Fyrir sjúklinga sem gangast undir bæklunarígræðsluaðgerð hafa bakteríusýkingar og ónæmissvörun af völdum sýkinga alltaf verið lífshættuleg áhætta.Hefðbundin líffræðileg efni eru næm fyrir líffræðilegri mengun sem veldur því að bakteríur ráðast inn á slasaða svæðið og valda sýkingu eftir aðgerð.Þess vegna er brýn þörf á að þróa sýkingar- og ónæmisflóttahúð fyrir bæklunarígræðslu.Hér höfum við þróað háþróaða yfirborðsbreytingartækni fyrir bæklunarígræðslur sem kallast Smurð bæklunarígræðsluyfirborð (LOIS), sem er innblásin af sléttu yfirborði könnuplöntukanna.LOIS hefur langvarandi og sterka vökvafráhrindingu gegn ýmsum vökva og líffræðilegum efnum (þar á meðal frumum, próteinum, kalki og bakteríum).Að auki staðfestum við vélræna endingu gegn rispum og festingarkrafti með því að líkja eftir óumflýjanlegum skaða við in vitro skurðaðgerðina.Líkanið með bólgu í lærleggsbrotum í kanínubeinmerg var notað til að rannsaka rækilega and-líffræðilega mælikvarða og sýkingargetu LOIS.Við sjáum fyrir okkur að LOIS, sem hefur gróðureyðandi eiginleika og vélrænni endingu, sé skref fram á við í sýkingarlausum bæklunaraðgerðum.
Í dag, vegna almennrar öldrunar, hefur fjöldi sjúklinga sem þjást af bæklunarsjúkdómum (svo sem öldruðum beinbrotum, hrörnunarsjúkdómum í liðum og beinþynningu) aukist mikið (1, 2).Þess vegna leggja sjúkrastofnanir mikla áherslu á bæklunarskurðlækningar, þar með talið bæklunarígræðslu á skrúfum, plötum, nöglum og gerviliðum (3, 4).Hins vegar hefur verið greint frá því að hefðbundin bæklunarígræðsla séu næm fyrir bakteríuviðloðun og líffilmumyndun, sem getur valdið sýkingu á skurðsvæði (SSI) eftir aðgerð (5, 6).Þegar líffilman hefur myndast á yfirborði bæklunarígræðslunnar verður mjög erfitt að fjarlægja líffilmuna, jafnvel þó að stórir skammtar af sýklalyfjum séu notaðir.Því leiðir það venjulega til alvarlegra sýkinga eftir aðgerð (7, 8).Vegna ofangreindra vandamála ætti meðferð sýktra vefja að fela í sér enduraðgerð, þar með talið brottnám allra vefja og nærliggjandi vefja;því mun sjúklingurinn þjást af miklum sársauka og einhverri áhættu (9, 10).
Til að leysa sum þessara vandamála hafa verið þróuð ígræðslur sem losa um lyf til að koma í veg fyrir sýkingu með því að útrýma bakteríum sem festast við yfirborðið (11, 12).Hins vegar sýnir stefnan enn nokkrar takmarkanir.Greint hefur verið frá því að langtímaígræðsla ígræðslna sem losa lyfja hafi valdið skemmdum á nærliggjandi vefjum og valdið bólgu sem getur leitt til dreps (13, 14).Að auki þurfa lífrænu leysiefnin sem kunna að vera til eftir framleiðsluferli lyfjaskljúfandi bæklunarígræðslna, sem eru stranglega bönnuð af matvæla- og lyfjaeftirliti Bandaríkjanna, frekari hreinsunarskref til að uppfylla staðla þeirra (15).Lyfjalosandi ígræðslur eru krefjandi fyrir stýrða losun lyfja og vegna takmarkaðrar lyfjahleðslu þeirra er langtímanotkun lyfsins ekki framkvæmanleg (16).
Önnur algeng aðferð er að húða vefjalyfið með gróðureyðandi fjölliðu til að koma í veg fyrir að líffræðileg efni og bakteríur festist við yfirborðið (17).Til dæmis hafa zwitterjónískar fjölliður vakið athygli vegna ólímandi eiginleika þeirra þegar þær eru komnar í snertingu við plasmaprótein, frumur og bakteríur.Hins vegar hefur það nokkrar takmarkanir sem tengjast langtímastöðugleika og vélrænni endingu, sem hindra hagnýtingu þess í bæklunarígræðslum, sérstaklega vegna vélrænnar skraps við skurðaðgerðir (18, 19).Þar að auki, vegna mikillar lífsamrýmanleika, skorts á þörf fyrir fjarlægingaraðgerðir og yfirborðshreinsandi eiginleika með tæringu, hafa bæklunarígræðslur úr lífbrjótanlegum efnum verið notaðar (20, 21).Við tæringu brotna efnatengi milli fjölliða fylkisins niður og losna frá yfirborðinu og viðloðin hreinsa yfirborðið.Hins vegar er líffræðileg óhreinindi með yfirborðshreinsun áhrifarík á stuttum tíma.Að auki munu flest gleypanleg efni, þar á meðal pólý(mjólkursýru-glýkólsýru samfjölliða) (PLGA), pólýmjólkursýra (PLA) og magnesíum-undirstaða málmblöndur verða fyrir ójafnri niðurbroti og veðrun í líkamanum, sem mun hafa neikvæð áhrif á vélrænan stöðugleika.(tuttugu og tveir).Að auki veita lífbrjótanlegu plötubrotin stað fyrir bakteríur til að festast, sem eykur líkurnar á sýkingu til lengri tíma litið.Þessi hætta á vélrænni niðurbroti og sýkingu takmarkar hagnýta beitingu lýtaaðgerða (23).
Ofurvatnsfælnir (SHP) yfirborð sem líkja eftir stigveldisbyggingu lótuslaufa hafa orðið hugsanleg lausn fyrir gróðureyðandi yfirborð (24, 25).Þegar SHP yfirborðið er sökkt í vökva, verða loftbólur föst og mynda þar með loftpoka og koma í veg fyrir viðloðun baktería (26).Hins vegar hafa nýlegar rannsóknir sýnt að SHP yfirborðið hefur ókosti sem tengjast vélrænni endingu og langtímastöðugleika, sem hindrar notkun þess í læknisfræðilegum ígræðslum.Þar að auki munu loftvasarnir leysast upp og missa gróðureyðandi eiginleika sína, sem leiðir til breiðari viðloðun baktería vegna stórs yfirborðs SHP yfirborðsins (27, 28).Nýlega kynntu Aizenberg og félagar nýstárlega aðferð við yfirborðshúðun gegn líffrjóvgun með því að þróa slétt yfirborð innblásið af Nepenthes könnuverksmiðjunni (29, 30).Slétt yfirborð sýnir langtímastöðugleika við vökvaaðstæður, er afar vökvafráhrindandi fyrir líffræðilega vökva og hefur sjálfviðgerðareiginleika.Hins vegar er hvorki aðferð til að bera húðun á flókin lækningaígræðsla, né er sannað að hún styður lækningu á skemmdum vef eftir ígræðslu.
Hér kynnum við smurt bæklunarígræðsluyfirborð (LOIS), ör/nano-skipulagt bæklunarígræðsluflöt og þétt blandað með þunnu smurlagi til að koma í veg fyrir að það tengist lýtaaðgerðum Bakteríusýkingum, svo sem beinbrotafestingu.Vegna þess að flúorvirkjað ör/nano-stig uppbyggingin festir smurefnið þétt á bygginguna, getur þróað LOIS hrint að fullu viðloðun ýmissa vökva og viðhaldið gróðurvarnarvirkni í langan tíma.Hægt er að bera LOIS húðun á efni af ýmsum gerðum sem ætluð eru til beinmyndunar.Framúrskarandi gróðureyðandi eiginleikar LOIS gegn líffilmubakteríum [Pseudomonas aeruginosa og meticillin ónæmum Staphylococcus aureus (MRSA)] og líffræðilegum efnum (frumur, prótein og kalsíum) hafa verið staðfestir in vitro.Viðloðun mikils viðloðun við undirlagið er minna en 1%.Að auki, jafnvel eftir að vélrænni streitu eins og yfirborðs rispur á sér stað, hjálpar sjálfgræðingin af völdum smurolíu sem kemst í gegnum að viðhalda gróðureyðandi eiginleikum þess.Niðurstöður vélrænni endingarprófunar sýna að jafnvel eftir byggingar- og efnabreytingar mun heildarstyrkurinn ekki minnka verulega.Að auki var gerð in vitro tilraun sem líkir eftir vélrænni streitu í skurðstofuumhverfinu til að sanna að LOIS þolir ýmsa vélræna álag sem verður við lýtaaðgerðir.Að lokum notuðum við kanínu-undirstaða in vivo lærleggsbrotslíkan, sem sannaði að LOIS hefur yfirburða bakteríudrepandi eiginleika og lífsamrýmanleika.Geisla- og vefjafræðilegar niðurstöður staðfestu að stöðug hegðun smurefnis og gróðureyðandi eiginleikar innan 4 vikna eftir ígræðslu geta náð árangri gegn sýkingum og ónæmisflótta árangri án þess að tefja fyrir beinheilun.
Mynd 1A sýnir skýringarmynd af þróuðum LOIS, sem er ígræddur með ör-/nano-kvarða uppbyggingu í lærleggsbrotalíkani kanínu til að staðfesta framúrskarandi and-líffræðilega gróður- og sýkingareiginleika þess.Lífeftirlíkingaraðferð er framkvæmd til að líkja eftir yfirborði vatnspottplöntu og til að koma í veg fyrir líffótrun með því að setja smurefnislag í ör/nano uppbyggingu yfirborðsins.Yfirborðið sem sprautað er með smurefni getur lágmarkað snertingu líffræðilegra efna og yfirborðsins.Þess vegna, vegna myndunar stöðugra efnatengja á yfirborðinu, hefur það framúrskarandi gróðurvarnarvirkni og langtímastöðugleika.Fyrir vikið leyfa andstæðingur-lífgræðslueiginleikar smuryfirborðsins ýmsa hagnýta notkun í líflæknisfræðilegum rannsóknum.Umfangsmiklum rannsóknum á því hvernig þetta sérstaka yfirborð hefur áhrif í líkamanum hefur þó ekki enn verið lokið.Með því að bera LOIS saman við nökt hvarfefni in vitro með því að nota albúmín og líffilmubakteríur, er hægt að staðfesta að LOIS ekki límist (Mynd 1B).Að auki, með því að rúlla af vatnsdropunum á hallandi beru undirlagið og LOIS undirlagið (Mynd S1 og Movie S1), er hægt að sýna fram á líffræðilega mengun.Eins og sést á flúrljómunarsmásjá myndinni sýndi óvarið hvarfefni sem var ræktað í sviflausn af próteini og bakteríum mikið magn af líffræðilegu efni sem loðir við yfirborðið.Hins vegar, vegna framúrskarandi gróðureyðandi eiginleika, sýnir LOIS varla flúrljómun.Í því skyni að staðfesta líffrjóvgun og sýkingareiginleika þess var LOIS borið á yfirborð bæklunarígræðslna fyrir beinmyndun (plötur og skrúfur) og sett í kanínubrotslíkan.Fyrir ígræðslu voru nöktu bæklunarígræðslan og LOIS ræktuð í bakteríusviflausn í 12 klukkustundir.Forræktunin tryggir að líffilma myndast á yfirborði óvarða vefjalyfsins til samanburðar.Mynd 1C sýnir mynd af brotstaðnum 4 vikum eftir ígræðslu.Vinstra megin sýndi kanína með ber bæklunarígræðslu alvarlega bólgu vegna myndunar líffilmu á yfirborði vefjalyfsins.Hin gagnstæða niðurstaða kom fram hjá kanínum sem voru ígræddar með LOIS, það er að segja að nærliggjandi vefir LOIS sýndu hvorki merki um sýkingu né merki um bólgu.Að auki sýnir sjónmyndin til vinstri skurðaðgerðarstað kanínunnar með óvarða vefjalyfinu, sem gefur til kynna að ekki hafi fundist mörg lím á yfirborði óvarða vefjalyfsins á yfirborði LOIS.Þetta sýnir að LOIS hefur langtímastöðugleika og hefur getu til að viðhalda líffræðilegum gróður- og viðloðunareiginleikum.
(A) Skýringarmynd af LOIS og ígræðslu þess í lærleggsbrotslíkani frá kanínu.(B) Flúrljómunarsmásjá mynd af próteini og bakteríulíffilmu á beru yfirborði og LOIS hvarfefni.4 vikum eftir ígræðslu, (C) ljósmyndamynd af brotstaðnum og (D) röntgenmynd (auðkennd með rauðum rétthyrningi).Mynd með leyfi: Kyomin Chae, Yonsei University.
Sótthreinsuðu, útsettu, neikvætt ígræddu kanínurnar sýndu eðlilegt beingræðsluferli án nokkurra merki um bólgu eða sýkingu.Á hinn bóginn sýna SHP ígræðslur sem eru forræktaðar í bakteríusviflausn sýkingartengda bólgu í nærliggjandi vefjum.Þetta má rekja til vanhæfni þess til að hindra viðloðun baktería í langan tíma (Mynd S2).Til að sanna að LOIS hafi ekki áhrif á lækningaferlið, heldur hamli hugsanlegum sýkingum tengdum ígræðslu, voru bornar saman röntgenmyndir af útsettu jákvæðu fylkinu og LOIS á brotstaðnum (Mynd 1D).Röntgenmyndin af berum jákvæða vefjalyfinu sýndi þrálátar beingreiningarlínur, sem bentu til þess að beinið væri ekki alveg gróið.Þetta bendir til þess að endurheimtarferli beina geti tafist verulega vegna sýkingatengdrar bólgu.Þvert á móti sýndi það að kanínurnar sem voru ígræddar með LOIS höfðu gróið og sýndu engan augljósan brotstað.
Í því skyni að þróa læknisfræðilega ígræðslu með langtímastöðugleika og virkni (þar á meðal ónæmi fyrir lífrænum ávöxtum) hefur margt verið gert.Hins vegar takmarkar tilvist ýmissa líffræðilegra efna og gangverki viðloðun vefja þróun klínískt áreiðanlegra aðferða þeirra.Til að vinna bug á þessum göllum höfum við þróað ör/nano lagskipt uppbyggingu og efnafræðilega breytt yfirborð, sem er fínstillt vegna mikils háræðakrafts og efnasækni til að halda sléttasta smurefninu í sem mestum mæli.Mynd 2A sýnir heildarframleiðsluferli LOIS.Fyrst skaltu undirbúa læknisfræðilegt ryðfrítt stál (SS) 304 undirlag.Í öðru lagi er míkró/nano uppbygging mynduð á SS undirlaginu með efnafræðilegri ætingu með flúorsýru (HF) lausn.Til að endurheimta tæringarþol SS er saltpéturssýru (HNO3) lausn (31) notuð til að vinna ætið undirlagið.Passivation eykur tæringarþol SS undirlagsins og hægir verulega á tæringarferlinu sem getur dregið úr heildarframmistöðu LOIS.Síðan, með því að mynda sjálfsamsett einlag (SAM) með 1H, 1H, 2H, 2H-perflúoróktýltríetoxýsílani (POTS), er yfirborðið efnafræðilega breytt til að bæta efnafræðilega víxlverkunina milli yfirborðsins og slétts smurefnisins.Yfirborðsbreytingin dregur verulega úr yfirborðsorku framleidda ör/nano-skala uppbyggða yfirborðsins, sem passar við yfirborðsorku slétta smurefnisins.Þetta gerir það kleift að bleyta smurefnið alveg og myndar þannig stöðugt smurlag á yfirborðinu.Breytt yfirborð sýnir aukna vatnsfælni.Niðurstöðurnar sýna að sleip smurefnið sýnir stöðuga hegðun á LOIS vegna mikillar efnasækni og háræðakrafts sem orsakast af míkró/nano uppbyggingu (32, 33).Sjónrænar breytingar á yfirborði SS eftir yfirborðsbreytingar og inndælingu smurefna voru rannsakaðar.Ör/nano lagskipt uppbygging sem myndast á yfirborðinu getur valdið sjónrænum breytingum og dekkað yfirborðið.Þetta fyrirbæri er rakið til aukinna ljósdreifingaráhrifa á gróft yfirborðið, sem eykur dreifða endurspeglun af völdum ljósfangabúnaðarins (34).Að auki, eftir að smurefnið er sprautað, verður LOIS dekkra.Smurlagið veldur því að minna ljós endurkastast frá undirlaginu og þar með dökknar LOIS.Til að hámarka örbygginguna/nanobygginguna til að sýna minnsta rennahornið (SA) til að ná frammistöðu gegn líffóstruflunum, voru skanna rafeindasmásjár (SEM) og atómpör notuð til að framkvæma mismunandi HF ætingartíma (0, 3)., 15 og 60 mínútur) Force Microscope (AFM) (Mynd 2B).SEM og AFM myndir sýna að eftir stuttan tíma á ætingu (3 mínútur af ætingu) hefur bert undirlagið myndað ójafnan nanó-kvarða grófleika.Yfirborðsgrófleiki breytist með ætingartímanum (Mynd S3).Tímabreytiferillinn sýnir að yfirborðsrjúfleiki heldur áfram að aukast og nær hámarki við 15 mínútna ætingu og þá sést aðeins lítilsháttar lækkun á hrjúfleikagildi við 30 mínútna ætingu.Á þessum tímapunkti er grófleiki nanóstigsins etsaður í burtu, en örstigsgrófleiki þróast kröftuglega, sem gerir grófleikabreytinguna stöðugri.Eftir ætingu í meira en 30 mínútur kemur fram frekari aukning á grófleika, sem er útskýrð ítarlega á eftirfarandi hátt: SS er samsett úr stáli, blandað með frumefnum þar á meðal járni, króm, nikkel, mólýbdeni og mörgum öðrum frumefnum.Meðal þessara frumefna gegna járn, króm og mólýbden mikilvægu hlutverki við að mynda míkron/nano-kvarða grófleika á SS með HF ætingu.Á fyrstu stigum tæringar eru járn og króm aðallega tært vegna þess að mólýbden hefur meiri tæringarþol en mólýbden.Þegar líður á ætið nær ætarlausnin staðbundinni ofmettun og myndar flúoríð og oxíð af völdum ætingar.Flúor og oxíð falla út og setjast að lokum aftur á yfirborðið og mynda yfirborðsgrófleika á míkron/nano sviðinu (31).Þessi ör/nano-stig grófleiki gegnir mikilvægu hlutverki í sjálfsgræðandi eiginleikum LOIS.Yfirborðið með tveimur mælikvarða framkallar samlegðaráhrif, sem eykur háræðskraftinn til muna.Þetta fyrirbæri gerir smurefninu kleift að komast stöðugt inn í yfirborðið og stuðlar að sjálfgræðandi eiginleikum (35).Myndun grófleika fer eftir ætingartímanum.Undir 10 mínútna ætingu inniheldur yfirborðið aðeins ójöfnur á nanóskala, sem er ekki nóg til að halda nægilegu smurefni til að hafa mótstöðu gegn líffótrefni (36).Á hinn bóginn, ef ætingartíminn fer yfir 30 mínútur, hverfur nanóhringurinn sem myndast við endurútfellingu járns og króms, og aðeins örþrýstin verður eftir vegna mólýbdens.Ofæta yfirborðið skortir grófleika á nanóskala og missir samverkandi áhrif tveggja þrepa grófleika, sem hefur neikvæð áhrif á sjálfgræðandi eiginleika LOIS.SA mælingar voru gerðar á undirlagi með mismunandi ætingartíma til að sanna gróðurvörn.Ýmsar tegundir vökva voru valdar út frá seigju og yfirborðsorku, þar á meðal afjónað (DI) vatn, blóð, etýlen glýkól (EG), etanól (EtOH) og hexadecan (HD) (Mynd S4).Tímabreytilegt ætingarmynstrið sýnir að fyrir ýmsa vökva með mismunandi yfirborðsorku og seigju er SA LOIS lægst eftir 15 mínútna ætingu.Þess vegna er LOIS fínstillt til að æta í 15 mínútur til að mynda míkron og nanó-kvarða grófleika, sem er hentugur til að viðhalda endingu smurefnisins og framúrskarandi gróðureyðandi eiginleika.
(A) Skýringarmynd af fjögurra þrepa framleiðsluferli LOIS.Innfellingin sýnir SAM sem myndast á undirlaginu.(B) SEM og AFM myndir, notaðar til að hámarka ör / nanó uppbyggingu undirlagsins við mismunandi ætingartíma.X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) litróf (C) Cr2p og (D) F1s eftir yfirborðsaðgerð og SAM húðun.au, handahófskennd eining.(E) Fulltrúarmyndir af vatnsdropum á beru, etsuðu, SHP og LOIS undirlagi.(F) Snertihornið (CA) og SA mælingar á vökva með mismunandi yfirborðsspennu á SHP og LOIS.Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± SD.
Síðan, til að staðfesta breytingu á efnafræðilegum eiginleikum yfirborðsins, var notuð röntgenljósrófsgreining (XPS) til að rannsaka breytingu á efnasamsetningu yfirborðs undirlagsins eftir hverja yfirborðshúð.Mynd 2C sýnir XPS mælingarniðurstöður HF etsaðs yfirborðs og HNO 3 meðhöndlaðs yfirborðs.Tveir helstu topparnir við 587,3 og 577,7 eV má rekja til Cr-O tengisins sem er til staðar í krómoxíðlaginu, sem er aðalmunurinn frá HF æta yfirborðinu.Þetta er aðallega vegna neyslu járns og krómflúoríðs á yfirborðinu með HNO3.HNO3-undirstaða æting gerir króm kleift að mynda passiverandi oxíðlag á yfirborðinu, sem gerir ætið SS aftur ónæmt fyrir tæringu.Á mynd 2D voru XPS litróf fengin til að staðfesta að flúorkolefni byggt silan myndaðist á yfirborðinu eftir SAM húðunina, sem hefur mjög mikla vökvafráhrindingu jafnvel fyrir EG, blóð og EtOH.SAM húðunin er fullkláruð með því að hvarfa sílan virka hópa við hýdroxýlhópa sem myndast við plasmameðferð.Fyrir vikið sást marktæk aukning á CF2 og CF3 toppum.Bindingorkan á milli 286 og 296 eV gefur til kynna að efnabreytingunni hafi verið lokið með SAM-húðinni.SHP sýnir tiltölulega stóra CF2 (290,1 eV) og CF3 (293,3 eV) toppa, sem orsakast af flúorkolefnisbundnu sílani sem myndast á yfirborðinu.Mynd 2E sýnir dæmigerðar sjónrænar myndir af snertihornsmælingum (CA) fyrir mismunandi hópa afjónaðs vatns í snertingu við ber, etsað, SHP og LOIS.Þessar myndir sýna að æta yfirborðið verður vatnssækið vegna ör/nano uppbyggingu sem myndast við efna ætingu þannig að afjónað vatn frásogast inn í bygginguna.Hins vegar, þegar undirlagið er húðað með SAM, sýnir undirlagið sterka vatnsfráhrindingu, þannig að yfirborð SHP myndast og snertiflöturinn milli vatns og yfirborðs er lítill.Loks kom fram lækkun á CA í LOIS, sem má rekja til þess að smurefni kom inn í örbygginguna og eykur þar með snertiflöturinn.Til að sanna að yfirborðið hafi framúrskarandi vökvafráhrindingu og ólímandi eiginleika, var LOIS borið saman við SHP undirlagið með því að mæla CA og SA með því að nota ýmsa vökva (Mynd 2F).Ýmsar tegundir vökva voru valdar út frá seigju og yfirborðsorku, þar á meðal afjónað vatn, blóð, EG, EtOH og HD (Mynd S4).CA mælingarniðurstöður sýna að þegar CA hefur tilhneigingu til HD er minnkunargildi CA, þar sem CA hefur lægstu yfirborðsorkuna.Að auki er LOIS heildar CA lágt.SA-mælingin sýnir hins vegar allt annað fyrirbæri.Fyrir utan jónaða vatnið festast allir vökvar við SHP undirlagið án þess að renni af.Á hinn bóginn sýnir LOIS mjög lágt SA, þar sem þegar allur vökvinn er hallaður undir 10° til 15° horni mun allur vökvinn rúlla af.Þetta sýnir eindregið að ekki viðloðun LOIS er betri en SHP yfirborðs.Að auki er LOIS húðun einnig borin á ýmsar gerðir af efnum, þar á meðal títan (Ti), pólýfenýlsúlfón (PPSU), pólýoxýmetýlen (POM), pólýeter eter ketón (PEEK) og lífafsoganlegar fjölliður (PLGA), Þetta eru ígræðanleg bæklunarefni (mynd S5)).Raðmyndir af dropunum á efninu sem meðhöndlað er með LOIS sýna að LOIS varnir gegn líffóður eru þeir sömu á öllum undirlagi.Að auki sýna mæliniðurstöður CA og SA að hægt er að nota ólímandi eiginleika LOIS á önnur efni.
Til að staðfesta gróðureyðandi eiginleika LOIS voru ýmsar gerðir hvarfefna (þar á meðal ber, etsað, SHP og LOIS) ræktaðar með Pseudomonas aeruginosa og MRSA.Þessar tvær bakteríur voru valdar sem dæmigerðar sjúkrahúsbakteríur, sem geta leitt til myndunar líffilma, sem leiðir til SSI (37).Mynd 3 (A og B) sýnir flúrljómunarsmásjármyndirnar og mæliniðurstöður nýlendumyndandi einingarinnar (CFU) af hvarfefnum sem ræktuð eru í bakteríusviflausninni í skammtíma (12 klukkustundir) og langtíma (72 klukkustundir), í sömu röð.Á stuttum tíma munu bakteríur mynda klasa og vaxa að stærð, hylja sig með slímlíkum efnum og koma í veg fyrir að þau séu fjarlægð.Hins vegar, meðan á 72 klukkustunda ræktun stendur, munu bakteríurnar þroskast og verða auðvelt að dreifa þeim til að mynda fleiri nýlendur eða klasa.Því má telja að 72 klst. ræktun sé langtíma og sé hæfilegur ræktunartími til að mynda sterka líffilmu á yfirborðinu (38).Á stuttum tíma sýndu ætið yfirborð og yfirborð SHP bakteríuviðloðun, sem minnkaði um 25% til 50% miðað við ber undirlagið.Hins vegar, vegna framúrskarandi virkni og stöðugleika gegn líffrjóvgun, sýndi LOIS ekki viðloðun bakteríulíffilmu til skamms og langs tíma.Skýringarmyndin (Mynd 3C) lýsir útskýringunni á líffræðilegum gróðursetningu ætingarlausnarinnar, SHP og LOIS.Gert er ráð fyrir að ætið undirlagið með vatnssækna eiginleika muni hafa stærra yfirborð en berið undirlagið.Þess vegna mun meiri bakteríuviðloðun eiga sér stað á æta undirlaginu.Hins vegar, samanborið við ber undirlagið, hefur ætað undirlagið marktækt minni líffilmu sem myndast á yfirborðinu.Þetta er vegna þess að vatnssameindir bindast þétt við vatnssækna yfirborðið og virka sem smurefni fyrir vatn og trufla þannig viðloðun baktería til skamms tíma (39).Hins vegar er lag vatnssameinda mjög þunnt og leysanlegt í bakteríusviflausnum.Þess vegna hverfur vatnsameindalagið í langan tíma, sem leiðir til mikillar viðloðun og fjölgun baktería.Fyrir SHP, vegna skammtímaeiginleika þess sem ekki bleytir, er viðloðun baktería hindrað.Minni bakteríuviðloðun má rekja til loftvasa sem eru föst í lagskiptu uppbyggingunni og minni yfirborðsorku, sem lágmarkar þannig snertingu milli bakteríusviflausnarinnar og yfirborðsins.Hins vegar sást mikil viðloðun baktería í SHP vegna þess að það missti gróðureyðandi eiginleika sína í langan tíma.Þetta er aðallega vegna þess að loftvasar hverfa vegna vatnsstöðuþrýstings og upplausnar lofts í vatni.Þetta er aðallega vegna þess að loftvasar hverfa vegna upplausnar og lagskiptrar uppbyggingar sem gefur stærra yfirborði fyrir viðloðun (27, 40).Ólíkt þessum tveimur hvarfefnum sem hafa mikilvæg áhrif á langtímastöðugleika, er smurolían sem er í LOIS sprautuð inn í míkró/nano uppbyggingu og mun ekki hverfa jafnvel til lengri tíma litið.Smurefni fyllt með míkró/nano uppbyggingu eru mjög stöðug og dragast mjög að yfirborðinu vegna mikillar efnasækni þeirra og koma þannig í veg fyrir viðloðun baktería í langan tíma.Mynd S6 sýnir endurskinssmásjármynd af undirlagi með smurefni sem er sökkt í fosfatbuðrað saltvatn (PBS).Stöðugar myndir sýna að jafnvel eftir 120 klukkustundir af vægum hristingi (120 rpm) helst smurefnislagið á LOIS óbreytt, sem gefur til kynna langtímastöðugleika við flæðisskilyrði.Þetta er vegna mikillar efnafræðilegrar sækni á milli flúor-undirstaða SAM-húðarinnar og perflúorkolefnis-undirstaða smurefni, þannig að stöðugt smurefni getur myndast.Þess vegna er gróðurvarnarvirkninni viðhaldið.Að auki var hvarfefnið prófað gegn dæmigerðum próteinum (albúmíni og fíbrínógen), sem eru í plasma, frumum sem eru nátengdar ónæmisstarfsemi (átfrumur og vefjafrumur) og þeim sem tengjast beinmyndun.Kalsíuminnihald er mjög hátt.(Mynd 3D, 1 og 2, og mynd S7) (41, 42).Auk þess sýndu flúrljómunarsmásjármyndirnar af viðloðunprófinu fyrir fíbrínógen, albúmín og kalsíum mismunandi viðloðunareiginleika hvers undirlagshóps (Mynd S8).Við myndun beina geta nýmynduð bein- og kalsíumlög umkringt bæklunarígræðsluna, sem gerir ekki aðeins erfitt fyrir að fjarlægja það heldur getur það einnig valdið sjúklingnum óvæntum skaða meðan á brottnáminu stendur.Þess vegna er lítið magn af kalkútfellingum á beinplötum og skrúfum gagnleg fyrir bæklunaraðgerðir sem krefjast fjarlægðar ígræðslu.Byggt á magngreiningu á meðfylgjandi svæði byggt á flúrljómunarstyrk og frumufjölda, staðfestum við að LOIS sýnir framúrskarandi gróðureyðandi eiginleika fyrir öll líffræðileg efni samanborið við önnur hvarfefni.Samkvæmt niðurstöðum in vitro tilrauna er hægt að beita líffræðilegu fóstureyðingunni LOIS á bæklunarígræðslur, sem geta ekki aðeins hamlað sýkingum af völdum líffilmubaktería, heldur einnig dregið úr bólgu af völdum virks ónæmiskerfis líkamans.
(A) Flúrljómunarsmásjármyndir af hverjum hópi (nöktum, etsuðum, SHP og LOIS) ræktaðar í Pseudomonas aeruginosa og MRSA sviflausnum í 12 og 72 klukkustundir.(B) Fjöldi viðloðandi CFU Pseudomonas aeruginosa og MRSA á yfirborði hvers hóps.(C) Skýringarmynd af andstæðingur-líffræðilegu gróðurkerfi skammtíma og langtíma ætingu, SHP og LOIS.(D) (1) Fjöldi trefjafrumna sem festast við hvert undirlag og flúrljómunarsmásjármyndir af frumunum sem festar eru við ber og LOIS.(2) Viðloðunpróf á ónæmistengdum próteinum, albúmíni og kalsíum sem taka þátt í beinagræðsluferlinu (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001 og **** P <0,0001).ns, ekki mikilvægt.
Þegar um er að ræða óhjákvæmilegt einbeitt álag, hefur vélræn ending alltaf verið aðal áskorunin fyrir beitingu gróðurvarnarhúðunar.Hefðbundnar aðferðir gegn skólphlaupi eru byggðar á fjölliðum með litla vatnsleysni og viðkvæmni.Þess vegna eru þeir venjulega viðkvæmir fyrir vélrænni streitu í lífeindafræðilegum notkun.Þess vegna er vélrænt endingargott gróðurvarnarefni enn áskorun fyrir notkun eins og bæklunarígræðslu (43, 44).Mynd 4A(1) sýnir tvær megingerðir streitu sem beitt er á bæklunarígræðslur, þar með talið klóra (skurðálag) og þjöppun með sjónrænu myndinni af skemmda vefjalyfinu sem framleitt er af tönginni.Til dæmis, þegar skrúfan er hert með skrúfjárni, eða þegar skurðlæknirinn heldur beinplötunni þétt með pincet og beitir þrýstikrafti, mun plastbeinplatan skemmast og rispast á bæði macro og micro/nano kvarðanum (Mynd 4A, 2).Til þess að prófa hvort framleidda LOIS þoli þessar skemmdir við lýtaaðgerðir, var gerð nanóinndráttur til að bera saman hörku beru undirlagsins og LOIS á míkró/nano mælikvarða til að rannsaka vélræna eiginleika ör/nano uppbyggingu áhrif (mynd 4B).Skýringarmyndin sýnir mismunandi aflögunarhegðun LOIS vegna nærveru ör/nano mannvirkja.Kraft-tilfærsluferill var teiknaður út frá niðurstöðum nanóinndráttar (Mynd 4C).Bláa myndin sýnir ber undirlagið, sem sýnir aðeins smávægilega aflögun, eins og sést af hámarksdýptinni sem er 0,26-μm.Á hinn bóginn getur smám saman aukning á nanóinndráttarkrafti og tilfærslu sem sést í LOIS (rauðri ferill) sýnt merki um skerta vélræna eiginleika, sem leiðir til nanóinndráttar dýpt upp á 1,61μm.Þetta er vegna þess að míkró/nano uppbyggingin sem er til staðar í LOIS veitir dýpra framgangsrými fyrir odd nanóinnarsins, þannig að aflögun þess er meiri en á beru undirlaginu.Konsta-Gdoutos o.fl.(45) telur að vegna tilvistar nanóbygginga leiði nanóinndráttur og ör/nano grófleiki til óreglulegra nanóinndráttarferla.Skyggða svæðið samsvarar óreglulegu aflögunarferlinu sem rekja má til nanóbyggingarinnar, en hið óskyggða svæði er rakið til örbyggingarinnar.Þessi aflögun getur skaðað örbyggingu/nanobyggingu smurefnisins og haft neikvæð áhrif á gróðurvarnarvirkni þess.Til þess að rannsaka áhrif skemmda á LOIS var óumflýjanlegt tjón á ör/nano mannvirkjum endurtekið í líkamanum við lýtaaðgerðir.Með því að nota blóð- og próteinviðloðunarpróf er hægt að ákvarða stöðugleika líffrjóvgunareiginleika LOIS eftir in vitro (Mynd 4D).Röð sjónmynda sýnir skemmdirnar sem urðu nálægt holum hvers undirlags.Blóðviðloðunarpróf var gert til að sýna fram á áhrif vélrænna skemmda á gróðureyðandi húðina (Mynd 4E).Eins og SHP tapast gróðurvarnareiginleikar vegna skemmda og LOIS sýnir framúrskarandi gróðureyðandi eiginleika með því að hrinda frá sér blóði.Þetta er vegna þess að, vegna þess að yfirborðsorkan er knúin áfram af háræðsaðgerðinni sem nær yfir skemmda svæðið, endurheimtir flæðið í smurolíu smurefninu smurefninu (35).Sama tilhneiging kom fram í próteinviðloðunarprófinu með albúmíni.Á skemmda svæðinu sést víða viðloðun próteina á yfirborði SHP og með því að mæla svæðisþekju þess er hægt að mæla það sem helming af viðloðuninni á beru undirlaginu.Á hinn bóginn hélt LOIS eigin gróðureyðandi eiginleikum sínum án þess að valda viðloðun (Mynd 4, F og G).Að auki er yfirborð skrúfunnar oft fyrir sterku vélrænu álagi, svo sem borun, þannig að við rannsökuðum getu LOIS húðarinnar til að vera ósnortinn á skrúfunni in vitro.Mynd 4H sýnir sjónrænar myndir af mismunandi skrúfum, þar á meðal berum, SHP og LOIS.Rauði rétthyrningurinn táknar marksvæðið þar sem mikil vélræn streita á sér stað við ígræðslu beina.Svipað og próteinviðloðun prófsins á plötunni er flúrljómunarsmásjá notuð til að mynda próteinviðloðunina og mæla þekjusvæðið til að sanna heilleika LOIS húðarinnar, jafnvel við mikla vélrænni streitu (Mynd 4, I og J).LOIS-meðhöndluðu skrúfurnar sýna framúrskarandi gróðurvörn og nánast ekkert prótein festist við yfirborðið.Hins vegar sást próteinviðloðun í berum skrúfum og SHP-skrúfum, þar sem flatarmál SHP-skrúfa var þriðjungur af flatarmáli af berum skrúfum.Að auki verður bæklunarígræðslan sem notuð er til festingar að vera vélræn sterk til að standast álagið sem beitt er á brotsvæðið, eins og sýnt er á mynd 4K.Þess vegna var beygjupróf gerð til að ákvarða áhrif efnabreytinga á vélræna eiginleika.Að auki er þetta gert til að viðhalda fastri streitu frá vefjalyfinu.Beittu lóðréttum vélrænum krafti þar til vefjalyfið er að fullu brotið saman og álags-álagsferill fæst (Mynd 4L, 1).Tveir eiginleikar, þar á meðal Young's stuðull og sveigjustyrkur, voru bornir saman á milli bers og LOIS undirlags sem vísbendingar um vélrænan styrk þeirra (Mynd 4L, 2 og 3).Stuðull Young gefur til kynna getu efnis til að standast vélrænar breytingar.Young's stuðull hvers undirlags er 41,48±1,01 og 40,06±0,96 GPa, í sömu röð;sá munur er um 3,4%.Að auki er greint frá því að beygjustyrkur, sem ákvarðar seigju efnisins, er 102,34±1,51 GPa fyrir ber undirlagið og 96,99±0,86 GPa fyrir SHP.Berið undirlag er um það bil 5,3% hærra.Lítilsháttar minnkun á vélrænni eiginleikum getur stafað af hakáhrifum.Í hakáhrifum getur míkró/nano grófleiki virkað sem sett af hak, sem leiðir til staðbundinnar streitustyrks og hefur áhrif á vélræna eiginleika vefjalyfsins (46).Hins vegar, miðað við þá staðreynd að stífleiki barkarbeins manna er sagður vera á milli 7,4 og 31,6 GPa og mældur LOIS stuðullinn er meiri en í heilaberki manna (47), er LOIS nægjanlegt til að styðja við brotið og heildarbrotið. vélrænni eiginleikar verða fyrir litlum áhrifum af yfirborðsbreytingum.
(A) Skýringarmynd af (1) vélrænni álagi sem er beitt á bæklunarígræðsluna meðan á aðgerðinni stendur og (2) sjónmynd af skemmda bæklunarígræðslunni.(B) Skýringarmynd af nanó-vélrænni eiginleikum mælingu með nanóinndrætti og LOIS á beru yfirborði.(C) Nanoindentation kraft-tilfærslu ferill ber yfirborðs og LOIS.(D) Eftir in vitro tilraunir skaltu líkja eftir sjónrænum myndum af mismunandi gerðum bæklunarplötum (skemmda svæðið er auðkennt með rauðum rétthyrningi) til að líkja eftir vélrænni streitu sem orsakast við aðgerðina.(E) Blóðviðloðun próf og (F) prótein viðloðun próf á skemmda bæklunarplötuhópnum.(G) Mældu svæðisþekju próteinsins sem loðir við plötuna.(H) Ljósmyndir af mismunandi gerðum bæklunarskrúfa eftir in vitro tilraunina.(I) Próteinviðloðun próf til að rannsaka heilleika mismunandi húðunar.(J) Mældu svæðisþekju próteinsins sem loðir við skrúfuna.(K) Hreyfingu kanínunnar er ætlað að mynda fasta streitu á beinbrotið.(L) (1) Niðurstöður beygjuprófa og sjónrænar myndir fyrir og eftir beygju.Munurinn á (2) Youngs stuðuli og (3) beygjustyrk milli bers ígræðslu og SHP.Gögn eru gefin upp sem meðaltal ± SD (*P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 og ****P<0,0001).Mynd með leyfi: Kyomin Chae, Yonsei University.
Í klínískum aðstæðum kemur flest snerting baktería við líffræðileg efni og sárstaði frá þroskuðum, þroskuðum líffilmum (48).Þess vegna áætlar bandaríska miðstöðvar fyrir sjúkdómseftirlit og forvarnir að 65% allra sýkinga í mönnum tengist líffilmum (49).Í þessu tilviki er nauðsynlegt að útvega in vivo tilraunahönnun sem veitir stöðuga líffilmumyndun á yfirborði vefjalyfsins.Þess vegna þróuðum við kanínulærleggsbrotslíkan þar sem bæklunarígræðslur voru forræktaðar í bakteríusvif og síðan græddar í lærlegg kanína til að rannsaka gróðureyðandi eiginleika LOIS in vivo.Vegna eftirfarandi þriggja mikilvægra staðreynda, eru bakteríusýkingar framkallaðar af forrækt frekar en beinni inndælingu bakteríusviflausna: (i) Ónæmiskerfi kanína er náttúrulega sterkara en manna;því er hægt að sprauta bakteríusviflausnum og svifbakteríum Það hefur engin áhrif á myndun líffilma.(Ii) Svifbakteríur eru næmari fyrir sýklalyfjum og sýklalyf eru venjulega notuð eftir aðgerð;að lokum, (iii) svifbaktería sviflausn má þynna með líkamsvökva dýrsins (50).Með því að forrækta vefjalyfið í bakteríusviflausn fyrir ígræðslu, getum við rannsakað rækilega skaðleg áhrif bakteríusýkingar og aðskotahlutaviðbragða (FBR) á beinagræðsluferlið.Kanínunum var fórnað 4 vikum eftir ígræðslu, vegna þess að beinsamþættingu sem er nauðsynleg fyrir beinheilunina verður lokið innan 4 vikna.Síðan voru ígræðslur fjarlægðar úr kanínum til rannsókna á eftir.Mynd 5A sýnir útbreiðsluferli baktería.Sýkta bæklunarígræðslan er sett inn í líkamann.Sem afleiðing af forræktun í bakteríusviflausn, voru sex af sex kanínum sem græddar voru með nöktum ígræðslum sýktar, en engin kanínanna sem voru ígrædd með LOIS-meðhöndluðum ígræðslum var sýkt.Bakteríusýkingar fara fram í þremur skrefum, þar á meðal vöxt, þroska og dreifingu (51).Í fyrsta lagi fjölga sér og vaxa tengdar bakteríur á yfirborðinu og síðan mynda bakteríurnar líffilmu þegar þær skilja út utanfrumufjölliðu (EPS), amyloid og utanfrumu DNA.Líffilmur truflar ekki aðeins inngöngu sýklalyfja heldur stuðlar einnig að uppsöfnun sýklalyfja-niðurbrotandi ensíma (eins og β-laktamasa) (52).Að lokum dreifir líffilman þroskuðu bakteríunum í nærliggjandi vefi.Þess vegna á sér stað sýking.Að auki, þegar aðskotahlutur kemst inn í líkamann, getur sýking sem getur valdið sterkri ónæmissvörun valdið alvarlegri bólgu, sársauka og skert ónæmi.Mynd 5B gefur yfirlit yfir FBR sem orsakast af ísetningu bæklunarígræðslu frekar en ónæmissvörun af völdum bakteríusýkingar.Ónæmiskerfið viðurkennir vefjalyfið sem sett er inn sem aðskotahlut og veldur því að frumur og vefir bregðast við og umlykja aðskotahlutinn (53).Í árdaga FBR myndaðist framboðsfylki á yfirborði bæklunarígræðslna sem leiddi til aðsogs fíbrínógens.Aðsogað fíbrínógen myndar síðan mjög þétt fíbrínnet, sem stuðlar að viðtengingu hvítkorna (54).Þegar fíbrínnetið hefur myndast mun bráð bólga eiga sér stað vegna íferðar daufkyrninga.Í þessu skrefi losna ýmis frumufrumur eins og æxlisdrep þáttur-α (TNF-α), interleukin-4 (IL-4) og IL-β og einfrumur byrja að síast inn um ígræðslustaðinn og aðgreina sig í risafrumur.Fagur (41, 55, 56).Að draga úr FBR hefur alltaf verið áskorun vegna þess að of mikið FBR getur valdið bráðri og langvinnri bólgu, sem getur leitt til banvænna fylgikvilla.Til að meta áhrif bakteríusýkinga í vefjum í kringum beru vefjalyfið og LOIS var litun með hematoxylin og eosin (H&E) og Masson trichrome (MT) litun.Hjá kanínum sem voru ígræddar með beru undirlagi fóru alvarlegar bakteríusýkingar fram og H&E vefjasýni sýndu greinilega ígerð og drep af völdum bólgu.Á hinn bóginn hindrar hið mjög sterka gróðureyðandi yfirborð LOIS viðloðun baktería, þannig að það sýnir engin merki um sýkingu og dregur úr bólgu (mynd 5C).Niðurstöður MT-litunar sýndu sömu þróun.Hins vegar sýndi MT litun einnig bjúg í kanínum sem voru ígræddar með LOIS, sem gefur til kynna að bati sé við það að eiga sér stað (Mynd 5D).Til þess að kanna hversu ónæmissvörun er, var ónæmisvefjaefnafræðileg litun (IHC) gerð með því að nota cýtókín TNF-α og IL-6 sem tengjast ónæmissvörun.Nakið neikvætt vefjalyf sem var ekki útsett fyrir bakteríum var borið saman við LOIS sem var útsett fyrir bakteríum en ekki sýkt til að rannsaka lækningaferlið í fjarveru bakteríusýkingar.Mynd 5E sýnir sjónræna mynd af IHC rennibraut sem tjáir TNF-α.Brúna svæðið táknar ónæmissvörun, sem gefur til kynna að ónæmissvörun í LOIS sé lítillega skert.Að auki var tjáning IL-6 í LOIS marktækt minni en neikvæð tjáning dauðhreinsaðs nakinnar (Mynd 5F).Tjáning cýtókíns var magngreind með því að mæla svæði mótefnalitunar sem samsvarar cýtókíninu (Mynd 5G).Í samanburði við kanínurnar sem voru útsettar fyrir neikvæðu ígræðslunni var tjáningarstig kanínanna sem voru ígræddar með LOIS lægri, sem sýndi marktækan mun.Minnkun á tjáningu cýtókína bendir til þess að langtíma, stöðugir gróðureyðandi eiginleikar LOIS séu ekki aðeins tengdir hömlun á bakteríusýkingum, heldur einnig minnkun FBR, sem er framkallað af átfrumum sem festast við hvarfefnið (53, 57, 58).Þess vegna getur skert ónæmissvörun vegna ónæmissniðganga eiginleika LOIS leyst aukaverkanir eftir ígræðslu, svo sem óhófleg ónæmissvörun eftir lýtaaðgerð.
(A) Skýringarmynd af ferli líffilmumyndunar og útbreiðslu á yfirborði sýkts bæklunarígræðslu.eDNA, utanfrumu DNA.(B) Skýringarmynd af ónæmissvörun eftir bæklunarígræðslu ísetningu.(C) H&E litun og (D) MT litun á nærliggjandi vefjum bæklunarígræðslu með berum jákvæðum og LOIS.IHC ónæmistengdra cýtókína (E) TNF-α og (F) IL-6 eru litaðar myndir af nöktum-neikvæðum og LOIS-ígræddum kanínum.(G) Magngreining á tjáningu frumuefna með svæðismælingu (** P <0,01).
Lífsamrýmanleiki LOIS og áhrif þess á beinagræðsluferli voru skoðuð in vivo með myndgreiningu [röntgenmyndatöku og örtölvusneiðmynd (CT)] og beinþynningar IHC.Mynd 6A sýnir beingræðsluferlið sem felur í sér þrjú mismunandi stig: bólgu, viðgerð og endurgerð.Þegar brot á sér stað munu bólgufrumur og trefjafrumur komast inn í beinbrotið og byrja að vaxa inn í æðavefinn.Í viðgerðarfasa dreifist innvöxtur æðavefs nálægt brotstaðnum.Æðavefur gefur næringarefni fyrir myndun nýrra beina, sem kallast callus.Lokastig beinagræðsluferlisins er endurmótunarstigið, þar sem stærð kallsins minnkar niður í eðlilegt bein með hjálp aukningar á magni virkjaðra beinþynningar (59).Þrívídd (3D) endurgerð brotasvæðisins var gerð með því að nota örsneiðmyndatökur til að athuga muninn á magni kallmyndunar í hverjum hópi.Fylgstu með þversniði lærleggsins til að fylgjast með þykkt callus sem umlykur beinbrotið (Mynd 6, B og C).Röntgengeislar voru einnig notaðir til að kanna brotstaði allra hópa í hverri viku til að fylgjast með mismunandi beinendurnýjunarferlum í hverjum hópi (Mynd S9).Callus og þroskuð bein eru sýnd í bláu/grænu og fílabeini, í sömu röð.Flestir mjúkir vefir eru síaðir út með forstilltum þröskuldi.Nakinn jákvæður og SHP staðfestu myndun á litlu magni af kalli í kringum brotstaðinn.Á hinn bóginn eru óvarinn neikvæður af LOIS og brotstaðurinn umkringdur þykkum kalli.Ör-CT myndir sýndu að myndun callus var hindrað af bakteríusýkingu og sýkingatengdri bólgu.Þetta er vegna þess að ónæmiskerfið setur lækningu rotþróaskaða af völdum sýkingatengdrar bólgu í forgang frekar en endurheimt beina (60).IHC og Tartrat-ónæm sýrufosfatasa (TRAP) litun var gerð til að fylgjast með beinþynningarvirkni og beinupptöku (Mynd 6D) (61).Aðeins örfáir virkjaðir beinþynningar, litaðir fjólubláir, fundust í nöktum jákvæðum og SHP.Á hinn bóginn sáust margir virkjaðir beinþynningar nálægt nöktum jákvæðum og þroskuðum beinum LOIS.Þetta fyrirbæri bendir til þess að þegar beinþynningar eru til staðar, sé kallinn í kringum brotstaðinn að ganga í gegnum kröftugt endurskipulagningarferli (62).Beinrúmmál og beinþynningarsvæði callussins voru mæld til að bera saman magn callusmyndunar í kringum brotstaðinn í öllum hópum, til að mæla ör-CT skönnun og IHC niðurstöður (Mynd 6E, 1 og 2).Eins og við var að búast voru nakin neikvæð atriði og kallmyndun í LOIS marktækt meiri en í hinum hópunum, sem bendir til þess að jákvæð bein endurgerð hafi átt sér stað (63).Mynd S10 sýnir sjónræna mynd af skurðaðgerðarstaðnum, MT-litunarniðurstöðu vefsins sem safnað er nálægt skrúfunni og TRAP-litunarniðurstöðuna sem undirstrikar skrúfu-beinviðmótið.Í beru undirlaginu sást sterkur kall- og bandvefsmyndun á meðan LOIS-meðhöndlaða vefjalyfið sýndi tiltölulega óviðloðandi yfirborð.Á sama hátt, samanborið við nakta neikvæða, kom fram minni bandvefsmyndun hjá kanínum sem voru ígræddar með LOIS, eins og hvítu örvarnar gefa til kynna.Að auki má rekja stífan bjúg (bláa ör) til ónæmisfrávikseiginleika LOIS og dregur þar með úr alvarlegri bólgu.The non-stick yfirborð í kringum vefjalyfið og minnkað bandvefsmyndun benda til þess að fjarlægingarferlið sé auðveldara, sem venjulega leiðir til annarra beinbrota eða bólgu.Beingræðsluferlið eftir að skrúfur var fjarlægður var metið út frá beinþynningarvirkni við skrúfu-beinskil.Bæði beinabeinið og LOIS ígræðsluviðmótið gleyptu svipað magn beinþynningar og frekari beinheilun, sem gefur til kynna að LOIS húðin hafi engin neikvæð áhrif á beinheilun eða ónæmissvörun.Til að staðfesta að yfirborðsbreytingin sem gerð er á LOIS trufli ekki beingræðsluferlið var röntgenrannsókn notuð til að bera saman beinheilun kanínanna við útsettar neikvæðar jónir og 6 vikna LOIS ígræðslu (Mynd 6F).Niðurstöðurnar sýndu að samanborið við ósýkta nektarjákvæða hópinn sýndi LOIS sömu beinagræðslu og engin augljós merki um beinbrot (samfelld beingreiningarlína) í báðum hópum.
(A) Skýringarmynd af beingræðsluferli eftir beinbrot.(B) Mismunur á stigi kallmyndunar hvers yfirborðshóps og (C) þversniðsmynd brotasvæðisins.(D) TRAP litun til að sjá beinþynningarvirkni og beinupptöku.Byggt á TRAP virkni var myndun ytri kalls í barkarbeini magngreind með (E) (1) ör-CT og (2) beinþynningarvirkni.(F) 6 vikum eftir ígræðslu, röntgenmyndir af brotnu beini af afhjúpuðu negatífinu (merkt með rauða strikaða rétthyrningnum) og LOIS (auðkennt með bláa strikaða rétthyrningnum).Tölfræðileg greining var gerð með einhliða dreifigreiningu (ANOVA).* P <0,05.** P <0,01.
Í stuttu máli, LOIS býður upp á nýja tegund af bakteríudrepandi sýkingaraðferð og ónæmisflóttahúðun fyrir bæklunarígræðslu.Hefðbundin bæklunarígræðsla með SHP-virkni sýna skammtímagræðslueyðandi eiginleika en geta ekki viðhaldið eiginleikum sínum í langan tíma.Ofurvatnsfælni undirlagsins fangar loftbólur á milli bakteríanna og undirlagsins og myndar þar með loftpoka og kemur þannig í veg fyrir bakteríusýkingu.Hins vegar, vegna dreifingar lofts, eru þessir loftvasar auðveldlega fjarlægðir.Á hinn bóginn hefur LOIS vel sannað getu sína til að koma í veg fyrir líffilmutengdar sýkingar.Þess vegna er hægt að koma í veg fyrir sýkingartengda bólgu vegna hafnunareiginleika smurlagsins sem sprautað er inn í lagskipt ör/nano uppbyggingu yfirborðið.Ýmsar lýsingaraðferðir, þar á meðal SEM, AFM, XPS og CA mælingar, eru notaðar til að hámarka LOIS framleiðsluaðstæður.Að auki er einnig hægt að nota LOIS á ýmis líffræðileg efni sem almennt eru notuð í bæklunarbúnaði, svo sem PLGA, Ti, PE, POM og PPSU.Síðan var LOIS prófað in vitro til að sanna andstæðingur líffóðurs gegn bakteríum og líffræðilegum efnum sem tengjast ónæmissvörun.Niðurstöðurnar sýna að það hefur framúrskarandi bakteríudrepandi og gróðureyðandi áhrif samanborið við beru vefjalyfið.Að auki sýnir LOIS vélrænan styrk, jafnvel eftir að hafa beitt vélrænni streitu, sem er óhjákvæmilegt í lýtaaðgerðum.Vegna sjálfgræðandi eiginleika smurefnisins á yfirborði míkró/nano byggingarinnar, hélt LOIS með góðum árangri and-líffræðilegum gróðureiginleikum sínum.Til að rannsaka lífsamrýmanleika og bakteríudrepandi eiginleika LOIS in vivo var LOIS grædd í lærlegg kanínu í 4 vikur.Engin bakteríusýking kom fram í kanínum sem voru ígræddar með LOIS.Að auki sýndi notkun IHC minnkuð staðbundin ónæmissvörun, sem gefur til kynna að LOIS hamli ekki beinagræðsluferlinu.LOIS sýnir framúrskarandi bakteríudrepandi og ónæmissniðuga eiginleika og hefur verið sannað að það kemur í veg fyrir myndun líffilmu fyrir og meðan á bæklunaraðgerðum stendur, sérstaklega fyrir beinmyndun.Með því að nota beinmergsbólgulíkan fyrir lærleggsbrot í kanínum, voru áhrif líffilmutengdra sýkinga á beingræðsluferli sem framkallað er af forræktuðum ígræðslum djúpt rannsakað.Sem framtíðarrannsókn er þörf á nýju in vivo líkani til að rannsaka mögulegar sýkingar eftir ígræðslu til að skilja að fullu og koma í veg fyrir líffilmutengdar sýkingar á öllu lækningaferlinu.Að auki er beininduction enn óleyst áskorun í samþættingu við LOIS.Frekari rannsókna er þörf til að sameina sértæka viðloðun beinvirkandi frumna eða endurnýjandi lyf við LOIS til að sigrast á áskoruninni.Á heildina litið táknar LOIS efnilega bæklunarígræðsluhúðun með vélrænni styrkleika og framúrskarandi gróðureyðandi eiginleika, sem getur dregið úr SSI og ónæmis aukaverkunum.
Þvoið 15 mm x 15 mm x 1 mm 304 SS undirlagið (Dong Kang M-Tech Co., Kóreu) í asetoni, EtOH og DI vatni í 15 mínútur til að fjarlægja mengunarefni.Til að mynda míkró/nano-stig uppbyggingu á yfirborðinu er hreinsaða undirlagið sökkt í 48% til 51% HF lausn (DUKSAN Corp., Suður-Kóreu) við 50°C.Ætingartíminn er á bilinu 0 til 60 mínútur.Síðan var æta undirlagið hreinsað með afjónuðu vatni og sett í 65% HNO3 (Korea DUKSAN Corp.) lausn við 50°C í 30 mínútur til að mynda krómoxíð aðgerðarlag á yfirborðinu.Eftir passivering er undirlagið þvegið með afjónuðu vatni og þurrkað til að fá undirlag með lagskiptri uppbyggingu.Því næst var hvarfefnið útsett fyrir súrefnisplasma (100 W, 3 mínútur), og strax sökkt í lausn af 8,88 mM POTS (Sigma-Aldrich, Þýskalandi) í tólúeni við stofuhita í 12 klukkustundir.Síðan var undirlagið sem var húðað með POTS hreinsað með EtOH og glæðað við 150°C í 2 klukkustundir til að fá þétt POTS SAM.Eftir SAM húðun myndaðist smurefni á undirlagið með því að bera á perflúorpólýeter smurefni (Krytox 101; DuPont, USA) með hleðslurúmmáli 20 μm/cm 2. Fyrir notkun skal sía smurefnið í gegnum 0,2 míkron síu.Fjarlægðu umfram smurefni með því að halla í 45° horn í 15 mínútur.Sama framleiðsluaðferð var notuð fyrir bæklunarígræðslur úr 304 SS (læsingarplata og barkarlæsiskrúfa; Dong Kang M-Tech Co., Kóreu).Allar bæklunarígræðslur eru hannaðar til að passa við rúmfræði kanínulærleggsins.
Yfirborðsformgerð undirlagsins og bæklunarígræðslna var skoðuð með SEM (Inspect F50, FEI, USA) og AFM (XE-100, Park Systems, Suður-Kóreu).Yfirborðsgrófleiki (Ra, Rq) er mældur með því að margfalda flatarmálið 20 μm með 20 μm (n=4).XPS (PHI 5000 VersaProbe, ULVAC PHI, Japan) kerfi búið Al Kα röntgengjafa með blettstærð 100μm2 var notað til að greina efnasamsetningu yfirborðs.CA mælikerfi búið kraftmikilli myndatökuvél (SmartDrop, FEMTOBIOMED, ​​Suður-Kórea) var notað til að mæla fljótandi CA og SA.Fyrir hverja mælingu eru 6 til 10 μl af dropum (afjónað vatn, hestablóð, EG, 30% etanól og HD) sett á yfirborðið til að mæla CA.Þegar hallahorn undirlagsins eykst með 2°/s hraða (n = 4) mælist SA þegar dropinn fellur.
Pseudomonas aeruginosa [American Type Culture Collection (ATCC) 27853] og MRSA (ATCC 25923) voru keyptir frá ATCC (Manassas, Virginia, Bandaríkjunum), og stofnræktinni var haldið við -80°C.Fyrir notkun var frosna ræktunin ræktuð í trypsínþíddu sojabaunasoði (Komed, Kóreu) við 37°C í 18 klukkustundir og síðan flutt tvisvar til að virkja hana.Eftir ræktun var ræktunin skilin í skilvindu við 10.000 rpm í 10 mínútur við 4°C og þvegin tvisvar með PBS (pH 7,3) lausn.Miðflótta ræktin er síðan undirræktuð á blóðagarplötum (BAP).MRSA og Pseudomonas aeruginosa voru útbúin yfir nótt og ræktuð í Luria-Bertani seyði.Styrkur Pseudomonas aeruginosa og MRSA í sáðefninu var magnbundið ákvarðað með CFU sviflausnarinnar í raðþynningum á agar.Stilltu síðan bakteríustyrkinn að 0,5 McFarland staðli, sem jafngildir 108 CFU/ml.Þynntu síðan virku bakteríusviflausnina 100 sinnum í 106 CFU/ml.Til að prófa bakteríudrepandi viðloðun eiginleika var undirlagið sótthreinsað við 121°C í 15 mínútur fyrir notkun.Undirlagið var síðan flutt í 25 ml af bakteríusviflausn og ræktað við 37°C með kröftugum hristingi (200 rpm) í 12 og 72 klukkustundir.Eftir ræktun var hvert hvarfefni fjarlægt úr ræktunarvélinni og þvegið þrisvar sinnum með PBS til að fjarlægja allar fljótandi bakteríur á yfirborðinu.Til að fylgjast með líffilmunni á undirlaginu var líffilman fest með metanóli og lituð með 1 ml af krímídín appelsínugult í 2 mínútur.Síðan var flúrljómunarsmásjá (BX51TR, Olympus, Japan) notuð til að taka myndir af lituðu líffilmunni.Til þess að mæla líffilmuna á undirlaginu voru tengdar frumur aðskildar frá undirlaginu með bead hvirfilaðferð, sem þótti heppilegasta aðferðin til að fjarlægja tengdar bakteríur (n = 4).Notaðu sæfða töng, fjarlægðu undirlagið úr vaxtarmiðlinum og bankaðu á brunnplötuna til að fjarlægja umfram vökva.Lauslega tengdar frumur voru fjarlægðar með því að þvo tvisvar með dauðhreinsuðu PBS.Hvert hvarfefni var síðan flutt í dauðhreinsað tilraunaglas sem innihélt 9 ml af 0,1% prótein ept saltvatni (PSW) og 2 g af 20 til 25 dauðhreinsuðum glerperlum (0,4 til 0,5 mm í þvermál).Því næst var hringt í 3 mínútur til að losa frumurnar úr sýninu.Eftir hringiðu var sviflausnin raðþynnt 10-falt með 0,1% PSW og síðan var 0,1 ml af hverri þynningu sáð á BAP.Eftir 24 klst ræktun við 37°C var CFU handvirkt talið.
Fyrir frumurnar voru músa trefjafrumur NIH/3T3 (CRL-1658; American ATCC) og músaátfrumur RAW 264.7 (TIB-71; American ATCC) notaðir.Notaðu Dulbecco's breytta Eagle miðil (DMEM; LM001-05, Welgene, Kóreu) til að rækta trefjafrumur úr músum og bæta við 10% kálvasermi (S103-01, Welgene) og 1% penicillín-streptomycin (PS ; LS202-02, Welgene (Welgene) Notaðu DMEM til að rækta músa átfrumna, bætt við 10% fóstursermi (S001-01, Welgene) og 1% PS Settu undirlagið í sex-brunn frumuræktunarplötu, og sáðu frumurnar við 105 frumur/cm2. Frumurnar voru ræktaðar yfir nótt við 37°C og 5% CO2 Fyrir frumulitun voru frumurnar festar með 4% paraformaldehýði í 20 mínútur og settar í 0,5% Triton X Incubate í 5 mínútur í -100 nM við 37°C í 30 mínútur. Eftir ræktunarferlið, notaðu hvarfefnið með 4',6-diamino-2-phenylindole (H -1200, Vector Laboratories, UK) VECTASHIELD fixation medium (n = 4 á hverja frumu). , fluorescein, fluorescein isothiocyanate-albúmín (A9771, Sigma-Aldrich, Þýskalandi) og manna plasma. Alexa Fluor 488-tengda fíbrínógenið (F13191, Invitrogen, USA) var leyst upp í PBS (10 mM, pH 7,4).Styrkur albúmíns og fíbrínógens var 1 og 150 μg/ml, í sömu röð.Eftir undirlagið Áður en það er dýft í próteinlausnina skaltu skola þau með PBS til að endurvökva yfirborðið.Dýfðu síðan öllu hvarfefninu í sex-brunn plötu sem inniheldur próteinlausnina og ræktaðu við 37°C í 30 og 90 mínútur.Eftir ræktun var hvarfefnið síðan fjarlægt úr próteinlausninni, þvegið varlega með PBS 3 sinnum og fest með 4% paraformaldehýði (n = 4 fyrir hvert prótein).Fyrir kalsíum, natríumklóríð (0,21 M) og kalíumfosfat (3,77 mM) ) var leyst upp í afjónuðu vatni.pH lausnarinnar var stillt á 2,0 með því að bæta við hýdróklóríðlausn (1M).Síðan var kalsíumklóríð (5,62 mM) leyst upp í lausninni.Með því að bæta við 1M tris(hýdroxýmetýl)-amínó stillir Metan pH lausnarinnar í 7,4.Dýfðu öllu hvarfefni í sex-brunn plötu fyllta með 1,5× kalsíumfosfatlausn og fjarlægðu úr lausninni eftir 30 mínútur.Til litunar, 2 g Alizarin Red S (CI 58005) Blandið saman við 100 ml af afjónuðu vatni.Notaðu síðan 10% ammóníumhýdroxíð til að stilla sýrustigið í 4. Litaðu undirlagið með Alizarin Red lausn í 5 mínútur og hristu síðan afgang af litarefninu og þurrkaðu.Eftir hristingarferlið skaltu fjarlægja undirlagið.Efnið er þurrkað, síðan sökkt í asetoni í 5 mínútur, síðan sökkt í asetón-xýlen (1:1) lausn í 5 mínútur og loks þvegið með xýleni (n = 4).Notuð er flúrljómunarsmásjá (Axio Imager) með ×10 og ×20 hlutlinsum..A2m, Zeiss, Þýskalandi) myndar allt undirlag.ImageJ/FIJI (https://imagej.nih.gov/ij/) var notað til að mæla viðloðun gagna líffræðilegra efna á hverjum hópi fjögurra mismunandi myndatökusvæða.Umbreyttu öllum myndum í tvöfaldar myndir með föstum þröskuldum til samanburðar á undirlagi.
Zeiss LSM 700 confocal smásjá var notuð til að fylgjast með stöðugleika smurlagsins í PBS í endurskinsham.Flúor-undirstaða SAM-húðað glersýni með sprautuðu smurlagi var sökkt í PBS lausn og prófað með svighristara (SHO-1D; Daihan Scientific, Suður-Kóreu) við vægar hristingarskilyrði (120 rpm).Taktu síðan sýnið og fylgstu með tapi á smurefni með því að mæla tap á endurkastandi ljósi.Til að ná flúrljómunarmyndum í endurkastsstillingu er sýnið útsett fyrir 633 nm leysi og síðan safnað, því ljósið mun endurkastast aftur frá sýninu.Sýnin voru mæld með 0, 30, 60 og 120 klst.
Til að ákvarða áhrif yfirborðsbreytingarferlisins á nanómekaníska eiginleika bæklunarígræðslna, var notaður nanóindenter (TI 950 TriboIndenter, Hysitron, USA) búinn þríhliða pýramídalaga Berkovich demantsoddi til að mæla nanóindendíón.Hámarksálag er 10 mN og flatarmálið er 100μmx 100μm.Fyrir allar mælingar er hleðslu- og affermingartíminn 10 sekúndur og biðtíminn undir hámarkshleðsluálagi er 2 s.Taktu mælingar frá fimm mismunandi stöðum og taktu meðaltalið.Til að meta frammistöðu vélrænni styrkleika undir álagi var þverskips þriggja punkta beygjupróf gerð með því að nota alhliða prófunarvél (Instron 5966, Instron, Bandaríkjunum).Undirlagið er þjappað með jöfnum hraða 10 N/s með auknu álagi.Bluehill Universal hugbúnaðarforritið (n = 3) var notað til að reikna út beygjustuðul og hámarksþjöppunarálag.
Til þess að líkja eftir aðgerðarferlinu og tengdum vélrænni skaða af völdum aðgerðarinnar var aðgerðarferlið framkvæmt in vitro.Lærleggjunum var safnað úr aflífuðu nýsjálensku hvítu kanínunum.Lærleggurinn var hreinsaður og festur í 4% paraformaldehýði í 1 viku.Eins og lýst er í dýratilraunaraðferðinni var fasta lærleggurinn aðgerðaraðgerð.Eftir aðgerðina var bæklunarígræðslan sökkt í blóð (hrossablóð, KISAN, Kóreu) í 10 sekúndur til að staðfesta hvort blóðviðloðun hafi átt sér stað eftir að vélrænni meiðslin voru sett á (n = 3).
Alls var 24 nýsjálenskum karlkyns hvítum kanínum (þyngd 3,0 til 3,5 kg, meðalaldur 6 mánuðir) skipt af handahófi í fjóra hópa: nektar neikvæðar, nektar jákvæðar, SHP og LOIS.Allar aðgerðir sem tóku þátt í dýrum voru framkvæmdar í samræmi við siðferðisstaðla dýraverndar- og notkunarnefndar stofnana (IACUC samþykkt, KOREA-2017-0159).Bæklunarígræðslan samanstendur af læsiplötu með fimm götum (lengd 41 mm, breidd 7 mm og þykkt 2 mm) og barkarlæsiskrúfur (lengd 12 mm, þvermál 2,7 mm) til að festa brot.Að undanskildum þeim plötum og skrúfum sem notaðar voru í ber-neikvæða hópnum voru allar plötur og skrúfur ræktaðar í MRSA sviflausn (106 CFU/ml) í 12 klukkustundir.Nakinn-neikvæði hópurinn (n=6) var meðhöndlaður með nöktum yfirborðsígræðslum án útsetningar fyrir bakteríusviflausn, sem neikvæð stjórn á sýkingu.Beri jákvæði hópurinn (n = 6) var meðhöndlaður með beru yfirborðsígræðslu sem var útsett fyrir bakteríum sem jákvæða stjórn á sýkingu.SHP hópurinn (n = 6) var meðhöndlaður með SHP ígræðslum sem urðu fyrir bakteríum.Að lokum var LOIS hópurinn meðhöndlaður með bakteríuútsettum LOIS ígræðslum (n = 6).Öll dýr eru geymd í búri og mikið af mat og vatni er útvegað.Fyrir aðgerðina voru kanínurnar fastar í 12 klukkustundir.Dýrin voru svæfð með inndælingu xýlazíns í vöðva (5mg/kg) og paklítaxeli í bláæð (3mg/kg) til örvunar.Eftir það skaltu gefa 2% ísófluran og 50% til 70% læknisfræðilegt súrefni (flæðihraði 2 l/mín) í gegnum öndunarfærin til að viðhalda svæfingu.Það er ígrædd með beinni nálgun við hlið lærleggsins.Eftir háreyðingu og póvídón-joðsótthreinsun á húð var gerður um 6 cm langur skurður utan á vinstri mið lærlegg.Með því að opna bilið á milli vöðva sem hylja lærlegginn er lærleggurinn að fullu afhjúpaður.Settu plötuna fyrir framan lærleggsskaftið og festu hana með fjórum skrúfum.Eftir festingu, notaðu sagarblað (1 mm þykkt) til að búa til brot á svæðinu milli annars gats og fjórðu gatsins.Í lok aðgerðarinnar var sárið þvegið með saltvatni og lokað með saumum.Hver kanína var sprautuð undir húð með enrofloxacin (5 mg/kg) þynnt þriðjungi í saltvatni.Eftir aðgerð voru teknar röntgenmyndir af lærlegg í öllum dýrum (0, 7, 14, 21, 28 og 42 dagar) til að staðfesta beinbrot í beininu.Eftir djúpa svæfingu voru öll dýr drepin með KCl í bláæð (2 mmól/kg) á 28 og 42 dögum.Eftir framkvæmd var lærleggurinn skannaður með ör-CT til að fylgjast með og bera saman beinagræðsluferlið og nýmyndun beina á milli hópanna fjögurra.
Eftir framkvæmd var þeim mjúkvefjum sem voru í beinni snertingu við bæklunarígræðsluna safnað saman.Vefurinn var festur í 10% hlutlausu jafnaðri formalíni yfir nótt og síðan þurrkaður í EtOH.Þurrkaður vefurinn var felldur inn í paraffín og sneiddur í 40 μm þykkt með því að nota míkrótóm (400CS; EXAKT, Þýskalandi).Til þess að sjá sýkinguna fyrir sér var H&E litun og MT litun gerð.Til að athuga svörun hýsilsins var skurðvefurinn ræktaður með kanínu-anti-TNF-α aðal mótefni (AB6671, Abcam, Bandaríkjunum) og kanínu-anti-IL-6 (AB6672; Abcam, Bandaríkjunum), og síðan meðhöndluð með piparrót.Oxidasi.Berið avidin-biotin flókið (ABC) litunarkerfið á hlutana samkvæmt leiðbeiningum framleiðanda.Til þess að koma fram sem brún hvarfafurð var 3,3-díamínóbensídín notað í öllum hlutum.Stafrænn glæruskanni (Panoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungverjaland) var notaður til að sjá allar sneiðar og að minnsta kosti fjögur hvarfefni í hverjum hópi voru greind með ImageJ hugbúnaði.
Röntgenmyndir voru teknar af öllum dýrum eftir aðgerð og vikulega til að fylgjast með beinbrotum (n=6 á hóp).Eftir framkvæmd var háupplausn micro-CT notað til að reikna út myndun kalls í kringum lærlegginn eftir gróun.Lærleggurinn sem fékkst var hreinsaður, festur í 4% paraformaldehýði í 3 daga og þurrkaður í 75% etanóli.Þurrkuðu beinin voru síðan skönnuð með því að nota ör-CT (SkyScan 1173, Brooke Micro-CT, Kandy, Belgíu) til að búa til 3D voxel myndir (2240×2240 pixlar) af beinsýninu.Notaðu 1,0 mm Al síu til að draga úr merki hávaða og beita hárri upplausn á allar skannanir (E = 133 kVp, I = 60 μA, samþættingartími = 500 ms).Nrecon hugbúnaður (útgáfa 1.6.9.8, Bruker microCT, Kontich, Belgíu) var notaður til að búa til þrívíddarrúmmál af skannaða sýninu úr áuninni tvívíddar hliðarvörpun.Til greiningar er 3D endurgerðu myndinni skipt í 10mm×10mm×10mm teninga í samræmi við brotstaðinn.Reiknaðu kallinn utan barkarbeinsins.DataViewer (útgáfa 1.5.1.2; Bruker microCT, Kontich, Belgíu) hugbúnaður var notaður til að beina skannaða beinrúmmáli stafrænt og CT-Analyzer (útgáfa 1.14.4.1; Bruker microCT, Kontich, Belgíu) hugbúnaður var notaður við greiningu.Hlutfallslegir frásogsstuðlar röntgengeisla í þroskuðum beinum og kalli eru aðgreindir með þéttleika þeirra og síðan er rúmmál callus magnmælt (n = 4).Til að staðfesta að lífsamrýmanleiki LOIS tefji ekki beinagræðsluferlið, voru gerðar viðbótarröntgen- og ör-CT-greiningar á tveimur kanínum: nöktu-neikvæðum og LOIS hópnum.Báðir hóparnir voru teknir af lífi á 6. viku.
Lærleggjum frá fórnuðum dýrum var safnað og fest í 4% paraformaldehýði í 3 daga.Bæklunarígræðslan er síðan fjarlægð varlega úr lærleggnum.Lærleggurinn var kalkaður í 21 dag með því að nota 0,5 M EDTA (EC-900, National Diagnostics Corporation).Síðan var afkalkað lærlegg sökkt í EtOH til að gera það þurrkað.Vökvata lærleggurinn var fjarlægður í xýleni og felldur inn í paraffín.Síðan var sýnið skorið í sneiðar með sjálfvirkum snúningsmikrótóm (Leica RM2255, Leica Biosystems, Þýskalandi) með þykkt 3 μm.Fyrir TRAP-litun (F6760, Sigma-Aldrich, Þýskalandi) voru sneidd sýni afparaffínuð, endurvötnuð og ræktuð í TRAP hvarfefni við 37°C í 1 klukkustund.Myndir voru teknar með glæruskanni (Panoramic 250 Flash III, 3DHISTECH, Ungverjalandi) og magnmældar með því að mæla svæðisþekju litaða svæðisins.Í hverri tilraun voru að minnsta kosti fjögur hvarfefni í hverjum hópi greind með ImageJ hugbúnaði.
Tölfræðileg marktektargreining var gerð með því að nota GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Bandaríkjunum).Óparað t-próf ​​og einhliða dreifnigreining (ANOVA) voru notuð til að prófa muninn á matshópunum.Marktektarstigið er gefið til kynna á myndinni sem hér segir: *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 og ****P<0,0001;NS, enginn marktækur munur.
Fyrir viðbótarefni fyrir þessa grein, vinsamlegast sjá http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/44/eabb0025/DC1
Þetta er grein með opnum aðgangi sem dreift er samkvæmt skilmálum Creative Commons Attribution-Non-Commercial License, sem leyfir notkun, dreifingu og fjölföldun á hvaða miðli sem er, svo framarlega sem notkunin er ekki í viðskiptalegum ávinningi og forsenda þess að upprunalega vinna er rétt.Tilvísun.
Athugið: Við biðjum þig aðeins um að gefa upp netfang svo að sá sem þú mælir með á síðuna viti að þú viljir að hann sjái tölvupóstinn og að tölvupósturinn sé ekki ruslpóstur.Við munum ekki fanga nein netföng.
Þessi spurning er notuð til að prófa hvort þú sért mannlegur gestur og til að koma í veg fyrir sjálfvirkar ruslpóstsendingar.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Bakteríudrepandi og ónæmissleppa húðun bæklunarígræðslna getur dregið úr sýkingum og ónæmissvörun af völdum sýkinga.
Choe Kyung Min, Oh Young Jang, Park Jun Joon, Lee Jin Hyuk, Kim Hyun Cheol, Lee Kyung Moon, Lee Chang Kyu, Lee Yeon Taek, Lee Sun-uck, Jeong Morui
Bakteríudrepandi og ónæmissleppa húðun bæklunarígræðslna getur dregið úr sýkingum og ónæmissvörun af völdum sýkinga.
©2021 American Association for the Advancement of Science.allur réttur áskilinn.AAAS er samstarfsaðili HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef og COUNTER.ScienceAdvances ISSN 2375-2548.