Per als pacients sotmesos a cirurgia d'implants ortopèdics, les infeccions bacterianes i les respostes immunes induïdes per infeccions sempre han estat riscos mortals.Els materials biològics convencionals són susceptibles a la contaminació biològica, la qual cosa fa que els bacteris envaeixin la zona lesionada i provoquin una infecció postoperatòria.Per tant, hi ha una necessitat urgent de desenvolupar recobriments antiinfecció i d'escapament immunitari per als implants ortopèdics.Aquí, hem desenvolupat una tecnologia avançada de modificació de superfícies per a implants ortopèdics anomenada Lubricated Orthopaedic Implant Surface (LOIS), que s'inspira en la superfície llisa dels càntirs de plantes de càntir.LOIS té una repel·lència líquida forta i duradora a una varietat de líquids i substàncies biològiques (incloses cèl·lules, proteïnes, calci i bacteris).A més, vam confirmar la durabilitat mecànica davant les ratllades i la força de fixació simulant el dany inevitable durant la cirurgia in vitro.El model de fractura femoral inflamatòria de la medul·la òssia de conill es va utilitzar per estudiar a fons l'escala antibiològica i la capacitat antiinfecció de LOIS.Ens imaginem que LOIS, que té propietats anti-biofouling i durabilitat mecànica, és un pas endavant en la cirurgia ortopèdica lliure d'infeccions.
Avui dia, a causa de l'envelliment general, el nombre de pacients que pateixen malalties ortopèdiques (com fractures a la gent gran, malalties degeneratives de les articulacions i osteoporosi) ha augmentat molt (1, 2).Per tant, les institucions mèdiques donen molta importància a la cirurgia ortopèdica, inclosos els implants ortopèdics de cargols, plaques, ungles i articulacions artificials (3, 4).No obstant això, s'ha informat que els implants ortopèdics tradicionals són susceptibles a l'adhesió bacteriana i la formació de biofilm, que poden causar infecció del lloc quirúrgic (SSI) després de la cirurgia (5, 6).Una vegada que el biofilm es forma a la superfície de l'implant ortopèdic, l'eliminació del biofilm es fa extremadament difícil fins i tot amb l'ús de grans dosis d'antibiòtics.Per tant, sol conduir a infeccions postoperatòries greus (7, 8).A causa dels problemes anteriors, el tractament dels implants infectats hauria d'incloure la reoperació, inclosa l'eliminació de tots els implants i teixits circumdants;per tant, el pacient patirà dolor intens i alguns riscos (9, 10).
Per resoldre alguns d'aquests problemes, s'han desenvolupat implants ortopèdics amb fàrmacs per prevenir la infecció eliminant els bacteris adherits a la superfície (11, 12).Tanmateix, l'estratègia encara mostra diverses limitacions.S'ha informat que la implantació a llarg termini d'implants de fàrmac ha causat danys als teixits circumdants i ha provocat inflamació, que pot provocar necrosi (13, 14).A més, els dissolvents orgànics que poden existir després del procés de fabricació d'implants ortopèdics d'eliminació de fàrmacs, que estan estrictament prohibits per la Food and Drug Administration dels Estats Units, requereixen passos de purificació addicionals per complir els seus estàndards (15).Els implants d'elució de fàrmacs són un repte per a l'alliberament controlat de fàrmacs i, a causa de la seva càrrega limitada de fàrmacs, l'aplicació a llarg termini del fàrmac no és factible (16).
Una altra estratègia habitual és recobrir l'implant amb un polímer antiincrustante per evitar que la matèria biològica i els bacteris s'adhereixin a la superfície (17).Per exemple, els polímers zwitteriònics han cridat l'atenció a causa de les seves propietats no adhesives quan estan en contacte amb proteïnes plasmàtiques, cèl·lules i bacteris.Tanmateix, té algunes limitacions relacionades amb l'estabilitat a llarg termini i la durabilitat mecànica, que dificulten la seva aplicació pràctica en implants ortopèdics, especialment a causa del raspat mecànic durant els procediments quirúrgics (18, 19).A més, a causa de la seva alta biocompatibilitat, la manca de necessitat de cirurgia d'extirpació i les propietats de neteja de superfícies per corrosió, s'han utilitzat implants ortopèdics fets amb materials biodegradables (20, 21).Durant la corrosió, els enllaços químics entre la matriu del polímer es trenquen i es desprenen de la superfície, i els adherents netegen la superfície.No obstant això, la contaminació antibiològica per neteja de superfícies és eficaç en un curt període de temps.A més, la majoria dels materials absorbibles, com ara el copolímer poli(àcid làctic-àcid glicòlic) (PLGA), àcid polilàctic (PLA) i aliatges basats en magnesi, patiran una biodegradació i erosió desiguals al cos, la qual cosa afectarà negativament l'estabilitat mecànica.(vint-i-dos).A més, els fragments de plaques biodegradables proporcionen un lloc perquè els bacteris s'uneixin, la qual cosa augmenta la possibilitat d'infecció a llarg termini.Aquest risc de degradació mecànica i infecció limita l'aplicació pràctica de la cirurgia plàstica (23).
Les superfícies superhidrofòbiques (SHP) que imiten l'estructura jeràrquica de les fulles de lotus s'han convertit en una solució potencial per a superfícies antiincrustantes (24, 25).Quan la superfície SHP està immersa en líquid, les bombolles d'aire quedaran atrapades, formant així bosses d'aire i impedint l'adhesió bacteriana (26).No obstant això, estudis recents han demostrat que la superfície SHP té desavantatges relacionats amb la durabilitat mecànica i l'estabilitat a llarg termini, que dificulten la seva aplicació en implants mèdics.A més, les bosses d'aire es dissolen i perdran les seves propietats antiincrustantes, donant lloc a una adhesió bacteriana més àmplia a causa de la gran superfície de la superfície de l'SHP (27, 28).Recentment, Aizenberg i els seus col·legues van introduir un mètode innovador de recobriment de superfícies anti-biofouling desenvolupant una superfície llisa inspirada en la planta de càntir Nepenthes (29, 30).La superfície llisa mostra estabilitat a llarg termini en condicions hidràuliques, és extremadament repel·lent líquida als líquids biològics i té propietats d'autoreparació.Tanmateix, no hi ha un mètode per aplicar un recobriment a un implant mèdic de forma complexa, ni està demostrat que recolzi el procés de curació del teixit danyat després de la implantació.
Aquí, introduïm una superfície d'implant ortopèdic lubricada (LOIS), una superfície d'implant ortopèdic micro/nanoestructurada i estretament combinada amb una fina capa de lubricant per evitar que s'associï amb cirurgia plàstica Infeccions bacterianes, com ara la fixació de fractures.Com que l'estructura micro/nano-nivell funcionalitzada amb fluor fixa fermament el lubricant a l'estructura, el LOIS desenvolupat pot repel·lir completament l'adhesió de diversos líquids i mantenir el rendiment antiincrustante durant molt de temps.Els recobriments LOIS es poden aplicar a materials de diverses formes destinats a la síntesi òssia.S'han confirmat in vitro les excel·lents propietats anti-biofouling de LOIS contra bacteris de biofilm [Pseudomonas aeruginosa i Staphylococcus aureus resistent a la meticil·lina (MRSA)] i substàncies biològiques (cèl·lules, proteïnes i calci).La taxa d'adhesió de l'adhesió extensiva al substrat és inferior a l'1%.A més, fins i tot després que es produeixi estrès mecànic com ara rascades superficials, l'autocuració provocada pel lubricant penetrant ajuda a mantenir les seves propietats antiincrustantes.Els resultats de les proves de durabilitat mecànica mostren que fins i tot després de la modificació estructural i química, la resistència total no es reduirà significativament.A més, es va dur a terme un experiment in vitro que simula l'estrès mecànic en l'entorn quirúrgic per demostrar que LOIS pot suportar diverses tensions mecàniques que es produeixen durant la cirurgia plàstica.Finalment, vam utilitzar un model de fractura femoral in vivo basat en conill, que va demostrar que LOIS té propietats antibacterianes i biocompatibilitat superiors.Els resultats radiològics i histològics van confirmar que el comportament estable del lubricant i les propietats anti-biofouling dins de les 4 setmanes posteriors a la implantació poden aconseguir un rendiment efectiu d'anti-infecció i d'escapament immunitari sense retardar el procés de cicatrització òssia.
La figura 1A mostra un diagrama esquemàtic del LOIS desenvolupat, que s'implanta amb estructures micro/nano-escala en el model de fractura femoral de conill per confirmar les seves excel·lents propietats anti-infecció i anti-infecció.Es duu a terme un mètode biomimètic per simular la superfície d'una planta de test d'aigua i per evitar la bioincrustació mitjançant la incorporació d'una capa de lubricant dins de la micro/nano estructura de la superfície.La superfície injectada amb lubricant pot minimitzar el contacte entre les substàncies biològiques i la superfície.Per tant, a causa de la formació d'enllaços químics estables a la superfície, té un excel·lent rendiment antifouling i estabilitat a llarg termini.Com a resultat, les propietats anti-biofouling de la superfície lubricant permeten diverses aplicacions pràctiques en investigació biomèdica.No obstant això, encara no s'ha completat una àmplia investigació sobre com interactua aquesta superfície especial en el cos.Comparant LOIS amb substrats nus in vitro mitjançant bacteris d'albúmina i biofilm, es pot confirmar la no adhesió de LOIS (figura 1B).A més, fent rodar les gotes d'aigua al substrat nu inclinat i al substrat LOIS (figura S1 i pel·lícula S1), es pot demostrar el rendiment de la contaminació biològica.Tal com es mostra a la imatge del microscopi de fluorescència, el substrat exposat incubat en una suspensió de proteïnes i bacteris mostrava una gran quantitat de material biològic adherit a la superfície.Tanmateix, a causa de les seves excel·lents propietats anti-biofouling, LOIS gairebé no mostra fluorescència.Per tal de confirmar les seves propietats anti-biofouling i anti-infecció, LOIS es va aplicar a la superfície d'implants ortopèdics per a la síntesi òssia (plaques i cargols) i es va col·locar en un model de fractura de conill.Abans de la implantació, l'implant ortopèdic nu i el LOIS es van incubar en una suspensió bacteriana durant 12 hores.La preincubació garanteix que es formi un biofilm a la superfície de l'implant exposat per a la seva comparació.La figura 1C mostra una foto del lloc de la fractura 4 setmanes després de la implantació.A l'esquerra, un conill amb un implant ortopèdic nu mostrava un nivell greu d'inflamació a causa de la formació d'un biofilm a la superfície de l'implant.El resultat contrari es va observar en conills implantats amb LOIS, és a dir, els teixits circumdants de LOIS no mostraven ni signes d'infecció ni signes d'inflamació.A més, la imatge òptica de l'esquerra indica el lloc quirúrgic del conill amb l'implant exposat, indicant que no s'han trobat múltiples adhesius presents a la superfície de l'implant exposat a la superfície del LOIS.Això demostra que LOIS té estabilitat a llarg termini i té la capacitat de mantenir les seves propietats anti-incrustacions biològiques i anti-adhesió.
(A) Diagrama esquemàtic de LOIS i la seva implantació en un model de fractura femoral de conill.(B) Imatge de microscòpia de fluorescència de biofilm de proteïnes i bacteris a la superfície nua i el substrat LOIS.4 setmanes després de la implantació, (C) una imatge fotogràfica del lloc de la fractura i (D) una imatge de raigs X (resaltada per un rectangle vermell).Imatge cortesia: Kyomin Chae, Universitat Yonsei.
Els conills esterilitzats, exposats i implantats negativament, van mostrar un procés de curació òssia normal sense cap signe d'inflamació o infecció.D'altra banda, els implants SHP pre-incubats en una suspensió bacteriana presenten una inflamació relacionada amb la infecció als teixits circumdants.Això es pot atribuir a la seva incapacitat per inhibir l'adhesió bacteriana durant molt de temps (figura S2).Per demostrar que LOIS no afecta el procés de curació, sinó que inhibeix possibles infeccions relacionades amb la implantació, es van comparar imatges de raigs X de la matriu positiva exposada i LOIS al lloc de la fractura (Figura 1D).La imatge de raigs X de l'implant positiu nu mostrava línies d'osteòlisi persistents, cosa que indicava que l'os no estava completament curat.Això suggereix que el procés de recuperació òssia es pot retardar molt a causa de la inflamació relacionada amb la infecció.Al contrari, va demostrar que els conills implantats amb LOIS s'havien curat i no mostraven cap lloc de fractura evident.
Per tal de desenvolupar implants mèdics amb estabilitat i funcionalitat a llarg termini (inclosa la resistència a la biofouling), s'han fet molts esforços.Tanmateix, la presència de diverses substàncies biològiques i la dinàmica d'adhesió dels teixits limita el desenvolupament dels seus mètodes clínicament fiables.Per tal de superar aquestes deficiències, hem desenvolupat una estructura micro/nano en capes i una superfície modificada químicament, que s'optimitza a causa de l'alta força capil·lar i afinitat química per mantenir el lubricant més suau en la major mesura.La figura 2A mostra el procés de fabricació global de LOIS.Primer, prepareu un substrat d'acer inoxidable (SS) 304 de grau mèdic.En segon lloc, l'estructura micro/nano es forma al substrat SS mitjançant gravat químic mitjançant una solució d'àcid fluorhídric (HF).Per tal de restaurar la resistència a la corrosió del SS, s'utilitza una solució d'àcid nítric (HNO3) (31) per processar el substrat gravat.La passivació millora la resistència a la corrosió del substrat SS i alenteix significativament el procés de corrosió que pot reduir el rendiment global de LOIS.A continuació, formant una monocapa autoassemblada (SAM) amb 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctiltrietoxisilà (POTS), la superfície es modifica químicament per millorar la interacció química entre la superfície i el lubricant suau Affinity.La modificació de la superfície redueix significativament l'energia superficial de la superfície estructurada a micro / nanoescala fabricada, que coincideix amb l'energia superficial del lubricant llis.Això permet que el lubricant es mulli completament, formant així una capa lubricant estable a la superfície.La superfície modificada presenta una hidrofobicitat millorada.Els resultats mostren que el lubricant relliscós presenta un comportament estable en LOIS a causa de l'alta afinitat química i la força capil·lar causada per l'estructura micro/nano (32, 33).Es van estudiar els canvis òptics a la superfície de SS després de la modificació de la superfície i la injecció de lubricant.L'estructura de micro/nano capes formada a la superfície pot provocar canvis visuals i enfosquir la superfície.Aquest fenomen s'atribueix a l'efecte millorat de dispersió de la llum a la superfície rugosa, que augmenta la reflexió difusa causada pel mecanisme de captura de la llum (34).A més, després d'injectar el lubricant, el LOIS es torna més fosc.La capa lubricant fa que es reflecteixi menys llum pel substrat, enfosquint així el LOIS.Per optimitzar la microestructura / nanoestructura per mostrar l'angle de lliscament (SA) més petit per aconseguir un rendiment anti-biofouling, es van utilitzar microscòpia electrònica d'escaneig (SEM) i parells atòmics per realitzar diferents temps de gravat HF ​​(0, 3)., 15 i 60 minuts) Microscopi de força (AFM) (Figura 2B).Les imatges SEM i AFM mostren que després d'un breu temps de gravat (3 minuts de gravat), el substrat nu ha format una rugositat desigual a nanoescala.La rugositat de la superfície canvia amb el temps de gravat (figura S3).La corba variable en el temps mostra que la rugositat de la superfície continua augmentant i arriba a un màxim als 15 minuts de gravat, i després només s'observa una lleugera disminució del valor de rugositat als 30 minuts de gravat.En aquest punt, la rugositat del nanonivell s'esborra, mentre que la rugositat del micronivell es desenvolupa amb força, fent que el canvi de rugositat sigui més estable.Després de gravar durant més de 30 minuts, s'observa un nou augment de la rugositat, que s'explica detalladament de la següent manera: SS està compost d'acer, aliat amb elements que inclouen ferro, crom, níquel, molibdè i molts altres elements.Entre aquests elements, el ferro, el crom i el molibdè tenen un paper important en la formació d'una rugositat a escala micro/nano a la SS mitjançant gravat HF.En les primeres etapes de la corrosió, el ferro i el crom es corroeixen principalment perquè el molibdè té una major resistència a la corrosió que el molibdè.A mesura que avança el gravat, la solució de gravat arriba a una sobresaturació local, formant fluorurs i òxids causats pel gravat.El fluorur i l'òxid precipiten i finalment es tornen a dipositar a la superfície, formant una rugositat superficial en el rang de micres/nano (31).Aquesta rugositat a nivell micro/nano té un paper important en les propietats d'autocuració de LOIS.La superfície de doble escala produeix un efecte sinèrgic, augmentant molt la força capil·lar.Aquest fenomen permet que el lubricant penetri a la superfície de manera estable i contribueix a les propietats d'autocuració (35).La formació de la rugositat depèn del temps de gravat.A menys de 10 minuts de gravat, la superfície només conté rugositat a nanoescala, que no és suficient per contenir prou lubricant per tenir resistència a la biofouling (36).D'altra banda, si el temps de gravat supera els 30 minuts, la rugositat a nanoescala formada per la redeposició de ferro i crom desapareixerà i només es mantindrà la rugositat a microescala a causa del molibdè.La superfície gravada no té rugositat a nanoescala i perd l'efecte sinèrgic de la rugositat en dues etapes, que afecta negativament les característiques d'autocuració de LOIS.Les mesures de SA es van realitzar en substrats amb diferents temps de gravat per demostrar el rendiment antiincrustante.Es van seleccionar diversos tipus de líquids en funció de la viscositat i l'energia superficial, incloent aigua desionitzada (DI), sang, etilenglicol (EG), etanol (EtOH) i hexadecà (HD) (Figura S4).El patró de gravat variable en el temps mostra que per a diversos líquids amb diferents energies superficials i viscositats, el SA de LOIS després de 15 minuts de gravat és el més baix.Per tant, LOIS està optimitzat per gravar-se durant 15 minuts per formar rugositat de micres i nanoescala, que és adequada per mantenir eficaçment la durabilitat del lubricant i excel·lents propietats antiincrustantes.
(A) Diagrama esquemàtic del procés de fabricació en quatre etapes de LOIS.El requadre mostra el SAM format al substrat.(B) Imatges SEM i AFM, utilitzades per optimitzar l'estructura micro/nano del substrat en diferents temps de gravat.Espectroscòpia de fotoelectrons de raigs X (XPS) de (C) Cr2p i (D) F1s després de la passivació superficial i el recobriment SAM.au, unitat arbitrària.(E) Imatges representatives de gotes d'aigua sobre substrats nus, gravats, SHP i LOIS.(F) La mesura de l'angle de contacte (CA) i SA de líquids amb diferents tensions superficials en SHP i LOIS.Les dades s'expressen com a mitjana ± SD.
Aleshores, per confirmar el canvi en les propietats químiques de la superfície, es va utilitzar l'espectroscòpia fotoelectrònica de raigs X (XPS) per estudiar el canvi en la composició química de la superfície del substrat després de cada recobriment superficial.La figura 2C mostra els resultats de la mesura XPS de la superfície gravada amb HF i la superfície tractada amb HNO 3.Els dos pics principals a 587,3 i 577,7 eV es poden atribuir a l'enllaç Cr-O existent a la capa d'òxid de crom, que és la diferència principal amb la superfície gravada amb HF.Això es deu principalment al consum de ferro i fluorur de crom a la superfície per part del HNO3.El gravat basat en HNO3 permet que el crom formi una capa d'òxid passivant a la superfície, cosa que fa que el SS gravat torni a ser resistent a la corrosió.A la figura 2D, es van obtenir espectres XPS per confirmar que el silà basat en fluorocarburs es va formar a la superfície després del recobriment SAM, que té una repel·lència de líquids extremadament alta fins i tot per a EG, sang i EtOH.El recobriment SAM es completa fent reaccionar grups funcionals silà amb grups hidroxil formats per tractament amb plasma.Com a resultat, es va observar un augment significatiu dels pics CF2 i CF3.L'energia d'unió entre 286 i 296 eV indica que la modificació química s'ha completat amb èxit pel recobriment SAM.SHP mostra pics de CF2 (290,1 ​​eV) i CF3 (293,3 eV) relativament grans, que són causats pel silà basat en fluorocarburs format a la superfície.La figura 2E mostra imatges òptiques representatives de les mesures de l'angle de contacte (CA) per a diferents grups d'aigua desionitzada en contacte amb SHP, SHP i LOIS nua, gravada.Aquestes imatges mostren que la superfície gravada es torna hidròfila a causa de la micro/nano estructura formada per gravat químic, de manera que l'aigua desionitzada s'absorbeix a l'estructura.Tanmateix, quan el substrat està recobert amb SAM, el substrat presenta una forta repel·lència a l'aigua, de manera que es forma un SHP superficial i l'àrea de contacte entre l'aigua i la superfície és petita.Finalment, es va observar una disminució de CA a LOIS, que es pot atribuir a la penetració de lubricant a la microestructura, augmentant així l'àrea de contacte.Per demostrar que la superfície té una excel·lent repel·lència de líquids i propietats no adhesives, es va comparar el LOIS amb el substrat SHP mesurant CA i SA amb diversos líquids (figura 2F).Es van seleccionar diversos tipus de líquids en funció de la viscositat i l'energia superficial, incloent aigua desionitzada, sang, EG, EtOH i HD (Figura S4).Els resultats de la mesura de CA mostren que quan CA tendeix a HD, el valor de reducció de CA, on CA té l'energia superficial més baixa.A més, el LOIS de l'AC global és baix.Tanmateix, la mesura SA mostra un fenomen completament diferent.Excepte l'aigua ionitzada, tots els líquids s'adhereixen al substrat SHP sense lliscar-se.D'altra banda, LOIS mostra un SA molt baix, on quan tot el líquid s'inclina en un angle inferior a 10° a 15°, tot el líquid rodarà.Això demostra fortament que la no adhesió de LOIS és millor que la de la superfície SHP.A més, els recobriments LOIS també s'apliquen a diversos tipus de materials, com ara titani (Ti), polifenilsulfona (PPSU), polioximetilè (POM), polièter-eter cetona (PEEK) i polímers bioabsorbibles (PLGA). Són materials ortopèdics implantables (figura). S5)).Les imatges seqüencials de les gotes del material tractat per LOIS mostren que les propietats anti-biofouling de LOIS són les mateixes en tots els substrats.A més, els resultats de mesura de CA i SA mostren que les propietats no adhesives de LOIS es poden aplicar a altres materials.
Per confirmar les propietats antiincrustantes de LOIS, es van incubar diversos tipus de substrats (inclosos nus, gravats, SHP i LOIS) amb Pseudomonas aeruginosa i MRSA.Aquests dos bacteris es van seleccionar com a bacteris hospitalaris representatius, que poden conduir a la formació de biofilms, donant lloc a SSI (37).La figura 3 (A i B) mostra les imatges del microscopi de fluorescència i els resultats de la mesura de la unitat de formació de colònies (CFU) dels substrats incubats a la suspensió bacteriana a curt termini (12 hores) i a llarg termini (72 hores), respectivament.En un curt període de temps, els bacteris formaran grups i creixeran de mida, cobrint-se amb substàncies semblants a moc i impedint-ne l'eliminació.Tanmateix, durant les 72 hores d'incubació, els bacteris maduraran i seran fàcils de dispersar per formar més colònies o grups.Per tant, es pot considerar que la incubació de 72 hores és a llarg termini i és el temps d'incubació adequat per formar un biofilm fort a la superfície (38).En un curt període de temps, la superfície gravada i la superfície de l'SHP van mostrar una adhesió bacteriana, que es va reduir entre un 25% i un 50% en comparació amb el substrat nu.Tanmateix, a causa del seu excel·lent rendiment i estabilitat anti-biofouling, LOIS no va mostrar adhesió de biofilm bacteriana a curt i llarg termini.El diagrama esquemàtic (figura 3C) descriu l'explicació del mecanisme d'incrustació antibiològica de la solució de gravat, SHP i LOIS.La hipòtesi és que el substrat gravat amb propietats hidròfiles tindrà una superfície més gran que el substrat nu.Per tant, es produirà més adhesió bacteriana al substrat gravat.Tanmateix, en comparació amb el substrat nu, el substrat gravat té molt menys biofilm format a la superfície.Això es deu al fet que les molècules d'aigua s'uneixen fermament a la superfície hidròfila i actuen com a lubricant per a l'aigua, interferint així amb l'adhesió dels bacteris a curt termini (39).Tanmateix, la capa de molècules d'aigua és molt prima i soluble en suspensions bacterianes.Per tant, la capa molecular d'aigua desapareix durant molt de temps, donant lloc a una àmplia adhesió i proliferació bacteriana.Per a SHP, a causa de les seves propietats no humectants a curt termini, s'inhibeix l'adhesió bacteriana.La reducció d'adhesió bacteriana es pot atribuir a les bosses d'aire atrapades a l'estructura en capes i a una menor energia superficial, minimitzant així el contacte entre la suspensió bacteriana i la superfície.No obstant això, es va observar una àmplia adhesió bacteriana en SHP perquè va perdre les seves propietats antiincrustantes durant molt de temps.Això es deu principalment a la desaparició de les bosses d'aire a causa de la pressió hidrostàtica i a la dissolució de l'aire a l'aigua.Això es deu principalment a la desaparició de les bosses d'aire a causa de la dissolució i a l'estructura en capes que proporciona una superfície més gran per a l'adhesió (27, 40).A diferència d'aquests dos substrats que tenen un efecte important sobre l'estabilitat a llarg termini, el lubricant lubricant contingut en LOIS s'injecta a l'estructura micro/nano i no desapareixerà fins i tot a llarg termini.Els lubricants plens de micro/nano estructures són molt estables i són fortament atrets per la superfície a causa de la seva alta afinitat química, evitant així l'adhesió bacteriana durant molt de temps.La figura S6 mostra una imatge de microscopi confocal de reflexió d'un substrat infós amb lubricant immers en solució salina tamponada amb fosfat (PBS).Les imatges contínues mostren que fins i tot després de 120 hores de sacsejada lleugera (120 rpm), la capa de lubricant del LOIS es manté sense canvis, cosa que indica estabilitat a llarg termini en condicions de flux.Això es deu a l'alta afinitat química entre el recobriment SAM a base de fluor i el lubricant a base de perfluorocarboni, de manera que es pot formar una capa de lubricant estable.Per tant, es manté el rendiment antifouling.A més, es va provar el substrat amb proteïnes representatives (albúmina i fibrinogen), que es troben al plasma, cèl·lules molt relacionades amb la funció immune (macròfags i fibroblasts) i les relacionades amb la formació òssia.El contingut de calci és molt elevat.(Figura 3D, 1 i 2, i Figura S7) (41, 42).A més, les imatges del microscopi de fluorescència de la prova d'adhesió de fibrinogen, albúmina i calci van mostrar diferents característiques d'adhesió de cada grup de substrat (figura S8).Durant la formació òssia, les capes òssies i de calci de nova formació poden envoltar l'implant ortopèdic, cosa que no només dificulta l'extirpació, sinó que també pot causar danys inesperats al pacient durant el procés d'extracció.Per tant, els nivells baixos de dipòsits de calci a les plaques òssies i els cargols són beneficiosos per a la cirurgia ortopèdica que requereix la retirada d'implants.A partir de la quantificació de l'àrea adjunta basada en la intensitat de la fluorescència i el recompte de cèl·lules, vam confirmar que LOIS mostra excel·lents propietats anti-biofouling per a totes les substàncies biològiques en comparació amb altres substrats.Segons els resultats d'experiments in vitro, el LOIS anti-incrustació biològic es pot aplicar als implants ortopèdics, que no només poden inhibir les infeccions causades per bacteris de biofilm, sinó que també poden reduir la inflamació causada pel sistema immunitari actiu del cos.
(A) Imatges de microscopi de fluorescència de cada grup (nu, gravat, SHP i LOIS) incubades en suspensions de Pseudomonas aeruginosa i MRSA durant 12 i 72 hores.(B) El nombre de CFU adherents de Pseudomonas aeruginosa i MRSA a la superfície de cada grup.(C) Diagrama esquemàtic del mecanisme de contaminació antibiològic de gravat a curt i llarg termini, SHP i LOIS.(D) (1) El nombre de fibroblasts adherits a cada substrat i les imatges de microscopi de fluorescència de les cèl·lules adherides a la nua i LOIS.(2) Prova d'adhesió de proteïnes relacionades amb el sistema immunitari, albúmina i calci implicats en el procés de cicatrització òssia (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 i **** P <0,0001).ns, no és important.
En el cas d'esforços concentrats inevitables, la durabilitat mecànica ha estat sempre el principal repte per a l'aplicació de recobriments antiincrustantes.Els mètodes tradicionals de gel anti-aigües residuals es basen en polímers amb baixa solubilitat en aigua i fragilitat.Per tant, solen ser susceptibles a l'estrès mecànic en aplicacions biomèdiques.Per tant, els recobriments antiincrustantes mecànicament duradors segueixen sent un repte per a aplicacions com els implants ortopèdics (43, 44).La figura 4A(1) mostra els dos tipus principals d'estrès aplicat als implants ortopèdics, incloent el rascat (esforç de cisalla) i la compressió amb la imatge òptica de l'implant danyat produïda per les pinces.Per exemple, quan el cargol s'estreny amb un tornavís, o quan el cirurgià subjecta la placa òssia fortament amb unes pinces i aplica força de compressió, la placa òssia de plàstic es farà malbé i es ratlla tant a les escales macro com micro/nano (Figura 4A, 2).Per tal de provar si el LOIS fabricat pot suportar aquests danys durant la cirurgia plàstica, es va realitzar una nanoindentació per comparar la duresa del substrat nu i la LOIS a escala micro/nano per estudiar les propietats mecàniques de l'impacte de l'estructura micro/nano (figura). 4B).El diagrama esquemàtic mostra el diferent comportament de deformació de LOIS a causa de la presència de micro/nanoestructures.Es va dibuixar una corba de força-desplaçament a partir dels resultats de la nanoindentació (figura 4C).La imatge blava representa el substrat nu, que només mostra una lleugera deformació, tal com es veu per la profunditat màxima de sagnat de 0,26 μm.D'altra banda, l'augment gradual de la força de nanoindentació i el desplaçament observat en LOIS (corba vermella) pot mostrar signes de propietats mecàniques reduïdes, donant lloc a una profunditat de nanoindentació d'1, 61 μm.Això es deu al fet que l'estructura micro/nano present al LOIS proporciona un espai d'avanç més profund per a la punta del nanoindentador, de manera que la seva deformació és més gran que la del substrat nu.Konsta-Gdoutos et al.(45) creu que, a causa de la presència de nanoestructures, la nanoindentació i la rugositat micro/nano condueixen a corbes de nanoindentació irregulars.L'àrea ombrejada correspon a la corba de deformació irregular atribuïda a la nanoestructura, mentre que l'àrea no ombrejada s'atribueix a la microestructura.Aquesta deformació pot danyar la microestructura/nanoestructura del lubricant de retenció i afectar negativament el seu rendiment antifouling.Per tal d'estudiar l'impacte dels danys en LOIS, es va replicar el dany inevitable a les micro/nano estructures al cos durant la cirurgia plàstica.Mitjançant proves d'adhesió de sang i proteïnes, es pot determinar l'estabilitat de les propietats anti-biofouling de LOIS després in vitro (figura 4D).Una sèrie d'imatges òptiques mostren els danys que es van produir prop dels forats de cada substrat.Es va realitzar una prova d'adhesió de sang per demostrar l'efecte del dany mecànic sobre el recobriment anti-biofouling (figura 4E).Igual que SHP, les propietats antiincrustantes es perden a causa dels danys, i LOIS presenta excel·lents propietats antiincrustantes repel·lent la sang.Això és degut a que, com que l'energia superficial és impulsada per l'acció capil·lar que cobreix l'àrea danyada, el flux del lubricant lubricant microestructurat restaura les propietats antiincrustantes (35).La mateixa tendència es va observar en la prova d'adhesió de proteïnes amb albúmina.A la zona danyada, s'observa àmpliament l'adhesió de proteïnes a la superfície de l'SHP i, mesurant la seva cobertura d'àrea, es pot quantificar com la meitat del nivell d'adhesió del substrat nu.D'altra banda, LOIS va mantenir les seves propietats anti-biofouling sense provocar adhesió (Figura 4, F i G).A més, la superfície del cargol sovint està sotmesa a un fort estrès mecànic, com ara la perforació, de manera que hem estudiat la capacitat del recobriment LOIS de romandre intacte al cargol in vitro.La figura 4H mostra imatges òptiques de diferents cargols, inclosos els nus, SHP i LOIS.El rectangle vermell representa l'àrea objectiu on es produeix un fort estrès mecànic durant la implantació òssia.De manera similar a la prova d'adhesió de proteïnes de la placa, s'utilitza un microscopi de fluorescència per imaginar l'adhesió de proteïnes i mesurar l'àrea de cobertura per demostrar la integritat del recobriment LOIS, fins i tot sota una forta tensió mecànica (figura 4, I i J).Els cargols tractats amb LOIS presenten un excel·lent rendiment antifouling i gairebé cap proteïna s'adhereix a la superfície.D'altra banda, es va observar l'adhesió de proteïnes en cargols nus i cargols SHP, on la cobertura d'àrea dels cargols SHP era un terç de la dels cargols nus.A més, l'implant ortopèdic utilitzat per a la fixació ha de ser mecànicament fort per suportar l'estrès aplicat al lloc de la fractura, tal com es mostra a la figura 4K.Per tant, es va realitzar una prova de flexió per determinar l'efecte de la modificació química sobre les propietats mecàniques.A més, això es fa per mantenir la tensió fixa de l'implant.Aplicar força mecànica vertical fins que l'implant estigui completament plegat i s'obté una corba tensió-deformació (Figura 4L, 1).Es van comparar dues propietats que inclouen el mòdul de Young i la resistència a la flexió entre substrats nus i LOIS com a indicadors de la seva resistència mecànica (figura 4L, 2 i 3).El mòdul de Young indica la capacitat d'un material per suportar canvis mecànics.El mòdul de Young de cada substrat és de 41,48±1,01 i 40,06±0,96 GPa, respectivament;la diferència observada és d'un 3,4%.A més, s'informa que la resistència a la flexió, que determina la duresa del material, és de 102,34 ± 1,51 GPa per al substrat nu i de 96,99 ± 0,86 GPa per a SHP.El substrat nu és aproximadament un 5,3% més gran.La lleugera disminució de les propietats mecàniques pot ser causada per l'efecte de l'osca.En l'efecte d'osca, la rugositat micro/nano pot actuar com un conjunt d'osques, provocant una concentració local d'estrès i afectant les propietats mecàniques de l'implant (46).No obstant això, basant-se en el fet que la rigidesa de l'os cortical humà està entre 7,4 i 31,6 GPa, i el mòdul LOIS mesurat supera el de l'os cortical humà (47), el LOIS és suficient per suportar la fractura i el seu conjunt. les propietats mecàniques es veuen mínimament afectades per la modificació de la superfície.
(A) Diagrama esquemàtic de (1) l'esforç mecànic aplicat a l'implant ortopèdic durant l'operació, i (2) la imatge òptica de l'implant ortopèdic danyat.(B) Diagrama esquemàtic de la mesura de propietats nanomecàniques per nanoindentació i LOIS a la superfície nua.(C) Corba de força-desplaçament de nanoindentació de la superfície nua i LOIS.(D) Després d'experiments in vitro, simuleu les imatges òptiques de diferents tipus de plaques ortopèdiques (la zona danyada es ressalta amb un rectangle vermell) per simular l'estrès mecànic causat durant l'operació.(E) Prova d'adhesió de sang i (F) prova d'adhesió de proteïnes del grup de plaques ortopèdiques danyades.(G) Mesureu la cobertura de l'àrea de la proteïna adherida a la placa.(H) Imatges òptiques de diferents tipus de cargols ortopèdics després de l'experiment in vitro.(I) Prova d'adhesió de proteïnes per estudiar la integritat de diferents recobriments.(J) Mesureu la cobertura de la zona de la proteïna adherida al cargol.(K) El moviment del conill pretén generar una tensió fixa a l'os fracturat.(L) (1) Resultats de la prova de flexió i imatges òptiques abans i després de la flexió.La diferència en (2) mòdul de Young i (3) resistència a la flexió entre l'implant nu i l'SHP.Les dades s'expressen com a mitjana ± SD (* P <0, 05, ** P < 0, 01, *** P < 0, 001 i **** P < 0, 0001).Imatge cortesia: Kyomin Chae, Universitat Yonsei.
En situacions clíniques, la majoria del contacte bacterià amb materials biològics i llocs de ferides prové de biofilms madurs i madurs (48).Per tant, els Centres per al Control i la Prevenció de Malalties dels EUA estimen que el 65% de totes les infeccions humanes estan relacionades amb biofilms (49).En aquest cas, és necessari proporcionar un disseny experimental in vivo que proporcioni una formació consistent de biofilm a la superfície de l'implant.Per tant, vam desenvolupar un model de fractura femoral de conill en què els implants ortopèdics es pre-incubaven en una suspensió bacteriana i després es van implantar en fèmurs de conill per estudiar les propietats antiincrustantes de LOIS in vivo.A causa dels tres fets importants següents, les infeccions bacterianes són induïdes pel precultiu en lloc de la injecció directa de suspensions bacterianes: (i) El sistema immunitari dels conills és naturalment més fort que el dels humans;per tant, la injecció de suspensions bacterianes i bacteris planctònics és possible No té cap efecte en la formació de biofilms.(Ii) Els bacteris planctònics són més susceptibles als antibiòtics, i els antibiòtics s'utilitzen normalment després de la cirurgia;finalment, (iii) la suspensió de bacteris planctònics es pot diluir pels fluids corporals de l'animal (50).Precultivant l'implant en una suspensió bacteriana abans de la implantació, podem estudiar a fons els efectes nocius de la infecció bacteriana i la reacció de cos estrany (FBR) en el procés de curació òssia.Els conills es van sacrificar 4 setmanes després de la implantació, perquè l'osteointegració essencial per al procés de cicatrització òssia es completarà en 4 setmanes.A continuació, es van retirar els implants dels conills per a estudis aigües avall.La figura 5A mostra el mecanisme de proliferació dels bacteris.L'implant ortopèdic infectat s'introdueix al cos.Com a resultat de la preincubació en suspensió bacteriana, sis dels sis conills implantats amb implants nus es van infectar, mentre que cap dels conills implantats amb implants tractats amb LOIS es va infectar.Les infeccions bacterianes es desenvolupen en tres passos, que inclouen el creixement, la maduració i la dispersió (51).Primer, els bacteris units es reprodueixen i creixen a la superfície, i després els bacteris formen un biofilm quan excreten el polímer extracel·lular (EPS), l'amiloide i l'ADN extracel·lular.El biofilm no només interfereix amb la penetració dels antibiòtics, sinó que també afavoreix l'acumulació d'enzims que degraden els antibiòtics (com la β-lactamasa) (52).Finalment, el biofilm difon els bacteris madurs als teixits circumdants.Per tant, es produeix la infecció.A més, quan un cos estrany entra al cos, una infecció que pot provocar una resposta immune forta pot causar inflamació severa, dolor i disminució de la immunitat.La figura 5B ofereix una visió general de la FBR causada per la inserció d'un implant ortopèdic, en lloc de la resposta immune causada per una infecció bacteriana.El sistema immunitari reconeix l'implant inserit com un cos estrany i després fa que les cèl·lules i els teixits reaccionin per encapsular el cos estrany (53).En els primers dies de FBR, es va formar una matriu de subministrament a la superfície dels implants ortopèdics, que va donar lloc a l'adsorció de fibrinogen.Aleshores, el fibrinogen adsorbit forma una xarxa de fibrina altament densa, que afavoreix la unió de leucòcits (54).Un cop formada la xarxa de fibrina, es produirà una inflamació aguda a causa de la infiltració de neutròfils.En aquest pas, s'alliberen una varietat de citocines com el factor de necrosi tumoral-α (TNF-α), la interleucina-4 (IL-4) i la IL-β, i els monòcits comencen a infiltrar-se al lloc d'implantació i a diferenciar-se en cèl·lules gegants.Fag (41, 55, 56).Reduir la FBR sempre ha estat un repte perquè un FBR excessiu pot causar inflamació aguda i crònica, que pot provocar complicacions mortals.Per avaluar l'impacte de les infeccions bacterianes als teixits que envolten l'implant nu i LOIS, es va utilitzar la tinció d'hematoxilina i eosina (H&E) i tricrom de Masson (MT).Per als conills implantats amb substrats nus, les infeccions bacterianes greus van progressar i les diapositives de teixit H&E van mostrar clarament abscessos i necrosi causades per la inflamació.D'altra banda, la superfície anti-biofouling extremadament forta LOIS inhibeix l'adhesió bacteriana, de manera que no mostra signes d'infecció i redueix la inflamació (figura 5C).Els resultats de la tinció amb MT van mostrar la mateixa tendència.Tanmateix, la tinció de MT també va mostrar edema en conills implantats amb LOIS, cosa que indica que la recuperació està a punt de produir-se (figura 5D).Per tal d'estudiar el grau de resposta immune, es va realitzar una tinció immunohistoquímica (IHC) utilitzant citocines TNF-α i IL-6 relacionades amb la resposta immune.Un implant negatiu nu que no estava exposat a bacteris es va comparar amb un LOIS que estava exposat a bacteris però no infectat per estudiar el procés de curació en absència d'infecció bacteriana.La figura 5E mostra una imatge òptica d'una diapositiva IHC que expressa TNF-α.L'àrea marró representa la resposta immune, cosa que indica que la resposta immune en LOIS està lleugerament reduïda.A més, l'expressió d'IL-6 a LOIS va ser significativament menor que l'expressió negativa de nu estèril (figura 5F).L'expressió de la citocina es va quantificar mesurant l'àrea de tinció d'anticossos corresponent a la citocina (figura 5G).En comparació amb els conills exposats als implants negatius, els nivells d'expressió dels conills implantats amb LOIS eren més baixos, mostrant una diferència significativa.La disminució de l'expressió de citocines indica que les propietats antiincrustantes estables a llarg termini de LOIS no només estan relacionades amb la inhibició de les infeccions bacterianes, sinó també amb la disminució de FBR, que és induïda pels macròfags que s'adhereixen al substrat (53, 57, 58).Per tant, la resposta immune reduïda a causa de les propietats d'evasió immune de LOIS pot resoldre els efectes secundaris després de la implantació, com ara una resposta immune excessiva després de la cirurgia plàstica.
(A) Un diagrama esquemàtic del mecanisme de formació i propagació del biofilm a la superfície d'un implant ortopèdic infectat.eDNA, ADN extracel·lular.(B) Diagrama esquemàtic de la resposta immune després de la inserció d'un implant ortopèdic.(C) Tinció H&E i (D) Tinció MT dels teixits circumdants dels implants ortopèdics amb positiu nu i LOIS.IHC de citocines relacionades amb el sistema immunitari (E) TNF-α i (F) IL-6 són imatges tacades de conills negatius nus i implantats amb LOIS.(G) Quantificació de l'expressió de citocines mitjançant la mesura de la cobertura d'àrea (** P <0,01).
La biocompatibilitat de LOIS i el seu efecte en el procés de cicatrització òssia es va examinar in vivo mitjançant imatges de diagnòstic [raigs X i tomografia microcomputada (TC)] i osteoclasts IHC.La figura 6A mostra el procés de curació òssia que implica tres etapes diferents: inflamació, reparació i remodelació.Quan es produeix una fractura, les cèl·lules inflamatòries i els fibroblasts penetren a l'os fracturat i comencen a créixer al teixit vascular.Durant la fase de reparació, el creixement intern del teixit vascular s'estén prop del lloc de la fractura.El teixit vascular proporciona nutrients per a la formació d'os nou, que s'anomena call.L'etapa final del procés de cicatrització òssia és l'etapa de remodelació, en la qual la mida del callo es redueix a la mida de l'os normal amb l'ajuda d'un augment del nivell d'osteoclasts activats (59).La reconstrucció tridimensional (3D) del lloc de la fractura es va realitzar mitjançant exploracions de micro-TC per observar les diferències en el nivell de formació de calls en cada grup.Observeu la secció transversal del fèmur per observar el gruix del call que envolta l'os fracturat (Figura 6, B i C).Els raigs X també es van utilitzar per examinar els llocs de fractura de tots els grups cada setmana per observar els diferents processos de regeneració òssia de cada grup (figura S9).El call i els ossos madurs es mostren en blau/verd i ivori, respectivament.La majoria dels teixits tous es filtren amb un llindar preestablert.Nude positiu i SHP van confirmar la formació d'una petita quantitat de callositat al voltant del lloc de la fractura.D'altra banda, el negatiu exposat de LOIS i el lloc de la fractura estan envoltats d'un call gruixut.Les imatges de micro-TC van mostrar que la formació de calls es veia obstaculitzada per la infecció bacteriana i la inflamació relacionada amb la infecció.Això es deu al fet que el sistema immunitari prioritza la curació de les lesions sèptiques causades per la inflamació relacionada amb la infecció, en lloc de la recuperació òssia (60).Es va realitzar una tinció de fosfatasa àcida resistent a IHC i tartrat (TRAP) per observar l'activitat dels osteoclasts i la reabsorció òssia (figura 6D) (61).Només es van trobar alguns osteoclasts activats tenyits de violeta en positius nus i SHP.D'altra banda, es van observar molts osteoclasts activats a prop dels ossos positius i madurs nus de LOIS.Aquest fenomen indica que, en presència d'osteoclasts, el call al voltant del lloc de la fractura està experimentant un procés de remodelació violent (62).Es va mesurar el volum ossi i l'àrea d'expressió dels osteoclasts del call per comparar el nivell de formació de callos al voltant del lloc de la fractura en tots els grups, per quantificar els resultats de la micro-TC i l'IHC (Figura 6E, 1 i 2).Com era d'esperar, els negatius nus i la formació de calls a LOIS van ser significativament més alts que en els altres grups, cosa que indica que es va produir una remodelació òssia positiva (63).La figura S10 mostra la imatge òptica del lloc quirúrgic, el resultat de la tinció de MT del teixit recollit a prop del cargol i el resultat de la tinció de TRAP que destaca la interfície cargol-os.Al substrat nu, es va observar una forta formació de calls i fibrosi, mentre que l'implant tractat amb LOIS mostrava una superfície relativament no adherida.De la mateixa manera, en comparació amb els negatius nus, es va observar una fibrosi més baixa en conills implantats amb LOIS, tal com indiquen les fletxes blanques.A més, l'edema ferm (fletxa blava) es pot atribuir a les propietats d'evasió immune de LOIS, reduint així la inflamació severa.La superfície antiadherent al voltant de l'implant i la reducció de la fibrosi suggereixen que el procés d'extirpació és més fàcil, la qual cosa sol donar lloc a altres fractures o inflamacions.El procés de curació òssia després de l'eliminació del cargol es va avaluar mitjançant l'activitat dels osteoclasts a la interfície cargol-os.Tant l'os nu com la interfície de l'implant LOIS van absorbir nivells similars d'osteoclasts per a una millor curació òssia, cosa que indica que el recobriment LOIS no té cap efecte negatiu en la curació òssia o la resposta immune.Per confirmar que la modificació de la superfície realitzada al LOIS no interfereix amb el procés de curació òssia, es va utilitzar un examen de raigs X per comparar la curació òssia dels conills amb ions negatius exposats i 6 setmanes d'implantació de LOIS (Figura 6F).Els resultats van mostrar que, en comparació amb el grup positiu nu no infectat, LOIS va mostrar el mateix grau de cicatrització òssia i no hi havia signes evidents de fractura (línia d'osteòlisi contínua) en ambdós grups.
(A) Diagrama esquemàtic del procés de cicatrització òssia després de la fractura.(B) La diferència en el grau de formació de calls de cada grup de superfície i (C) la imatge de la secció transversal del lloc de la fractura.(D) Tinció de TRAP per visualitzar l'activitat dels osteoclasts i la reabsorció òssia.A partir de l'activitat TRAP, es va analitzar quantitativament la formació de callos externs de l'os cortical mitjançant (E) (1) micro-TC i (2) activitat dels osteoclasts.(F) 6 setmanes després de la implantació, imatges de raigs X de l'os fracturat del negatiu exposat (ressaltat pel rectangle de guions vermells) i LOIS (ressaltat pel rectangle de guions blaus).L'anàlisi estadística es va realitzar mitjançant anàlisi de variància unidireccional (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
En resum, LOIS proporciona un nou tipus d'estratègia d'infecció antibacteriana i un recobriment d'escapament immunitari per als implants ortopèdics.Els implants ortopèdics convencionals amb funcionalització SHP presenten propietats anti-biofouling a curt termini, però no poden mantenir les seves propietats durant molt de temps.La superhidrofobicitat del substrat atrapa les bombolles d'aire entre els bacteris i el substrat, formant així bosses d'aire, evitant així la infecció bacteriana.Tanmateix, a causa de la difusió de l'aire, aquestes butxaques d'aire s'eliminen fàcilment.D'altra banda, LOIS ha demostrat la seva capacitat per prevenir infeccions relacionades amb el biofilm.Per tant, a causa de les propietats anti-rebuig de la capa de lubricant injectada a la superfície de l'estructura micro/nano en capes, es pot prevenir la inflamació relacionada amb la infecció.S'utilitzen diversos mètodes de caracterització, com ara mesures SEM, AFM, XPS i CA per optimitzar les condicions de fabricació de LOIS.A més, LOIS també es pot aplicar a diversos materials biològics utilitzats habitualment en equips de fixació ortopèdica, com ara PLGA, Ti, PE, POM i PPSU.Després, LOIS es va provar in vitro per demostrar les seves propietats anti-biofouling contra bacteris i substàncies biològiques relacionades amb la resposta immune.Els resultats mostren que té excel·lents efectes antibacterians i anti-biofouling en comparació amb l'implant nu.A més, LOIS mostra resistència mecànica fins i tot després d'aplicar esforços mecànics, que és inevitable en cirurgia plàstica.A causa de les propietats d'autocuració del lubricant a la superfície de l'estructura micro/nano, LOIS va mantenir amb èxit les seves propietats anti-incrustacions biològiques.Per tal d'estudiar la biocompatibilitat i les propietats antibacterianes de LOIS in vivo, LOIS es va implantar al fèmur de conill durant 4 setmanes.No es va observar cap infecció bacteriana en conills implantats amb LOIS.A més, l'ús d'IHC va demostrar un nivell reduït de resposta immune local, cosa que indica que LOIS no inhibeix el procés de curació òssia.LOIS presenta excel·lents propietats antibacterianes i d'evasió immune, i s'ha demostrat que prevé eficaçment la formació de biofilm abans i durant la cirurgia ortopèdica, especialment per a la síntesi òssia.Mitjançant l'ús d'un model de fractura femoral inflamatòria de medul·la òssia de conill, es va estudiar profundament l'efecte de les infeccions relacionades amb el biofilm sobre el procés de curació òssia induïda per implants pre-incubats.Com a estudi futur, es necessita un nou model in vivo per estudiar possibles infeccions després de la implantació per comprendre i prevenir completament les infeccions relacionades amb el biofilm durant tot el procés de curació.A més, l'osteoinducció és encara un repte no resolt en la integració amb LOIS.Es necessiten més investigacions per combinar l'adhesió selectiva de cèl·lules osteoinductores o la medicina regenerativa amb LOIS per superar el repte.En general, LOIS representa un recobriment d'implants ortopèdics prometedor amb robustesa mecànica i excel·lents propietats anti-biofouling, que poden reduir els efectes secundaris de la SSI i del sistema immunitari.
Rentar el substrat 304 SS de 15 mm x 15 mm x 1 mm (Dong Kang M-Tech Co., Corea) amb acetona, EtOH i aigua DI durant 15 minuts per eliminar els contaminants.Per tal de formar una estructura de micro/nano-nivell a la superfície, el substrat netejat es submergeix en una solució d'HF del 48% al 51% (DUKSAN Corp., Corea del Sud) a 50 °C.El temps de gravat varia de 0 a 60 minuts.A continuació, es va netejar el substrat gravat amb aigua desionitzada i es va col·locar en una solució al 65% de HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) a 50 ° C durant 30 minuts per formar una capa de passivació d'òxid de crom a la superfície.Després de la passivació, el substrat es renta amb aigua desionitzada i s'asseca per obtenir un substrat amb una estructura en capes.A continuació, el substrat es va exposar a plasma d'oxigen (100 W, 3 minuts) i immediatament es va submergir en una solució de 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Alemanya) en toluè a temperatura ambient durant 12 hores.A continuació, el substrat recobert amb POTS es va netejar amb EtOH i es va recuit a 150 ° C durant 2 hores per obtenir un POTS SAM dens.Després del recobriment SAM, es va formar una capa de lubricant sobre el substrat aplicant un lubricant perfluoropolièter (Krytox 101; DuPont, EUA) amb un volum de càrrega de 20 μm/cm 2. Abans d'utilitzar, filtrar el lubricant a través d'un filtre de 0,2 micres.Traieu l'excés de lubricant inclinant-lo en un angle de 45° durant 15 minuts.El mateix procediment de fabricació es va utilitzar per als implants ortopèdics de 304 SS (placa de bloqueig i cargol de bloqueig cortical; Dong Kang M-Tech Co., Corea).Tots els implants ortopèdics estan dissenyats per adaptar-se a la geometria del fèmur del conill.
La morfologia superficial del substrat i els implants ortopèdics es va inspeccionar mitjançant SEM d'emissió de camp (Inspect F50, FEI, EUA) i AFM (XE-100, Park Systems, Corea del Sud).La rugositat superficial (Ra, Rq) es mesura multiplicant l'àrea de 20 μm per 20 μm (n=4).Es va utilitzar un sistema XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japó) equipat amb una font de raigs X Al Kα amb una mida de punt de 100 μm2 per analitzar la composició química de la superfície.Es va utilitzar un sistema de mesura de CA equipat amb una càmera de captura d'imatge dinàmica (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​​​Corea del Sud) per mesurar CA i SA líquids.Per a cada mesura, es col·loquen a la superfície de 6 a 10 μl de gotes (aigua desionitzada, sang de cavall, EG, etanol al 30% i HD) per mesurar CA.Quan l'angle d'inclinació del substrat augmenta a una velocitat de 2°/s (n = 4), el SA es mesura quan la gota cau.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] i MRSA (ATCC 25923) es van comprar a ATCC (Manassas, Virgínia, EUA) i el cultiu d'existències es va mantenir a -80 °C.Abans del seu ús, el cultiu congelat es va incubar en brou de soja descongelat amb tripsina (Komed, Corea) a 37 ° C durant 18 hores i després es va transferir dues vegades per activar-lo.Després de la incubació, el cultiu es va centrifugar a 10.000 rpm durant 10 minuts a 4 ° C i es va rentar dues vegades amb una solució de PBS (pH 7,3).A continuació, el cultiu centrifugat es subcultiva en plaques d'agar sang (BAP).MRSA i Pseudomonas aeruginosa es van preparar durant la nit i es van cultivar en brou Luria-Bertani.La concentració de Pseudomonas aeruginosa i MRSA a l'inòcul es va determinar quantitativament mitjançant la CFU de la suspensió en dilucions en sèrie sobre agar.A continuació, ajusteu la concentració bacteriana a 0,5 McFarland estàndard, que equival a 108 CFU/ml.A continuació, diluïu la suspensió bacteriana de treball 100 vegades a 106 CFU/ml.Per provar les propietats d'adhesió antibacteriana, el substrat es va esterilitzar a 121 °C durant 15 minuts abans de l'ús.A continuació, es va transferir el substrat a 25 ml de suspensió bacteriana i es va incubar a 37 ° C amb agitació vigorosa (200 rpm) durant 12 i 72 hores.Després de la incubació, es va treure cada substrat de la incubadora i es va rentar 3 vegades amb PBS per eliminar qualsevol bacteri flotant a la superfície.Per observar el biofilm al substrat, el biofilm es va fixar amb metanol i es va tacar amb 1 ml de taronja de crimidina durant 2 minuts.A continuació, es va utilitzar un microscopi de fluorescència (BX51TR, Olympus, Japó) per fer fotografies del biofilm tacat.Per quantificar el biofilm al substrat, les cèl·lules adherides es van separar del substrat mitjançant el mètode de vòrtex de perles, que es va considerar el mètode més adequat per eliminar els bacteris units (n = 4).Utilitzant pinces estèrils, traieu el substrat del medi de creixement i toqueu la placa del pou per eliminar l'excés de líquid.Les cèl·lules poc adherides es van eliminar rentant dues vegades amb PBS estèril.A continuació, cada substrat es va transferir a un tub d'assaig estèril que contenia 9 ml de proteïna salina ept (PSW) al 0,1% i 2 g de 20 a 25 perles de vidre estèrils (de 0,4 a 0,5 mm de diàmetre).Després es va vortexar durant 3 minuts per separar les cèl·lules de la mostra.Després del vortex, la suspensió es va diluir en sèrie 10 vegades amb PSW al 0, 1% i després es va inocular 0, 1 ml de cada dilució a BAP.Després de 24 hores d'incubació a 37 ° C, el CFU es va comptar manualment.
Per a les cèl·lules, es van utilitzar fibroblasts de ratolí NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) i macròfags de ratolí RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC).Utilitzeu el medi Eagle modificat de Dulbecco (DMEM; LM001-05, Welgene, Corea) per cultivar fibroblasts de ratolí i complementeu amb sèrum de vedella al 10% (S103-01, Welgene) i penicil·lina-estreptomicina a l'1% (PS; LS202-02, Welgene (Welgene). Utilitzeu DMEM per cultivar macròfags de ratolí, complementat amb sèrum boví fetal al 10% (S001-01, Welgene) i 1% PS Col·loqueu el substrat en una placa de cultiu cel·lular de sis pous i inoculeu les cèl·lules a 105 cèl·lules/cm2. Les cèl·lules es van incubar durant la nit a 37 ° C i 5% de CO2 a 37 °C durant 30 minuts, després del procés d'incubació, utilitzeu el substrat amb 4′,6-diamino-2-fenilindol (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD (n = 4 per cèl·lula). , fluoresceïna, isotiocianat-albúmina de fluoresceïna (A9771, Sigma-Aldrich, Alemanya) i plasma humà El fibrinogen conjugat amb Alexa Fluor 488 (F13191, Invitrogen, EUA) es va dissoldre en PBS (10 mM, pH 7,4).Les concentracions d'albúmina i fibrinogen eren d'1 i 150 μg/ml, respectivament.Després del substrat Abans d'immergir-los a la solució de proteïnes, esbandiu-los amb PBS per rehidratar la superfície.A continuació, submergiu tots els substrats en una placa de sis pous que conté la solució de proteïnes i s'incuba a 37 °C durant 30 i 90 minuts.Després de la incubació, es va treure el substrat de la solució de proteïnes, es va rentar suaument amb PBS 3 vegades i es va fixar amb un 4% de paraformaldehid (n = 4 per a cada proteïna).Per al calci, el clorur de sodi (0,21 M) i el fosfat de potassi (3,77 mM) es van dissoldre en aigua desionitzada.El pH de la solució es va ajustar a 2,0 afegint una solució de clorhidrat (1 M).A continuació, es va dissoldre clorur de calci (5,62 mM) a la solució.Afegint 1 M de tris(hidroximetil)-amino metà, ajusta el pH de la solució a 7,4.Submergiu tots els substrats en una placa de sis pous plena amb una solució de fosfat de calci 1,5 × i retireu-la de la solució després de 30 minuts.Per a la tinció, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Barrejar amb 100 ml d'aigua desionitzada.A continuació, utilitzeu hidròxid d'amoni al 10% per ajustar el pH a 4. Tingueu el substrat amb una solució vermella d'alizarina durant 5 minuts, i després sacsegeu l'excés de colorant i taqueu.Després del procés d'agitació, traieu el substrat.El material es deshidrata, després es submergeix en acetona durant 5 minuts, després es submergeix en una solució d'acetona-xilè (1:1) durant 5 minuts i finalment es renta amb xilè (n = 4).S'utilitza un microscopi de fluorescència (Axio Imager) amb lents objectius ×10 i ×20..A2m, Zeiss, Alemanya) imatges de tots els substrats.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) es va utilitzar per quantificar les dades d'adhesió de substàncies biològiques a cada grup de quatre àrees d'imatge diferents.Converteix totes les imatges en imatges binàries amb llindars fixos per a la comparació de substrats.
Es va utilitzar un microscopi confocal Zeiss LSM 700 per controlar l'estabilitat de la capa de lubricant al PBS en mode de reflexió.La mostra de vidre recoberta de SAM a base de fluor amb una capa lubricant injectada es va submergir en una solució de PBS i es va provar amb un agitador orbital (SHO-1D; Daihan Scientific, Corea del Sud) en condicions suaus de sacsejada (120 rpm).A continuació, agafeu la mostra i controleu la pèrdua de lubricant mesurant la pèrdua de llum reflectida.Per adquirir imatges de fluorescència en mode de reflexió, la mostra s'exposa a un làser de 633 nm i després es recull, perquè la llum es reflectirà des de la mostra.Les mostres es van mesurar a intervals de temps de 0, 30, 60 i 120 hores.
Per tal de determinar la influència del procés de modificació de la superfície sobre les propietats nanomecàniques dels implants ortopèdics, es va utilitzar un nanoindentador (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, EUA) equipat amb una punta de diamant Berkovich en forma de piràmide de tres cares per mesurar la nanoindenedione.La càrrega màxima és de 10 mN i l'àrea és de 100 μmx 100 μm.Per a totes les mesures, el temps de càrrega i descàrrega és de 10 s i el temps de retenció sota la càrrega màxima de sagnat és de 2 s.Preneu mesures de cinc llocs diferents i feu la mitjana.Per avaluar el rendiment de la resistència mecànica sota càrrega, es va realitzar una prova de flexió transversal de tres punts mitjançant una màquina de prova universal (Instron 5966, Instron, EUA).El substrat es comprimeix a una velocitat constant de 10 N/s amb una càrrega augmentada.Es va utilitzar el programa de programari Bluehill Universal (n = 3) per calcular el mòdul de flexió i l'esforç màxim de compressió.
Per tal de simular el procés d'operació i el dany mecànic relacionat causat durant l'operació, el procés d'operació es va realitzar in vitro.Els fèmurs es van recollir dels conills blancs de Nova Zelanda executats.El fèmur es va netejar i es va fixar en paraformaldehid al 4% durant 1 setmana.Tal com es descriu en el mètode d'experimentació amb animals, el fèmur fix es va operar quirúrgicament.Després de l'operació, l'implant ortopèdic es va submergir en sang (sang de cavall, KISAN, Corea) durant 10 s per confirmar si es van produir adherències de sang després de l'aplicació de la lesió mecànica (n = 3).
Un total de 24 conills blancs mascles de Nova Zelanda (pes de 3,0 a 3,5 kg, edat mitjana de 6 mesos) es van dividir aleatòriament en quatre grups: nu negatiu, nu positiu, SHP i LOIS.Tots els procediments amb animals es van realitzar d'acord amb els estàndards ètics del Comitè Institucional de Cura i Ús d'Animals (IACUC aprovat, KOREA-2017-0159).L'implant ortopèdic consta d'una placa de bloqueig amb cinc forats (longitud 41 mm, amplada 7 mm i gruix 2 mm) i cargols de bloqueig corticals (longitud 12 mm, diàmetre 2,7 mm) per a la fixació de fractures.Excepte les plaques i els cargols utilitzats en el grup nu-negatiu, totes les plaques i els cargols es van incubar en suspensió de MRSA (106 CFU/ml) durant 12 hores.El grup nu-negatiu (n = 6) es va tractar amb implants de superfície nua sense exposició a la suspensió bacteriana, com a control negatiu de la infecció.El grup positiu nu (n = 6) es va tractar amb un implant de superfície nua exposat a bacteris com a control positiu de la infecció.El grup SHP (n = 6) es va tractar amb implants SHP exposats a bacteris.Finalment, el grup LOIS es va tractar amb implants LOIS exposats a bacteris (n = 6).Tots els animals es mantenen dins d'una gàbia, i se'n proporciona molt menjar i aigua.Abans de l'operació, els conills estaven en dejuni durant 12 hores.Els animals van ser anestesiats mitjançant injecció intramuscular de xilazina (5mg/kg) i injecció intravenosa de paclitaxel (3mg/kg) per a la inducció.Després d'això, introduïu un 2% d'isoflurà i un 50% a un 70% d'oxigen mèdic (caudal de 2 L/min) a través del sistema respiratori per mantenir l'anestèsia.S'implanta mitjançant una aproximació directa al fèmur lateral.Després de la depilació i desinfecció de la pell amb povidona iodada, es va fer una incisió d'uns 6 cm de llarg a l'exterior del fèmur mitjà esquerre.En obrir l'espai entre els músculs que cobreixen el fèmur, el fèmur queda totalment exposat.Col·loqueu la placa davant de l'eix femoral i fixeu-la amb quatre cargols.Després de la fixació, utilitzeu una fulla de serra (1 mm de gruix) per crear artificialment una fractura a la zona entre el segon forat i el quart forat.Al final de l'operació, la ferida es rentava amb solució salina i es tancava amb sutures.A cada conill se li va injectar per via subcutània enrofloxacina (5 mg/kg) diluïda en un terç en solució salina.Es van fer radiografies postoperatòries del fèmur a tots els animals (0, 7, 14, 21, 28 i 42 dies) per confirmar l'osteotomia de l'os.Després d'una anestèsia profunda, tots els animals van ser assassinats per KCl intravenós (2 mmol/kg) els 28 i 42 dies.Després de l'execució, es va escanejar el fèmur mitjançant micro-TC per observar i comparar el procés de curació òssia i la formació d'os nous entre els quatre grups.
Després de l'execució, es van recollir els teixits tous que estaven en contacte directe amb els implants ortopèdics.El teixit es va fixar en formalina tamponada al 10% durant la nit i després es va deshidratar en EtOH.El teixit deshidratat es va incrustar en parafina i es va seccionar amb un gruix de 40 μm mitjançant un micròtom (400CS; EXAKT, Alemanya).Per tal de visualitzar la infecció, es va realitzar una tinció H&E i una tinció MT.Per comprovar la resposta de l'hoste, el teixit seccionat es va incubar amb anticossos primaris anti-TNF-α de conill (AB6671, Abcam, EUA) i anti-IL-6 de conill (AB6672; Abcam, EUA), i després es va tractar amb rave picant.Oxidasa.Apliqueu el sistema de tinció del complex d'avidina-biotina (ABC) a les seccions segons les instruccions del fabricant.Per aparèixer com un producte de reacció marró, es va utilitzar 3,3-diaminobenzidina en totes les parts.Es va utilitzar un escàner de diapositives digital (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hongria) per visualitzar totes les rodanxes i es van analitzar almenys quatre substrats de cada grup mitjançant el programari ImageJ.
Es van prendre imatges de raigs X a tots els animals després de la cirurgia i cada setmana per controlar la curació de fractures (n = 6 per grup).Després de l'execució, es va utilitzar micro-TC d'alta resolució per calcular la formació de callositat al voltant del fèmur després de la curació.El fèmur obtingut es va netejar, es va fixar en paraformaldehid al 4% durant 3 dies i es va deshidratar en etanol al 75%.A continuació, es van escanejar els ossos deshidratats mitjançant micro-TC (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Bèlgica) per generar imatges de voxel 3D (2240 ​​× 2240 píxels) de la mostra òssia.Utilitzeu un filtre Al d'1,0 mm per reduir el soroll del senyal i aplicar una alta resolució a totes les exploracions (E = 133 kVp, I = 60 μA, temps d'integració = 500 ms).Es va utilitzar el programari Nrecon (versió 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Bèlgica) per generar un volum 3D de la mostra escanejada a partir de la projecció lateral 2D adquirida.Per a l'anàlisi, la imatge reconstruïda en 3D es divideix en cubs de 10 mm × 10 mm × 10 mm segons el lloc de la fractura.Calcula el call fora de l'os cortical.Es va utilitzar el programari DataViewer (versió 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Bèlgica) per redirigir digitalment el volum ossi escanejat i per a l'anàlisi es va utilitzar el programari CT-Analyzer (versió 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Bèlgica).Els coeficients relatius d'absorció de raigs X en l'os madur i el callo es distingeixen per la seva densitat, i després es quantifica el volum del call (n = 4).Per confirmar que la biocompatibilitat de LOIS no retarda el procés de curació òssia, es van realitzar anàlisis addicionals de raigs X i micro-TC en dos conills: el grup nu-negatiu i LOIS.Tots dos grups van ser executats a la 6a setmana.
Els fèmurs dels animals sacrificats es van recollir i es van fixar en paraformaldehid al 4% durant 3 dies.Aleshores, l'implant ortopèdic es retira amb cura del fèmur.El fèmur es va descalcificar durant 21 dies mitjançant EDTA 0,5 M (EC-900, National Diagnostics Corporation).A continuació, el fèmur descalcificat es va submergir en EtOH per deshidratar-lo.El fèmur deshidratat es va treure en xile i es va incrustar en parafina.A continuació, es va tallar la mostra amb un micròtom rotatiu automàtic (Leica RM2255, Leica Biosystems, Alemanya) amb un gruix de 3 μm.Per a la tinció de TRAP (F6760, Sigma-Aldrich, Alemanya), les mostres seccionades es van desparafinar, es van rehidratar i es van incubar en reactiu TRAP a 37 ° C durant 1 hora.Les imatges es van adquirir mitjançant un escàner de diapositives (Pannoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Hongria) i es van quantificar mesurant la cobertura de l'àrea de la zona tacada.En cada experiment, es van analitzar almenys quatre substrats de cada grup mitjançant el programari ImageJ.
L'anàlisi de significació estadística es va realitzar mitjançant GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., EUA).Es van utilitzar la prova t no aparellada i l'anàlisi de variància unidireccional (ANOVA) per provar les diferències entre els grups d'avaluació.El nivell de significació s'indica a la figura de la següent manera: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 i ****P<0,0001;NS, cap diferència significativa.
Per obtenir materials addicionals per a aquest article, consulteu http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Es tracta d'un article d'accés obert distribuït sota els termes de la Llicència Reconeixement-No Comercial de Creative Commons, que permet l'ús, la distribució i la reproducció en qualsevol mitjà, sempre que l'ús no sigui amb finalitats comercials i la premissa sigui que l'original el treball és correcte.Referència.
Nota: només us demanem que proporcioneu una adreça de correu electrònic perquè la persona que recomaneu a la pàgina sàpiga que voleu que vegi el correu electrònic i que el correu electrònic no és correu brossa.No capturarem cap adreça de correu electrònic.
Aquesta pregunta s'utilitza per comprovar si sou un visitant humà i per evitar enviaments automàtics de correu brossa.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Els recobriments antibacterians i d'escapament immunitari dels implants ortopèdics poden reduir les infeccions i les respostes immunitàries causades per infeccions.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Els recobriments antibacterians i d'escapament immunitari dels implants ortopèdics poden reduir les infeccions i les respostes immunitàries causades per infeccions.
©2021 Associació Americana per a l'Avenç de la Ciència.tots els drets reservats.AAAS és soci de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef i COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.