua imbasan (E = 133 kVp, I = 60 μA, masa penyepaduan = 500 ms).Perisian Nrecon (versi 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgium) digunakan untuk menjana volum 3D sampel yang diimbas daripada unjuran sisi 2D yang diperoleh.Untuk analisis, imej yang dibina semula 3D dibahagikan kepada kiub 10mm×10mm×10mm mengikut tapak patah.Kira kalus di luar tulang kortikal.Perisian DataViewer (versi 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgium) digunakan untuk mengubah hala isipadu tulang yang diimbas secara digital, dan perisian CT-Analyzer (versi 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgium) digunakan untuk analisis.Pekali penyerapan sinar-x relatif dalam tulang matang dan kalus dibezakan dengan ketumpatannya, dan kemudian isipadu kalus dikira (n = 4).Untuk mengesahkan bahawa biokompatibiliti LOIS tidak melambatkan proses penyembuhan tulang, analisis X-ray dan mikro-CT tambahan dilakukan dalam dua arnab: kumpulan negatif-telanjang dan LOIS.Kedua-dua kumpulan telah dilaksanakan pada minggu ke-6.
Femur daripada haiwan yang dikorbankan dikumpulkan dan difiksasi dalam 4% paraformaldehid selama 3 hari.Implan ortopedik kemudiannya dikeluarkan dengan berhati-hati dari femur.Femur telah dinyahkalsifikasi selama 21 hari dengan menggunakan 0.5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Kemudian femur yang dinyahkalsifikasi direndam dalam EtOH untuk menjadikannya dehidrasi.Femur yang terdehidrasi dikeluarkan dalam xilena dan dibenamkan dalam parafin.Kemudian sampel dihiris dengan mikrotom berputar automatik (Leica RM2255, Leica Biosystems, Jerman) dengan ketebalan 3 μm.Untuk pewarnaan TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Jerman), sampel yang dipotong telah dinyahparafin, dihidrat semula dan diinkubasi dalam reagen TRAP pada 37 ° C selama 1 jam.Imej diperoleh menggunakan pengimbas slaid (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hungary) dan dikira dengan mengukur liputan kawasan kawasan bernoda.Dalam setiap eksperimen, sekurang-kurangnya empat substrat dalam setiap kumpulan dianalisis oleh perisian ImageJ.
Analisis kepentingan statistik dilakukan dengan menggunakan GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., USA).Ujian-t tidak berpasangan dan analisis varians sehala (ANOVA) digunakan untuk menguji perbezaan antara kumpulan penilaian.Aras keertian ditunjukkan dalam rajah seperti berikut: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 dan ****P<0.0001;NS, tiada perbezaan yang ketara.
Untuk bahan tambahan untuk artikel ini, sila lihat http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Ini ialah artikel akses terbuka yang diedarkan di bawah syarat Lesen Atribusi-Bukan Komersial Creative Commons, yang membenarkan penggunaan, pengedaran dan pembiakan dalam mana-mana medium, selagi penggunaannya bukan untuk keuntungan komersial dan premisnya adalah yang asal. kerja betul.Rujukan.
Nota: Kami hanya meminta anda memberikan alamat e-mel supaya orang yang anda cadangkan ke halaman itu tahu bahawa anda mahu mereka melihat e-mel itu dan bahawa e-mel itu bukan spam.Kami tidak akan menangkap sebarang alamat e-mel.
Soalan ini digunakan untuk menguji sama ada anda seorang pelawat manusia dan untuk menghalang penyerahan spam automatik.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Salutan antibakteria dan imunisasi implan ortopedik boleh mengurangkan jangkitan dan tindak balas imun yang disebabkan oleh jangkitan.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Salutan antibakteria dan imunisasi implan ortopedik boleh mengurangkan jangkitan dan tindak balas imun yang disebabkan oleh jangkitan.
©2021 American Association for the Advancement of Science.hak cipta terpelihara.AAAS ialah rakan kongsi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef dan COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.