Ortopedik implant ameliyatı geçiren hastalar için bakteriyel enfeksiyonlar ve enfeksiyonun neden olduğu bağışıklık tepkileri her zaman yaşamı tehdit eden riskler olmuştur.Geleneksel biyolojik materyaller biyolojik kontaminasyona karşı hassastır, bu da bakterilerin yaralı bölgeyi işgal etmesine ve postoperatif enfeksiyona neden olmasına neden olur.Bu nedenle ortopedik implantlar için enfeksiyon önleyici ve bağışıklıktan kaçış kaplamalarının geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır.Burada, sürahi bitki sürahilerinin pürüzsüz yüzeyinden ilham alan Lubricated Ortopedic Implant Surface (LOIS) adı verilen ortopedik implantlar için gelişmiş bir yüzey modifikasyon teknolojisi geliştirdik.LOIS, çeşitli sıvılara ve biyolojik maddelere (hücreler, proteinler, kalsiyum ve bakteriler dahil) karşı uzun süreli ve güçlü bir sıvı iticiliğine sahiptir.Ayrıca in vitro ameliyat sırasında kaçınılmaz hasarı simüle ederek çizilmelere ve sabitleme kuvvetine karşı mekanik dayanıklılığını doğruladık.LOIS'in anti-biyolojik ölçeklendirme ve anti-enfeksiyon yeteneğini kapsamlı bir şekilde incelemek için tavşan kemik iliği inflamatuar femur kırığı modeli kullanıldı.Biyolojik kirlilik önleyici özelliklere ve mekanik dayanıklılığa sahip olan LOIS'in enfeksiyonsuz ortopedik cerrahide ileri bir adım olduğunu düşünüyoruz.
Günümüzde genel yaşlanmaya bağlı olarak ortopedik hastalıklara (yaşlı kırıkları, dejeneratif eklem hastalıkları, osteoporoz gibi) yakalanan hastaların sayısı büyük oranda artmıştır (1, 2).Bu nedenle tıp kurumları ortopedik vida, plak, çivi ve yapay eklem implantasyonu dahil olmak üzere ortopedik cerrahiye büyük önem vermektedir (3, 4).Ancak geleneksel ortopedik implantların, ameliyat sonrası cerrahi alan enfeksiyonuna (CAE) neden olabilecek bakteriyel adezyon ve biyofilm oluşumuna duyarlı olduğu bildirilmektedir (5, 6).Ortopedik implantın yüzeyinde biyofilm oluştuğunda, yüksek dozda antibiyotik kullanılsa bile biyofilmin çıkarılması son derece zorlaşır.Bu nedenle genellikle postoperatif ciddi enfeksiyonlara yol açmaktadır (7, 8).Yukarıdaki sorunlardan dolayı, enfekte olmuş implantların tedavisi, tüm implantların ve çevre dokuların çıkarılması dahil olmak üzere yeniden ameliyatı içermelidir;bu nedenle hasta şiddetli ağrı ve bazı risklerle karşı karşıya kalacaktır (9, 10).
Bu sorunlardan bazılarını çözmek için yüzeye yapışan bakterileri yok ederek enfeksiyonu önleyen ilaç salınımlı ortopedik implantlar geliştirilmiştir (11, 12).Ancak strateji hala bazı sınırlamalar göstermektedir.İlaç salınımlı implantların uzun süreli implantasyonunun çevre dokulara zarar vererek inflamasyona neden olduğu ve bunun da nekroza yol açabileceği bildirilmektedir (13, 14).Ayrıca ABD Gıda ve İlaç İdaresi tarafından kesinlikle yasaklanan ilaç salınımlı ortopedik implantların üretim prosesi sonrasında oluşabilecek organik solventlerin de standartlarını karşılayabilmesi için ek saflaştırma adımları gerekmektedir (15).İlaç salınımlı implantlar, ilaçların kontrollü salınımı açısından zorludur ve sınırlı ilaç yüklemeleri nedeniyle ilacın uzun süreli uygulanması mümkün değildir (16).
Diğer bir yaygın strateji ise biyolojik maddenin ve bakterilerin yüzeye yapışmasını önlemek için implantı kirlenme önleyici bir polimerle kaplamaktır (17).Örneğin zwitteriyonik polimerler, plazma proteinleri, hücreler ve bakterilerle temas ettiğinde yapışkan olmayan özellikleri nedeniyle dikkat çekmiştir.Ancak uzun süreli stabilite ve mekanik dayanıklılıkla ilgili bazı sınırlamaları vardır ve bu durum özellikle cerrahi işlemler sırasında mekanik kazıma nedeniyle ortopedik implantlarda pratik uygulamasını engellemektedir (18, 19).Ayrıca biyouyumluluğunun yüksek olması, cerrahi müdahale gerektirmemesi ve korozyon yoluyla yüzey temizleme özelliği nedeniyle biyolojik olarak parçalanabilen malzemelerden yapılmış ortopedik implantlar da kullanılmaya başlanmıştır (20, 21).Korozyon sırasında polimer matris arasındaki kimyasal bağlar parçalanarak yüzeyden ayrılır ve yapıştırıcılar yüzeyi temizler.Ancak yüzey temizliği ile anti-biyolojik kirlenme kısa sürede etkili olur.Ek olarak, poli(laktik asit-glikolik asit kopolimeri) (PLGA), polilaktik asit (PLA) ve magnezyum bazlı alaşımlar dahil emilebilir malzemelerin çoğu vücutta eşit olmayan biyolojik bozunmaya ve erozyona uğrayacak ve bu da mekanik stabiliteyi olumsuz etkileyecektir.(yirmi iki).Ayrıca biyolojik olarak parçalanabilen plaka parçaları bakterilerin tutunabileceği bir yer sağlar ve bu da uzun vadede enfeksiyon olasılığını artırır.Bu mekanik bozulma ve enfeksiyon riski, plastik cerrahinin pratik uygulamasını sınırlamaktadır (23).
Lotus yapraklarının hiyerarşik yapısını taklit eden süperhidrofobik (SHP) yüzeyler, kirlenme önleyici yüzeyler için potansiyel bir çözüm haline gelmiştir (24, 25).SHP yüzeyi sıvıya batırıldığında hava kabarcıkları hapsedilecek, böylece hava cepleri oluşturulacak ve bakteriyel yapışma önlenecektir (26).Ancak son çalışmalar, SHP yüzeyinin mekanik dayanıklılık ve uzun vadeli stabilite ile ilgili dezavantajlara sahip olduğunu ve bu durumun tıbbi implantlarda uygulanmasını engellediğini göstermiştir.Üstelik hava cepleri çözülecek ve kirlenme önleyici özelliklerini kaybedecek, böylece SHP yüzeyinin geniş yüzey alanı nedeniyle daha geniş bakteriyel yapışma meydana gelecektir (27, 28).Son zamanlarda Aizenberg ve meslektaşları, Nepenthes sürahi tesisinden esinlenerek pürüzsüz bir yüzey geliştirerek biyolojik kirlilik önleyici yüzey kaplamanın yenilikçi bir yöntemini tanıttılar (29, 30).Pürüzsüz yüzey, hidrolik koşullar altında uzun süreli stabilite gösterir, biyolojik sıvılara karşı son derece sıvı iticidir ve kendi kendini onarma özelliğine sahiptir.Ancak ne kompleks şekilli bir medikal implanta kaplama uygulanmasına yönelik bir yöntem mevcut, ne de implantasyon sonrası hasar görmüş dokunun iyileşme sürecini desteklediği kanıtlanmıştır.
Burada, mikro/nano yapılı ortopedik implant yüzeyi olan ve plastik cerrahi ile ilişkili olmasını önlemek için ince bir yağlayıcı tabaka ile sıkı bir şekilde birleştirilmiş, yağlanmış ortopedik implant yüzeyini (LOIS) tanıtıyoruz. Kırık fiksasyonu gibi bakteriyel enfeksiyonlar.Flor işlevselleştirilmiş mikro/nano seviyeli yapı, yağlayıcıyı yapıya sıkı bir şekilde sabitlediğinden, geliştirilen LOIS, çeşitli sıvıların yapışmasını tamamen engelleyebilir ve kirlenme önleyici performansı uzun süre koruyabilir.LOIS kaplamaları kemik sentezine yönelik çeşitli şekillerdeki malzemelere uygulanabilir.LOIS'in biyofilm bakterilerine [Pseudomonas aeruginosa ve metisiline dirençli Staphylococcus aureus (MRSA)] ve biyolojik maddelere (hücreler, proteinler ve kalsiyum) karşı mükemmel biyolojik kirlenme önleyici özellikleri in vitro olarak doğrulanmıştır.Kapsamlı yapışmanın alt tabakaya yapışma oranı %1'den azdır.Ek olarak, yüzeyin çizilmesi gibi mekanik stres meydana geldikten sonra bile nüfuz eden yağlayıcının neden olduğu kendi kendine iyileşme, kirlenme önleyici özelliklerinin korunmasına yardımcı olur.Mekanik dayanıklılık testi sonuçları, yapısal ve kimyasal modifikasyondan sonra bile toplam mukavemetin önemli ölçüde azalmayacağını göstermektedir.Ayrıca LOIS'in plastik cerrahi sırasında oluşan çeşitli mekanik streslere dayanabildiğini kanıtlamak için cerrahi ortamdaki mekanik stresi simüle eden bir in vitro deney gerçekleştirildi.Son olarak, LOIS'in üstün antibakteriyel özelliklere ve biyouyumluluğa sahip olduğunu kanıtlayan tavşan bazlı bir in vivo femur kırığı modeli kullandık.Radyolojik ve histolojik sonuçlar, implantasyondan sonraki 4 hafta içinde stabil yağlama davranışı ve biyolojik kirlenme önleyici özelliklerin, kemik iyileşme sürecini geciktirmeden etkili enfeksiyon önleme ve bağışıklıktan kaçış performansı sağlayabileceğini doğruladı.
Şekil 1A, mükemmel anti-biyolojik kirlenme ve anti-enfeksiyon özelliklerini doğrulamak için tavşan femur kırığı modelinde mikro/nano ölçekli yapılarla implante edilen geliştirilen LOIS'in şematik bir diyagramını göstermektedir.Bir su kabı bitkisinin yüzeyini simüle etmek ve yüzeyin mikro/nano yapısına bir yağlayıcı katman ekleyerek biyolojik kirlenmeyi önlemek için biyomimetik bir yöntem gerçekleştirilir.Yağlayıcı madde enjekte edilen yüzey, biyolojik maddeler ile yüzey arasındaki teması en aza indirebilir.Bu nedenle yüzeyde stabil kimyasal bağların oluşması nedeniyle mükemmel antifouling performansına ve uzun süreli stabiliteye sahiptir.Sonuç olarak, yağlama yüzeyinin biyolojik kirlilik önleyici özellikleri, biyomedikal araştırmalarda çeşitli pratik uygulamalara olanak tanır.Ancak bu özel yüzeyin vücutta nasıl etkileşime girdiğine dair kapsamlı araştırmalar henüz tamamlanmadı.Albümin ve biyofilm bakterileri kullanılarak LOIS'i çıplak substratlarla in vitro olarak karşılaştırarak, LOIS'in yapışkanlığı doğrulanabilir (Şekil 1B).Ek olarak, eğimli çıplak alt tabaka ve LOIS alt tabakası (Şekil S1 ve Film S1) üzerindeki su damlacıklarının yuvarlanması yoluyla biyolojik kirlenme performansı gösterilebilir.Floresan mikroskobu görüntüsünde gösterildiği gibi, bir protein ve bakteri süspansiyonunda inkübe edilen açıkta kalan substrat, yüzeye büyük miktarda biyolojik malzemenin yapıştığını gösterdi.Bununla birlikte, mükemmel biyolojik kirlenme önleyici özellikleri nedeniyle LOIS neredeyse hiç floresans göstermez.Biyolojik kirlilik ve enfeksiyon önleyici özelliklerini doğrulamak amacıyla, kemik sentezi için ortopedik implantların (plakalar ve vidalar) yüzeyine LOIS uygulandı ve bir tavşan kırığı modeline yerleştirildi.İmplantasyondan önce çıplak ortopedik implant ve LOIS, bakteriyel bir süspansiyon içerisinde 12 saat süreyle inkübe edildi.Ön inkübasyon, karşılaştırma için açıkta kalan implantın yüzeyinde bir biyofilm oluşmasını sağlar.Şekil 1C'de implantasyondan 4 hafta sonra kırık bölgesinin fotoğrafı gösterilmektedir.Solda, çıplak ortopedik implantı olan bir tavşan, implantın yüzeyinde biyofilm oluşumu nedeniyle şiddetli düzeyde iltihaplanma gösterdi.LOIS implante edilen tavşanlarda bunun tersi sonuç gözlendi; yani LOIS'i çevreleyen dokular ne enfeksiyon ne de iltihaplanma belirtileri gösterdi.Ek olarak soldaki optik görüntü, implantın açıkta olduğu tavşanın cerrahi bölgesini gösterir; bu da LOIS'in yüzeyinde açıkta kalan implantın yüzeyinde hiçbir çoklu yapıştırıcının bulunmadığını gösterir.Bu, LOIS'in uzun vadeli stabiliteye sahip olduğunu ve anti-biyolojik kirlenme ve yapışma önleyici özelliklerini koruma yeteneğine sahip olduğunu göstermektedir.
(A) LOIS'in şematik diyagramı ve tavşan femur kırığı modelinde implantasyonu.(B) Çıplak yüzey ve LOIS substratındaki protein ve bakteriyel biyofilmin floresan mikroskopi görüntüsü.İmplantasyondan 4 hafta sonra, (C) kırık bölgesinin fotoğrafik görüntüsü ve (D) bir röntgen görüntüsü (kırmızı bir dikdörtgenle vurgulanmıştır).Resim izniyle: Kyomin Chae, Yonsei Üniversitesi.
Sterilize edilmiş, negatif implante edilmiş tavşanlar, herhangi bir iltihaplanma veya enfeksiyon belirtisi olmaksızın normal bir kemik iyileşme süreci gösterdi.Öte yandan, bakteriyel bir süspansiyon içinde önceden inkübe edilen SHP implantları, çevre dokularda enfeksiyona bağlı iltihaplanma sergiler.Bu, bakteriyel yapışmayı uzun süre engelleyememesiyle ilişkilendirilebilir (Şekil S2).LOIS'in iyileşme sürecini etkilemediğini ancak implantasyona bağlı olası enfeksiyonları engellediğini kanıtlamak için, açıkta kalan pozitif matrisin X-ışını görüntüleri ile kırık bölgesindeki LOIS karşılaştırıldı (Şekil 1D).Çıplak pozitif implantın röntgen görüntüsünde kalıcı osteoliz çizgileri görülüyordu, bu da kemiğin tamamen iyileşmediğini gösteriyordu.Bu, enfeksiyona bağlı iltihaplanma nedeniyle kemik iyileşme sürecinin büyük ölçüde gecikebileceğini düşündürmektedir.Aksine LOIS implante edilen tavşanların iyileştiğini ve belirgin bir kırık bölgesi göstermediğini gösterdi.
Uzun vadeli stabiliteye ve işlevselliğe (biyolojik kirlenmeye karşı direnç dahil) sahip tıbbi implantlar geliştirmek için birçok çaba sarf edilmiştir.Ancak çeşitli biyolojik maddelerin varlığı ve doku yapışmasının dinamikleri, klinik olarak güvenilir yöntemlerin geliştirilmesini sınırlamaktadır.Bu eksikliklerin üstesinden gelmek için, en pürüzsüz yağlayıcıyı en büyük ölçüde tutmak için yüksek kılcal kuvvet ve kimyasal afinite nedeniyle optimize edilmiş, mikro/nano katmanlı bir yapı ve kimyasal olarak değiştirilmiş bir yüzey geliştirdik.Şekil 2A, LOIS'in genel üretim sürecini göstermektedir.Öncelikle tıbbi sınıf paslanmaz çelik (SS) 304 alt tabakasını hazırlayın.İkinci olarak, mikro/nano yapı, hidroflorik asit (HF) çözeltisi kullanılarak kimyasal aşındırma yoluyla SS substrat üzerinde oluşturulur.SS'nin korozyon direncini yeniden sağlamak amacıyla, kazınmış alt tabakayı işlemek için bir nitrik asit (HNO3) çözeltisi (31) kullanılır.Pasifleştirme, SS alt katmanının korozyon direncini arttırır ve korozyon sürecini önemli ölçüde yavaşlatır, bu da LOIS'in genel performansını azaltabilir.Daha sonra, 1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktiltrietoksisilan (POTS) ile kendiliğinden birleşen bir tek tabaka (SAM) oluşturularak, yüzey ile pürüzsüz yağlayıcı Affinity arasındaki kimyasal etkileşimi geliştirmek için yüzey kimyasal olarak değiştirilir.Yüzey modifikasyonu, üretilen mikro/nano ölçekli yapılandırılmış yüzeyin yüzey enerjisini önemli ölçüde azaltır; bu, pürüzsüz yağlayıcının yüzey enerjisine uygundur.Bu, yağlayıcının tamamen ıslanmasını sağlar, böylece yüzeyde stabil bir yağlayıcı tabaka oluşur.Modifiye edilmiş yüzey, gelişmiş hidrofobiklik sergiler.Sonuçlar, mikro/nano yapının neden olduğu yüksek kimyasal afinite ve kılcal kuvvet nedeniyle kaygan yağlayıcının LOIS üzerinde stabil davranış sergilediğini göstermektedir (32, 33).Yüzey modifikasyonu ve yağlayıcı enjeksiyonundan sonra SS yüzeyindeki optik değişiklikler incelenmiştir.Yüzeyde oluşan mikro/nano katmanlı yapı görsel değişikliklere neden olabilir ve yüzeyin kararmasına neden olabilir.Bu fenomen, pürüzlü yüzey üzerindeki ışık yakalama mekanizmasının (34) neden olduğu dağınık yansımayı artıran gelişmiş ışık saçılım etkisine atfedilir.Ayrıca yağlayıcı madde enjekte edildikten sonra LOIS koyulaşır.Kayganlaştırıcı katman, alt tabakadan daha az ışığın yansımasına neden olur ve böylece LOIS'in kararmasına neden olur.Biyolojik kirlilik önleme performansı elde etmek amacıyla mikroyapıyı/nanoyapıyı en küçük kayma açısını (SA) gösterecek şekilde optimize etmek amacıyla, farklı HF aşındırma sürelerini (0, 3) gerçekleştirmek için taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve atom çiftleri kullanıldı., 15 ve 60 dakika) Kuvvet Mikroskobu (AFM) (Şekil 2B).SEM ve AFM görüntüleri, kısa bir aşındırma süresinden sonra (3 dakikalık aşındırma), çıplak alt tabakanın düzensiz nano ölçekli pürüzlülük oluşturduğunu göstermektedir.Yüzey pürüzlülüğü aşındırma süresine göre değişir (Şekil S3).Zamanla değişen eğri, yüzey pürüzlülüğünün artmaya devam ettiğini ve 15 dakikalık aşındırmada zirveye ulaştığını, ardından 30 dakikalık aşındırmada pürüzlülük değerinde sadece hafif bir azalmanın gözlemlendiğini göstermektedir.Bu noktada nano düzeydeki pürüzlülük aşındırılırken, mikro düzeydeki pürüzlülük güçlü bir şekilde gelişerek pürüzlülük değişiminin daha stabil olmasını sağlar.30 dakikadan daha uzun süre aşındırdıktan sonra pürüzlülükte daha da bir artış gözlenir ve bu durum aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmaktadır: SS, demir, krom, nikel, molibden ve diğer birçok elementi içeren elementlerle alaşımlanmış çelikten oluşur.Bu elementler arasında demir, krom ve molibden, HF aşındırma ile SS üzerinde mikron/nano ölçekli pürüzlülüğün oluşmasında önemli bir rol oynamaktadır.Korozyonun erken aşamalarında demir ve krom esas olarak korozyona uğrar çünkü molibden molibdenden daha yüksek korozyon direncine sahiptir.Aşındırma ilerledikçe aşındırma çözeltisi yerel aşırı doygunluğa ulaşır ve aşındırma nedeniyle oluşan florürler ve oksitler oluşur.Florür ve oksit çökelir ve sonunda yüzeyde yeniden birikerek mikron/nano aralığında bir yüzey pürüzlülüğü oluşturur (31).Bu mikro/nano düzeydeki pürüzlülük, LOIS'in kendi kendini iyileştirme özelliklerinde önemli bir rol oynar.Çift ölçekli yüzey, kılcal kuvveti büyük ölçüde artıran sinerjistik bir etki yaratır.Bu olgu yağlayıcının yüzeye stabil bir şekilde nüfuz etmesini sağlar ve kendi kendini iyileştirme özelliklerine katkıda bulunur (35).Pürüzlülüğün oluşması aşındırma süresine bağlıdır.10 dakikalık aşındırma altında yüzey yalnızca nano ölçekli pürüzlülük içerir ve bu, biyolojik kirlenme direncine sahip olmak için yeterli yağlayıcıyı tutmaya yeterli değildir (36).Öte yandan aşındırma süresi 30 dakikayı aşarsa, demir ve kromun yeniden birikmesiyle oluşan nano ölçekli pürüzlülük ortadan kalkacak ve molibden nedeniyle yalnızca mikro ölçekli pürüzlülük kalacaktır.Aşırı kazınmış yüzey nano ölçekli pürüzlülükten yoksundur ve iki aşamalı pürüzlülüğün sinerjik etkisini kaybeder, bu da LOIS'in kendi kendini iyileştirme özelliklerini olumsuz yönde etkiler.Kirlenme önleyici performansı kanıtlamak için farklı aşındırma sürelerine sahip alt tabakalar üzerinde SA ölçümleri yapıldı.Deiyonize (DI) su, kan, etilen glikol (EG), etanol (EtOH) ve heksadekan (HD) (Şekil S4) dahil olmak üzere viskozite ve yüzey enerjisine göre çeşitli sıvı türleri seçildi.Zamanla değişen aşındırma modeli, farklı yüzey enerjileri ve viskoziteleri olan çeşitli sıvılar için, 15 dakikalık aşındırma sonrasında LOIS'in SA'sının en düşük olduğunu göstermektedir.Bu nedenle LOIS, yağlayıcının dayanıklılığını ve mükemmel kirlenme önleyici özellikleri etkili bir şekilde korumak için uygun olan mikron ve nano ölçekli pürüzlülük oluşturmak üzere 15 dakika süreyle aşındırmak üzere optimize edilmiştir.
(A) LOIS'in dört aşamalı üretim sürecinin şematik diyagramı.Ek, substrat üzerinde oluşturulan SAM'yi gösterir.(B) Farklı aşındırma süreleri altında alt tabakanın mikro/nano yapısını optimize etmek için kullanılan SEM ve AFM görüntüleri.Yüzey pasifleştirmesi ve SAM kaplamasından sonra (C) Cr2p ve (D) F1'lerin X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS) spektrumları.au, keyfi birim.(E) Çıplak, kazınmış, SHP ve LOIS yüzeylerdeki su damlacıklarının temsili görüntüleri.(F) SHP ve LOIS üzerinde farklı yüzey gerilimlerine sahip sıvıların temas açısı (CA) ve SA ölçümü.Veriler ortalama ± SD olarak ifade edildi.
Daha sonra, yüzeyin kimyasal özelliklerindeki değişikliği doğrulamak amacıyla, her yüzey kaplamasından sonra substrat yüzeyinin kimyasal bileşimindeki değişikliği incelemek için X-ışını fotoelektron spektroskopisi (XPS) kullanıldı.Şekil 2C, HF ile aşındırılmış yüzeyin ve HNO3 ile işlenmiş yüzeyin XPS ölçüm sonuçlarını göstermektedir.587,3 ve 577,7 eV'deki iki ana tepe, HF ile aşındırılmış yüzeyden ana fark olan krom oksit tabakasında mevcut olan Cr-O bağına atfedilebilir.Bunun temel nedeni yüzeydeki demir ve krom florürün HNO3 tarafından tüketilmesidir.HNO3 bazlı aşındırma, kromun yüzeyde pasifleştirici bir oksit tabakası oluşturmasına olanak tanır, bu da kazınmış SS'yi tekrar korozyona karşı dirençli hale getirir.Şekil 2D'de, EG, kan ve EtOH için bile son derece yüksek sıvı iticiliğe sahip olan SAM kaplamadan sonra yüzeyde florokarbon bazlı silanın oluştuğunu doğrulamak için XPS spektrumları elde edildi.SAM kaplama, silan fonksiyonel gruplarının plazma işlemiyle oluşturulan hidroksil gruplarıyla reaksiyona sokulmasıyla tamamlanır.Sonuç olarak CF2 ve CF3 piklerinde önemli bir artış gözlendi.286 ile 296 eV arasındaki bağlanma enerjisi, SAM kaplama ile kimyasal modifikasyonun başarıyla tamamlandığını gösterir.SHP, yüzeyde oluşan florokarbon bazlı silanın neden olduğu nispeten büyük CF2 (290,1 eV) ve CF3 (293,3 eV) tepe noktaları gösterir.Şekil 2E, çıplak, kazınmış, SHP ve LOIS ile temas halindeki farklı deiyonize su grupları için temas açısı (CA) ölçümlerinin temsili optik görüntülerini gösterir.Bu görüntüler, kimyasal aşındırmayla oluşturulan mikro/nano yapı nedeniyle aşındırılmış yüzeyin hidrofilik hale geldiğini ve böylece deiyonize suyun yapıya emildiğini göstermektedir.Bununla birlikte, substrat SAM ile kaplandığında, substrat güçlü bir su iticiliği sergiler, dolayısıyla bir yüzey SHP oluşur ve su ile yüzey arasındaki temas alanı küçüktür.Son olarak LOIS'te CA'da bir azalma gözlendi; bu, yağlayıcının mikro yapıya nüfuz etmesine ve dolayısıyla temas alanının artmasına atfedilebilir.Yüzeyin mükemmel sıvı iticiliğine ve yapışkan olmayan özelliklere sahip olduğunu kanıtlamak için LOIS, çeşitli sıvılar kullanılarak CA ve SA ölçülerek SHP substratıyla karşılaştırıldı (Şekil 2F).Deiyonize su, kan, EG, EtOH ve HD dahil olmak üzere viskozite ve yüzey enerjisine göre çeşitli sıvı türleri seçildi (Şekil S4).CA ölçüm sonuçları, CA'nın HD'ye yöneldiğinde, CA'nın en düşük yüzey enerjisine sahip olduğu CA'nın indirgenme değerinin olduğunu göstermektedir.Ayrıca genel CA'nın LOIS'i düşüktür.Ancak SA ölçümü tamamen farklı bir olguyu gösteriyor.İyonize su dışındaki tüm sıvılar SHP alt katmanına kaymadan yapışır.Öte yandan, LOIS çok düşük bir SA gösterir; burada tüm sıvı 10° ila 15°'den daha düşük bir açıyla eğildiğinde tüm sıvı yuvarlanır.Bu, LOIS'in yapışmazlığının SHP yüzeyine göre daha iyi olduğunu güçlü bir şekilde göstermektedir.Ayrıca LOIS kaplamaları titanyum (Ti), polifenilsülfon (PPSU), polioksimetilen (POM), polieter eter keton (PEEK) ve biyolojik olarak emilebilir polimerler (PLGA) dahil olmak üzere çeşitli malzeme türlerine de uygulanır. Bunlar implante edilebilir ortopedik malzemelerdir (Şekil S5)).LOIS tarafından işlenen malzeme üzerindeki damlacıkların sıralı görüntüleri, LOIS'in biyolojik kirlenme önleyici özelliklerinin tüm substratlarda aynı olduğunu göstermektedir.Ayrıca CA ve SA'nın ölçüm sonuçları LOIS'in yapışkan olmayan özelliklerinin diğer malzemelere de uygulanabileceğini göstermektedir.
LOIS'in kirlenme önleyici özelliklerini doğrulamak için çeşitli substrat türleri (çıplak, kazınmış, SHP ve LOIS dahil) Pseudomonas aeruginosa ve MRSA ile inkübe edildi.Bu iki bakteri CAE'ye yol açan biyofilm oluşumuna yol açabilen temsili hastane bakterisi olarak seçilmiştir (37).Şekil 3 (A ve B), sırasıyla kısa süreli (12 saat) ve uzun süreli (72 saat) bakteriyel süspansiyonda inkübe edilen substratların floresans mikroskobu görüntülerini ve koloni oluşturan birim (CFU) ölçüm sonuçlarını gösterir.Kısa sürede bakteriler kümeler oluşturup büyüyerek kendilerini mukus benzeri maddelerle kaplayacak ve bunların uzaklaştırılmasını engelleyecektir.Bununla birlikte, 72 saatlik inkübasyon sırasında bakteriler olgunlaşacak ve daha fazla koloni veya küme oluşturmak üzere dağılması kolaylaşacaktır.Bu nedenle 72 saatlik inkübasyonun uzun süreli olduğu ve yüzeyde güçlü bir biyofilm oluşması için uygun inkübasyon süresi olduğu düşünülebilir (38).Kısa bir süre içinde aşındırılmış yüzey ve SHP'nin yüzeyi, çıplak alt tabakaya kıyasla yaklaşık %25 ila %50 oranında azaltılmış bakteriyel yapışma sergiledi.Bununla birlikte, mükemmel biyolojik kirlenme önleyici performansı ve stabilitesi nedeniyle LOIS, kısa ve uzun vadede bakteriyel biyofilm yapışması göstermedi.Şematik diyagram (Şekil 3C), aşındırma çözeltisi SHP ve LOIS'in anti-biyolojik kirlenme mekanizmasının açıklamasını açıklamaktadır.Hidrofilik özelliklere sahip aşındırılmış substratın çıplak substrattan daha büyük bir yüzey alanına sahip olacağı varsayımı vardır.Bu nedenle aşındırılan alt tabaka üzerinde daha fazla bakteri yapışması meydana gelecektir.Bununla birlikte, çıplak alt tabaka ile karşılaştırıldığında, aşındırılmış alt tabakanın yüzeyinde önemli ölçüde daha az biyofilm oluşmuştur.Bunun nedeni, su moleküllerinin hidrofilik yüzeye sıkı bir şekilde bağlanması ve su için kayganlaştırıcı görevi görmesi, dolayısıyla kısa vadede bakterilerin yapışmasına müdahale etmesidir (39).Ancak su moleküllerinin tabakası çok incedir ve bakteri süspansiyonlarında çözünür.Bu nedenle, su moleküler tabakası uzun bir süre boyunca kaybolur ve bu da yoğun bakteri yapışmasına ve çoğalmasına yol açar.SHP'nin kısa süreli ıslatmama özelliği nedeniyle bakteriyel yapışma engellenir.Bakteriyel yapışmanın azalması, katmanlı yapıda sıkışan hava ceplerine ve daha düşük yüzey enerjisine bağlanabilir, böylece bakteri süspansiyonu ile yüzey arasındaki temas en aza indirilebilir.Ancak SHP'nin kirlenme önleyici özelliğini uzun süre kaybetmesi nedeniyle yoğun bakteri yapışması gözlemlendi.Bunun temel nedeni hidrostatik basınç nedeniyle hava ceplerinin ortadan kalkması ve havanın su içinde çözünmesidir.Bunun başlıca nedeni, çözünme nedeniyle hava ceplerinin ortadan kalkması ve yapışma için daha geniş bir yüzey alanı sağlayan katmanlı yapıdır (27, 40).Uzun vadeli stabilite üzerinde önemli bir etkiye sahip olan bu iki substrattan farklı olarak LOIS'in içerdiği yağlayıcı, mikro/nano yapıya enjekte edilir ve uzun vadede bile kaybolmaz.Mikro/nano yapılarla doldurulmuş yağlayıcılar çok stabildir ve yüksek kimyasal afiniteleri nedeniyle yüzeye güçlü bir şekilde çekilir, bu sayede bakterilerin yapışmasını uzun süre engeller.Şekil S6, fosfat tamponlu saline (PBS) batırılmış yağlayıcıyla aşılanmış bir substratın yansıma eş odaklı mikroskop görüntüsünü gösterir.Sürekli görüntüler, 120 saatlik hafif çalkalamadan (120 rpm) sonra bile LOIS üzerindeki yağlayıcı katmanın değişmeden kaldığını gösterir; bu da akış koşulları altında uzun vadeli stabiliteye işaret eder.Bunun nedeni, flor bazlı SAM kaplama ile perflorokarbon bazlı yağlayıcı arasındaki yüksek kimyasal afinitedir, böylece stabil bir yağlayıcı tabaka oluşturulabilir.Bu nedenle kirlenme önleme performansı korunur.Ek olarak substrat, plazmada bulunan temsili proteinlere (albümin ve fibrinojen), bağışıklık fonksiyonuyla yakından ilişkili hücrelere (makrofajlar ve fibroblastlar) ve kemik oluşumuyla ilişkili olanlara karşı test edildi.Kalsiyum içeriği çok yüksektir.(Şekil 3D, 1 ve 2 ve Şekil S7) (41, 42).Ek olarak fibrinojen, albümin ve kalsiyum için yapışma testinin floresans mikroskobu görüntüleri, her substrat grubunun farklı yapışma özellikleri gösterdi (Şekil S8).Kemik oluşumu sırasında yeni oluşan kemik ve kalsiyum tabakaları ortopedik implantın etrafını sarabilir, bu durum hem implantın çıkarılmasını zorlaştırır hem de çıkarma işlemi sırasında hastaya beklenmedik zararlar verebilir.Bu nedenle kemik plakaları ve vidalar üzerinde düşük düzeyde kalsiyum birikmesi, implantın çıkarılmasını gerektiren ortopedik cerrahi için faydalıdır.Floresan yoğunluğu ve hücre sayımına dayalı olarak eklenen alanın niceliğine dayanarak, LOIS'in diğer substratlarla karşılaştırıldığında tüm biyolojik maddeler için mükemmel biyolojik kirlenme önleyici özellikler gösterdiğini doğruladık.İn vitro deneylerin sonuçlarına göre, anti-biyolojik kirlenme LOIS ortopedik implantlara uygulanabilir; bu, yalnızca biyofilm bakterilerinin neden olduğu enfeksiyonları engellemekle kalmayıp aynı zamanda vücudun aktif bağışıklık sisteminin neden olduğu iltihabı da azaltır.
(A) Pseudomonas aeruginosa ve MRSA süspansiyonlarında 12 ve 72 saat boyunca inkübe edilen her grubun (çıplak, kazınmış, SHP ve LOIS) floresans mikroskobu görüntüleri.(B) Her grubun yüzeyinde Pseudomonas aeruginosa ve MRSA'nın yapışık CFU sayısı.(C) Kısa vadeli ve uzun vadeli aşındırma, SHP ve LOIS'in anti-biyolojik kirlenme mekanizmasının şematik diyagramı.(D) (1) Her bir alt tabakaya yapışan fibroblastların sayısı ve çıplak ve LOIS'e yapışan hücrelerin floresans mikroskobu görüntüleri.(2) Kemik iyileşme sürecinde yer alan bağışıklıkla ilgili proteinler, albümin ve kalsiyumun yapışma testi (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 ve **** P <0,0001).ns, önemli değil.
Kaçınılmaz yoğun stres durumunda, mekanik dayanıklılık her zaman zehirli boyaların uygulanmasında temel zorluk olmuştur.Geleneksel kanalizasyon önleyici jel yöntemleri, suda çözünürlüğü ve kırılganlığı düşük olan polimerlere dayanmaktadır.Bu nedenle biyomedikal uygulamalarda genellikle mekanik strese karşı hassastırlar.Bu nedenle, mekanik olarak dayanıklı kirlenme önleyici kaplamalar, ortopedik implantlar gibi uygulamalar için bir zorluk olmaya devam etmektedir (43, 44).Şekil 4A(1), forseps tarafından oluşturulan hasarlı implantın optik görüntüsüyle çizilme (kesme gerilimi) ve sıkıştırma dahil olmak üzere ortopedik implantlara uygulanan iki ana gerilim türünü göstermektedir.Örneğin vida tornavidayla sıkıldığında veya cerrah kemik plakasını cımbızla sıkıca tutup baskı kuvveti uyguladığında plastik kemik plakası hem makro hem de mikro/nano ölçekte hasar görecek ve çizilecektir (Şekil 4A, 2).Üretilen LOIS'in plastik cerrahi sırasında bu hasarlara dayanıp dayanamayacağını test etmek için, mikro/nano yapının mekanik özelliklerini incelemek amacıyla çıplak alt tabakanın sertliğini ve LOIS'i mikro/nano ölçekte karşılaştırmak için nanoindentasyon yapıldı. 4B).Şematik diyagram, mikro/nano yapıların varlığından dolayı LOIS'in farklı deformasyon davranışını göstermektedir.Nanoindentasyon sonuçlarına göre bir kuvvet-yer değiştirme eğrisi çizildi(Şekil 4C).Mavi görüntü, 0,26 μm'lik maksimum girinti derinliği ile görüldüğü gibi yalnızca hafif bir deformasyon gösteren çıplak alt tabakayı temsil eder.Öte yandan, LOIS'te (kırmızı eğri) gözlemlenen nano indentasyon kuvveti ve yer değiştirmedeki kademeli artış, mekanik özelliklerin azaldığına dair işaretler gösterebilir ve bu da 1,61 μm'lik bir nano indentasyon derinliği ile sonuçlanır.Bunun nedeni, LOIS'te mevcut olan mikro/nano yapının, nano indenterin ucu için daha derin bir ilerleme alanı sağlaması, dolayısıyla deformasyonunun çıplak alt tabakanınkinden daha büyük olmasıdır.Konsta-Gdoutos ve ark.(45) nanoyapıların varlığı nedeniyle nanoindentasyon ve mikro/nano pürüzlülüğün düzensiz nanoindentasyon eğrilerine yol açtığına inanmaktadır.Gölgeli alan, nano yapıya atfedilen düzensiz deformasyon eğrisine karşılık gelirken, gölgeli olmayan alan, mikro yapıya atfedilir.Bu deformasyon, tutucu yağlayıcının mikro yapısına/nano yapısına zarar verebilir ve kirlenme önleyici performansını olumsuz etkileyebilir.Hasarın LOIS üzerindeki etkisini incelemek amacıyla, plastik cerrahi sırasında mikro/nano yapılardaki kaçınılmaz hasar vücutta çoğaltıldı.Kan ve protein yapışma testleri kullanılarak LOIS'in biyolojik kirlenme önleyici özelliklerinin in vitro stabilitesi belirlenebilir (Şekil 4D).Bir dizi optik görüntü, her bir alt tabakanın deliklerinin yakınında meydana gelen hasarı gösteriyor.Mekanik hasarın biyolojik kirlilik önleyici kaplama üzerindeki etkisini göstermek için bir kan yapışma testi yapıldı (Şekil 4E).SHP gibi, kirlenme önleyici özellikler hasar nedeniyle kaybolur ve LOIS, kanı iterek mükemmel kirlenme önleyici özellikler sergiler.Bunun nedeni, yüzey enerjisinin hasarlı alanı kaplayan kılcal hareket tarafından yönlendirilmesi nedeniyle, mikro yapılı yağlayıcı madde içindeki akışın kirlenme önleyici özellikleri (35) geri kazanmasıdır.Albümin kullanılarak yapılan protein yapışma testinde de aynı eğilim gözlendi.Hasarlı alanda, SHP'nin yüzeyinde proteinin yapışması yaygın olarak gözlemlenir ve alan kapsamı ölçülerek çıplak alt tabakanın yapışma seviyesinin yarısı kadar ölçülebilir.Öte yandan LOIS, yapışmaya neden olmadan biyolojik kirlenme önleyici özelliklerini korumuştur (Şekil 4, F ve G).Ek olarak, vidanın yüzeyi sıklıkla delme gibi güçlü mekanik strese maruz kalır, bu nedenle LOIS kaplamasının vida üzerinde in vitro bozulmadan kalma yeteneğini inceledik.Şekil 4H çıplak, SHP ve LOIS dahil olmak üzere farklı vidaların optik görüntülerini gösterir.Kırmızı dikdörtgen, kemik implantasyonu sırasında güçlü mekanik stresin oluştuğu hedef alanı temsil eder.Plakanın protein yapışma testine benzer şekilde, protein yapışmasını görüntülemek ve güçlü mekanik stres altında bile LOIS kaplamanın bütünlüğünü kanıtlamak için kapsama alanını ölçmek için bir floresan mikroskobu kullanılır (Şekil 4, I ve J).LOIS ile işlenmiş vidalar mükemmel kirlenme önleyici performans sergiler ve yüzeye neredeyse hiç protein yapışmaz.Öte yandan çıplak vidalarda ve SHP vidalarında protein yapışması gözlendi; SHP vidalarının kapladığı alan çıplak vidaların üçte biri kadardı.Ayrıca sabitleme için kullanılan ortopedik implantın Şekil 4K'da gösterildiği gibi kırık bölgesine uygulanan strese dayanacak şekilde mekanik olarak güçlü olması gerekir.Bu nedenle kimyasal modifikasyonun mekanik özelliklere etkisini belirlemek için eğilme testi yapıldı.Ayrıca bu, implantın sabit stresini korumak için yapılır.İmplant tamamen katlanana ve stres-gerinim eğrisi elde edilene kadar dikey mekanik kuvvet uygulayın (Şekil 4L, 1).Young modülü ve bükülme mukavemeti dahil iki özellik, mekanik mukavemetlerinin göstergesi olarak çıplak ve LOIS yüzeyler arasında karşılaştırıldı (Şekil 4L, 2 ve 3).Young modülü, bir malzemenin mekanik değişikliklere dayanma yeteneğini gösterir.Her bir substratın Young modülü sırasıyla 41,48±1,01 ve 40,06±0,96 GPa'dır;gözlenen fark yaklaşık %3,4'tür.Ayrıca malzemenin tokluğunu belirleyen eğilme mukavemetinin çıplak altlık için 102,34±1,51 GPa, SHP için ise 96,99±0,86 GPa olduğu rapor edilmiştir.Çıplak alt tabaka yaklaşık %5,3 daha yüksektir.Mekanik özelliklerdeki hafif düşüş çentik etkisinden kaynaklanabilir.Çentik etkisinde, mikro/nano pürüzlülük bir dizi çentik gibi davranarak lokal stres konsantrasyonuna yol açabilir ve implantın mekanik özelliklerini etkileyebilir (46).Bununla birlikte, insan kortikal kemiğinin sertliğinin 7,4 ila 31,6 GPa arasında olduğu ve ölçülen LOIS modülünün insan kortikal kemiğininkini aştığı (47) gerçeğine dayanarak, LOIS kırığı ve onun genelini desteklemek için yeterlidir. Mekanik özellikler yüzey modifikasyonundan minimum düzeyde etkilenir.
(A) Operasyon sırasında ortopedik implanta uygulanan mekanik stresin (1) şematik diyagramı ve (2) hasarlı ortopedik implantın optik görüntüsü.(B) Çıplak yüzeyde nanoindentasyon ve LOIS ile nano-mekanik özellik ölçümünün şematik diyagramı.(C) Çıplak yüzeyin ve LOIS'in nanoindentasyon kuvvet-yer değiştirme eğrisi.(D) İn vitro deneylerden sonra, operasyon sırasında oluşan mekanik stresi simüle etmek için farklı türdeki ortopedik plakaların (hasarlı alan kırmızı bir dikdörtgenle vurgulanır) optik görüntülerini simüle edin.Hasarlı ortopedik plaka grubunun (E) Kan yapışma testi ve (F) protein yapışma testi.(G) Plakaya yapışan proteinin alan kapsamını ölçün.(H) İn vitro deneyden sonra farklı tipte ortopedik vidaların optik görüntüleri.(I) Farklı kaplamaların bütünlüğünü incelemek için protein yapışma testi.(J) Vidaya yapışan proteinin alan kapsamını ölçün.(K) Tavşanın hareketinin amacı kırık kemik üzerinde sabit bir stres oluşturmaktır.(L) (1) Bükülme testi sonuçları ve bükülmeden önce ve sonra optik görüntüler.Çıplak implant ile SHP arasındaki (2) Young modülü ve (3) bükülme mukavemeti arasındaki fark.Veriler ortalama ± SD olarak ifade edilmiştir (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 ve ****P<0,0001).Resim izniyle: Kyomin Chae, Yonsei Üniversitesi.
Klinik durumlarda, biyolojik materyaller ve yara bölgeleri ile bakteriyel temasın çoğu olgun, olgun biyofilmlerden gelir (48).Bu nedenle ABD Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri, tüm insan enfeksiyonlarının %65'inin biyofilmlerle ilişkili olduğunu tahmin etmektedir (49).Bu durumda implant yüzeyinde tutarlı biyofilm oluşumunu sağlayacak bir in vivo deney tasarımının sağlanması gerekmektedir.Bu nedenle, ortopedik implantların bakteriyel bir süspansiyon içinde önceden inkübe edildiği ve daha sonra LOIS'in kirlenme önleyici özelliklerini in vivo olarak incelemek için tavşan femurlarına implante edildiği bir tavşan femur kırığı modeli geliştirdik.Aşağıdaki üç önemli gerçek nedeniyle bakteriyel enfeksiyonlar, bakteriyel süspansiyonların doğrudan enjeksiyonu yerine ön kültür yoluyla indüklenir: (i) Tavşanların bağışıklık sistemi doğal olarak insanlarınkinden daha güçlüdür;bu nedenle bakteriyel süspansiyonların ve planktonik bakterilerin enjeksiyonu mümkündür. Biyofilm oluşumu üzerinde hiçbir etkisi yoktur.(ii) Planktonik bakteriler antibiyotiklere daha duyarlıdır ve antibiyotikler genellikle ameliyattan sonra kullanılır;son olarak, (iii) planktonik bakteri süspansiyonu hayvanın vücut sıvıları (50) tarafından seyreltilebilir.İmplantı implantasyondan önce bakteriyel bir süspansiyonda önceden kültürleyerek, bakteriyel enfeksiyonun ve yabancı cisim reaksiyonunun (FBR) kemik iyileşme süreci üzerindeki zararlı etkilerini kapsamlı bir şekilde inceleyebiliriz.Tavşanlar implantasyondan 4 hafta sonra sakrifiye edildi çünkü kemik iyileşme süreci için gerekli olan osseointegrasyon 4 hafta içinde tamamlanacak.Daha sonra implantlar, sonraki çalışmalar için tavşanlardan çıkarıldı.Şekil 5A bakterilerin çoğalma mekanizmasını göstermektedir.Enfekte olmuş ortopedik implant vücuda yerleştirilir.Bakteri süspansiyonunda ön inkübasyon sonucunda, çıplak implant implante edilen altı tavşandan altısı enfekte olurken, LOIS ile tedavi edilen implantlar implante edilmiş tavşanların hiçbiri enfekte olmadı.Bakteriyel enfeksiyonlar büyüme, olgunlaşma ve dağılma olmak üzere üç aşamada ilerler (51).İlk önce tutunan bakteriler yüzeyde çoğalıp büyürler, daha sonra bakteriler hücre dışı polimer (EPS), amiloid ve hücre dışı DNA salgılayarak bir biyofilm oluştururlar.Biyofilm sadece antibiyotiklerin penetrasyonunu engellemekle kalmaz, aynı zamanda antibiyotiği parçalayan enzimlerin (β-laktamaz gibi) birikimini de teşvik eder (52).Son olarak biyofilm olgun bakterileri çevre dokulara yayar.Bu nedenle enfeksiyon meydana gelir.Ayrıca vücuda yabancı bir cisim girdiğinde, güçlü bir bağışıklık tepkisine neden olabilecek bir enfeksiyon, şiddetli iltihaplanma, ağrı ve bağışıklığın azalmasına neden olabilir.Şekil 5B, bakteriyel bir enfeksiyonun neden olduğu bağışıklık tepkisinden ziyade, ortopedik bir implantın yerleştirilmesinin neden olduğu FBR'ye genel bir bakış sunmaktadır.Bağışıklık sistemi yerleştirilen implantı yabancı cisim olarak tanır ve hücrelerin ve dokuların yabancı cismi kapsüllemek üzere reaksiyona girmesine neden olur (53).FBR'nin ilk günlerinde ortopedik implantların yüzeyinde fibrinojenin adsorbsiyonuyla sonuçlanan bir besleme matrisi oluştu.Adsorbe edilen fibrinojen daha sonra lökositlerin bağlanmasını teşvik eden oldukça yoğun bir fibrin ağı oluşturur (54).Fibrin ağı oluştuktan sonra nötrofillerin infiltrasyonuna bağlı olarak akut inflamasyon meydana gelecektir.Bu adımda tümör nekroz faktörü-α (TNF-α), interlökin-4 (IL-4) ve IL-β gibi çeşitli sitokinler salınır ve monositler implantasyon bölgesine sızmaya ve dev hücrelere farklılaşmaya başlar.Faj (41, 55, 56).FBR'yi azaltmak her zaman zor olmuştur çünkü aşırı FBR, ölümcül komplikasyonlara yol açabilecek akut ve kronik inflamasyona neden olabilir.Çıplak implantı ve LOIS'i çevreleyen dokulardaki bakteriyel enfeksiyonların etkisini değerlendirmek amacıyla hematoksilen ve eozin (H&E) ve Masson trikrom (MT) boyama kullanıldı.Çıplak substratlar implante edilen tavşanlarda ciddi bakteriyel enfeksiyonlar ilerledi ve H&E doku slaytlarında inflamasyonun neden olduğu apseler ve nekroz açıkça görüldü.Öte yandan, son derece güçlü biyolojik kirlilik önleyici yüzey LOIS bakteriyel yapışmayı engeller, dolayısıyla enfeksiyon belirtisi göstermez ve iltihabı azaltır (Şekil 5C).MT boyamanın sonuçları da aynı eğilimi gösterdi.Bununla birlikte, MT boyaması LOIS implante edilen tavşanlarda da ödem gösterdi, bu da iyileşmenin gerçekleşmek üzere olduğunu gösteriyor (Şekil 5D).İmmün yanıtın derecesini incelemek amacıyla, immün yanıtla ilgili sitokinler TNF-a ve IL-6 kullanılarak immünohistokimyasal (IHC) boyama yapıldı.Bakterilere maruz kalmayan çıplak bir negatif implant, bakteriyel enfeksiyonun yokluğunda iyileşme sürecini incelemek için bakterilere maruz kalan ancak enfekte olmayan bir LOIS ile karşılaştırıldı.Şekil 5E, TNF-a'yı ifade eden bir IHC slaytının optik görüntüsünü gösterir.Kahverengi alan bağışıklık tepkisini temsil eder ve LOIS'teki bağışıklık tepkisinin biraz azaldığını gösterir.Ek olarak LOIS'te IL-6'nın ifadesi, steril çıplakın negatif ifadesinden önemli ölçüde daha azdı (Şekil 5F).Sitokinin ifadesi, sitokine karşılık gelen antikor boyama alanı ölçülerek ölçüldü (Şekil 5G).Negatif implantlara maruz kalan tavşanlarla karşılaştırıldığında LOIS implante edilen tavşanların ekspresyon seviyeleri daha düşüktü ve anlamlı bir fark gösteriyordu.Sitokin ekspresyonundaki azalma, LOIS'in uzun vadeli, stabil kirlenme önleyici özelliklerinin yalnızca bakteriyel enfeksiyonların inhibisyonu ile ilgili olmadığını, aynı zamanda substrata yapışan makrofajlar tarafından indüklenen FBR'nin azalmasıyla da ilişkili olduğunu gösterir (53, 57, 58).Bu nedenle, LOIS'in bağışıklıktan kaçma özelliklerine bağlı olarak azalan bağışıklık tepkisi, plastik cerrahi sonrası aşırı bağışıklık tepkisi gibi implantasyon sonrası yan etkileri çözebilir.
(A) Biyofilm oluşumu ve enfekte ortopedik implantın yüzeyine yayılma mekanizmasının şematik diyagramı.eDNA, hücre dışı DNA.(B) Ortopedik implant yerleştirilmesinden sonra bağışıklık tepkisinin şematik diyagramı.(C) H&E boyama ve (D) ortopedik implantların çevre dokularının çıplak pozitif ve LOIS ile MT boyaması.İmmün ilişkili sitokinlerin (E) TNF-a ve (F) IL-6'nın IHC'si, çıplak negatif ve LOIS implante edilmiş tavşanların lekeli görüntüleridir.(G) Sitokin ekspresyonunun alan kapsama ölçümü ile ölçülmesi (** P <0.01).
LOIS'in biyouyumluluğu ve kemik iyileşme süreci üzerindeki etkisi, tanısal görüntüleme [x-ışını ve mikro bilgisayarlı tomografi (BT)] ve osteoklast IHC kullanılarak in vivo olarak incelenmiştir.Şekil 6A, üç farklı aşamayı içeren kemik iyileşme sürecini göstermektedir: iltihaplanma, onarım ve yeniden şekillenme.Bir kırık meydana geldiğinde, inflamatuar hücreler ve fibroblastlar kırılan kemiğe nüfuz edecek ve vasküler dokuya doğru büyümeye başlayacaktır.Onarım aşamasında damar dokusunun büyümesi kırık bölgesinin yakınına yayılır.Damar dokusu, kallus adı verilen yeni kemiğin oluşumu için besin sağlar.Kemik iyileşme sürecinin son aşaması, aktive osteoklastların seviyesinin artmasıyla kallus boyutunun normal kemik boyutuna küçültüldüğü yeniden yapılanma aşamasıdır (59).Her gruptaki kallus oluşumu seviyesindeki farklılıkları gözlemlemek için mikro-CT taramaları kullanılarak kırık bölgesinin üç boyutlu (3D) rekonstrüksiyonu yapıldı.Kırık kemiği çevreleyen nasırın kalınlığını gözlemlemek için femurun kesitini gözlemleyin (Şekil 6, B ve C).Her gruptaki farklı kemik yenilenme süreçlerini gözlemlemek amacıyla her hafta tüm grupların kırık bölgelerini incelemek için X ışınları da kullanıldı (Şekil S9).Nasır ve olgun kemikler sırasıyla mavi/yeşil ve fildişi renkte gösterilmiştir.Yumuşak dokuların çoğu önceden belirlenmiş bir eşikle filtrelenir.Çıplak pozitif ve SHP, kırık bölgesinin çevresinde az miktarda kallus oluşumunu doğruladı.Öte yandan LOIS'in açığa çıkan negatifi ve kırık bölgesi kalın kallusla çevrelenmiştir.Mikro BT görüntüleri kallus oluşumunun bakteriyel enfeksiyon ve enfeksiyona bağlı inflamasyon tarafından engellendiğini gösterdi.Bunun nedeni, bağışıklık sisteminin kemik iyileşmesinden ziyade enfeksiyona bağlı inflamasyonun neden olduğu septik yaralanmaların iyileşmesine öncelik vermesidir (60).Osteoklast aktivitesini ve kemik rezorpsiyonunu gözlemlemek için IHC ve Tartrata dirençli Asit Fosfataz (TRAP) boyaması yapıldı (Şekil 6D) (61).Çıplak pozitiflerde ve SHP'de sadece birkaç aktif osteoklast mor boyalı olarak bulundu.Öte yandan LOIS'in çıplak pozitif ve olgun kemiklerinin yakınında çok sayıda aktif osteoklast gözlendi.Bu fenomen, osteoklastların varlığında kırık bölgesi etrafındaki kallusun şiddetli bir yeniden şekillenme sürecinden geçtiğini göstermektedir (62).Kallusun kemik hacmi ve osteoklast ekspresyon alanı, mikro-BT taraması ve IHC sonuçlarını ölçmek için tüm gruplarda kırık bölgesi etrafındaki kallus oluşumunun seviyesini karşılaştırmak için ölçüldü (Şekil 6E, 1 ve 2).Beklendiği gibi, LOIS'teki çıplak negatifler ve kallus oluşumu diğer gruplara göre anlamlı derecede yüksekti, bu da pozitif kemik yeniden şekillenmesinin meydana geldiğini gösteriyordu (63).Şekil S10, cerrahi bölgenin optik görüntüsünü, vidanın yakınında toplanan dokunun MT boyama sonucunu ve vida-kemik arayüzünü vurgulayan TRAP boyama sonucunu göstermektedir.Çıplak substratta güçlü kallus ve fibroz oluşumu gözlenirken LOIS ile tedavi edilen implant nispeten yapışmamış bir yüzey gösterdi.Benzer şekilde çıplak negatiflerle karşılaştırıldığında, beyaz oklarla gösterildiği gibi LOIS implante edilen tavşanlarda daha düşük fibroz gözlendi.Ek olarak, sert ödem (mavi ok), LOIS'in bağışıklıktan kaçınma özelliklerine atfedilebilir, böylece şiddetli inflamasyonu azaltır.İmplantın etrafındaki yapışmaz yüzey ve azalmış fibrozis, çıkarma işleminin daha kolay olduğunu gösterir ve bu da genellikle başka kırıklara veya iltihaplanmalara neden olur.Vidanın çıkarılmasından sonraki kemik iyileşme süreci, vida-kemik arayüzündeki osteoklast aktivitesi ile değerlendirildi.Hem çıplak kemik hem de LOIS implant arayüzü, daha fazla kemik iyileşmesi için benzer seviyelerde osteoklast emdi; bu da LOIS kaplamanın kemik iyileşmesi veya bağışıklık tepkisi üzerinde olumsuz bir etkisinin olmadığını gösteriyor.LOIS üzerinde gerçekleştirilen yüzey modifikasyonunun kemik iyileşme sürecine müdahale etmediğini doğrulamak için, tavşanların kemik iyileşmesini maruz kalan negatif iyonlarla ve 6 haftalık LOIS implantasyonuyla karşılaştırmak için X-ışını incelemesi kullanıldı (Şekil 6F).Sonuçlar, enfekte olmamış çıplak pozitif grupla karşılaştırıldığında LOIS'in aynı derecede kemik iyileşmesi gösterdiğini ve her iki grupta da belirgin bir kırık belirtisi (sürekli osteoliz hattı) olmadığını gösterdi.
(A) Kırık sonrası kemik iyileşme sürecinin şematik diyagramı.(B) Her yüzey grubunun kallus oluşum derecesindeki fark ve (C) kırık bölgesinin kesit görüntüsü.(D) Osteoklast aktivitesini ve kemik erimesini görselleştirmek için TRAP boyama.TRAP aktivitesine dayanarak, kortikal kemiğin dış kallus oluşumu (E) (1) mikro-CT ve (2) osteoklast aktivitesi ile niceliksel olarak analiz edildi.(F) implantasyondan 6 hafta sonra, maruz kalan negatifin (kırmızı kesikli dikdörtgenle vurgulanmıştır) ve LOIS'in (mavi kesikli dikdörtgenle vurgulanmıştır) kırık kemiğinin X-ışını görüntüleri.İstatistiksel analiz tek yönlü varyans analizi (ANOVA) ile yapıldı.* P<0.05.** P<0,01.
Kısacası LOIS, ortopedik implantlar için yeni tip bir antibakteriyel enfeksiyon stratejisi ve bağışıklık kaçış kaplaması sağlar.SHP işlevselleştirmeli geleneksel ortopedik implantlar, kısa süreli biyolojik kirlenme önleyici özellikler sergiler, ancak özelliklerini uzun süre koruyamazlar.Substratın süperhidrofobikliği, bakteri ve substrat arasındaki hava kabarcıklarını yakalar, böylece hava cepleri oluşturur ve böylece bakteriyel enfeksiyonu önler.Ancak havanın difüzyonu nedeniyle bu hava cepleri kolayca çıkarılabilir.Öte yandan LOIS'in biyofilmle ilişkili enfeksiyonları önleme yeteneği de kanıtlanmıştır.Bu nedenle katmanlı mikro/nano yapı yüzeyine enjekte edilen kayganlaştırıcı tabakanın reddetme önleyici özelliği sayesinde enfeksiyona bağlı iltihaplanmanın önüne geçilebilmektedir.LOIS üretim koşullarını optimize etmek için SEM, AFM, XPS ve CA ölçümleri dahil olmak üzere çeşitli karakterizasyon yöntemleri kullanılır.Ayrıca LOIS, ortopedik sabitleme ekipmanlarında yaygın olarak kullanılan PLGA, Ti, PE, POM ve PPSU gibi çeşitli biyolojik malzemelere de uygulanabilir.Daha sonra LOIS, bakterilere ve bağışıklık tepkisiyle ilgili biyolojik maddelere karşı biyolojik kirlenme önleyici özelliklerini kanıtlamak için in vitro olarak test edildi.Sonuçlar, çıplak implantla karşılaştırıldığında mükemmel antibakteriyel ve biyolojik kirlilik önleyici etkilere sahip olduğunu göstermektedir.Ayrıca LOIS, plastik cerrahide kaçınılmaz olan mekanik stres uygulandıktan sonra bile mekanik dayanıklılık gösterir.Mikro/nano yapının yüzeyindeki yağlayıcının kendi kendini iyileştirme özelliğinden dolayı LOIS, anti-biyolojik kirlenme özelliklerini başarıyla korumuştur.LOIS'in in vivo biyouyumluluğunu ve antibakteriyel özelliklerini incelemek için LOIS, 4 hafta boyunca tavşan uyluk kemiğine implante edildi.LOIS implante edilen tavşanlarda bakteriyel enfeksiyon gözlenmedi.Ek olarak, IHC kullanımı lokal bağışıklık tepkisinde azalma gösterdi; bu da LOIS'in kemik iyileşme sürecini engellemediğini gösteriyor.LOIS'in mükemmel antibakteriyel ve bağışıklık önleme özellikleri sergilediği ve özellikle kemik sentezi için ortopedik cerrahi öncesi ve sırasında biyofilm oluşumunu etkili bir şekilde önlediği kanıtlanmıştır.Bir tavşan kemik iliği inflamatuar femur kırığı modeli kullanılarak, biyofilmle ilişkili enfeksiyonların, önceden inkübe edilmiş implantların neden olduğu kemik iyileşme süreci üzerindeki etkisi derinlemesine araştırıldı.Gelecekteki bir çalışma olarak, tüm iyileşme süreci boyunca biyofilmle ilişkili enfeksiyonları tam olarak anlamak ve önlemek için implantasyon sonrası olası enfeksiyonları incelemek üzere yeni bir in vivo modele ihtiyaç vardır.Ayrıca LOIS ile entegrasyonda osteoindüksiyon hala çözülmemiş bir sorundur.Bu zorluğun üstesinden gelmek için osteoindüktif hücrelerin veya rejeneratif tıbbın seçici yapışmasını LOIS ile birleştirmek için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.Genel olarak LOIS, mekanik sağlamlığa ve mükemmel biyolojik kirlenme önleyici özelliklere sahip, CAE'yi ve bağışıklık yan etkilerini azaltabilen ümit verici bir ortopedik implant kaplamasını temsil eder.
Kirletici maddeleri çıkarmak için 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS alt tabakayı (Dong Kang M-Tech Co., Kore) aseton, EtOH ve DI su içinde 15 dakika yıkayın.Yüzeyde mikro/nano düzeyde bir yapı oluşturmak için, temizlenen alt tabaka 50°C'de %48 ila %51 HF çözeltisine (DUKSAN Corp., Güney Kore) daldırılır.Aşındırma süresi 0 ila 60 dakika arasında değişir.Daha sonra aşındırılan altlık, deiyonize su ile temizlendi ve yüzeyde bir krom oksit pasivasyon tabakası oluşturmak için 50°C'de 30 dakika boyunca %65 HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) çözeltisine yerleştirildi.Pasifleştirmeden sonra substrat deiyonize suyla yıkanır ve katmanlı yapıya sahip bir substrat elde etmek için kurutulur.Daha sonra substrat oksijen plazmasına (100 W, 3 dakika) maruz bırakıldı ve hemen 12 saat boyunca oda sıcaklığında tolüen içerisinde 8.88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Almanya) içeren bir çözeltiye daldırıldı.Daha sonra POTS ile kaplanan substrat EtOH ile temizlendi ve yoğun bir POTS SAM elde etmek için 150°C'de 2 saat tavlandı.SAM kaplamasından sonra, 20 μm/cm2 yükleme hacmine sahip bir perfloropolieter yağlayıcı (Krytox 101; DuPont, ABD) uygulanarak alt tabaka üzerinde bir yağlayıcı tabaka oluşturuldu. Kullanmadan önce, yağlayıcıyı 0,2 mikronluk bir filtreden filtreleyin.Fazla yağlayıcıyı 15 dakika boyunca 45° açıyla eğerek çıkarın.Aynı üretim prosedürü 304 SS'den (kilitleme plakası ve kortikal kilitleme vidası; Dong Kang M-Tech Co., Kore) yapılan ortopedik implantlar için de kullanıldı.Tüm ortopedik implantlar tavşan femurunun geometrisine uyacak şekilde tasarlanmıştır.
Substrat ve ortopedik implantların yüzey morfolojisi, alan emisyonu SEM (Inspect F50, FEI, ABD) ve AFM (XE-100, Park Systems, Güney Kore) ile incelendi.Yüzey pürüzlülüğü (Ra, Rq), 20 μm alanının 20 μm (n=4) ile çarpılmasıyla ölçülür.Yüzey kimyasal bileşimini analiz etmek için 100μm2 nokta boyutuna sahip bir Al Ka ​​X-ışını kaynağıyla donatılmış bir XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japonya) sistemi kullanıldı.Sıvı CA ve SA'yı ölçmek için dinamik görüntü yakalama kamerasıyla (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Güney Kore) donatılmış bir CA ölçüm sistemi kullanıldı.Her ölçüm için, CA'yı ölçmek üzere yüzeye 6 ila 10 ul damlacık (deiyonize su, at kanı, EG, %30 etanol ve HD) yerleştirilir.Alt tabakanın eğim açısı 2°/s (n = 4) hızla arttığında damlacık düştüğünde SA ölçülür.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] ve MRSA (ATCC 25923), ATCC'den (Manassas, Virginia, ABD) satın alındı ​​ve stok kültürü -80°C'de tutuldu.Kullanımdan önce, dondurulmuş kültür, trypsin ile çözülmüş soya fasulyesi et suyunda (Komed, Kore) 37°C'de 18 saat boyunca inkübe edildi ve daha sonra aktive edilmesi için iki kez aktarıldı.İnkübasyonun ardından kültür, 4°C'de 10 dakika boyunca 10.000 rpm'de santrifüjlendi ve iki kez bir PBS (pH 7.3) çözeltisiyle yıkandı.Santrifüjlenen kültür daha sonra kanlı agar plakaları (BAP) üzerinde alt kültüre tabi tutulur.MRSA ve Pseudomonas aeruginosa gece boyunca hazırlandı ve Luria-Bertani sıvı besiyerinde kültürlendi.Aşılamadaki Pseudomonas aeruginosa ve MRSA konsantrasyonu, agar üzerindeki seri seyreltmelerdeki süspansiyonun CFU'su ile niceliksel olarak belirlendi.Daha sonra bakteri konsantrasyonunu 108 CFU/ml'ye eşdeğer olan 0,5 McFarland standardına ayarlayın.Daha sonra çalışan bakteri süspansiyonunu 100 kez 106 CFU/ml'ye seyreltin.Antibakteriyel yapışma özelliklerini test etmek için substrat, kullanımdan önce 121°C'de 15 dakika süreyle sterilize edildi.Substrat daha sonra 25 ml bakteri süspansiyonuna aktarıldı ve 37°C'de kuvvetli bir şekilde çalkalanarak (200 rpm) 12 ve 72 saat süreyle inkübe edildi.İnkübasyondan sonra her bir substrat inkübatörden çıkarıldı ve yüzeydeki yüzen bakterileri uzaklaştırmak için 3 kez PBS ile yıkandı.Substrat üzerindeki biyofilmi gözlemlemek için biyofilm metanol ile sabitlendi ve 1 ml suçidin turuncusu ile 2 dakika süreyle boyandı.Daha sonra lekeli biyofilmin fotoğraflarını çekmek için bir floresan mikroskobu (BX51TR, Olympus, Japonya) kullanıldı.Substrat üzerindeki biyofilmi ölçmek için, tutunan hücreler, tutunan bakterileri uzaklaştırmak için en uygun yöntem olarak kabul edilen boncuk vorteks yöntemi ile substrattan ayrıldı (n = 4).Steril forseps kullanarak, substratı büyüme ortamından çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için kuyu plakasına hafifçe vurun.Gevşek bir şekilde bağlanan hücreler, steril PBS ile iki kez yıkanarak çıkarıldı.Daha sonra her bir substrat, 9 ml %0,1 protein ept salin (PSW) ve 2 g 20 ila 25 steril cam boncuk (0,4 ila 0,5 mm çapında) içeren steril bir test tüpüne aktarıldı.Daha sonra hücreleri numuneden ayırmak için 3 dakika boyunca vortekslendi.Vortekslemeden sonra süspansiyon %0,1 PSW ile seri olarak 10 kat seyreltildi ve ardından her seyreltmeden 0,1 ml BAP üzerine aşılandı.37°C'de 24 saatlik inkübasyonun ardından CFU manuel olarak sayıldı.
Hücreler için fare fibroblastları NIH/3T3 (CRL-1658; Amerikan ATCC) ve fare makrofajları RAW 264.7 (TIB-71; Amerikan ATCC) kullanıldı.Fare fibroblastlarını kültürlemek için Dulbecco'nun değiştirilmiş Eagle ortamını (DMEM; LM001-05, Welgene, Kore) kullanın ve %10 buzağı serumu (S103-01, Welgene) ve %1 penisilin-streptomisin (PS; LS202-02, Welgene (Welgene) ile destekleyin) ) %10 fetal sığır serumu (S001-01, Welgene) ve %1 PS ile desteklenmiş fare makrofajlarını kültürlemek için DMEM kullanın. Substratı altı kuyulu bir hücre kültürü plakasına yerleştirin ve hücreleri 105 hücre/cm2 oranında aşılayın. Hücreler gece boyunca 37°C'de ve %5 C02'de inkübe edildi. Hücre boyaması için, hücreler 20 dakika boyunca %4 paraformaldehid ile sabitlendi ve 5 dakika süreyle %0.5 Triton X Incubate'e yerleştirildi. Substratı 50 nM tetrametilrhodamine batırın. 30 dakika boyunca 37°C'de İnkübasyon işleminden sonra, 4',6-diamino-2-fenilindol (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD sabitleme ortamı (hücre başına n = 4) içeren substratı kullanın. , floresein, floresein izotiyosiyanat-albümin (A9771, Sigma-Aldrich, Almanya) ve insan plazması Alexa Fluor 488-konjuge fibrinojen (F13191, Invitrogen, ABD), PBS (10 mM, pH 7,4) içinde çözüldü.Albümin ve fibrinojen konsantrasyonları sırasıyla 1 ve 150 μg/ml idi.Substrattan sonra Protein çözeltisine daldırılmadan önce, yüzeyi yeniden nemlendirmek için bunları PBS ile durulayın.Daha sonra tüm substratları protein çözeltisi içeren altı kuyulu bir plakaya daldırın ve 30 ve 90 dakika boyunca 37°C'de inkübe edin.İnkübasyondan sonra substrat protein çözeltisinden çıkarıldı, 3 kez PBS ile hafifçe yıkandı ve %4 paraformaldehit ile sabitlendi (her protein için n = 4).Kalsiyum için sodyum klorür (0,21 M) ve potasyum fosfat (3,77 mM)) Deiyonize su içerisinde çözüldü.Çözeltinin pH'ı, hidroklorür çözeltisi (İM) eklenerek 2,0'a ayarlandı.Daha sonra çözelti içinde kalsiyum klorür (5.62 mM) çözüldü.1M tris(hidroksimetil)-amino Metan eklenerek çözeltinin pH'ı 7,4'e ayarlanır.Tüm substratları 1,5x kalsiyum fosfat çözeltisiyle doldurulmuş altı kuyulu bir plakaya batırın ve 30 dakika sonra çözeltiden çıkarın.Boyama için 2 g Alizarin Red S (CI 58005) 100 ml deiyonize su ile karıştırılır.Daha sonra pH'ı 4'e ayarlamak için %10 amonyum hidroksit kullanın. Substratı 5 dakika boyunca Alizarin Kırmızısı çözeltisiyle boyayın ve ardından fazla boyayı silkeleyerek kurulayın.Çalkalama işleminden sonra alt tabakayı çıkarın.Malzeme kurutulur, ardından 5 dakika süreyle aseton içerisine daldırılır, ardından 5 dakika süreyle aseton-ksilen (1:1) çözeltisine daldırılır ve son olarak ksilen (n = 4) ile yıkanır.×10 ve ×20 objektif lensli floresan mikroskobu (Axio Imager) kullanılır..A2m, Zeiss, Almanya) tüm alt tabakaların görüntülerini alır.Dört farklı görüntüleme alanının her bir grubundaki biyolojik maddelerin yapışma verilerini ölçmek için ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) kullanıldı.Alt tabaka karşılaştırması için tüm görüntüleri sabit eşik değerlerine sahip ikili görüntülere dönüştürün.
Yansıma modunda PBS'deki yağlayıcı tabakanın stabilitesini izlemek için bir Zeiss LSM 700 eş odaklı mikroskop kullanıldı.Enjekte edilmiş bir yağlama katmanına sahip flor bazlı SAM kaplı cam numunesi, bir PBS çözeltisine daldırıldı ve hafif çalkalama koşulları altında (120 rpm) bir yörünge çalkalayıcı (SHO-1D; Daihan Scientific, Güney Kore) kullanılarak test edildi.Daha sonra numuneyi alın ve yansıyan ışık kaybını ölçerek yağlayıcı kaybını izleyin.Yansıma modunda floresans görüntüleri elde etmek için numune 633 nm lazere maruz bırakılır ve daha sonra toplanır çünkü ışık numuneden geri yansıtılacaktır.Numuneler 0, 30, 60 ve 120 saatlik zaman aralıklarında ölçüldü.
Yüzey modifikasyon işleminin ortopedik implantların nanomekanik özellikleri üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla, nanoindenedionu ölçmek için üç taraflı piramit şeklinde Berkovich elmas ucuyla donatılmış bir nanoindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, ABD) kullanıldı.Tepe yükü 10 mN'dir ve alan 100μmx 100μm'dir.Tüm ölçümler için yükleme ve boşaltma süresi 10 saniyedir ve en yüksek girinti yükü altında tutma süresi 2 saniyedir.Beş farklı yerden ölçüm alın ve ortalamasını alın.Yük altında mekanik dayanım performansını değerlendirmek amacıyla üniversal bir test makinesi (Instron 5966, Instron, ABD) kullanılarak enine üç noktalı eğilme testi yapıldı.Substrat artan yük ile 10 N/s sabit hızda sıkıştırılır.Eğilme modülünü ve maksimum basınç gerilimini hesaplamak için Bluehill Universal yazılım programı (n = 3) kullanıldı.
Operasyon sürecini ve buna bağlı olarak operasyon sırasında oluşan mekanik hasarı simüle etmek amacıyla operasyon süreci in vitro olarak gerçekleştirildi.Femurlar idam edilen Yeni Zelanda beyaz tavşanlarından toplandı.Femur temizlendi ve 1 hafta boyunca %4 paraformaldehid içerisinde sabitlendi.Hayvan deneyi yönteminde anlatıldığı gibi sabit femur cerrahi olarak ameliyat edildi.Operasyon sonrası ortopedik implant, mekanik yaralanma uygulandıktan sonra kan yapışıklıkları oluşup oluşmadığını doğrulamak için 10 saniye boyunca kana (at kanı, KISAN, Kore) batırıldı (n = 3).
Toplam 24 erkek Yeni Zelanda beyaz tavşanı (ağırlık 3,0 ila 3,5 kg, ortalama yaş 6 ay) rastgele dört gruba ayrıldı: çıplak negatif, çıplak pozitif, SHP ve LOIS.Hayvanları içeren tüm prosedürler, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin (IACUC onaylı, KORE-2017-0159) etik standartlarına uygun olarak gerçekleştirildi.Ortopedik implant, beş delikli bir kilitleme plakasından (uzunluk 41 mm, genişlik 7 mm ve kalınlık 2 mm) ve kırık tespiti için kortikal kilitleme vidalarından (uzunluk 12 mm, çap 2,7 mm) oluşur.Çıplak negatif grupta kullanılan plak ve vidalar dışındaki tüm plak ve vidalar MRSA süspansiyonunda (106 CFU/ml) 12 saat inkübe edildi.Çıplak negatif grup (n=6), enfeksiyon için negatif kontrol olarak bakteri süspansiyonuna maruz bırakılmadan çıplak yüzey implantlarıyla tedavi edildi.Çıplak pozitif grup (n = 6), enfeksiyon için pozitif kontrol olarak bakterilere maruz bırakılan çıplak yüzey implantıyla tedavi edildi.SHP grubu (n = 6), bakteriyel olarak maruz kalan SHP implantlarıyla tedavi edildi.Son olarak LOIS grubu bakterilere maruz kalan LOIS implantlarıyla tedavi edildi (n = 6).Tüm hayvanlar kafeste tutuluyor ve bol miktarda yiyecek ve su sağlanıyor.Operasyon öncesinde tavşanlar 12 saat süreyle aç bırakıldı.Hayvanlara, indüksiyon için intramüsküler ksilazin (5 mg/kg) enjeksiyonu ve intravenöz paklitaksel (3 mg/kg) enjeksiyonu yoluyla anestezi uygulandı.Bundan sonra anesteziyi sürdürmek için solunum sistemi aracılığıyla %2 izofluran ve %50 ila %70 tıbbi oksijen (akış hızı 2 L/dak) iletin.Lateral femura doğrudan yaklaşılarak implante edilir.Epilasyon ve derinin povidon-iyot dezenfeksiyonundan sonra sol orta uyluk kemiğinin dış kısmına yaklaşık 6 cm uzunluğunda bir kesi yapıldı.Femur'u kaplayan kasların arasındaki boşluk açılarak femur tamamen ortaya çıkar.Plakayı femoral şaftın önüne yerleştirin ve dört vidayla sabitleyin.Sabitlemeden sonra, ikinci delik ile dördüncü delik arasındaki alanda yapay olarak bir kırılma oluşturmak için bir testere bıçağı (1 mm kalınlığında) kullanın.Ameliyat bitiminde yara serum fizyolojik ile yıkanıp dikişlerle kapatıldı.Her tavşana üçte bir oranında salinle seyreltilmiş enrofloksasin (5 mg/kg) deri altından enjekte edildi.Kemiğin osteotomisini doğrulamak için tüm hayvanlarda (0, 7, 14, 21, 28 ve 42. günlerde) ameliyat sonrası femur röntgenleri çekildi.Derin anestezinin ardından tüm hayvanlar 28 ve 42. günlerde intravenöz KCl (2 mmol/kg) ile öldürüldü.Uygulamanın ardından femur, dört grup arasındaki kemik iyileşme sürecini ve yeni kemik oluşumunu gözlemlemek ve karşılaştırmak için mikro BT ile tarandı.
Uygulamanın ardından ortopedik implantlarla doğrudan temas halinde olan yumuşak dokular toplandı.Doku gece boyunca %10 nötr tamponlu formalinde sabitlendi ve daha sonra EtOH içerisinde dehidre edildi.Susuz kalan doku parafine gömüldü ve bir mikrotom (400CS; EXAKT, Almanya) kullanılarak 40 mikron kalınlığında kesitler alındı.Enfeksiyonu görselleştirmek için H&E boyama ve MT boyama yapıldı.Konakçı tepkisini kontrol etmek için kesitli doku, tavşan anti-TNF-a birincil antikoru (AB6671, Abcam, ABD) ve tavşan anti-IL-6 (AB6672; Abcam, ABD) ile inkübe edildi ve ardından yaban turpu ile işlendi.Oksidaz.Üreticinin talimatlarına göre kesitlere avidin-biyotin kompleksi (ABC) boyama sistemini uygulayın.Kahverengi bir reaksiyon ürünü olarak ortaya çıkması için tüm parçalarda 3,3-diaminobenzidin kullanıldı.Tüm dilimleri görselleştirmek için bir dijital slayt tarayıcı (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Macaristan) kullanıldı ve her gruptaki en az dört substrat ImageJ yazılımı ile analiz edildi.
Ameliyattan sonra ve kırık iyileşmesini izlemek için her hafta tüm hayvanlarda röntgen görüntüleri alındı ​​(grup başına n=6).Uygulamanın ardından, iyileşme sonrası femur çevresinde kallus oluşumunu hesaplamak için yüksek çözünürlüklü mikro-BT kullanıldı.Elde edilen femur temizlendi, %4 paraformaldehit içerisinde 3 gün süreyle sabitlendi ve %75 etanol içerisinde dehidre edildi.Susuz kalan kemikler daha sonra kemik numunesinin 3D voksel görüntülerini (2240x2240 piksel) oluşturmak için mikro-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belçika) kullanılarak tarandı.Sinyal gürültüsünü azaltmak ve tüm taramalara yüksek çözünürlük uygulamak için 1,0 mm Al filtre kullanın (E = 133 kVp, I = 60 μA, entegrasyon süresi = 500 ms).Elde edilen 2 boyutlu yan projeksiyondan taranan numunenin 3 boyutlu hacmini oluşturmak için Nrecon yazılımı (versiyon 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belçika) kullanıldı.Analiz için 3 boyutlu yeniden oluşturulmuş görüntü, kırık bölgesine göre 10mm×10mm×10mm küplere bölünür.Kortikal kemiğin dışındaki kallusu hesaplayın.Taranan kemik hacmini dijital olarak yönlendirmek için DataViewer (versiyon 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belçika) yazılımı kullanıldı ve analiz için CT-Analyzer (versiyon 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belçika) yazılımı kullanıldı.Olgun kemik ve kallustaki göreceli x-ışını absorpsiyon katsayıları, yoğunluklarına göre ayırt edilir ve ardından kallusun hacmi ölçülür (n = 4).LOIS'in biyouyumluluğunun kemik iyileşme sürecini geciktirmediğini doğrulamak için iki tavşanda ek X-ışını ve mikro-BT analizi yapıldı: çıplak negatif ve LOIS grupları.Her iki grup da 6. haftada idam edildi.
Kurban edilen hayvanlardan alınan femurlar toplandı ve 3 gün boyunca %4 paraformaldehid içerisinde sabitlendi.Ortopedik implant daha sonra femurdan dikkatlice çıkarılır.Femur 21 gün süreyle 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation) kullanılarak kireçten arındırıldı.Daha sonra dekalsifiye edilmiş femur, dehidre edilmesi için EtOH'ye daldırıldı.Susuz kalan femur ksilen içerisinde çıkarıldı ve parafine gömüldü.Daha sonra numune otomatik döner mikrotom (Leica RM2255, Leica Biosystems, Almanya) ile 3 µm kalınlığında dilimlendi.TRAP boyaması için (F6760, Sigma-Aldrich, Almanya), kesitlere ayrılan numuneler parafinden arındırıldı, yeniden hidratlandı ve TRAP reaktifinde 37°C'de 1 saat süreyle inkübe edildi.Görüntüler bir slayt tarayıcı (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Macaristan) kullanılarak elde edildi ve lekeli alanın alan kapsamı ölçülerek ölçüldü.Her deneyde, her gruptaki en az dört substrat ImageJ yazılımı ile analiz edildi.
İstatistiksel anlamlılık analizi GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., ABD) kullanılarak yapıldı.Değerlendirme grupları arasındaki farkları test etmek için eşleştirilmemiş t testi ve tek yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanıldı.Anlamlılık düzeyi şekilde şu şekilde gösterilmektedir: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 ve ****P<0,0001;NS, anlamlı bir fark yok.
Bu makaleye ilişkin ek materyaller için lütfen http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1 adresine bakın.
Bu, Creative Commons Atıf-Ticari Olmayan Lisans koşulları altında dağıtılan açık erişimli bir makaledir; kullanım ticari kazanç amacıyla olmadığı ve orijinal olduğu sürece herhangi bir ortamda kullanıma, dağıtıma ve çoğaltmaya izin verir. iş doğrudur.Referans.
Not: Sizden yalnızca sayfaya önerdiğiniz kişinin e-postayı görmesini istediğinizi ve e-postanın spam olmadığını bilmesi için bir e-posta adresi vermenizi istiyoruz.Herhangi bir e-posta adresini yakalamayacağız.
Bu soru, insan ziyaretçi olup olmadığınızı test etmek ve otomatik spam gönderimlerini önlemek için kullanılır.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Ortopedik implantların antibakteriyel ve bağışıklıktan kaçış kaplamaları enfeksiyonları ve enfeksiyonların neden olduğu bağışıklık tepkilerini azaltabilir.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Ortopedik implantların antibakteriyel ve bağışıklıktan kaçış kaplamaları enfeksiyonları ve enfeksiyonların neden olduğu bağışıklık tepkilerini azaltabilir.
©2021 Amerikan Bilimi İlerletme Derneği.her hakkı saklıdır.AAAS, HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef ve COUNTER'ın ortağıdır.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.